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Forschungsartikel

Mehrstufige genetische, transkriptomische und Einzelzell-Evidenz priorisiert MAP1LC3A unter ferroptose-bezogenen Genen im Glioblastom

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11. September 2026

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1Department of Cerebrovascular Neurosurgery, The First People's Hospital of Zhaoqing, 2The National Key Clinical Specialty, Guangdong Provincial Key Laboratory on Brain Function Repair and Regeneration, Department of Neuro-oncological Surgery, Zhujiang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein genetisch verankerter, mehrstufiger Ansatz, der Mendelsche Randomisierung, Tumor-Transkriptomik und Einzelzellanalysen integriert, stellte MAP1LC3A als ein mit Ferroptose assoziiertes Gen heraus, das mit der Anfälligkeit für Glioblastom verknüpft ist und als Kandidat für zukünftige experimentelle Validierung gilt.

Zusammenfassung

Glioblastom (GBM) bleibt eine äußerst aggressive maligne Erkrankung, und der Beitrag ferroptotischer Gene zur Krankheitsanfälligkeit ist noch nicht vollständig verstanden. Ein genetisch verankerter, mehrstufiger Ansatz wurde angewandt, um ferroptotische Gene zu identifizieren, die mit GBM assoziiert sind. Von 483 Genen, die aus FerrDb V2 zusammengestellt wurden, wiesen 315 kandidatenhafte cis-Expressions-Quantitative-Trait-Loci (cis-eQTLs) in eQTLGen auf, 250 behielten nach der Kopplungsungleichgewichts-Clustering mindestens drei unabhängige Instrumente bei, und 226 ergaben valide Mendelsche Randomisierungsschätzungen nach der Methode der inversen Varianzgewichtung (IVW) anhand einer genomweiten Assoziationsstudie zu GBM mit 6.183 Fällen und 18.169 Kontrollen. Vierunddreißig Gene erfüllten die explorativen Entdeckungskriterien mit einem P < 0,05 und einer Benjamini–Hochberg-False-Discovery-Rate (BH-FDR) < 0,20 sowie in gleicher Richtung zeigenden Schätzungen der bayesschen gewichteten Mendelschen Randomisierung (BWMR). Die Validierungsstufe der Mendelschen Randomisierung unter Verwendung von cis-eQTLs aus dem gesamten Blut aus GTEx V10 bestätigte vier Gene: ATG7, RPTOR, MAP1LC3A und CHMP6. Die Auswertung anhand von drei unabhängigen transkriptomischen Kohorten mit Tumor- und Kontrollproben zeigte, dass MAP1LC3A im Tumorgewebe konsistent herunterreguliert war und eine signifikante gepoolte Schätzung nach dem Zufallseffektmodell ergab (log₂-Faltungsänderung: −1,273; 95 % Konfidenzintervall: −1,625 bis −0,920; False-Discovery-Rate = 0,016), während die anderen drei Gene keine vergleichbare statistische Unterstützung über die Kohorten hinweg aufwiesen. Anschließend wurde eine virtuelle Einzelzell-Knockout-Analyse in einer patientengewichteten Teilmenge von 2.400 malignen Zellen durchgeführt, die aus 4.916 in Frage kommenden Zellen aus 20 adulten IDH-wildtypischen GBM-Tumoren ausgewählt wurden. In fünf unabhängig initialisierten Durchläufen wurden jeweils 3, 15, 4 und 7 robuste downstream liegende Gene für ATG7, RPTOR, MAP1LC3A und CHMP6 identifiziert. Die resultierenden Konsensmengen umfassten 17 einzigartige Gene, wobei RND3 bei allen vier Zielgenen gemeinsam war. Die Gen-Ontologie-Analyse zeigte eine Anreicherung von Prozessen der Zelladhäsion und der Zelloberfläche, während nach Korrektur für Mehrfachvergleiche keine KEGG- oder Reactome-Wege signifikant blieben. Insgesamt priorisieren diese Ergebnisse MAP1LC3A für zukünftige experimentelle Untersuchungen, während sie genetische Assoziation, Übereinstimmung der Tumor-Expressionsdaten und computergestützte Störungsanalysen von definitiven Beweisen für Kausalität oder Mechanismus abgrenzen.

