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Methodenartikel

Isolierung von Hirnmikroglia zur Untersuchung der Persistenz des Humanen Immundefizienz-Virus-1

230 Aufrufe

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DOI:

10.3791/71673

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18. September 2026

 ,  ,  , 
1UNC HIV Cure Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Infectious Diseases at the Department of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biochemistry & Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Reinigung und Kultur hochreiner humaner myeloischer Zellen/Mikroglia aus Gehirngewebe von Schnellautopsien postmortaler Proben von Personen mit und ohne humane Immundefizienzvirus-1 (HIV-1). Es bietet eine robuste ex vivo-Plattform zur Untersuchung der Biologie myeloischer Zellen/Mikroglia, des HIV-Reservoirs im Gehirn, der Neuroinflammation sowie von Strategien zur Heilung von HIV.

Zusammenfassung

Wir haben ein robustes Protokoll etabliert und optimiert, um primäre humane myeloide Zellen des Gehirns (BrMCs) aus postmortalen Gehirngeweben von Personen mit oder ohne HIV-1 (HIV) zu isolieren, zu kultivieren und zu untersuchen, die im Rahmen einer Schnellautopsie gewonnen wurden, wobei >97,3 % der BrMCs sind Mikrogliazellen (MG) des Gehirns. Daher bezeichnen wir diese isolierten BrMCs als MG bzw. BrMCs/MG, um die Zellpopulationen besser widerzuspiegeln. Diese Methode ermöglicht eine umfassende ex vivo Untersuchung der Mikroglialbiologie, einschließlich ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung von HIV-Reservoiren im Gehirn, der Vermittlung von Neuroinflammation und der Beteiligung an neuronaler Schädigung, sowie Bewertung von Strategien zur Heilung von HIV.

Um die Zellviabilität und die Integrität von RNA und Protein zu bewahren, wurden Gehirngewebe innerhalb von 6 h nach dem Tod im Anschluss an eine schnelle Forschungsautopsie entnommen. Mehrere Regionen, darunter die frontalen, parietalen und okzipitalen Kortizes, der Hippocampus und die Basalganglien, wurden mittels enzymatischer Verdauung und kontrollierter mechanischer Dissoziation sowie anschließender Dichtegradientenzentrifugation aufgearbeitet. Dichtegradientenzentrifugation zur Erzeugung lebensfähiger Einzelzell-Suspensionen mit effizienter Entfernung von Myelintrümmern und Erythrozytenlyse. BrMCs/MG wurden anschließend mittels eines zweistufigen Isolationsverfahrens gereinigt, das aus der CD3-⁺ T-Zell-Depletion gefolgt von CD11b⁺ magnetische Bead-Anreicherung zur Sicherstellung von Reinheit und Spezifität

Gereinigte myeloide Zellen wurden unter definierten Bedingungen mit Zugabe von M-CSF kultiviert, um die Vitalität und funktionelle Integrität während einer langen ex vivo-Kultur zu erhalten. Diese optimierte Plattform bietet eine zuverlässige und skalierbare Grundlage für molekulare, immunologische und virologische Analysen von HIV-Reservoiren im Gehirn sowie verwandter Mechanismen in BrMCs/MG.

Einleitung

Hirnmyeloide Zellen (BrMCs)/Mikroglia sind die wichtigsten angeborenen Immunzellen im zentralen Nervensystem (ZNS)1,2,3. Unter gesunden Bedingungen überwachen sie ständig das Gehirn und unterstützen bei Aufgaben wie der synaptischen Beschneidung, der Beseitigung von Zelltrümmern und der Unterstützung von Neuronen4,5,6. Bei Krankheitszuständen werden Mikroglia immunologisch aktiviert, was zu Neuroinflammation führt und eine wesentliche Rolle bei der Neurodegeneration in verschiedenen ZNS-Erkrankungen spielt7,8,9. Während einer HIV-1-(HIV-)Infektion stellen BrMCs/Mikroglia zusammen mit ZNS-T-Zellen und möglicherweise Astrozyten das wichtigste HIV-Reservoir im Gehirn dar; letztere spielen vermutlich nur eine untergeordnete Rolle bei HIV-Reservoiren im ZNS. Mikroglia beherbergen latent infiziertes, integriertes provirales HIV-DNA, zeigen jedoch trotz effektiver antiretroviraler Therapie (ART) nur eine geringe Expression von HIV-RNA10,11,12. Eine persistierende HIV-Infektion in BrMCs/Mikroglia führt zu chronischer Entzündung und ist mit der HIV-assoziierten neurokognitiven Störung (HAND) assoziiert, auch unter moderner ART, was sich in kognitiven, Verhaltens- und motorischen Symptomen bei bis zu 50 % der Menschen mit HIV (PWH) zeigt13,14,15,16. Daher ist das Verständnis der Funktion persistierend HIV-infizierter Mikroglia einer der Schlüssel, um die molekularen Mechanismen der HIV-Infektion und -Latenz, die Wechselwirkungen zwischen Mikroglia, Astrozyten und anderen ZNS-Zellen, neuronale Schädigungen sowie den Krankheitsverlauf von HAND zu erforschen, was entscheidend ist, um Behandlungsziele gegen neuroHIV zu identifizieren11,12,17.

