Standardisierte Immunfluoreszenzbildgebung von tunnelierenden Nanoröhren und mitochondrialem Transfer zwischen Astrozyten und Neuronen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll standardisiert Fixations-, Färbungs- und konfokale Bildgebungsmethoden zur Visualisierung von Tunnel-Nanoröhren und mitochondrialem Transfer zwischen Astrozyten und Neuronen in vitro.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind essentielle Organellen, die die Energieproduktion, die zelluläre Signalübertragung und die metabolische Homöostase in neuronalen Zellen regulieren. Tunnel-Nanoröhren (TNTs) sind dünne, membranartige Strukturen, die die Fernkommunikation zwischen zellulären Stellen vermitteln und den Transfer zellulärer Komponenten, einschließlich Mitochondrien, zwischen verbundenen Zellen erleichtern. Eine zuverlässige Visualisierung von TNTs und mitochondrialem Transfer erfordert eine sorgfältige Probenhandhabung, da diese Strukturen sehr empfindlich und empfindlich gegenüber Fixations-, Wasch- und Bildgebensbedingungen sind. Dieses Protokoll beschreibt standardisierte Verfahren zur Fixierung, Färbung und konfokalen Bildgebung von TNTs in Astrozyten und Astrozyten-Neuron-Kokultursystemen. Der Arbeitsablauf umfasst Membran- und Zytoskelettfärbung zur TNT-Visualisierung, mitochondriale Markierung zur Verfolgung der mitochondrialen Lokalisation sowie Immunfluoreszenzfärbung für die Miro1-Kolokalisationsanalyse. Wichtige Schritte zur Erhaltung der TNT-Morphologie, darunter sanftes Waschen und lichtgeschütztes Handhaben, werden während des gesamten Prozesses betont. Das Protokoll skizziert außerdem bildgebende Ansätze zur Charakterisierung von TNTs und Mitochondrien in festzelligen Präparaten. Diese Methoden bieten einen reproduzierbaren experimentellen Rahmen zur Untersuchung der TNT-Bildung und des mitochondrialen Transfers zwischen neuronalen Zellen in vitro.

Einleitung

Mitochondrien dienen als Energiefabriken der Zelle und liefern die für zelluläre Aktivitäten benötigte Energie durch die Produktion von Adenosintriphosphat und spielen zudem eine wichtige Rolle bei der zellulären Signaltransduktion und dem Redox-Gleichgewicht¹. Im Nervensystem können mitochondriale Metaboliten die Komplexität und Anregbarkeit neuronaler Prozesse erhöhen und so das neuronale Wachstum und die Entwicklung unterstützen². Mitochondrien sind keine statischen Organellen; Sie verändern kontinuierlich ihre Morphologie, ihren Ort und ihre Verteilung, um sich an verschiedene intrazelluläre und extrazelluläre Belastungen und metabolischen Anforderungen^anzupassen. Interzellulärer mitochondrialer Transfer trägt zur Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase bei und fördert die Entwicklung unter physiologischen Bedingungen, während er unter pathologischen Bedingungen an der Schadensreparatur, Immunregulation und Krankheitsprogression beteiligt ist ^4,5.

Die interzelluläre Kommunikation von Materialien und Energie ist für verschiedene biologische Prozesse unerlässlich, darunter zelluläre Homöostase, Gewebereparatur und Regulierung neuronaler Netze. Aktuelle Studien haben mehrere Kommunikationsarten zwischen den Zellulären aufgedeckt, unter denen Tunnel-Nanoröhren (TNTs) einen der am umfangreichsten untersuchten Mechanismen für den interzellulären mitochondrialen Transfer⁶ darstellen. TNTs sind F-Aktin-basierte, brückenartige Membranstrukturen mit einer röhrenförmigen Morphologie, die von 50 bis 200 nm im Durchmesser variiert und sich bis zu mehreren Zelldurchmessern in der^{Länge 7} erstreckt. Forschungen haben gezeigt, dass TNTs als physikalische Verbindungen zwischen neuronalen Zellen dienen können und eng mit dem Beginn und Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen, Hirntumoren und anderen Erkrankungen verbunden sind. So wurde beispielsweise berichtet, dass mitochondriale Übertragungen von Mikroglia zu Neuronen mittels TNTs neuronale Zellen^{retten 8,9}.

Die aktuelle Forschung zu TNTs steht häufig vor mehreren Herausforderungen, darunter die strukturelle Fragilität von TNTs, die sie anfällig für Brüche macht und folglich experimentelle Ergebnisse beeinflussen kann; Schwierigkeiten, TNTs von Filopodien oder anderen Membranvorsprüngen zu unterscheiden; und Herausforderungen bei der genauen Quantifizierung interzellulärer TNTs. Um die Reproduzierbarkeit und Konsistenz von TNT-bezogenen Studien zu verbessern, sind standardisierte Methoden für das Waschen, Fixieren, Färben und Bildgebung von TNTs erforderlich, um eine genaue Bewertung ihrer Struktur und Verteilung zu ermöglichen und gleichzeitig die experimentelle Variabilität zu minimieren. Faktoren wie die Zelldichte vor der Fixierung, Lichtschutz, Waschintensität, Fixierungsdauer und die Färbungsbedingungen nach der Fixierung können alle die Struktur und Stabilität von TNTs beeinflussen. In dieser Studie beschreiben wir Verfahren zur Vorbehandlung, Färbung und konfokalen Bildgebung von TNTs und mitochondrienassoziierten TNT-Strukturen in Astrozyten- und Astrozyten-Neuronenkultursystemen.

