FTY720 erhöht die Doxorubicin-Sensitivität in resistenten akuten myeloischen Leukämiezellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bewertet, wie FTY720 die Doxorubicin-Sensitivität in resistenten akuten myeloischen Leukämiezellen erhöht, indem es die Zellviabilität, Apoptose, intrazelluläre Doxorubicin-Akkumulation, Expression des Arzneimittel-Efflux-Transporters und Proteinkinase B/mechanistisches Ziel der Rapamycin-Signalübertragung bewertet.

Zusammenfassung

Chemoresistenz bleibt eine große Barriere für eine wirksame Behandlung akuter myeloischer Leukämie, teilweise weil resistente leukämische Zellen die intrazelluläre Medikamentenexposition verringern und Apoptose vermeiden. FTY720, ein Sphingosin-1-phosphat-Rezeptormodulator, hat in mehreren Tumormodellen antiproliferative und chemosensensibilisierende Aktivität berichtet. Ob FTY720 die Doxorubicin-Sensitivität in doxorubicinresistenten akuten myeloischen Leukämiezellen erhöht und ob dieser Effekt mit Veränderungen der Arzneimittel-Efflux-Transporter und der Proteinkinase B/mechanistischem Ziel der Rapamycin-Signalübertragung assoziiert ist, bleibt jedoch unzureichend definiert. Diese Studie bewertete die Effekte von FTY720 allein und in Kombination mit Doxorubicin in elterlichen akuten myeloiden Leukämie-Zelllinien (HL60 und K562) und deren doxorubicinresistenten Derivaten (HL60/A und K562/A). Die Zellviabilität wurde mittels Zellzählungs-Kit-8-Tests bewertet, Apoptose wurde mit Annexin V/Propidiumiodid Flowzytometrie gemessen, die intrazelluläre Doxorubicin-Akkumulation wurde durch Flowzytometrie quantifiziert, und P-Glykoprotein, multiresistent-assoziiertes Protein 1, Proteinkinase B/mechanistisches Ziel der Rapamycin-Signalwegproteine sowie apoptosebezogene Proteine wurden mittels Durchflusszytometrie und Western-Blotting untersucht. FTY720 zeigte dosisabhängige Zytotoxoxizität und eine erhöhte Doxorubicin-Sensitivität in resistenten Leukämiezellen. Die kombinierte Behandlung verringerte die Zelllebensfähigkeit, erhöhte die apoptotischen Zellfraktionen, verbesserte die intrazelluläre Doxorubicin-Akkumulation und verringerte die Expression von P-Glykoproteinen sowie der multiresistenten Protein-1-Expression. Die FTY720-Behandlung war außerdem mit einer reduzierten Phosphorylierung der Proteinkinase B und dem mechanistischen Ziel von Rapamycin assoziiert, während der Proteinkinase-B-Aktivator SC79 die beobachteten Veränderungen in Signalübertragung, Transporterexpression und Apoptose teilweise umkehrte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass FTY720 die Doxorubicin-Sensitivität in HL60/A- und K562/A-Zellen erhöht und dass dieser Effekt mit einer reduzierten Proteinkinase-B/mechanistischen Ziel der Rapamycin-Signalübertragung, einer verminderten Expression von Arzneimittel-Efflux-Transportern, einer erhöhten intrazellulären Doxorubicin-Ansammlung und einer erhöhten Apoptose verbunden ist. Da diese Studie auf in-vitro-Zelllinienmodelle beschränkt war, ist eine weitere Validierung in primären Leukämieproben und in vivo-Systemen erforderlich, bevor therapeutische Schlussfolgerungen gezogen werden können.

Einleitung

Akute myeloische Leukämie ist eine heterogene hämatologische Malignität, die durch die bösartige Umwandlung hämatopoietischer Stamm- und Vorläuferzellen entsteht. Sie ist die häufigste Form der akuten Leukämie bei Erwachsenen und bleibt weiterhin mit einer schlechten Langzeitüberlebensrate verbunden. Obwohl sich die Behandlungsstrategien verbessert haben, bleibt die Induktionshemotherapie auf Basis von Cytarabin in Kombination mit einem Anthracyclin ein Grundpfeiler der Behandlung. Viele Patienten entwickeln jedoch primäre oder erworbene Resistenz, was zu Rückfällen, refraktären Erkrankungen und schlechten klinischen Ergebnissen^führt. Das Verständnis der Mechanismen, die die Doxorubicin-Sensitivität verringern, bleibt daher ein wichtiges Ziel in der Forschung zur akuten myeloiden Leukämie.