Es gibt jedoch technische Herausforderungen bei der Untersuchung von Mikrogliazellen an menschlichem postmortalen Gehirngewebe. Ein hoher Myelingehalt, insbesondere in der weißen Substanz, kann Zellen einfangen und Filter verstopfen, wodurch die Zellausbeute sinkt, es sei denn, das Myelin wird vor der immunmagnetischen Selektion entfernt18,19. Nach dem Tod von PWH können Oberflächenmarker der Zellen, wie TMEM119 und P2RY12, abgebaut werden, wodurch die genaue Identifizierung von Mikrogliazellen erschwert wird20,21. Außerdem weisen myeloide Zellen in HIV-infizierten Gehirnen periphere Monozyten und gewebe-residente Makrophagen auf, die einige gemeinsame Marker mit Mikrogliazellen teilen; daher sind zusätzliche Schritte erforderlich, um eine reine Population von BrMCs, insbesondere von Mikrogliazellen, anzureichern22,23.

Aktuelle Ansätze zur Isolierung menschlicher Mikroglia eignen sich nicht gut für HIV-infizierte postmortale Gewebe. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung liefert umfassende Ergebnisse, erfordert jedoch teure Geräte, ist zeitaufwändiger und ergibt eine geringe Zellausbeute aus kleinen Mengen wertvollen menschlichen Hirngewebes24,25. Die Immunpanning-Methode ist spezifisch, kann aber nicht viele Proben aus verschiedenen Hirnregionen gleichzeitig verarbeiten und benötigt eine lange Inkubationszeit, was für postmortales Gewebe ungeeignet ist, das nach einem Übernacht-Transport schnell bearbeitet werden muss26,27. Außerdem ermöglicht keine dieser Methoden die Gewinnung sowohl von T-Lymphozyten als auch von myeloischen Zellen aus derselben Probe, was notwendig wäre, um eine vollständige Immuncharakterisierung HIV-infizierter ZNS-Zellen durchzuführen17,28.

Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare, zuverlässige und effiziente Methode zur Isolierung und Anreicherung von Mikroglia und anderen Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) aus postmortalen menschlichen Hirngeweben von HIV-infizierten Personen. Eine kontrollierte mechanische Dissoziation in Kombination mit einer schonenden enzymatischen Verdauung (z. B. TrypLE Express und DNase I) erhält die Oberflächenantigene weitgehend und minimiert die Zellaggregation29,30. Die Entfernung von Myelin erfolgt durch Dichtegradientenzentrifugation über Percoll, gefolgt von der immunmagnetischen Trennung von CD3⁺-T-Zellen und CD11b⁺-Myeloidzellen31,32. Wichtig ist, dass die Verwendung milder enzymatischer Bedingungen entscheidende Myeloidmarker wie CD11b und CD68 sowie mikrogliaspezifische Biomarker wie TMEM119 und P2RY12 erhält und somit eine präzise Charakterisierung der ZNS-Zellen sowie Analysen nachgeschalteter Signalwege ermöglicht33. Der zweistufige Selektionsansatz liefert zudem eine hochreine Fraktion von CD3⁺-T-Zellen, die für virologische und immunologische Untersuchungen geeignet ist. Dies ist im Kontext von NeuroHIV von besonderer Bedeutung, da T-Zellen eine Rolle im viralen ZNS-Reservoir spielen und an der HIV-assoziierten neurologischen Schädigung beteiligt sind, die nach dem Einwandern von T-Zellen ins Gehirn auftritt34,35.

Insgesamt verbessert dieser zweistufige, sequenzielle Ansatz – zunächstige Depletion von CD3⁺ T-Zellen, gefolgt von der Anreicherung von CD11b⁺ myeloischen Zellen aus der CD3-negativen Fraktion – sowohl die Zellreinheit als auch die Ausbeute an ZNS-Zellen, während gleichzeitig der Einsatz dieser wertvollen, begrenzten und kostbaren Gewebeproben maximiert wird. Die isolierten Zellen eignen sich für eine breite Palette nachgeschalteter Anwendungen, einschließlich Bulk- und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Durchflusszytometrie, funktionelle Assays und virologische Analysen, wie die Quantifizierung von HIV-DNA/RNA sowie virale Auswuchs-Assays zur Bestimmung der replikationsfähigen viralen Reservoire in im ZNS ansässigen Immunzellen17,36,37.