Dieses Forschungsprotokoll kann im Allgemeinen auf die meisten Laborumgebungen angewendet werden. Die Validierung bei primären Astrozyten und einer Hippocampus-Zelllinie der Maus bestätigte, dass das Protokoll sowohl für primäre Neuralzellen als auch für unsterbliche Zelllinien geeignet ist. Dieses Protokoll hat jedoch dennoch mehrere Einschränkungen. Die konfokale Mikroskopie bietet eine geringere räumliche Auflösung als superauflösende Bildgebungsmethoden zur TNT-Visualisierung, und die auf MitoTracker basierende Bewertung des mitochondrialen Transfers kann durch Farbstoffleckage und nicht-mitochondriale Signalstörungen¹⁰ beeinflusst werden.

Protokoll

Diese Studie umfasste weder menschliche Probanden noch lebende Wirbeltieren; Es wurden nur kommerziell erworbene oder etablierte Zelllinien verwendet, und es war keine ethische Genehmigung erforderlich.

1. Färbung für TNTs in Astrozyten

1. Zell-Seeding
   1. Samen isolierten primäre Rattenastrozyten am Durchgang 3 (P3) in 35 mm Glasboden-Kulturschalen mit einer Dichte von 5 × 10^{4 Zellen pro} Schale. Fügen Sie 2 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) Complete Medium hinzu, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % dreifacher Antibiotikamischung (Penicillin G, Streptomycin und Amphotericin B). Kultivieren Sie die Zellen bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
   2. Inkubieren Sie die Zellen etwa 24 Stunden, bis die Anhaftung erfolgt.
2. Vorbehandlung und Fixierung
   1. Bringen Sie die Kulturschüsseln nach der Zellanheftung auf eine saubere Bank unter lichtgeschützten Bedingungen.
      HINWEIS: Minimieren Sie unnötige Bewegungen und Vibrationen während der Handhabung, um die Integrität der TNT zu erhalten.
   2. Entfernen Sie das Kulturmedium vorsichtig bei schwachem Licht.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das vollständige Trocknen der Zelloberfläche während der Entfernung des Mediums, da TNTs kollabieren und sich am Kultursubstrat anheften können.
   3. Waschen Sie die Zellen vorsichtig einmal mit 500 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium- und Magnesiumionen (pH 7,3–7,5). Fügen Sie das PBS langsam entlang der Wand der Kulturschale hinzu und entfernen Sie, um eine Störung der interzellulären TNTs beim Waschen zu vermeiden.
   4. Entferne das PBS vorsichtig.
   5. Fixieren Sie die Zellen mit einer kommerziellen 4%-Gewebezellfixierungslösung, die Paraformaldehyd (pH 7,2–7,4) für 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT; 20°C–25°C) unter schwachem Licht enthält.
      VORSICHT: Verwenden Sie fixierende Lösungen mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und führen Sie alle Verfahren gemäß den institutionellen Chemikaliensicherheitsrichtlinien durch.
   6. Entferne die fixierende Lösung.
   7. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
3. Zellpermeabilisierung und fluoreszierende Färbung
   1. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 500 μL einsatzbereiter Triton X-100 Permeabilisierungslösung für 20 Minuten bei RT.
      VORSICHT: Triton X-100 könnte empfindliche TNT-Strukturen stören. Minimieren Sie übermäßige Bewegung während der Permeabilisierung.
   2. Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung.
   3. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
   4. Bereiten Sie die Färbelösung sofort vor der Anwendung vor. Verdünnen Sie den F-Actin-Farbstoff in PBS auf eine Endkonzentration von 1 μM und verwenden Sie 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) als einsatzbereite nukleare Färbung. Mische die beiden Farbstoffe vor der Anwendung gründlich.
      HINWEIS: Phalloidinbasierte Färbereazien können als Alternativen zur F-Aktin-Visualisierung verwendet werden.
   5. Mische die F-Actin- und Kernfärbungslösungen im Verhältnis 1:1 (gleiche Volumen) unter lichtgeschützten Bedingungen.
   6. Fügen Sie die vorbereitete Färbelösung zu den Kulturschalen hinzu.
   7. Inkubiere die Zellen 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln.
   8. Entferne die Flecklösung.
   9. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und 500 μL pro Wasch, jeweils 1 Minute pro Wasch.
   10. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um das Austrocknen der Zellen während der Bildgebungsvorbereitung zu verhindern.
4. Konfokale Bildgebung
   1. Aufnahmen Sie Bilder mit einem Nikon invertierten Konfokalmikroskop, das mit einem ×20-Objektiv ausgestattet ist. Verwenden Sie 405 nm Anregung für DAPI und 488 nm Anregung für F-Aktin-Färbung. Aufnahme von Bildern mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixel unter lichtgeschützten Bedingungen bei RT.
   2. Führen Sie qualitative Bewertungen und manuelle Quantifizierungen mit mindestens fünf zufällig ausgewählten Sichtfeldern pro Stichprobe durch. Quantifizieren Sie die Anzahl der TNTs und die Anzahl der TNT-positiven Zellen, die in jedem Sichtfeld ein oder mehrere TNTs enthalten (Abbildung 1A und 1B).
      HINWEIS: Erstellen Sie Bilder unmittelbar nach der Färbung, um den Fluoreszenzverlust und die strukturelle Zerstörung der TNTs zu minimieren.