Doxorubicin-Resistenz ist ein multifaktorieller Prozess. Resistente Leukämiezellen können die intrazelluläre Arzneimittelexposition durch erhöhte Expression oder Aktivität von Adenosintriphosphat-bindenden Kassetten-Arzneimittel-Efflux-Transportern, einschließlich P-Glykoprotein, codiert von der Adenosintriphosphat-bindenden Kassetten-Unterfamilie B-Mitglied 1, und dem multiresistent-assoziierten Protein 1, codiert vom Adenosintriphosphat-bindenden Kassettenmitglied 1 4, reduzieren. Die Aktivierung der Proteinkinase B und des mechanistischen Ziels der Rapamycin-Signalübertragung kann ebenfalls das Überleben der Leukämiezellen fördern, Apoptose unterdrücken und zur Behandlungsresistenz^{beitragen 5}. Zusammen verringern diese Mechanismen die intrazelluläre Doxorubicin-Ansammlung und verringern die zytotoxische Wirksamkeit. Die direkte pharmakologische Zielsetzung von Multiarzneimittelresistenztransportern war aufgrund von Toxizität, begrenzter Wirksamkeit und kompensatorischen Resistenzmechanismen^{eine Herausforderung 6}. Ähnlich sehen sich Inhibitoren der Proteinkinase B und das mechanistische Ziel der Rapamycin-Signalübertragung vor translationalen Herausforderungen im Zusammenhang mit dosisabhängiger Toxizität, eingeschränkter Wirksamkeit und Signalweganpassung ^7,8.

FTY720, auch bekannt als Fingolimod, ist ein Sphingosin-1-phosphat-Rezeptormodulator, der von der United States Food and Drug Administration zur Behandlung der Multiplen Sklerose zugelassen wurde und als potenzielles Krebsmittel⁹ Interesse erregte. Über seine immunmodulatorische Aktivität hinaus hat FTY720 antiproliferative, proapoptotische und behandlungssensibilisierende Effekte in mehreren präklinischen Tumormodellen gezeigt, darunter Prostatakrebs, hepatozelluläres Karzinom, Lungenkrebs, Darmkrebs, multiples Myelom, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Leukämie, Lymphom und Glioblastom 10,11,12,13,14,15,16^{. 17, 18, 19}. Frühere Studien haben gezeigt, dass FTY720 die Doxorubicin-Aktivität bei Brustkrebs steigern, die Cisplatin-Sensitivität in cisplatinresistenten, nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen erhöhen und cisplatinresistente Melanomzellen durch Modulation der Phosphoinositid-3-Kinase-Signalierung 20,21,22 resensibilisieren kann. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass FTY720 sowohl die Überlebenssignalübertragung als auch die Wirkstoffretentionsmechanismen in resistenten Krebszellen beeinflussen kann. Ob FTY720 die Doxorubicin-Sensitivität in doxorubicinresistenten akuten myeloischen Leukämiezellen erhöht und ob dieser Effekt mit koordinierten Veränderungen der intrazellulären Doxorubicin-Akkumulation, der Expression von Arzneimittel-Efflux-Transportern, Apoptose und Proteinkinase B/mechanistischem Ziel der Rapamycin-Signalübertragung assoziiert ist, bleibt unzureichend definiert.

Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um diese Lücke zu schließen, indem die doxorubicinresistenten akuten myeloiden Leukämiezellmodelle HL60/A und K562/A sowie deren elterliche Gegenstücke verwendet wurden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass FTY720 die Doxorubicin-Sensitivität erhöhen könnte, indem es die Expression des Arzneimittel-Efflux-Transporters reduziert, die intrazelluläre Doxorubicienansammlung erhöht und die Apoptose verbessert, wobei Proteinkinase B/mechanistisches Ziel der Rapamycin-Signalübertragung als assoziierter regulatorischer Weg beteiligt ist. Zur Bewertung dieser Hypothese wurden die Zellviabilität, halbmaximale inhibitorische Konzentrationswerte, Apoptose, intrazelluläre Doxorubicin-Akkumulation, Transporterexpression und Signalproteinänderungen nach Behandlung mit FTY720 allein oder in Kombination mit Doxorubicin bewertet. Da alle Experimente in Zelllinienmodellen durchgeführt wurden, werden die Ergebnisse als in-vitro-mechanistische Belege und nicht als direkte Belege für klinische Wirksamkeit interpretiert.