Dieses Protokoll ist mit Laboren kompatibel, die für die Bearbeitung von postmortalen Hirngeweben unter BSL-2+-Bedingungen ausgestattet sind, da viele PWH unter ART-Suppression stehen oder nur kurzfristig am Lebensende von der ART unterbrochen werden. Es erfordert lediglich Standardplattformen für die immunmagnetische Trennung und Durchflusszytometrie, um die Spezifität von BrMCs/Mikroglia nach der Isolierung zu überprüfen. Mit geringfügigen Modifikationen kann es auch zur Untersuchung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Alzheimer-Krankheit, multipler Sklerose, Long COVID19 und traumatischer Hirnverletzung38,39,40 angepasst werden. Dieses Protokoll wurde außerdem für die Isolierung von Gehirnzellen aus SIVmac251- oder SIVmac239-infizierten nichtmenschlichen Primaten (NHPs)12,41 sowie aus humanisierten Mausmodellen der HIV-Infektion oder -Latenz optimiert und bietet damit ein physiologisch relevantes Modell der HIV-Infektion im Gehirn. Im Gegensatz zu menschlichen Gehirnen sind diese Tiermodelle leichter zugänglich und stellen eine wertvolle ergänzende Ressource für mechanistische und translationsorientierte Studien zur HIV-Infektion, HIV-Latenz und assoziiertem neuroHIV dar.

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Protokoll

HINWEIS: Alle humanen und NHP-Gewebeproben unter BSL-2-Bedingungen behandeln. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Kittel, Handschuhe, Maske und Gesichtsschutz, bei der Behandlung mit Percoll, ACK-Puffer und DMSO. Entsorgen Sie chemische und biologische Abfälle gemäß den institutionellen Richtlinien. Spülen Sie alle Einweggeräte, die während der Gewebe-Dissociation verwendet wurden – beispielsweise Skalpelle, Pipetten und Petrischalen – mit 10 % Bleichmittel aus, bevor Sie sie in Bioabfallsäcken entsorgen. Spülen Sie wiederverwendbare Geräte wie Pinzetten und Scheren mit 10 % SDS ab, bevor Sie sie waschen und autoklavieren.

1. Sammlung von Gehirngewebe

  1. Menschliche Proben
    HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten menschlichen Gewebe wurden gemäß Protokollen beschafft, die von der Institutional Review Board (IRB) der University of California, San Diego (UCSD; IRB Nr. 160563)12 genehmigt wurden. Die menschlichen Spender waren Personen mit HIV, die eine antiretrovirale Therapie (ART) erhielten. Wichtige Merkmale der Spender, einschließlich Alter, Geschlecht, postmortaler Intervall (PMI) und ART-Status, werden hier kurz zusammengefasst; diese Spendermerkmale wurden bereits in einer früheren Veröffentlichung ausführlich beschrieben12.
    1. Sammlung des Gewebes innerhalb von ≤6 h nach dem Tod , um die Zellviabilität und die RNA-Integrität zu bewahren, und Versand an das Verarbeitungslabor innerhalb von 24 h.
  2. NHP-Proben
    HINWEIS: Rhesusmakaken (Macaca mulatta) wurden im Emory National Primate Research Center (ENPRC, PROTO201700286) oder im California National Primate Research Center (CNPRC, UCD IACUC #22832) gehalten. Die Tierpflege und experimentellen Verfahren wurden gemäß den Vorschriften der jeweiligen Institutional Animal Care and Use Committees (IACUCs) durchgeführt und entsprachen den institutionellen und bundesweiten Richtlinien. Alle Einrichtungen zur Tierpflege sind vom US-Landwirtschaftsministerium und der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditiert.
    1. Sammlung des Gewebes unmittelbar nach der Sektion12.
  3. Gewebesammlung
    HINWEIS: Alle Handhabungen in vorab gekühlten Wägebooten auf Eis durchführen.
    1. Sammlung von 2–20 g pro Hirnregion (z. B. frontaler, parietaler, okzipitaler Kortex, Hippocampus, Basalganglien), abhängig von der Gewebeverfügbarkeit.
    2. Gewebeproben in eiskaltes DMEM/F12 überführen, ergänzt mit ART: 100 nM Nevirapin, 200 nM Raltegravir, 25 nM Darunavir. Die Proben bei 4 °C lagern.
  4. Transportbedingungen
    1. Proben in verschlossenen Röhrchen bei 4 °C auf Eis lagern.
    2. Transport der Röhrchen durch zertifiziertes Personal gemäß UN3373-Kategorie-B-Vorschriften12. Übernachtversand auf Eis an das Verarbeitungslabor.