Abbildung 1: Fluoreszenzfärbung von Tunnel-Nanoröhren (TNTs) in Astrozyten. (A) Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder, die Kern- und F-Actin-Färbungen in Astrozyten zeigen, die in Glasboden-Kulturschalen kultiviert wurden. (B) Vergrößerte Ansicht des umrahmten Bereichs im Panel A. Weiße Pfeile zeigen TNT-ähnliche Strukturen zwischen benachbarten Zellen. (C) Repräsentative Bilder, die TNT-ähnliche Strukturen zeigen, die nach unsachgemäßer Probenhandhabung zerstört wurden. (D) Vergrößerte Ansicht des umrahmten Bereichs im Panel C. Gelbe Pfeile zeigen zerstörte, TNT-ähnliche Strukturen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Färbung für mitochondriale Übertragung von Astrozyten zu Neuronen mittels TNTs

1. Astrozyten-Säung und mitochondriale Markierung
   1. Samen isolierten primäre Rattenastrozyten am Durchgang 3 (P3) in 35 mm Glasboden-Kulturschalen mit einer Dichte von 3 × 10^{4 Zellen pro} Schale. Fügen Sie 2 ml DMEM/F-12 Complete Medium hinzu, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % dreifacher Antibiotikamischung (Penicillin G, Streptomycin und Amphotericin B). Kultivieren Sie die Zellen bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
   2. Inkubieren Sie die Zellen etwa 24 Stunden, bis die Anhaftung erfolgt.
   3. Bringen Sie die Kulturschalen nach dem Zellanheft auf eine saubere Bank bei schwachem Licht.
      HINWEIS: Minimieren Sie unnötige Bewegungen und Vibrationen während der Handhabung, um die Integrität der TNT zu erhalten.
   4. Entfernen Sie das Kulturmedium vorsichtig unter lichtgeschützten Bedingungen. Vermeiden Sie es, TNTs während der Mittelentfernung zu stören.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das vollständige Trocknen der Zelloberfläche während der Entfernung des Mediums, da TNTs kollabieren und sich am Kultursubstrat anheften können.
   5. Rekonstituere 50 μg lyophilisierten MitoTracker-Farbstoff in Dimethylsulfoxid (DMSO), um eine 1 mM lange Serienlösung herzustellen und die Lagerlösung bei −20°C zu lagern. Vor der Anwendung wird die Serienlösung in 400 μL vollständigem DMEM/F-12-Medium verdünnt, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % dreifacher Antibiotikamischung, um eine endgültige MitoTracker-Konzentration von 50 μM zu erhalten.
      VORSICHT: Schützen Sie fluoreszierende Farbstoffe vor direkter Lichteinwirkung während der Vorbereitung und Inkubationsverfahren.
   6. Fügen Sie die mitochondriale Färbungslösung den Kulturschalen hinzu.
   7. Inkubieren Sie die Zellen bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ für 30 Minuten unter lichtgeschützten Bedingungen.
   8. Entfernen Sie die mitochondriale Färbungslösung unter lichtgeschützten Bedingungen.
   9. Waschen Sie die Zellen vorsichtig einmal mit 500 μL PBS ohne Calcium- und Magnesiumionen (pH 7,3–7,5). Fügen Sie das PBS langsam entlang der Wand der Kulturschale hinzu und entfernen Sie, um eine Störung der interzellulären TNTs beim Waschen zu vermeiden.
   10. Entferne das PBS vorsichtig.
2. Kokultur von Astrozyten und Neuronen
   1. Samen verewigt die neuronalen Neuronenzellen des Mäusehippocampus am Durchgang 3 (P3) in die astrozytenhaltigen Kulturschalen mit einer Dichte von 3 × 10^{4 Zellen pro} Schale. Fügen Sie Zellen in ein Gesamtvolumen von 2 ml hinzu, bestehend aus einer 1:1-Mischung aus DMEM und DMEM/F-12 Complete Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % dreifacher Antibiotikum-Mischung. Stellen Sie die Kokultur mit einer Direktkontaktmethode ohne Transwell-Einsatz her. Kultivieren Sie die Zellen bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
      HINWEIS: Neuronale Zellen vorsichtig hinzufügen, um die Störung bereits vorhandener TNT-Strukturen zu minimieren.
   2. Halten Sie die Kokultur 24 Stunden unter standardisierten Inkubatorbedingungen aufrecht, während Proben während der Handhabung vor unnötiger Lichtbelastung geschützt werden.
3. Fixierung und Permeabilisierung
   1. Entfernen Sie das Kulturmedium unter lichtgeschützten Bedingungen.
   2. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
   3. Fixieren Sie die Zellen mit einer 4%igen Gewebezell-Fixationslösung mit Paraformaldehyd für 30 Minuten bei RT unter schwachen Lichtverhältnissen.
      VORSICHT: Verwenden Sie fixierende Lösungen mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und führen Sie alle Verfahren gemäß den institutionellen Chemikaliensicherheitsrichtlinien durch.
   4. Entferne die fixierende Lösung.
   5. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
   6. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 500 μL einsatzbereiter Triton X-100 Permeabilisierungslösung für 20 Minuten bei RT unter schwachen Lichtverhältnissen.
      VORSICHT: Triton X-100 könnte empfindliche TNT-Strukturen stören. Minimieren Sie übermäßige Bewegung während der Permeabilisierung.
   7. Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung.
   8. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
4. Fluoreszierende Färbung und Bildgebung
   1. Bereiten Sie die Färbelösung sofort vor der Anwendung vor. Verdünnen Sie den F-Actin-Farbstoff in PBS auf eine Endkonzentration von 1 μM und verwenden Sie DAPI als gebrauchsfertige nukleare Färbung. Mischen Sie die Fleckenlösungen vor der Anwendung gründlich.
      HINWEIS: Phalloidinbasierte Färbereazien können als Alternativen zur F-Aktin-Visualisierung verwendet werden.
   2. Mische die F-Aktin- und Kernfärbungslösungen im Verhältnis 1:1 (gleiche Volumen) unter lichtgeschützten Bedingungen unmittelbar vor der Verwendung.
   3. Fügen Sie die vorbereitete Färbelösung zu den Kulturschalen hinzu.
   4. Inkubiere die Zellen 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln.
   5. Entferne die Flecklösung.
   6. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und 500 μL pro Wasch, jeweils 1 Minute pro Wasch.
   7. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um das Austrocknen der Zellen während der Bildgebungsvorbereitung zu verhindern.
   8. Aufnahmen Sie Bilder mit einem Nikon invertierten Konfokalmikroskop, das mit einem ×20-Objektiv ausgestattet ist. Verwenden Sie 405 nm Anregung für DAPI, 488 nm Anregung für F-Aktin-Färbung und 665 nm Anregung für MitoTracker-Färbung. Aufnahme von Bildern mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixel unter lichtgeschützten Bedingungen bei RT.
   9. Führen Sie eine qualitative Bewertung mit mindestens fünf zufällig ausgewählten Sichtfeldern pro Stichprobe durch. Bewertung des Vorhandenseins von TNT-ähnlichen Strukturen und mitochondrienassoziierten Fluoreszenzsignalen innerhalb der interzellulären Membranverbindungen (Abbildung 2A und 2B).
      HINWEIS: Erstellen Sie Bilder unmittelbar nach der Färbung, um den Fluoreszenzverlust und die strukturelle Zerstörung der TNTs zu minimieren.