Protokoll

Diese Studie wurde mit etablierten humanen akuten myeloiden Leukämie-Zelllinien und deren doxorubicinresistenten Derivaten durchgeführt. Es waren keine menschlichen Teilnehmer, Tiere oder primäre Patientenproben beteiligt. Daher waren keine Genehmigung des institutionellen Überprüfungsausschusses für Forschung an Menschen und Tierethik erforderlich. Die Zelllinien wurden vom Institut für Hämatologie der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften in Tianjin, China, gewonnen und am Fujian Institute of Hematology, Fujian Medical University Union Hospital, aufbewahrt. Die Zellidentität wurde vor den Experimenten durch Karyotyp- und morphologische Untersuchung bestätigt, und alle Zellkulturen wurden auf Mykoplasma-Kontamination getestet. Die im Protokoll verwendeten Chemikalien, Ausrüstungen und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellkultur und Bestätigung des resistenten Phänotyps

Humane HL60- und K562-Zellen der akuten myeloiden Leukämie sowie ihre doxorubicinresistenten Derivate HL60/A und K562/A wurden vom Institut für Hämatologie der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften in Tianjin, China, bezogen. Die Zellen wurden im Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium kultiviert, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

HL60/A-Zellen wurden in einem vollständigen Medium mit 1 μg/mL Doxorubicin aufbewahrt, und K562/A-Zellen in einem vollständigen Medium mit 5 μg/mL Doxorubicin, um den resistenten Phänotyp zu erhalten. Doxorubicin wurde einen Monat vor experimentellen Tests aus dem Kulturmedium entfernt, um akute Arzneimittelselektionseffekte während der Behandlungstests zu vermeiden.

Vor den Experimenten wurde der resistente Phänotyp durch den Vergleich von Doxorubicin-halbmaximalen inhibitorischen Konzentrationswerten zwischen elterlichen und resistenten Zellen erneut bestätigt. Die Resistenzstabilität nach einem Monat medikamentenfreier Kultur wurde durch Wiederholung des Doxorubicin-Sensitivitätstests und Untersuchung der basalen P-Glykoprotein- und multiresistent-assoziierten Protein-1-Expression bewertet. Kulturen wurden für Experimente nur verwendet, wenn die resistenten Derivate höhere Doxorubicin-halbmaximale inhibitorische Konzentrationswerte und eine höhere Transporterexpression als ihre elterlichen Gegenstücke behielten.

2. Arzneimittelvorbereitung und Behandlungsdesign

FTY720, Doxorubicin und SC79 wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers als Standardlösungen hergestellt. FTY720 und SC79 wurden in Dimethylsulfoxid gelöst, und Doxorubicin wurde im empfohlenen Lösungsmittel hergestellt und während der Handhabung vor Licht geschützt. Arbeitslösungen wurden vor der Behandlung frisch in einem vollständigen Kulturmedium verdünnt. Die endgültige Dimethylsulfoxidkonzentration blieb in allen Behandlungsgruppen identisch und überschritt 0,1 % nicht.

Vehikelkontrollgruppen erhielten die gleiche Endkonzentration von Dimethylsulfoxid wie die entsprechenden Behandlungsgruppen. Für Kombinationsbehandlungsexperimente wurde 5 μM FTY720 als Sensibilisierungskonzentration verwendet. Doxorubicin wurde bei 4 μM für HL60/A-Zellen und bei 8 μM für K562/A-Zellen in Apoptose- und intrazellulären Doxorubicin-Akkumulationsassays eingesetzt, sofern nicht anders angegeben.