2. Gewebevorbereitung

  1. Überführen Sie das Gewebe in 50-mL-Röhrchen. Waschen Sie das Gewebe 10–15 Mal, indem Sie die Röhrchen vorsichtig mit 20–40 mL kaltem HBSS mit DNase (10 U/mL) umdrehen, bis der Überstand klar ist.
    ANMERKUNG: Dadurch werden Blut, Gewebereste und Kontaminationen entfernt. Stellen Sie sicher, dass das Volumen ausreicht, damit die Gewebestücke beim Waschen frei beweglich sind.
  2. Entfernen und verwerfen Sie die Hirnhäute und großen Gefäße mithilfe steriler Pinzetten.
  3. Überführen Sie das Gewebe in eine neue Petrischale und notieren Sie das Gewicht des Gewebes (ohne Behältnis) nach Gehirnregionen.
  4. Zerreißen Sie das Gewebe mit einem sterilen Paar Pinzetten in etwa 10 mL HBSS + DNase I (10 U/mL) zu Fragmenten von ca. 1–2 mm Größe.
    ANMERKUNG: Das Zerkleinern kann in der Petrischale mit einem Skalpell erfolgen.

3. Enzymatische Verdauung

  1. Bereiten Sie die Verdauungslösung vor, indem Sie 10 mL 1x rekombinantes Zell-Dissociationsenzym und DNase I (endgültig 10 U/mL) mischen.
  2. Erwärmen Sie den Rotationsschüttler auf 37 °C vor und stellen Sie das rekombinante Zell-Dissociationsenzym mit DNase I (endgültig 10 U/mL) in einen 37 °C-Inkubator.
  3. Überführen Sie das Gewebe in der Verdauungslösung aus Schritt 3.1 in Kolben (T150 bei Volumina > 50 mL; kleinere Kolben bei < 50 mL) und inkubieren Sie es in Rotationsschüttlern unter folgenden Bedingungen: 37 °C, 150 U/min, 30 min.
  4. Resuspendieren Sie vorsichtig mit einer 10-mL- und anschließend mit einer 5-mL-Pipette durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.
    ​HINWEIS: Vermeiden Sie aggressives Pipettieren.
  5. Inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur, damit sich das Gewebe absetzen kann.
  6. Zellgewinnung
    1. Sammeln Sie den Überstand in einem 50-mL-Röhrchen; dies ist Gewinnung #1. Geben Sie 10 % FBS zum gesammelten Überstand hinzu, um die Enzymaktivität zu stoppen.
    2. Resuspendieren Sie das verbleibende Gewebe in HBSS + DNase I (10 U/mL) + 10 % FBS (10 mL/g Gewebe). Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab und filtrieren Sie durch 70–100 µm-Siebe.
      ​HINWEIS: Bei ausreichendem enzymatischen Verdau sollte das gesamte Gewebe durch das Sieb passieren.
    3. Zentrifugieren Sie bei 500 × g, Raumtemperatur, 10 min; dies ist Gewinnung #2.
      HINWEIS: Um die Ausbeute zu maximieren, lassen Sie die Suspension absetzen und überführen Sie nur den Überstand in ein neues Röhrchen.
  7. Endverarbeitung
    1. Zentrifugieren Sie die Gewinnungen (C1 und C2) bei 500 × g für 10 min.
    2. Entfernen Sie die Überstände. Vereinigen Sie die Zellpellets aus C1 und C2 in einem einzigen Röhrchen.