Abbildung 2: Fluoreszenzfärbung von Mitochondrien und TNTs in einem Astrozyten-Neuron-Kokultursystem. (A) Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder, die nukleäre, mitochondriale und F-Aktin-Färbungen in Astrozyten und Neuronen zeigen, die in Glasboden-Kulturschalen kultiviert wurden. Astrozyten wiesen unregelmäßige sternförmige oder polygonale Morphologien mit ausgedehnten zellulären Prozessen auf, während neuronale Zellen rund oder oval mit schlanken neuritartigen Erweiterungen erschienen. (B) Vergrößerte Ansicht des umrahmten Bereichs im Panel A. Weiße Pfeile zeigen mitochondrienassoziierte, TNT-ähnliche Strukturen zwischen den Zellen. Die beiden Zellpopulationen wurden hauptsächlich anhand ihrer charakteristischen zellulären Morphologie unterschieden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Immunfluoreszenz-Kolokalisationsfärbung für Mitochondrien und Miro1 in TNTs

1. Astrozyten-Säung und mitochondriale Markierung
   1. Samen isolierten primäre Rattenastrozyten am Durchgang 3 (P3) in 35 mm Glasboden-Kulturschalen mit einer Dichte von 3 × 10^{4 Zellen pro} Schale. Fügen Sie 2 ml DMEM/F-12 Complete Medium hinzu, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % dreifacher Antibiotikamischung (Penicillin G, Streptomycin und Amphotericin B). Kultivieren Sie die Zellen bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
   2. Inkubieren Sie die Zellen etwa 24 Stunden, bis die Anhaftung erfolgt.
   3. Bringen Sie die Kulturschalen nach dem Zellanheft auf eine saubere Bank bei schwachem Licht.
      HINWEIS: Minimieren Sie unnötige Bewegungen und Vibrationen während der Handhabung, um die Integrität der TNT zu erhalten.
   4. Entfernen Sie das Kulturmedium vorsichtig unter lichtgeschützten Bedingungen. Vermeiden Sie es, TNTs während der Mittelentfernung zu stören.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das vollständige Trocknen der Zelloberfläche während der Entfernung des Mediums, da TNTs kollabieren und sich am Kultursubstrat anheften können.
   5. Rekonstituieren Sie 50 μg lyophilisierten MitoTracker-Farbstoff in DMSO, um eine 1 mM lange Serienlösung herzustellen, und lagern Sie die Lagerlösung bei −20°C. Vor der Anwendung wird die Serienlösung in 400 μL vollständigem DMEM/F-12-Medium verdünnt, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % dreifacher Antibiotikamischung, um eine endgültige MitoTracker-Konzentration von 50 μM zu erhalten.
      VORSICHT: Schützen Sie fluoreszierende Farbstoffe vor direkter Lichteinwirkung während der Vorbereitung und Inkubationsverfahren.
   6. Fügen Sie die mitochondriale Färbungslösung den Kulturschalen hinzu.
   7. Inkubieren Sie die Zellen bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ für 30 Minuten unter lichtgeschützten Bedingungen.
   8. Entfernen Sie die mitochondriale Färbungslösung unter lichtgeschützten Bedingungen.
   9. Waschen Sie die Zellen vorsichtig einmal mit 500 μL PBS ohne Calcium- und Magnesiumionen (pH 7,3–7,5). Fügen Sie das PBS langsam entlang der Wand der Kulturschale hinzu und entfernen Sie, um eine Störung der interzellulären TNTs beim Waschen zu vermeiden.
   10. Entferne das PBS vorsichtig.
2. Kokultur von Astrozyten und Neuronen
   1. Samen verewigt die neuronalen Neuronenzellen des Mäusehippocampus am Durchgang 3 (P3) in die astrozytenhaltigen Kulturschalen mit einer Dichte von 3 × 10^{4 Zellen pro} Schale. Fügen Sie Zellen in ein Gesamtvolumen von 2 ml hinzu, bestehend aus einer 1:1-Mischung aus DMEM und DMEM/F-12 Complete Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % dreifacher Antibiotikum-Mischung. Stellen Sie die Kokultur mit einer Direktkontaktmethode ohne Transwell-Einsatz her. Kultivieren Sie die Zellen bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
      HINWEIS: Neuronale Zellen vorsichtig hinzufügen, um die Störung bereits vorhandener TNT-Strukturen zu minimieren.
   2. Halten Sie die Kokultur 24 Stunden unter standardisierten Inkubatorbedingungen aufrecht, während Proben während der Handhabung vor unnötiger Lichtbelastung geschützt werden.
3. Fixierung und Permeabilisierung
   1. Entfernen Sie das Kulturmedium unter lichtgeschützten Bedingungen.