Einleitung

Glioblastom (GBM) bleibt eine paradigmatische therapieresistente maligne Erkrankung. Trotz zunehmend verfeinerter molekularer Klassifizierung und multidisziplinärer Behandlung sind nachhaltige Verbesserungen der Patientenergebnisse begrenzt1. Bei medizinisch geeigneten Patienten besteht die derzeitige Therapie in einer maximal sicheren Resektion, gefolgt von Strahlentherapie mit gleichzeitiger und adjuvanter Gabe von Temozolomid, einem Behandlungsschema, das in einer wegweisenden randomisierten Studie etabliert wurde und in aktuellen klinischen Leitlinien beibehalten wird1,2. Dennoch begrenzen diffuse Infiltration und umfangreiche zelluläre sowie molekulare Heterogenität eine dauerhafte Krankheitskontrolle, und die meisten Patienten erleiden letztlich ein Fortschreiten oder Rezidiv der Erkrankung, für das es keine universell wirksame Standardtherapie gibt1,3. Diese anhaltende Diskrepanz zwischen Fortschritten in der Charakterisierung der Erkrankung und den klinischen Ergebnissen verdeutlicht die Notwendigkeit, biologisch relevante molekulare Abhängigkeiten zu identifizieren, die neue therapeutische Strategien beim GBM begründen könnten.

Ferroptose ist eine eisenabhängige Form des regulierten Zelltods, die durch eine unkontrollierte Peroxidation von Phospholipiden und das Versagen zellulärer antioxidativer Abwehrmechanismen gekennzeichnet ist und sich dadurch mechanistisch von der Apoptose und anderen kanonischen Zelltodprogrammen unterscheidet4,5. Dieser Prozess ist besonders relevant für das GBM, bei dem genetische Veränderungen und metabolische Plastizität die Eisenhomöostase, die Redox-Balance sowie den Lipidstoffwechsel neu gestalten. Integrierte genomische und lipidomische Profilierungen haben gezeigt, dass die Deletion von CDKN2A oxidierbare mehrfachungesättigte Fettsäuren umverteilt und dadurch eine genotypabhängige Empfänglichkeit für Ferroptose in GBM-Modellen schafft6. Ebenso haben vergleichende Analysen von primären und rezidivierten Tumoren relapsassoziierte Veränderungen in GPX4, ACSL4 und anderen Ferroptose-Regulatoren identifiziert7. Experimentelle Modulation von Ferroptose-Abwehrwegen hat zudem gezeigt, dass sie die Empfindlichkeit gegenüber Temozolomid in GBM-Zellen und Xenotransplantationsmodellen beeinflusst8. Insgesamt identifizieren diese Befunde die Ferroptose als biologisch plausible therapeutische Schwachstelle beim GBM. Diese Erkenntnisse spiegeln jedoch hauptsächlich assoziative Tumorzustände oder kontextabhängige experimentelle Beobachtungen wider und belegen nicht, ob konstitutive Variationen in der Genexpression ferroptoserelevanter Gene zu einer vererbten Anfälligkeit für GBM beitragen.