4. Entfernung von Myelingebäck (Percoll-Gradient)

  1. Stellen Sie isotonisches Percoll (SIP) her, indem Sie 9 Teile Percoll mit 1 Teil 10x HBSS mischen. Bereiten Sie so viel zu, dass etwa 2,5 mL/g Gewebe zur Verfügung stehen.
  2. Stellen Sie eine 35 %ige Percoll-Arbeitslösung her, indem Sie 3,5 mL SIP mit 5,5 mL 1x HBSS mischen. Bereiten Sie so viel zu, dass etwa 4,5 mL/g Gewebe zur Verfügung stehen.
  3. Dichtetrennung
    1. Suspendieren Sie das Zellpellet aus Schritt 3.7.2 in 35 %igem Percoll. Verwenden Sie etwa 4,5 mL 35 %iges Percoll pro Gramm ursprüngliches Gewebegewicht (d. h. das vor der Dissoziation gemessene Gewicht).
    2. HINWEIS: Suspendieren Sie die Zellen in 35 %igem Percoll in einem 50-mL-Röhrchen (maximal 30 mL pro Röhrchen). Bei großen Gewebemengen verteilen Sie die Zellen auf mehrere 50-mL-Röhrchen.
    3. Überschichten Sie jedes Röhrchen vorsichtig mit 10 mL 1x HBSS. Inkubieren Sie 5 Minuten auf Eis oder bei 4 °C.
    4. Zentrifugieren Sie bei 800 ×g, 45 Minuten, 4 °C (ohne Bremse während der Verzögerung).
  4. Gewinnung der Schichten
    1. Entfernen Sie das Überstand und die Myelinschicht vorsichtig, ohne die untere Interphase zu stören.
    2. Sammeln Sie das Pellet und die Interphase (unterhalb der Myelinschicht, enthaltend gemischte Gehirnzellen und den Percoll-Anteil) in einem neuen 50-mL-Konusröhrchen, um eine Mitnahme von Verunreinigungen zu vermeiden.
  5. Verdünnen und Waschen
    1. Fügen Sie HBSS im Verhältnis 3:1 hinzu (z. B. 30 mL HBSS pro 10 mL gesammelter Suspension), um Percoll zu verdünnen (~3-fache Verdünnung).
    2. Zentrifugieren Sie bei 1.000 × g, 10 Minuten bei 4 °C (mit voller Bremse und Beschleunigung).
    3. Entfernen Sie den Überstand vollständig.
  6. Erythrozytenlyse und Zellzählung
    1. Behandeln Sie das Zellpräparat aus Schritt 4.5.3 mit ACK-Puffer (5 mL, 10 Minuten, 37 °C).
    2. Zählen Sie die vitalen Zellen mithilfe von Trypanblau.
    3. HINWEIS: Erwartete Ausbeute: ~0,1–1 × 106 ZNS-Zellen/g Gewebe, abhängig vom Zustand des Gewebes.
    4. Fügen Sie 10 mL PBS hinzu, um den ACK-Lysepuffer zu inaktivieren. Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 500 × g.
      HINWEIS: Optionaler Haltepunkt: Die Zellen können vor der Sortierung über Nacht bei einer Dichte von 0,5–1 × 106 Zellen/mL Medium kultiviert werden (DMEM/F-12, Glutamin-Zusatz mit Natriumpyruvat (500 mL), 10 % hitzeinaktiviertes FBS, 1x HEPES-Pufferlösung, 1x Antibiotikum-Antimykotikum (5,5 mL 100x-Lösung), 10 ng/mL MCSF (1.000x-Lösung).
      Nach Abschluss der oben beschriebenen Schritte zur Gewebedissoziation, Erythrozytenlyse, Zellzählung und optionalen Übernachtkultur wurden die Populationen der CD3+- und CD11b+-Zellen mit kommerziell verfügbaren Zellisolationssystemen gemäß den Herstelleranweisungen isoliert. Detaillierte Informationen zu den Kits, Reagenzien und dem vollständigen Isolationsverfahren finden Sie in der Materialtabelle, wobei im Folgenden ein kurzer Überblick über den Isolationsarbeitsablauf gegeben wird.

5. Isolierung von CD3⁺ T-Zellen (positive Selektion)

HINWEIS: Isolieren Sie zunächst CD3+ aus der hergestellten Einzelzell-Suspension mithilfe eines immunmagnetischen Positivselektions-Kits im Freisetzungformat für CD3 (siehe Tabelle der Materialien). Bewahren Sie sowohl die CD3+- als auch die CD3--Fraktion auf, die bei diesem Schritt entstehen. Die CD3--Fraktion wird für Schritt 6 benötigt.