3. Zellviabilitätstest und Berechnung der halbmaximalen inhibitorischen Konzentration

Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 1 × 10^{4 Zellen pro} Bohrloch in einem 100 μL vollständigen Medium ausgesaat. Für FTY720-Einzelarzneimitteltests wurden HL60, K562, HL60/A und K562/A-Zellen mit 0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 und 100 μM FTY720 für 48 Stunden behandelt. Für Doxorubicin-Sensitivitätstests wurden HL60/A- und K562/A-Zellen mit seriellen Doxorubicin-Konzentrationen in Anwesenheit oder Abwesenheit von 5 μM FTY720 für 48 Stunden behandelt.

Die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem Cell Counting Kit-8-Test gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Nach der Behandlung wurde jedem Brunnen das Cell Counting Kit-8-Reagenz zugegeben, und die Platte wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert. Die Absorption wurde mit 450 nm mittels eines Mikroplattenlesers gemessen.

Die relative Zelllebensfähigkeit wurde wie folgt berechnet: relative Zelllebensfähigkeit = [(Absorption behandelter Bohrlöcher – Absorption von Leerbrunnen) / (Absorption von Fahrzeugkontrollbrunnen – Absorption von Leerbrunnen)] × 100 %

Die halbmaximalen inhibitorischen Konzentrationswerte wurden mittels nichtlinearer Regression mit einem vierparametrigen logistischen Dosis-Antwort-Modell in GraphPad Prism, Version 9.5, berechnet. Jedes Experiment umfasste drei unabhängige biologische Replika, mit drei technischen Brunnen pro Behandlungsbedingung.

4. Arzneimittelkombinationsanalyse

Die Auswirkungen von FTY720 auf die Doxorubicin-Sensitivität wurden durch den Vergleich von Doxorubicin-Dosis-Antwort-Beziehungen in Anwesenheit oder Abwesenheit von FTY720 bewertet. HL60/A- und K562/A-Zellen wurden mit seriellen Konzentrationen von Doxorubicin allein oder Doxorubicin-Kombination mit FTY720 für 48 Stunden behandelt.

Die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem Cell Counting Kit-8-Test bewertet, und die halbmaximalen inhibitorischen Konzentrationswerte wurden mittels nichtlinearer Regression mit einem vierparametrigen logistischen Dosis-Antwort-Modell berechnet. Veränderungen der Doxorubicin-Sensitivität wurden anhand von Verschiebungen der Dosis-Antwort-Kurven und Unterschieden in halbmaximalen inhibitorischen Konzentrationswerten zwischen den Behandlungsgruppen interpretiert.

Da die Experimente nicht als vollständige Dosis-Matrix-Studie mit festem Verhältnis konzipiert waren, wurde keine formale Kombinationsindexanalyse durchgeführt. Daher wurden die Ergebnisse als Hinweis auf eine veränderte Doxorubicin-Sensitivität und nicht als eindeutige pharmakologische Synergie interpretiert.

5. Apoptose-Analyse mit Annexin V und Propidiodid-Flusszytometrie

HL60/A- und K562/A-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit 4 × 10⁵ Zellen/mL eingepflanzt und 48 Stunden lang mit Vehikel, FTY720 allein, Doxorubicin allein oder Doxorubicin in Kombination mit FTY720 behandelt. Für die Kombinationsbehandlung wurde 5 μM FTY720 mit 4 μM Doxorubicin in HL60/A-Zellen oder 8 μM Doxorubicin in K562/A-Zellen kombiniert.

Nach der Behandlung wurden Zellen gesammelt, einschließlich im Kulturmedium suspendierter Zellen, und zweimal mit kalt phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden im Annexin-V-Bindungspuffer in der vom Hersteller empfohlenen Apoptose-Detektionskit-Konzentration wieder suspendiert. Jede Probe wurde mit 5 μL Annexin V-Fluorescein Isothiocyanat oder Annexin V-Allophycocyanin und 5 μL Propidiumiodid gefärbt, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Die Proben wurden sofort mittels Durchflusszytometrie analysiert. Ungefärbte Kontrollen, Einzel-gefärbte Kontrollen und Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollen wurden verwendet, um Kompensation und Quadrantengatter einzustellen. Trümmer wurden durch Vorwärtsstreuung und Seitenstreu-Gating ausgeschlossen. Frühe apoptotische Zellen wurden als Annexin-V-positive und Propidiumiodid-negative Zellen definiert, und späte apoptotische oder tote Zellen als Annexin-V-positive und Propidiumiodid-positive Zellen. Die totale Apoptose wurde als Summe der frühen und späten apoptotischen Zellfraktionen berechnet. Für jede Probe wurden mindestens 10.000 lebensfähige Einzelzell-Ereignisse erfasst.