Die meisten humanen Studien zur Untersuchung der Ferroptose bei Gliomen stützten sich auf Analysen differentieller Expression, Überlebensmodellierung und molekulare Subtypisierung anhand der Datensätze von TCGA, CGGA und GEO9,10. Obwohl diese Studien die prognostische Relevanz ferroptosebezogener transkriptioneller Programme belegten, kann ihr Beobachtungsdesign nicht klären, ob veränderte Genexpression zur Anfälligkeit für Glioblastom (GBM) beiträgt oder stattdessen eine Folge der Tumorentwicklung darstellt. Mendelsche Zufallsstichprobenanalysen (Mendelian randomization) auf transkriptomweiter Ebene haben anschließend genetisch regulierte, gewebeabhängige Gene identifiziert, die mit dem Gliomrisiko assoziiert sind, während neuere, auf expressionsquantitativen Merkmalssorten (eQTL) und proteinquantitativen Merkmalssorten (pQTL) basierende Studien damit begonnen haben, potenzielle therapeutische Zielstrukturen für das GBM zu priorisieren11,12. Dennoch haben frühere Untersuchungen im Allgemeinen entweder transkriptomweite oder auf Arzneimittelziele ausgerichtete Ansätze verfolgt, anstatt eine vorab festgelegte, umfassende Genmenge im Zusammenhang mit Ferroptose zu bewerten. Zudem integrierten bisher nur wenige Studien eine große genomweite Assoziationsstudie (GWAS) zum GBM mit einer replikationsbasierten Mendelschen Zufallsstichprobe unter Verwendung einer unabhängigen eQTL-Ressource, gefolgt von einer Bewertung anhand mehrerer transkriptomischer Kohorten aus Tumor und Kontrollen. Diese Unterscheidung ist wichtig, da die genetische Regulation der Genexpression zwischen verschiedenen Geweben erheblich variiert und eQTL-Assoziationen aus Blutproben nicht ohne Weiteres als repräsentativ für regulatorische Effekte innerhalb von Hirntumoren angesehen werden können11,13. Daher ist ein integrativer Ansatz erforderlich, der genetische Assoziationen, replikationsbasierte Mendelsche Zufallsstichproben, transkohortenübergreifende Tumor-Transkriptomik und funktionelle Vorhersagen auf Basis patientenabgeleiteter Einzelzellanalysen kombiniert, um Ferroptose-assoziierte Gene zu identifizieren, die durch konvergierende Evidenzlinien in ihrer Beteiligung am GBM gestützt werden.

In dieser Studie wurde untersucht, ob die genetisch regulierte Expression eisenabhängigen Zelltods (Ferroptose) verwandter Gene mit der Anfälligkeit für Glioblastom (GBM) assoziiert ist. Im Entdeckungs- und Replikationsstadium wurden Mendelsche Zufallsbelegung (Mendelian randomization) mit Genexpressionsanalysen über drei unabhängige transkriptomische Kollektive aus Tumor und Kontrollen kombiniert. Gene, die durch beide Stadien der Mendelschen Zufallsbelegung gestützt wurden, wurden anschließend anhand von single-cell-transkriptomischen Daten von Patienten mithilfe virtueller Störungsanalysen (virtual perturbation) evaluiert, um vorhergesagte transkriptionelle Reaktionen in malignen Zellen zu charakterisieren. Anstatt Gene allein basierend auf Expressionsprofilen des Tumors zu priorisieren, nutzte dieser mehrstufige Ansatz zunächst vererbte genetische Variationen und bewertete danach krankheitsrelevante Expressionsmuster zusammen mit zellauflösenden computergestützten Störungsprofilen. Die resultierenden konvergenten Hinweise wurden verwendet, um ferroptoseassoziierte Gene für zukünftige experimentelle Untersuchungen beim GBM zu priorisieren.

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Protokoll

Diese Studie wurde vom Medizinischen Ethikkomitee des First People's Hospital of Zhaoqing von der ethischen Prüfung befreit (Referenznummer B2026-08-03). Die Studie verwendete retrospektiv erhobene, anonymisierte genetische und transkriptomische Daten auf Zusammenfassungsebene, einschließlich von einem Data Access Committee genehmigter kontrollierter Zugriffsdaten aus EGAD00010001657 sowie Datensätze aus GEO, eQTLGen und GTEx gemäß deren jeweils geltenden Zugriffs- und Nutzungsvorgaben. Es wurden keine neuen Teilnehmer rekrutiert, keine Bioproben gesammelt und keine identifizierbaren individuellen Teilnehmerdaten abgerufen. Die ethische Genehmigung und die informierte Einwilligung für die ursprünglichen Studien wurden von den jeweiligen Datenanbietern eingeholt, und die kontrollierten Zugriffsdaten wurden gemäß der jeweils geltenden Data Access Agreement verwendet.