  1. Bereiten Sie den Freisetzungspuffer vor.
    1. Bereiten Sie den 1x Freisetzungspuffer am Tag der Verwendung durch Verdünnung des 40x Freisetzungspuffer-Konzentrats in Zellseparationspuffer vor und lagern Sie ihn bei 4–6 °C oder auf Eis.
      HINWEIS: Bereiten Sie 2,5 mL 1x Freisetzungspuffer für jede zu verarbeitende Probe vor.
  2. Bereiten Sie die Zellprobe vor und markieren Sie sie mit dem Selektionscocktail.
    1. Resuspendieren Sie das Zellpellet aus Schritt 4.6.3 bei 1 × 108 Zellen/mL in Zellseparationspuffer in einem 5 mL-Rundboden-Polystyrolrohr.
    2. Geben Sie den CD3-Selektionscocktail zur Probe im Verhältnis 100 µL pro mL Probe hinzu. Mischen Sie die Probe vorsichtig und inkubieren Sie sie 3 min bei Raumtemperatur.
  3. Markieren Sie die Probe mit magnetischen Partikeln.
    1. Vortexen Sie die magnetischen Partikel unmittelbar vor Gebrauch 30 s. Geben Sie die magnetischen Partikel im Verhältnis 100 µL pro mL Probe hinzu. Mischen Sie die Probe vorsichtig und inkubieren Sie sie 3 min bei Raumtemperatur.
    2. Bringen Sie die Probe durch Zugabe von Zellseparationspuffer auf ein Gesamtvolumen von 2 mL und mischen Sie durch vorsichtiges mehrmaliges Auf- und Abpipettieren der Suspension.
  4. Isolieren Sie die CD3+-Fraktion durch magnetische Trennung.
    1. Stellen Sie das ungekapselte Probenröhrchen in den magnetischen Zellseparator und inkubieren Sie es 5 min bei Raumtemperatur.
    2. HINWEIS: An die magnetischen Partikel gebundene Zellen bilden die CD3+-Fraktion und verbleiben an der Röhrchenwand innerhalb des Magnetfelds; die nicht gebundene Überstände bilden die CD3--Fraktion.
    3. Ohne das Röhrchen aus dem magnetischen Separator zu entfernen, pipettieren Sie den Überstand in ein sauberes, beschriftetes 15 mL-Konischrohr, das für die CD3--Fraktion vorgesehen ist.
    4. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem magnetischen Separator und resuspendieren Sie die zurückgehaltenen Zellen vorsichtig in 2 mL Zellseparationspuffer.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 5.4.1 bis 5.4.3 insgesamt dreimal mit jeweils 5 min magnetischer Trennung und sammeln Sie alle Überstände im gleichen Röhrchen für die CD3--Fraktion.
  5. Lösen Sie die CD3+-Fraktion von den magnetischen Partikeln ab.
    1. Geben Sie 2,5 mL 1x Freisetzungspuffer (hergestellt in Schritt 5.1.2) zu den zurückgehaltenen Zellen hinzu und mischen Sie durch vorsichtiges zweimal bis dreimaliges Auf- und Abpipettieren der Suspension. Inkubieren Sie die Suspension 3 min bei Raumtemperatur.
    2. Stellen Sie das ungekapselte Röhrchen in den magnetischen Zellseparator und inkubieren Sie es 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Ohne das Röhrchen aus dem magnetischen Separator zu entfernen, pipettieren Sie den Überstand in ein sauberes, beschriftetes 15 mL-Konischrohr, das für die CD3+-Fraktion vorgesehen ist.
      HINWEIS: Der Freisetzungspuffer löst die magnetischen Partikel von den markierten Zellen ab: Der resultierende Überstand stellt die gereinigte CD3+-Fraktion dar, während die verbleibenden magnetischen Partikel im Magnetfeld an der Röhrchenwand gebunden bleiben und verworfen werden.
  6. Zellzählung und Kryokonservierung
    1. Zählen Sie die Zellen und lagern Sie den CD3+-Anteil durch Schnellgefrieren von Aliquots bei -80 °C ein, nachdem die verbleibenden Zellen 24 h in einem Kryogemisch (90 % FBS + 10 % DMSO) in einem Isopropanol-basierten Einfriermedium kryokonserviert wurden, und überführen Sie die Probe anschließend in flüssigen Stickstoff.

6. Isolierung von CD11b⁺ myeloischen Zellen (aus der CD3⁻-Fraktion)

HINWEIS: Die in Schritt 5.4.4 zurückgehaltene CD3--Fraktion wurde einer zweiten immunmagnetischen positiven Selektion unterzogen, um mittels anti-CD11b-magnetischer Mikroperlen und eines magnetischen Trennsystems im Säulenformat CD11b+ myeloide Zellen zu isolieren (siehe Materialtabelle).