6. Intrazellulärer Doxorubicin-Akkumulationstest

HL60/A- und K562/A-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit 4 × 10⁵ Zellen/mL ausgesat und über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden anschließend mit Vehikelkontrolle behandelt, Doxorubicin allein oder Doxorubicin in Kombination mit 5 μM FTY720. HL60/A-Zellen wurden mit 4 μM-Doxorubicin behandelt, und K562/A-Zellen mit 8 μM-Doxorubin. Die Zellen wurden 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und vor Licht geschützt.

Nach der Behandlung wurden die Zellen entnommen und zweimal mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, um extrazelluläres Doxorubicin zu entfernen. Die Zellen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der intrinsischen Fluoreszenz von Doxorubicin analysiert. Unbehandelte Zellen wurden zur Definition der Hintergrund-Autofluoreszenz verwendet, und Doxorubicin-behandelte Zellen dienten als fluoreszenz-positive Referenz. Die intrazelluläre Doxorubicin-Akkumulation wurde als mediane Fluoreszenzintensität nach Ausschluss von Trümmern und Aggregaten quantifiziert. Die mediane Fluoreszenzintensitätswerte wurden innerhalb jedes unabhängigen Experiments auf die Doxorubicin-Allein-Gruppe normalisiert.

7. Flowzytometrische Analyse der Expression von P-Glykoprotein und multiresistent assoziiertem Protein 1

HL60/A- und K562/A-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit 2 × 10⁶ Zellen/mL ausgesat und mit 5 μM FTY720 oder Vehicle-Control für 24 Stunden behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen zweimal mit eiskalten phosphatgepufferten Kochsalzlösung gewaschen und in einem 100-μL-Cell-Färbepuffer wieder suspendiert.

Die Zellen wurden mit phycoerythrin-konjugiertem Anti-P-Glykoprotein-Antikörper und Alexa Fluor 647-konjugiertem, anti-multiresistent-assoziiertem Protein-1-Antikörper bei der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung gefärbt. Abgestimmte Isotyp-Kontrollen, unverfärbte Steuerungen, Einzel-gefärbte Steuerungen und Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollen wurden für die Gate-Einstellung und -Kompensation enthalten. Die Proben wurden 30 Minuten bei 4 °C im Dunkeln inkubiert, zweimal mit einem Zellfärbungspuffer gewaschen und vor der Entnahme in einem 500 μL Zellfärbungspuffer wieder suspendiert.

Die Durchflusszytometrie wurde mit einem BD FACScan Durchflusszytometer durchgeführt. Für jede Probe wurden mindestens 10.000 lebensfähige Einzelzell-Ereignisse erfasst. Die Expression von P-Glykoproteinen und multiresistent assoziierten Protein-1-Expressionsniveaus wurden als mediane Fluoreszenzintensität nach Subtraktion des entsprechenden Isotyp-Kontrollsignals quantifiziert. Die normalisierten Werte wurden relativ zur Fahrzeug-Kontrollgruppe innerhalb jedes unabhängigen Experiments angegeben.

8. Westliche Blotting und dichtsitometrische Quantifizierung

Nach den empfohlenen Behandlungen wurden die Zellen gesammelt und zweimal mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Das Gesamtprotein wurde mittels eines Radioimmunpräzipitations-Puffers extrahiert, der mit Protease- und Phosphataseinhibitoren ergänzt wurde. Die Proteinkonzentration wurde mit einem Protein-Assay-Kit für Biinchoninsäure gemessen.

Insgesamt wurden 30 μg Protein pro Leitung durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und auf Polyvinyliden-Difluoridmembranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettarmer Milch oder 5 % Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert.

Membranen wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen das Gesamtprotein-Kinase B, phosphorylierte Protein-Kinase B, das gesamt-mechanistische Ziel von Rapamycin, phosphoryliertes mechanistisches Ziel von Rapamycin, gespaltene Caspase-3, gespaltene Poly(Adenosindiphosphat-Ribose)-Polymerase, P-Glykoprotein, multiresistent-assoziiertes Protein 1 und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen mit den entsprechenden Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Proteinbänder wurden mit verbesserter chemilumineszenzierter Detektion visualisiert.