   2. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
   3. Fixieren Sie die Zellen mit einer kommerziellen 4%-Gewebezell-Fixationslösung mit Paraformaldehyd (pH 7,2–7,4) für 30 Minuten bei RT unter schwachen Lichtbedingungen.
      VORSICHT: Verwenden Sie fixierende Lösungen mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und führen Sie alle Verfahren gemäß den institutionellen Chemikaliensicherheitsrichtlinien durch.
   4. Entferne die fixierende Lösung.
   5. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
   6. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 500 μL einsatzbereiter Triton X-100 Permeabilisierungslösung für 20 Minuten bei RT unter schwachen Lichtverhältnissen.
      VORSICHT: Triton X-100 könnte empfindliche TNT-Strukturen stören. Minimieren Sie übermäßige Bewegung während der Permeabilisierung.
   7. Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung.
   8. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
4. Blockierung und Immunfluoreszenzfärbung
   1. Blockiere die Zellen mit 5%-Ziegenserum für 1 Stunde bei RT bei schwachem Lichtverhältnis. Bereiten Sie die Blocklösung vor, indem Sie das Ziegenserum 1:20 in PBS verdünnen.
   2. Entferne die Blocklösung.
   3. Verdünne den monoklonalen Anti-Miro1-Antikörper des Kaninchens in PBS mit einem Verdünnungsverhältnis von 1:100. Geben Sie die verdünnte primäre Antikörperlösung zu den Kulturschalen und bebrüten Sie sie über Nacht (12–16 H) bei 4°C.
      HINWEIS: Schützen Sie fluoreszierend markierte Proben während des Färbeverfahrens vor direkter Lichteinwirkung.
   4. Entferne die primäre Antikörperlösung.
   5. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und 500 μL pro Wasch, jeweils 1 Minute pro Wasch.
   6. Verdünnen Sie den fluoreszierenden Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in PBS mit einem Verdünnungsverhältnis von 1:100. Fügen Sie 500 μL verdünnte sekundäre Antikörperlösung zu jeder Kulturschale hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde unter lichtgeschützten Bedingungen.
      HINWEIS: Eine Kontrolle ohne primäre Antikörper wurde in der vorliegenden Studie nicht einbezogen. Künftige Experimente sollten geeignete Immunfluoreszenzkontrollen enthalten, um die Färbungsspezifität weiter zu validieren.
   7. Entferne die fluoreszierende sekundäre Antikörperlösung.
5. Fluoreszierende Gegenfärbung und Bildgebung
   1. Bereiten Sie die Färbelösung sofort vor der Anwendung vor. Verdünnen Sie den F-Actin-Farbstoff in PBS auf eine Endkonzentration von 1 μM und verwenden Sie DAPI als gebrauchsfertige nukleare Färbung. Mischen Sie die Fleckenlösungen vor der Anwendung gründlich.
      HINWEIS: Phalloidinbasierte Färbereazien können als Alternativen zur F-Aktin-Visualisierung verwendet werden.
   2. Gib die Färbungslösung zu den Kulturschalen.
   3. Inkubiere die Zellen 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln.
   4. Entferne die Flecklösung.
   5. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und 500 μL pro Wasch, jeweils 1 Minute pro Wasch.
   6. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um das Austrocknen der Zellen während der Bildgebungsvorbereitung zu verhindern.
   7. Aufnahmen Sie Bilder mit einem Nikon invertierten Konfokalmikroskop, das mit einem ×20-Objektiv ausgestattet ist. Sammeln Sie Z-Stack-Bilder mit einer Schrittweite von 5 μm über einen gesamten Bildgebungsbereich von 40 μm (8 optische Abschnitte). Verwenden Sie 405 nm Anregung für DAPI, 488 nm Anregung für F-Aktin-Färbung, 594 nm Anregung für Miro1-Immunfärbung und 665 nm Anregung für MitoTracker-Färbung. Aufnahme von Bildern mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixel unter lichtgeschützten Bedingungen bei RT.
   8. Führen Sie eine qualitative Bewertung mit mindestens fünf zufällig ausgewählten Sichtfeldern pro Stichprobe durch. Bewerten Sie TNT-ähnliche Strukturen, mitochondrienassoziierte Fluoreszenzsignale und die scheinbare Kolokalisierung zwischen Miro1- und mitochondrienassoziierter Färbung innerhalb der interzellulären Membranverbindungen (Abbildung 3A–3C).
      HINWEIS: Erstellen Sie Bilder unmittelbar nach der Färbung, um den Fluoreszenzverlust und die strukturelle Zerstörung der TNTs zu minimieren.