  1. Bereiten Sie den Trennpuffer vor und bestimmen Sie die Zellanzahl.
    1. Stellen Sie den 1x BSA-basierten Trennpuffer her, indem Sie die 20x-Konzentration in isotonischer Spüllösung verdünnen, und bewahren Sie den hergestellten Puffer bis zur Verwendung kühl (4–8 °C) auf.
    2. Bestimmen Sie die Gesamtanzahl der Zellen in der CD3-Fraktion mithilfe eines Hämozytometers oder eines automatischen Zellzählgeräts.
  2. Markieren Sie die Zellen mit anti-CD11b magnetischen Mikroperlen.
    1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 10 Minuten bei 300 × g und aspirieren Sie das Überstandsvolumen vollständig.
    2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 80 µL 1x BSA-basiertem Trennpuffer pro 1 × 107 Gesamtzellen.
    3. Fügen Sie 20 µL anti-CD11b magnetische Mikroperlen pro 1 × 107 Gesamtzellen hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie 15 Minuten bei 4–8 °C.
    4. HINWEIS: Die Inkubation auf nassem Eis anstelle im Kühlschrank kann eine längere Inkubationszeit erfordern. Eine Inkubation bei höheren Temperaturen oder über die empfohlene Zeit hinaus kann das Risiko einer unspezifischen Zellmarkierung erhöhen.
    5. Waschen Sie die markierten Zellen, indem Sie 1 mL 1x Trennpuffer pro 1 × 107 Zellen hinzufügen, zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 300 × g und aspirieren Sie das Überstandsvolumen vollständig.
    6. Resuspendieren Sie bis zu 1 × 108 Gesamtzellen in 500 µL Trennpuffer.
  3. Führen Sie die magnetische Trennung an der Säule durch.
    1. Platzieren Sie eine magnetische Trennsäule im Magneten und equilibrieren Sie sie, indem Sie 500 µL 1x Trennpuffer (für Kleinvolumensäule) oder 1 mL 1x Trennpuffer (für Großvolumensäule) durchlaufen lassen; verwerfen Sie den Waschabfluss.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Kleinvolumensäule, wenn die Probe nur wenige Gesamtzellen enthält. Verwenden Sie eine Großvolumensäule für Proben mit hoher Gesamtzellzahl, wie beispielsweise aus Milz gewonnene oder kombinierte Immunpräparationen.
    2. Platzieren Sie ein sauberes 5-mL-Rundbodenglas aus Polystyrol unter die equilibrierte Säule und geben Sie die 500 µL (Kleinvolumensäule) oder 1 mL (Großvolumensäule) markierte Zellsuspension auf die Oberseite der Säule.
    3. Nachdem die Probe vollständig in die Säule eingetreten ist, waschen Sie die Säule dreimal, wobei Sie pro Waschgang 500 µL 1x Trennpuffer (Kleinvolumensäule) oder 1 mL (Großvolumensäule) hinzufügen. Fügen Sie jeweils erst den nächsten Waschgang hinzu, sobald das Reservoir der Säule leer ist.
      ​HINWEIS: Der kombinierte Abfluss, der in den Schritten 6.3.2 und 6.3.3 gesammelt wurde, stellt die nicht markierte, CD11b--Fraktion dar.
    4. Nehmen Sie die Säule vom Magneten und setzen Sie sie auf ein sauberes, beschriftetes 5-mL-Polystyrolrohr, das für die CD11b+-Fraktion vorgesehen ist.
    5. Pipettieren Sie 1 mL (Kleinvolumensäule) oder 2 mL (Großvolumensäule) 1x Trennpuffer auf die Oberseite der Säule und spülen Sie die markierten Zellen unmittelbar in das Sammelrohr, indem Sie den mitgelieferten Kolben fest nach unten drücken.
  4. Quantifizierung und Weiterverarbeitung der CD11b+-Fraktionen
    1. Zählen Sie die Zellen aus beiden Fraktionen (CD11b+ und CD11b-) und lagern Sie die CD11b--Aliquote durch Schnellgefrieren bei -80 °C ein, nachdem die verbleibenden Zellen 24 Stunden in einem Kryogemisch (90 % FBS + 10 % DMSO) in einem auf Isopropanol basierenden Gefriermittel kryokonserviert wurden; anschließend überführen Sie die Probe in flüssigen Stickstoff.
    2. Verwenden Sie die CD11b+-Zellen für nachfolgende Experimente.

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Ergebnisse

Der in diesem Protokoll beschriebene optimierte Arbeitsablauf ermöglicht die reproduzierbare Isolierung lebensfähiger, hochangereicherter T-Zellen und BrMCs/Mikroglia aus postmortalen, mit HIV infizierten menschlichen Hirngeweben. Die erfolgreiche Durchführung des Protokolls wird durch eine Reihe von Qualitätskontrollen bestätigt, einschließlich der Beurteilung der Zellviabilität, der Quantifizierung der Zellzahlen und der immunphänotypischen Charakterisierung in entscheidenden Phasen. Repräsentative Ergebnisse eines erf...