Bandintensitäten wurden mit der ImageJ-Software, Version 1.53t, quantifiziert. Phosphorylierte Proteinkinase B wurde auf Gesamtproteinkinase B normalisiert, und das phosphorylierte mechanistische Ziel von Rapamycin wurde auf das totale mechanistische Ziel von Rapamycin normalisiert. P-Glykoprotein, multiresistent-assoziiertes Protein 1, gespaltene Caspase-3 und gespaltene Poly(Adenosin-Diphosphat-Ribose)-Polymerase wurden zu Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase normalisiert. Normalisierte Werte wurden als Faltenänderungen im Verhältnis zur Vehikelkontroll- oder Doxorubicin-Alleingruppe angegeben, abhängig vom Vergleich. Western-Blot-Analysen wurden mit drei unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt. Unbeschnittene Western-Blot-Bilder wurden im öffentlichen Datenarchiv abgelegt oder als ergänzende Dateien hochgeladen.

9. SC79-Rettungsexperiment

Um zu untersuchen, ob die Proteinkinase-B-Signalübertragung mit den beobachteten Effekten von FTY720 assoziiert ist, wurden HL60/A- und K562/A-Zellen mit FTY720 in Anwesenheit oder Abwesenheit von SC79, einem Proteinkinase-B-Aktivator, behandelt. Die Zellen wurden mit 5 μM FTY720 für 12 Stunden vorbehandelt und anschließend weitere 12 Stunden mit 30 μM SC79 oder Vehicle Control behandelt.

Nach der Behandlung wurden phosphorylierte Proteinkinase B, phosphoryliertes mechanistisches Ziel von Rapamycin, P-Glykoprotein und multiresistent-assoziierte Protein-1-Werte mittels Western Blotting bewertet. Parallel dazu wurde die Apoptose mittels Annexin V und Propidiumiodid-Färbung nach der Behandlung mit Doxorubicin, FTY720 und SC79 untersucht. Rettungseffekte wurden als pfadassoziierte Beweise interpretiert. Da kein genetisches Überexpressions- oder Knockdown-Experiment durchgeführt wurde, wurden kausale Schlussfolgerungen vorsichtig formuliert.

10. Statistische Analyse und Datenberichterstattung

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism, Version 9.5, und IBM SPSS Statistics, Version 23.0, durchgeführt. Biologische Replikate wurden als unabhängige Experimente definiert, die an verschiedenen Tagen mit unabhängig kultivierten Zellen durchgeführt wurden. Technische Replikate wurden als wiederholte Bohrungen oder wiederholte Messungen innerhalb desselben biologischen Experiments definiert.

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt, sofern nicht anders angegeben. Zwei-Gruppen-Vergleiche wurden mit einem ungepaarten, zweiseitigen Studenten-t-Test analysiert, als die Daten ungefähr normalverteilt waren. Vergleiche zwischen drei oder mehr Gruppen wurden mittels Einweg-Varianzanalyse analysiert, gefolgt vom Tukey-Post-hoc-Test. Experimente mit zwei unabhängigen Faktoren, wie der Arzneimittelkonzentration und dem Behandlungszustand, wurden mittels einer zweiseitigen Varianzanalyse analysiert, gefolgt von einer geeigneten Mehrfachvergleichskorrektur.

Wenn Normalitätsannahmen nicht unterstützt wurden, wurden nichtparametrische Tests verwendet. Exakte p-Werte wurden, wann immer möglich, angegeben. Die statistische Signifikanz wurde nach Korrektur für Mehrfachvergleiche als p < 0,05 definiert. Alle Abbildungslegenden gaben die Anzahl der biologischen Replikate, den verwendeten statistischen Test, die Bedeutung der Fehlerbalken und die Signifikanzschwelle an. Einzelne biologische Replikationswerte wurden in Streudiagrammen gezeigt oder wann immer möglich auf Balkendiagramme überlagert.