Abbildung 3: Kolokalisationsfärbung von Mitochondrien und Miro1 in TNTs in einem Astrozyten-Neuron-Kokultursystem. (A) Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder, die nukleäre, mitochondriale, Miro1- und F-Aktin-Färbungen in Astrozyten und Neuronen zeigen, die in Glasboden-Kulturschalen kultiviert wurden. Weiße Pfeile zeigen Bereiche scheinbarer Kolokalisierung zwischen mitochondrienassoziierten Signalen und Miro1 innerhalb TNT-ähnlicher Strukturen. (B) Dreidimensionales rekonstruiertes Z-Stack-Bild, das TNT-ähnliche Strukturen zwischen benachbarten Zellen zeigt. (C) Seitliche Rekonstruktion desselben Z-Stack-Bildes, das TNT-ähnliche Strukturen zwischen benachbarten Zellen zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

In Astrozyten-Monokulturpräparaturen wurden dünne Membranvorsprünge beobachtet, die benachbarte Zellen verbinden, nachdem F-Actin und Kernfärbungen (Abbildung 1A und 1B) gebildet wurden (Abbildung 1A und 1B). Mehrere TNT-ähnliche Strukturen wurden zwischen benachbarten Astrozyten entdeckt, und einzelne Astrozyten bildeten häufig Verbindungen zu mehreren umliegenden Zellen. Die erfolgreiche Erhaltung von TNT-ähnlichen Strukturen war mit sanfter Handhabung während der Wasch- und Fixierungsverfahren verbunden. Übermäßige mechanische Störungen während der Entfernung oder Waschung des Mediums führten zu einer verminderten Nachweisbarkeit und struktureller Störung dieser Membranverbindungen, wie bei zerstörten TNT-ähnlichen Strukturen nach unsachgemäßer Probenhandhabung gezeigt wurde (Abbildung 1C und 1D).

In Astrozyten-Neuron-Kokulturpräparaten wurden mitochondrienassoziierte Fluoreszenzsignale in TNT-ähnlichen Strukturen beobachtet, die benachbarte Zellen nach MitoTracker-Färbung und konfokaler Bildgebung verbinden (Abbildung 2A und 2B). Diese Strukturen wurden zusammen mit F-Aktin und Kernfärbung visualisiert, um die morphologische Bewertung TNT-ähnlicher Verbindungen zu unterstützen. Richtiger Lichtschutz und minimierte Waschintensität verbesserten die Erhaltung des Fluoreszenzsignals und der TNT-Morphologie während der Bildgebungsvorbereitung.