Studienaufbau

Diese Studie verwendete einen mehrstufigen Ansatz, um Eisenotose-assoziierte Gene zu identifizieren, die mit der Anfälligkeit für Glioblastom (GBM) verknüpft sind, und um deren krankheitsrelevante transkriptionelle Effekte zu bewerten (Abbildung 1). Zunächst wurden Eisenotose-assoziierte Gene, die aus FerrDb V2 zusammengestellt wurden, mittels zweistufiger Mendelscher Randomisierung (MR) unter Verwendung von cis-Expressions-Quantitative-Trait-Locus-(cis-eQTL)-Daten und einer umfangreichen genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) zu GBM evaluiert. Die mittels inverser Varianz gewichtete MR (IVW-MR) diente dabei als primäre Screening-Methode, die bayessche gewichtete Mendelsche Randomisierung (BWMR) ermöglichte eine ergänzende Beurteilung der Robustheit, und ein unabhängiger eQTL-Datensatz wurde für die Replikationsstufe der MR-Analyse verwendet. Zweitens wurden Gene, die durch die genetischen Analysen gestützt wurden, anhand von drei unabhängigen transkriptomischen Kohorten mit Tumor- und Kontrollproben untersucht, gefolgt von einer Metaanalyse über die Kohorten hinweg. Drittens wurden transkriptomische Einzelzell-Daten von Patienten verwendet, um eine virtuelle Genmodulation in malignen Zellen durchzuführen und reproduzierbare downstream-transkriptionelle Reaktionen zu identifizieren. Diese Reaktionen wurden anschließend mittels funktioneller Anreicherungsanalysen und Analysen gemeinsamer Netzwerke charakterisiert. Insgesamt waren die genetischen Analysen darauf ausgelegt, Gene zu identifizieren, die mit der Anfälligkeit für GBM assoziiert sind, während die transkriptomischen und Einzelzell-Analysen die biologische Kohärenz beurteilten und Hypothesen für nachfolgende experimentelle Validierungen generierten.

Datenquellen

Ferroptosebezogene Gene wurden aus FerrDb V2 gewonnen, wodurch nach Harmonisierung der Gensymbole und Entfernung doppelter Einträge 483 eindeutige menschliche protein-kodierende Gene verblieben14. Als Expositionssatz für die Entdeckungsphase der Mendelschen Randomisierung (MR) wurden Zusammenfassungsstatistiken von Whole-Blood-cis-Expressionsquantitativmerkmal-Loci (cis-eQTL) des eQTLGen-Konsortiums verwendet, während die Whole-Blood-cis-eQTL-Daten der GTEx-Version V10 als unabhängiger Expositionssatz für die Replikationsphase der MR dienten11,15. Assoziationen mit dem GBM-Krankheitsverlauf wurden aus kontrolliert zugänglichen Zusammenfassungsstatistiken einer genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) bezogen, die über das European Genome-phenome Archive verfügbar sind und 6.183 Fälle sowie 18.169 Kontrollen europäischer Abstammung umfassen16. Die gewebespezifische Expression genetisch priorisierter Gene wurde anhand von drei unabhängigen Genexpressions-Omnibus-(GEO)-Kohorten untersucht: GSE196533, bestehend aus 61 Gliomproben des Grades 4, die in den hinterlegten Metadaten als GBM annotiert sind, sowie neun nicht-neoplastischen Hirnproben; GSE4290, bestehend aus GBM- und epilepsieassoziierten nicht-tumoralen Hirnproben; und GSE116520, das gepaarte Tumor-Kern- und peritumorale Proben sowie nicht-neoplastische Kontrollen enthält17,18,19. Patientenstammende Smart-seq2-Daten aus GSE131928 wurden für die virtuelle Störungsanalyse maligner Zellen verwendet20. Die Merkmale der Datensätze und ihre jeweiligen analytischen Funktionen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Alle Analysen wurden anhand zuvor erhobener, anonymisierter Datensätze durchgeführt, für die in den ursprünglichen Studien eine ethische Genehmigung und informierte Einwilligung vorlagen.