Ergebnisse

FTY720 verringerte die Lebensfähigkeit von elterlichen und doxorubicinresistenten akuten myeloiden Leukämiezellen

HL60-, K562-, HL60/A- und K562/A-Zellen wurden 48 Stunden lang steigenden Konzentrationen von FTY720 (0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 und 100 μM) ausgesetzt, und die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem Cell Counting Kit-8-Test gemessen. FTY720 verringerte die Zelllebensfähigkeit in allen vier Zelllinien konzentrationsabhängig (

Diskussion

Chemoresistenz bleibt eines der größten Hindernisse für eine wirksame Behandlung der akuten myeloiden Leukämie. Bei Patienten, die nicht auf die Einleitungstherapie ansprechen oder nach der Erstreaktion einen Rückfall entwickeln, können resistente Leukämiezellen trotz der Exposition gegenüber cytarabin- und anthracyclinbasierten Regimen bestehen bleiben, weshalb die Identifizierung von Ansätzen, die die Arzneimittelsensitivität erhöhen, eine wichtige experimentelle und klinische Frage

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-well tissue culture plates	Corning / Costar	3516 oder laborverifiziertes Äquivalent	Verwendet für Behandlung, Apoptose, Doxorubicin-Akkumulation und Proteinexpressionsexperimente.
96-well tissue culture plates	Corning / Costar	3599 oder laborverifiziertes Äquivalent	Verwendet für Cell Counting Kit-8 Assays.
Alexa Fluor 647 mouse immunoglobulin G1 isotype control	BioLegend	400130 oder laborverifiziertes Äquivalent	Isotyp-Kontrolle für Alexa Fluor 647-konjugierte Antikörper-Färbung. Verwenden Sie die genaue Katalognummer aus dem Reagenzfläschchen.
Alexa Fluor 647-conjugated anti-human multidrug resistance-associated protein 1 / ABCC1 antibody	BioLegend	370103	Verwendet für die flusszytometrische Detektion von multidrug resistance-associated protein 1. Die Produktverfügbarkeit sollte bestätigt werden, da einige BioLegend MRP1-Formate eingestellt oder ersetzt wurden.
Annexin V apoptosis detection kit with propidium iodide	BioLegend	640914 oder laborverifiziertes Äquivalent	Verwendet für Annexin V und Propidiumiodid-Apoptoseanalyse durch Zytometrie. Wenn Annexin V-Allophycocyanin anstelle von Annexin V-Fluoresceinisothiocyanat verwendet wurde, ersetzen Sie dies durch die genaue Kit-Katalognummer.
Bicinchoninic acid protein assay kit	Thermo Fisher Scientific / Beyotime / laborverifizierter Lieferant	Verwenden Sie die tatsächliche Katalognummer	Verwendet für die Proteinkonzentrationsmessung.
Carbon dioxide cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific / Eppendorf / laborverifiziertes Instrument	Modell ist im Laborprotokoll einzutragen	Zellen wurden bei 37 °C und 5% Kohlendioxid gehalten.
Caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	9662; RRID:AB_331439	Erkennt volle Länge und gespaltenes Caspase-3 durch Western Blot. Wenn ein gespaltenes Caspase-3-spezifisches Antikörper verwendet wurde, ersetzen Sie es durch die genaue Katalognummer.
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies	CK04	Verwendet für Zellviabilität und halbmaximale hemmende Konzentrationsassays.
Cell staining buffer	BioLegend	420201	Verwendet für Antikörperverdünnung und Waschen während der zytometrischen Färbung.
Cleaved poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase antibody	Cell Signaling Technology	94885; RRID:AB_2800237	Western Blot Antikörper für gespaltene Poly(Adenosindiphosphat-Ribose)-Polymerase.
CompuSyn	ComboSyn, Inc.	Version 1.0 oder laborverifizierte Version	Verwendet für Chou-Talalay Kombinationsindexanalyse, wenn vollständige Kombinationsdosisdaten verfügbar sind.
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich / Merck	D2650 oder laborverifiziertes Äquivalent	Lösungsmittel für FTY720 und SC79 Stammlösungen; die Endkonzentration überschritt 0,1% nicht.
Doxorubicin hydrochloride	Verwenden Sie den tatsächlichen Lieferanten aus dem Laboreinkaufsprotokoll	Verwenden Sie die tatsächliche Katalognummer und Chargennummer	Anthrazyklin, das für Resistenzaufrechterhaltung und Behandlungsassays verwendet wird. Dieser Eintrag muss dem tatsächlich in den Experimenten verwendeten Reagenz entsprechen.