In Immunfluoreszenz-Kolokalisationsexperimenten wurden überlappende Fluoreszenzsignale, die mitochondrienassoziierter Färbung und Miro1-Immunfärbung entsprechen, in TNT-ähnlichen Strukturen in Astrozyten-Neuron-Kokulturpräparaten beobachtet (Abbildung 3A). Diese Beobachtungen deuten auf eine mögliche Verbindung zwischen Miro1 und Mitochondrien hin, die in TNT-ähnlichen Strukturen lokalisiert sind. Dreidimensionale rekonstruierte Z-Stack-Bildgebung unterstützte zudem das Vorhandensein von TNT-ähnlichen Strukturen, die sich zwischen benachbarten Zellen erstrecken (Abbildung 3B und 3C). TNT-Erhaltung, Fluoreszenzsignalintensität und Bildqualität wurden durch Fixations-, Permeabilisierungs- und Bildgebende Bedingungen beeinflusst.

Diskussion

Der erste entscheidende Schritt im oben beschriebenen experimentellen Protokoll ist die lichtgeschützte Vorbehandlung vor der Fixierung. TNT-ähnliche Strukturen sind hochempfindlich, und die Aufrechterhaltung lichtgeschützter Bedingungen nach der Entnahme aus dem Inkubator ist wichtig, um die Fluoreszenzsignalintensität und strukturelle Integrität während der Probenvorbereitung zu erhalten. Der zweite entscheidende Schritt ist die Durchführung einer PBS-Reinigung mit sanfter Manipulation, um die Störung von TNT-ähnlichen Strukturen durch Flüssigkeitsfluss zu minimieren. Die Einhaltung dieser wichtigsten Handhabungsverfahren hilft, die Morphologie und Stabilität TNT-ähnlicher Strukturen zu erhalten und verbessert die Konsistenz der nachfolgenden Bildgebungsergebnisse. Übermäßige Aspiration, langanhaltendes Waschen oder starke Flüssigkeitsbewegung können während der Probenbearbeitung zum Kollaps oder Fragmentierung von TNT-ähnlichen Strukturen führen. Aufgrund ihrer hochdynamischen Natur sind TNTs lichtempfindlich. Phototoxizität, die durch Lichtbelichtung induziert wird, kann TNT-Störungen verursachen, wodurch diese Strukturen schwer sichtbar werden^können. Daher sollten während TNT-bezogener Experimente lichtgeschützte Bedingungen aufrechterhalten werden.

Die intrazelluläre mitochondriale Bewegung trägt zur zellulären Energieverteilung bei, insbesondere in Neuronen. Studien haben gezeigt, dass Mitochondrien sich entlang von Aktinfilamenten und Mikrotubuli^{bewegen können}. Neuere Studien haben außerdem gezeigt, dass TNTs als Fernverbindungsstrukturen zwischen zellulären Systemen fungieren können, die mit mitochondrialem Transfer zwischen neuronalen Zellen¹³ verbunden sind. Der in dieser Studie beschriebene methodische Ansatz ermöglicht die Visualisierung von TNT-ähnlichen Strukturen und mitochondrienassoziierten Fluoreszenzsignalen in neuronalen Zellkultursystemen. Frühere Studien haben gezeigt, dass der interzelluläre mitochondriale Transfer zwischen neuronalen Zellen zur Gewebereparatur und neuroprotektiven Prozessen bei neurologischen Erkrankungen wie Parkinson und zerebraler ischämischer Verletzung^14,15 beitragen kann. Mit den in dieser Studie beschriebenen Methoden wurden TNT-ähnliche Strukturen zwischen Astrozyten und zwischen Astrozyten und Neuronen beobachtet, zusammen mit mitochondrienassoziierten Fluoreszenzsignalen, die innerhalb dieser Strukturen lokalisiert sind.

Wie in früheren Studien¹⁰ festgestellt wurde, unterliegt die Färbung von MitoTracker Farbstofflecks und nicht-mitochondrialer Signalübertragung, was die Datenzuverlässigkeit verringern kann. Um diese Einschränkung zu beheben, sollten zukünftige Untersuchungen robustere Methoden wie genetisch kodierte mitochondriale Markierung einsetzen, um schlüssigere Ergebnisse zu erzielen. Unter den aktuellen experimentellen Bedingungen wurden die beiden Zelltypen hauptsächlich anhand der zellulären Morphologie unterschieden, ein Ansatz, der die Spezifität der Zelltypidentifikation verringern könnte. Zukünftige Studien sollten zelltypspezifische fluoreszierende Markierung einbeziehen, um die Genauigkeit der Kokulturanalyse zu verbessern. Miro1 ist ein Adaptorprotein, das auf die äußere mitochondriale Membran lokalisiert ist und an mitochondrialen Transportprozessen in Neuronen^16,17 beteiligt ist. Mit dem in dieser Studie beschriebenen Immunfluoreszenz-Kolokalisationsprotokoll wurden überlappende Fluoreszenzsignale, die der mitochondrienassoziierten Färbung und der Miro1-Immunfärbung entsprechen, in TNT-ähnlichen Strukturen beobachtet. Diese Beobachtungen deuten auf eine mögliche Verbindung zwischen Miro1 und Mitochondrien hin, die in TNT-ähnlichen Strukturen lokalisiert sind. Die räumliche Auflösung der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie kann jedoch die endgültige Beurteilung der molekularen Kolokalisation innerhalb dünner Membranvorsprünge einschränken.