Auswahl genetischer Instrumente und Harmonisierung der Daten

Kandidateninstrumente wurden auf cis-Expressions-Quantitative-Trait-Loci (cis-eQTLs) beschränkt, die mit der Genexpression auf genomweiter Signifikanz assoziiert waren (P < 5 × 10⁻8). Die Varianten wurden mithilfe des europäischen Referenzpanels des 1000 Genomes Project mit einer Kopplungsungleichgewichts-Schwelle (LD) von r2 < 0,001 innerhalb eines 10.000-kb-Fensters gruppiert. Gene, die nach der Gruppierung weniger als drei unabhängige Instrumente aufwiesen, wurden von der primären Mendelschen Zufallsanalyse (MR) ausgeschlossen. Angesichts des explorativen Screening-Ziels wurde im Voraus eine Mindestanzahl von drei Instrumenten festgelegt, um Gene mit sparsamer, aber starker cis-eQTL-Unterstützung beizubehalten und gleichzeitig die multivariate IVW-Schätzung mit mehreren Instrumenten zu ermöglichen. Dieser Schwellenwert wurde durch eine strenge LD-Gruppierung und eine Filterung nach F-Statistik ergänzt; Schätzungen, die nur auf drei oder vier Instrumenten basierten, wurden vorsichtig interpretiert, und Sensitivitätsanalysen wurden nur durchgeführt, wenn sie methodisch anwendbar waren. Die Stärke der Instrumente wurde für jede Variante anhand der F-Statistik bewertet (F = β2/SE2), wobei β und SE den cis-eQTL-Effektschätzwert bzw. dessen Standardfehler darstellen. Varianten mit F < 10 wurden ausgeschlossen, um Verzerrungen durch schwache Instrumente zu minimieren21,22. Die Expositions- und Outcome-Datensätze wurden harmonisiert, indem die Effektallelle und Effekt-Richtungen angeglichen wurden. Doppelte Varianten, Varianten, die im GBM-GWAS-Datensatz nicht verfügbar waren, sowie Varianten mit inkompatibler Allelkodierung wurden ausgeschlossen. Da Effektallel-Frequenzen für das GBM-GWAS nicht verfügbar waren, wurden palindromische Varianten mit mehrdeutiger Strangorientierung entfernt, anstatt sie abzuleiten. Aus demselben Grund wurde kein formaler Steiger-Richtungstest durchgeführt.

Mendelsche Zufallsanalysen

Der Zusammenhang zwischen genetisch vorhergesagter Genexpression und der Anfälligkeit für Glioblastom (GBM) wurde mittels zweistufiger Mendelscher Randomisierung (MR) untersucht. Im Entdeckungsstadium wurden nur Gene berücksichtigt, für die mindestens drei unabhängige cis-Expression quantitative Trait Locus (cis-eQTL)-Instrumente zur Verfügung standen, und die gewichtete Invers-Varianz-Methode (IVW) diente als primärer analytischer Ansatz. Die Effektgrößen wurden als Odds Ratios (ORs) mit 95 % Konfidenzintervallen (CIs) pro Einheit Anstieg der genetisch vorhergesagten Genexpression angegeben. Um Mehrfachvergleiche über alle untersuchten Gene hinweg zu berücksichtigen, wurden die IVW-P-Werte mittels der Benjamini-Hochberg-Methode23 korrigiert. Gene mit einem P-Wert < 0,05 und einer Benjamini-Hochberg-Falsch-Entdeckungs-Rate (BH-FDR) < 0,20 wurden als explorative Kandidaten beibehalten. Diese relativ großzügige FDR-Schwelle wurde gewählt, um ein vorzeitiges Ausschließen potenziell relevanter Gene im Entdeckungsstadium zu vermeiden; daher wurde der Kandidatenstatus stets im Kontext nachfolgender Analysen interpretiert und nicht als bestätigender Nachweis gewertet. Die Bayesianisch gewichtete Mendelsche Randomisierung (BWMR) wurde anschließend auf die Kandidaten des Entdeckungsstadiums unter Verwendung derselben harmonisierten Instrumente angewandt24. Die Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der IVW- und BWMR-Analysen wurde anhand der statistischen Signifikanz sowie der Effektrichtung beurteilt. Sofern die Anzahl verfügbarer Instrumente es zuließ, wurden Cochran-Q-Test, MR-Egger-Achsenabschnittstest, MR-PRESSO und Leave-one-out-Analysen durchgeführt, um Heterogenität, horizontale Pleiotropie, einflussreiche Ausreißer-Varianten sowie den Einfluss einzelner Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) zu prüfen22.