Enhanced chemiluminescence substrate	Thermo Fisher Scientific / MilliporeSigma / laborverifizierter Lieferant	Verwenden Sie die tatsächliche Katalognummer	Verwendet für Western Blot Signalerkennung.
Fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10099-141 oder laborverifiziertes Äquivalent	Zum Kulturmedium bei 10% hinzugefügt. Verwenden Sie konsistenterweise erhitztes oder nicht erhitztes Serum in allen Experimenten.
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACScan oder tatsächliches Instrumentenmodell	Verwendet für Apoptose, intrazelluläre Doxorubicin-Akkumulation und Transporterexpressionsassays. Notieren Sie die Laser/Filter Konfiguration in den ergänzenden Methoden, falls verfügbar.
Flow cytometry analysis software	BD Biosciences / FlowJo / laborverifizierte Software	Version ist im Laborprotokoll einzutragen	Verwendet für Kompensation, Gating und Medianfluoreszenzintensitätsanalyse.
FTY720 / fingolimod hydrochloride	Verwenden Sie den tatsächlichen Lieferanten aus dem Laboreinkaufsprotokoll	Verwenden Sie die tatsächliche Katalognummer und Chargennummer	Arzneimittelbehandlungsreagenz. Dieser Eintrag muss dem tatsächlich in den Experimenten verwendeten Reagenz entsprechen. Ersetzen Sie nicht durch einen anderen Lieferanten, es sei denn, das Experiment wurde mit diesem Produkt durchgeführt.
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase antibody	Abcam	ab181602	Ladekontrolle für Western Blot. Bestätigen Sie RRID aus dem Produktinsert vor dem Einreichen.
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.5	Verwendet für Dosis-Wirkungskurven-Anpassung, halbmaximale hemmende Konzentrationsberechnung und statistische Analyse.
HL60 human acute myeloid leukemia cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	In dieser Studie nicht kommerziell katalogisiert	Humane akute myeloische Leukämie Elternzelllinie; vor Verwendung durch Karyotyp und Morphologie authentifiziert. Wenn eine öffentliche Referenz erforderlich ist, entspricht HL60 RRID:CVCL_0002.
HL60/A doxorubicin-resistant cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	Nicht kommerziell katalogisiert	Doxorubicin-resistente Ableitung von HL60 Zellen; aufbewahrt am Fujian Institute of Hematology. Resistenz wurde mit 1 μg/mL Doxorubicin vor der arzneimittelfreien Kultur aufrechterhalten.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit immunoglobulin G secondary antibody	Cell Signaling Technology / Abcam / laborverifizierter Lieferant	Verwenden Sie die tatsächliche Katalognummer	Sekundärantikörper für Western Blot. Tragen Sie den genauen Lieferanten und die Katalognummer aus den Laboraufzeichnungen ein.
IBM SPSS Statistics	IBM	Version 23.0	Verwendet für statistische Analyse.
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.53t	Verwendet für Western Blot densitometrische Quantifizierung.
K562 human leukemia cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	In dieser Studie nicht kommerziell katalogisiert	Humane Leukämie Elternzelllinie; vor Verwendung durch Karyotyp und Morphologie authentifiziert. Wenn eine öffentliche Referenz erforderlich ist, entspricht K562 RRID:CVCL_0004.
K562/A doxorubicin-resistant cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	Nicht kommerziell katalogisiert	Doxorubicin-resistente Ableitung von K562 Zellen; aufbewahrt am Fujian Institute of Hematology. Resistenz wurde mit 5 μg/mL Doxorubicin vor der arzneimittelfreien Kultur aufrechterhalten.
Microplate reader	BioTek / Thermo Fisher Scientific / Molecular Devices / laborverifiziertes Instrument	Modell ist im Laborprotokoll einzutragen	Verwendet zur Messung der Absorption bei 450 nm für Cell Counting Kit-8 Assays.
Multidrug resistance-associated protein 1 antibody for Western blot	Cell Signaling Technology	72202	Verwendet für Western Blot Detektion von multidrug resistance-associated protein 1. Bestätigen Sie RRID aus dem Produktinsert oder Antibody Registry vor dem Einreichen.