Wir führten Z-Stack-Bildgebung durch, um das Vorhandensein von TNT-ähnlichen Strukturen zwischen den Zellen zu bestätigen und so die strukturelle Validierung dieser Membranverbindungen zu unterstützen. Während das vorliegende Protokoll für die meisten experimentellen Umgebungen geeignet ist, kann die konfokale Bildgebung fixierter Zellen während der Probenverarbeitung im Vergleich zur Live-Cell-Bildgebung zum Verlust fragiler, TNT-ähnlicher Strukturen führen und so die genaue TNT-Quantifizierung¹⁸ einschränken. Darüber hinaus ermöglicht die Bildgebung fixierter Zellen keine eindeutige Bestimmung der Richtung des mitochondrialen Transfers, was weitere Untersuchungen in zukünftigen Studien rechtfertigt. Dieses Protokoll bietet einen standardisierten experimentellen Workflow zur Färbung von TNT-ähnlichen Strukturen, mitochondrienassoziierten Signalen und verwandten Proteinen in neuronalen Zellkultursystemen. Im Vergleich zu unkontrollierten Wasch- und Fixierungsverfahren legt das Protokoll besonderen Wert auf sanfte Probenhandhabung und Erhaltung der Fluoreszenz bei der Bildgebensvorbereitung. Diese Methoden können dazu beitragen, die experimentelle Konsistenz und Reproduzierbarkeit in TNT-bezogenen Bildaufnahmen zu verbessern.

Zusammenfassend bietet diese Studie ein praktisches und breit anwendbares Laborprotokoll zur qualitativen Bewertung von TNTs und zur Untersuchung des mitochondrialen Transports über TNT-ähnliche Strukturen. Allerdings können Probenverarbeitungsschritte wie Fixierung und Waschen im Vergleich zu Live-Cell-Bildgebungsmethoden eine Quantifizierungsvariabilität verursachen. Darüber hinaus bietet die konfokale Mikroskopie eine geringere räumliche Auflösung als die Superauflösungsmikroskopie, was die detaillierte strukturelle Charakterisierung von TNTs einschränkt. Darüber hinaus wird die mitochondriale Färbung auf MitoTracker-Basis durch Farbleckage und unspezifische Signalübertragung beeinflusst, was in zukünftigen Studien zur Verbesserung der experimentellen Genauigkeit berücksichtigt werden sollte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1% Dreifachantibiotikamischung	Biosharp	BL142A	Verhindert bakterielle und pilzliche Kontamination während der Zellkultur
4% Gewebezell-Fixiermittel	Solarbio	P1110	Zellfixierungsmittel
Anti-Miro1-Antikörper	Abcam	AB319154	Primärantikörper gegen Miro1
Astrozyten	Laborisolierte Primärzellen	N/A	Astrozyten wurden aus dem Großhirnkortex von neonatalen SD-Rattenküken im Alter von 1–3 Tagen isoliert. Die Reinheit der isolierten Zellen wurde durch GFAP-Färbung bestätigt, und für alle Experimente wurden Zellen des dritten Passages (P3) verwendet
Astrozytenzellkulturmedium (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	DMEM und F-12 wurden im Verhältnis 1:1 (v/v) gemischt, mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Dreifachantibiotika ergänzt
Konfokalmikroskop	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	Bilder wurden mit einem Nikon AX Konfokalmikroskop (Nikon Corporation, Japan) aufgenommen, gesteuert durch NIS-Elements (Version 5.4)
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	Kernfärbemittel
DMSO	BioFroxx	1084ML100	Lösungsmittel zur Herstellung von fluoreszierenden Farbstoffstammlösungen
F-Aktin-Färbemittel	Thermo Fisher Scientific	A57243	F-Aktin-Färbemittel zur Visualisierung von Zytoskelettstrukturen und Tunnelnanoröhren
Fötales Rinderserum	ExCell Bio	FSD500	Liefert essentielle Nährstoffe für die Zellkultur
Fluoreszierende Sekundärantikörper (Geiss-Anti-Kaninchen IgG)	ABclonal	AS039	Sekundärantikörper für Immunfluoreszenzfärbung
Glasboden-Zellkulturschale	NEST	801001	Bildgebungsschale für Konfokalmikroskopie
Geissserum	Solarbio	210C051	Blockierungsmittel für Immunfluoreszenzfärbung
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondriale Färbemittel
Neuronen	Zellbank der CAS	HT22-GNM47	Verewigte Maus-hippocampale Neuronenzellen wurden in DMEM-Vollmedium gehalten. Zellen im dritten Passage (P3) wurden gesammelt und für nachfolgende Experimente verwendet.
Neuronenzellkulturmedium (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	DMEM, ergänzt mit GlutaPlus und Natriumpyruvat, ohne HEPES, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Dreifachantibiotika
Phosphat-gepuffertes Salz (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	Wäschepuffer, verwendet während Fixierung und Färbung
Triton X-100	Solarbio	P1080	Zellpermeabilisierungsreagenz