Die Replikationsstadium-MR wurde unter Verwendung der GTEx V10 Ganzblut-cis-eQTL-Daten durchgeführt. Die Wald-Quotienten-Methode wurde angewandt, wenn nur ein einziges Instrument verfügbar war, während die IVW-Methode für Gene mit zwei oder mehr Instrumenten verwendet wurde. Eine Replikation wurde definiert durch P < 0,05, BH-FDR < 0,20 und eine Effekt-Richtung, die mit der entsprechenden Schätzung aus der Entdeckungsphase übereinstimmte. Da mehrere GTEx-Replikationsschätzungen auf nur einem oder zwei Instrumenten basierten, wurden sie als unterstützender Hinweis für die Replikation und nicht als unabhängiger Nachweis von Kausalität interpretiert.

Auswertung der transkriptomischen Daten über verschiedene Kohorten hinweg

Die vier Gene, die in den Entdeckungs- und Replikationsstufen der Mendelschen Zufallsanalyse (MR) priorisiert wurden, wurden anhand von drei unabhängigen transkriptomischen Kohorten bewertet. Für GSE196533 wurden rohe RNA-Sequenzierungs-Zähldaten mit DESeq225 analysiert. Gene mit Zählwerten unterhalb von 10 in allen bis auf zwei Proben wurden ausgeschlossen, wohingegen die vier Zielgene unabhängig von der Expressionsfilterung beibehalten wurden. Der differentielle Expressionsgrad wurde zwischen 61 Gliomproben des Grades 4, die in den hinterlegten Metadaten als GBM annotiert waren, und neun nicht-neoplastischen Hirnproben untersucht.

Für GSE4290 wurden vier Proben ohne explizite histopathologische Diagnose ausgeschlossen, sodass 77 GBM- und 23 Nicht-Tumor-Gehirnproben verblieben. Die aufbereiteten Microarray-Signalintensitäten wurden log2-transformiert, quantil-normalisiert und mittels robuster empirischer Bayes’scher linearer Modelle analysiert, die in limma26 implementiert sind. Wenn mehrere Sonden auf dasselbe Gen abbildeten, wurde unabhängig von der Signifikanz der differentiellen Expression die Sonde mit der höchsten mittleren Expression über alle eingeschlossenen Proben ausgewählt.

GSE116520 umfasste gepaarte Tumor-Kern- und peritumorale Proben von 17 Patienten sowie acht nicht-neoplastische Kontrollen. Die hinterlegten log-transformierten, quantil-normalisierten Expressionsdaten wurden mit limma analysiert. Innerhalb-Patienten-Korrelationen zwischen Tumor-Kern- und peritumoralen Proben wurden mithilfe einer Patienten-Ebene-Blockierung und der Funktion duplicateCorrelation berücksichtigt. Der Vergleich Tumor-Kern versus Kontrolle war der vorab festgelegte Vergleich für die metaanalytische Auswertung über Kohorten hinweg, während die peritumoralen Vergleiche und der geordnete Trend Kontrolle–peritumoral–Tumor-Kern separat bewertet wurden.