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Diskussion

Um reproduzierbare Daten mit diesem Protokoll zu erhalten, ist es wichtig, jeden Schritt sorgfältig zu befolgen. Das Auslassen oder Überstürzen einzelner Schritte kann die Zellausbeute, Vitalität und Reinheit verringern. Der wichtigste Faktor vor der Analyse ist die Schnelligkeit, mit der Gewebe nach dem Tod verarbeitet werden42. Menschliches Hirngewebe sollte so schnell wie möglich bearbeitet werden, idealerweise innerhalb von 6–12 h. Längeres Warten führt zum Abbau von Mikroglia-Oberflächenantig...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

We thank Dr. Sara Gianella from the “Last Gift” cohort at UC San Diego for collecting human tissues. We also thank Dr. Ann Chahroudi at the Emory National Primate Research Center, Dr. Afam Okoye at Oregon Health & Science University, and Dr. Satya Dandekar at the University of California, Davis, for providing rhesus macaque tissues. This work was supported by R21MH128034, R01MH136852, R21AI167709, R01MH139446, and R01AI186609. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10-mL-SpritzenVWRCat# 76837-040
25-mL-serologische PipettenVWRCat# 76201-710
ACK-LysepufferThermo Fisher ScientificCat# A1049201
Antibiotikum-Antimykotikum (100x)Thermo Fisher ScientificCat# 15240112
autoMACS-SpüllösungMiltenyi BiotecCat# 130-091-222
Biosicherheitswerkbank (BSL-2)  
CD11b-Mikroperlen, human und Maus – lyophilisiertMiltenyi BiotecCat# 130-097-142
CD11b-Mikroperlen, nicht-menschliche PrimatenMiltenyi BiotecCat# 130-091-100
CD3-Mikroperlen-Kit, nicht-menschliche PrimatenMiltenyi BiotecCat# 130-092-012
ZellzählplättchenThermo Fisher CountessCat# C10312Alternative VWR, Cat# 10228-0050
Clorox-Keimtötendes BleichmittelEssendantCat# 50371500
Corning-Zellkulturschalen, unbehandeltThermo Fisher ScientificCat# 08-772-32
Cynomolgus-Affen-M-CSFKingfisher BiotechCat# RP1612Y-100
Einwegspritzen mit Luer-Lok-AnschlussBDCat# 14-829-45
DMEM/F-12 Thermo Fisher ScientificCat# 11320082
DNase I, rekombinant, RNase-freiRocheCat# 4716728001
EasySep-PufferSTEMCELL TechnologiesCat# 20144
EasySep FITC-Positivselektionskit IISTEMCELL TechnologiesCat# 17682
EasySep Release Human CD3 PositivselektionskitSTEMCELL TechnologiesCat# 17751
Falcon-Zellseparatoren, 70 µm und 100 µmCorningCat# 21008-950
Fötales Kälberserum (FBS)VWRCat#97068-091
Feine gebogene Pinzette VWRCat# 82027-410
Gentamicin Thermo Fisher ScientificCat# 15750060
Gibco RPMI 1640 Thermo Fisher ScientificCat# 11875-119
HBSS, 1x ohne Calcium, Magnesium und PhenolrotThermo Fisher ScientificCat# 14175103
HBSS, 10x mit Calcium, Magnesium, PhenolrotThermo Fisher ScientificCat# 14060040
Blutkörperchenzähler oder automatischer Zellzähler 
Menschliches M-CSFPeproTechCat# 300-25 alternative Cat# 78057
Isotonische Spül-/Verdünnungslösung für die magnetische TrennungMiltenyi Biotec130-091-222
L-Glutamin (200 mM)Thermo Fisher ScientificCat# 25030-061
MACS BSA-Grundlösung (20x)Miltenyi BiotecCat# 130-091-376
Magnetisches TrennsystemEasySep oder MACS
MS-Säulen Miltenyi BiotecCat# 130-042-201
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher ScientificCat# 15140122
Percoll Cytiva/GE Healthcare, Cat# GE17-0891-01
SchutzkittelKappler ProVentCat# 17-988-497B
Kühlzentrifuge
Natriumpyruvat (100 mM)Thermo Fisher ScientificCat# 11360070
PräparationspinzetteVWRCat# 82027-440Alternative Cat# 82027-438
Sterile Einweg-MesserklingenCardinal HealthCat# 11213-237VWR-Alternative Cat# 89140-800
TrypLE Express Enzym (1x), PhenolrotThermoFisherCat# 1250510

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