Studienbezogene log2-Fold-changes und Standardfehler wurden mithilfe eines random-effects-Modells mit eingeschränkter Maximum-Likelihood-Schätzung und Hartung–Knapp-Inferenz, wie in metafor implementiert, zusammengefasst. Die Heterogenität zwischen den Studien wurde mittels des Cochran-Q-Tests und I2 bewertet. Die gepoolten p-Werte für die vier Zielgene wurden mit der Benjamini–Hochberg-Methode angepasst. Starke transkriptomische Evidenz wurde definiert durch eine Meta-Analyse mit einer falschen Entdeckungsrate (FDR) < 0,05, FDR-Signifikanz auf Ebene der Kohorten in mindestens zwei Datensätzen sowie übereinstimmende Effektrichtungen in allen drei Kohorten.

Virtuelle Einzelzell-Knockout-Analyse

Patientenstammende Smart-seq2-Daten aus GSE131928 wurden verwendet, um die vier MR-replizierten Gene in malignen Zellen zu bewerten. Adulte maligne Zellen wurden gemäß den Anmerkungen der Originalstudie identifiziert, und aus jedem in Frage kommenden Patienten wurden jeweils gleich viele Zellen zufällig ausgewählt, um ein Ungleichgewicht in der Patientenrepräsentation zu minimieren. Ein virtueller Knockout wurde mittels scTenifoldKnk durchgeführt und über fünf unabhängige Durchläufe wiederholt. Gene mit einem mittels Benjamini–Hochberg korrigierten P < 0,05 in einem einzelnen Durchlauf galten als signifikant. Nachgeschaltete Gene, die in mindestens drei der fünf Durchläufe reproduziert wurden, wurden als primärer Konsenssatz definiert, während für die Sensitivitätsanalyse ein strengereres Kriterium von vier aus fünf verwendet wurde. Diese Ergebnisse wurden als rechnergestützte Vorhersagen einer transkriptionellen Störung und nicht als Beleg für eine direkte molekulare Regulation interpretiert.

Funktionelle Anreicherung und Analyse gemeinsamer Netzwerke

Die funktionelle Anreicherungsanalyse wurde unter Verwendung zielgerichteter nachgeschalteter Gene durchgeführt, die in mindestens drei von fünf virtuellen Knockout-Durchläufen reproduzierbar identifiziert wurden. Die Anreicherung von Pfaden in der Gene Ontology (GO), der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) und Reactome wurde mittels einseitiger hypergeometrischer Tests bewertet, wobei die 1.004 Gene, die in die Netzwerkinferenz einbezogen wurden, als Hintergrund-Gen-Set dienten. Die P-Werte wurden für jede Anmerkungsdatenbank einzeln mittels des Verfahrens nach Benjamini–Hochberg korrigiert, und ein adjustierter P < 0,05 galt als statistisch signifikant.

Ein bipartites Netzwerk wurde erstellt, um die Beziehungen zwischen den vier Knockout-Zielen und deren konsensuellen downstream-Genen darzustellen. Gene, die mit mehreren Zielstrukturen assoziiert sind, wurden basierend auf ihrem gemeinsamen Grad identifiziert, und die Überschneidung zwischen zielgruppenspezifischen Gensätzen wurde mithilfe von Schnittmengenanzahlen und Jaccard-Indizes quantifiziert. Die Kanten des Netzwerks repräsentieren Assoziationen zwischen reproduzierbaren computergestützten Störungen und sollten nicht als Hinweis auf direkte molekulare Wechselwirkungen interpretiert werden.

Statistische Analyse und Reproduzierbarkeit

Sofern nicht anders angegeben, waren die statistischen Tests zweiseitig, und multiple Vergleiche wurden mithilfe des Benjamini–Hochberg-Verfahrens kontrolliert. Die spezifischen Signifikanzkriterien für die Analysen sind in den entsprechenden Unterkapiteln beschrieben. Alle Analysen wurden mit R oder Python durchgeführt. Bei randomisierten Verfahren wurden vorab festgelegte Zufallszahlen-Samen verwendet, und der Analysecode, die Softwareversionen sowie detaillierte Parameter-Einstellungen wurden archiviert, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Alle Datensätze wurden zuvor erhoben und anonymisiert; die ethische Genehmigung und die informierte Einwilligung wurden in den ursprünglichen Studien eingeholt.

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Ergebnisse

Auswahl eisenabhängiger Todesweg-bezogener Gene und genetischer Instrumente

Insgesamt wurden 483 Eisensterbe-bezogene Gene aus FerrDb V2 abgeleitet (Abbildung 1). Davon konnten 315 Gene dem eQTLGen-Datensatz zugeordnet werden und wiesen mindestens einen Kandidaten für einen cis-Expressionsquantitativmerkmal-Locus (cis-eQTL) auf. Nach der Kopplungsungleichgewichtsbereinigung verblieben für 250 Gene mindestens drei unabhängige kandidatenbasierte Ins...

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Diskussion

Diese Studie kombinierte genetische Assoziationsanalysen, eine replikationsstadienbasierte Mendelsche Randomisierung (MR), Tumor-Transkriptomik und patientenbasierte Einzelzell-Modellierung, um eisenbedingten Zelltod (Ferroptose) verwandte Gene zu identifizieren, die mit der Anfälligkeit für Glioblastom (GBM) assoziiert sind. Die Untersuchung von 483 kuratierten Genen gegenüber einer GBM-Genomweiten Assoziationsstudie (GWAS), die 6.183 Fälle und 18.169 Kontrollen umfasste, ergab 34 Kandidaten in der Entdeckungsphase, von...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Wettbewerbsinteresse besteht.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Cancer Genomics-Team am Institute of Cancer Research für den Zugang zu den Zusammenfassungsstatistiken der Gliom-GWAS über das European Genome-phenome Archive (Datensatz EGAD00010001657). Die ursprüngliche Erstellung dieser Daten wurde von Cancer Research UK unterstützt, einschließlich des Bobby Moore Fund, des Wellcome Trust und des DJ Fielding Medical Research Trust (C1298/A8362).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BWMRR-PaketBWMRBayessche gewichtete Mendelsche Randomisierung
DESeq2BioconductorVersion 1.46.0RNA-Sequenzierungs-Analyse zur differentiellen Genexpression
FerrDb V2FerrDbVersion 2Quelle für 483 kuratierte Eisen-spezifisch-regulierte Gene
Glioblastom Bulk-MikroarrayNCBI Genexpressions-OmnibusGSE4290Transkriptomische Evaluationskohorte
Zusammenfassende GWAS-Statistiken für GlioblastomEuropäisches Genom-Phänotyp-ArchivEGAD00010001657Datensatz mit kontrolliertem Zugang; 6.183 Fälle und 18.169 Kontrollen
Glioblastom Smart-seq2 Einzelzell-RNA-SequenzierungNCBI Genexpressions-OmnibusGSE131928Einzelzell-Virtual-Knockout-Analyse für maligne Zellen
Bulk-RNA-Sequenzierung von Grad-4-GliomenNCBI Genexpressions-OmnibusGSE196533Transkriptomische Evaluationskohorte
Zusammenfassende cis-eQTL-Statistiken aus Vollblut (GTEx)Genotyp-Gewebe-ExpressionsprojektGTEx V10Expositionsdaten für die Replikationsphase
limmaBioconductorVersion 3.62.2Mikroarray-Analyse zur differentiellen Genexpression
metaforR-PaketVersion 4.8-0Metaanalyse mit zufälligen Effekten
RR Foundation for Statistical ComputingVersion 4.4.2Statistische Berechnungsumgebung
scTenifoldKnkR-PaketVersion 1.0.3Einzelzell-Virtual-Knockout-Analyse
Bulk-Mikroarray von Tumorkern und peritumoralem GewebeNCBI Genexpressions-OmnibusGSE116520Transkriptomische Evaluationskohorte
TwoSampleMRR-PaketVersion 0.6.29Zwei-Stichproben-Mendelsche Randomisierung
Zusammenfassende cis-eQTL-Statistiken aus VollbluteQTLGen-KonsortiumeQTLGenExpositionsdaten für die Entdeckungsphase

Referenzen

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