Ein wiederholtes Gewichtsverlustverfahren zur Etablierung eines Mausmodells chronischer traumatischer Hirnverletzung

Zusammenfassung

Ein Protokoll wird vorgestellt, um ein repetitives, leicht traumatisches Hirnverletzungsmodell mit geschlossenem Kopf zu etablieren, um die Mechanismen zu untersuchen, die chronisch-depressiv-ähnlichem Verhalten in Abwesenheit grober struktureller Hirnläsionen zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Eine traumatische Hirnverletzung (TBI) kann zu anhaltenden neuropathologischen Veränderungen und langfristigen neuropsychiatrischen Folgen führen. Während der Genesung entwickelt ein erheblicher Anteil der Patienten affektive Störungen, darunter depressive Symptome und schlafbedingte Beschwerden, selbst wenn routinemäßige Computertomographie oder Magnetresonanztomographie keine offensichtlichen strukturellen Auffälligkeiten zeigen. Experimentelle Modelle, die diese Merkmale reproduzieren, sind erforderlich, um die Mechanismen der chronischen posttraumatischen neuropsychiatrischen Symptome zu untersuchen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein repetitives, leicht traumatisches Hirnverletzungsmodell mit geschlossenem Kopf zu etablieren, um die Mechanismen zu untersuchen, die chronisch-depressiv-ähnlichem Verhalten zugrunde liegen, ohne offensichtliche grobe strukturelle Hirnläsionen, die durch makroskopische Untersuchung und T2-gewichtete MRT nachweisbar sind. Bei dieser Methode wird der intakte Schädel freigelegt und über fünf aufeinanderfolgende Tage hinweg wiederholt mit definierten Gewichtsabfallparametern getroffen. Unter den hier beschriebenen Bedingungen führt der Eingriff zu einer geschlossenen Kopfverletzung ohne grobe Schädelfraktur oder makroskopische fokale Prellung. Nach einem Intervall nach der Verletzung zeigen Mäuse depressiv-ähnliches Verhalten, ohne bei der Makroskopuntersuchung oder der T2-gewichteten Magnetresonanztomographie unter den in dieser Studie verwendeten Bedingungen offensichtliche fokale strukturelle Anomalien zu zeigen. Dieses Protokoll bietet einen experimentellen Ansatz zur Untersuchung chronisch-depressiv-ähnlicher Verhaltensweisen nach wiederholten leichten traumatischen Hirnverletzungen und zur Bewertung möglicher therapeutischer Interventionen.

Einleitung

Da das gegenwärtige Paradigma jedoch hauptsächlich lineare Auswirkungen auf eine kopffixierte Maus liefert, sollte es als geschlossenes rmTBI-Modell interpretiert werden, das für die Untersuchung chronischer affektiver Ergebnisse optimiert ist, und nicht als direkte biomechanische Nachahmung sportbedingter Gehirnerschütterungen oder kleinerer Verkehrsunfälle." Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind derzeit eine der Hauptursachen für traumabedingte Morbidität und Mortalität und stellen eine erhebliche medizinische und wirtschaftliche Belastung für Familien und die Gesellschaft^dar. Bemerkenswert ist, dass die Schädigung des zentralen Nervensystems nach TBI nicht vorübergehend ist; Sie entwickelt sich typischerweise chronisch und fortschreitend. Eine Studie zu TBI zeigte, dass selbst 18 Jahre nach der Verletzung die Mikroglialaktivierung anhält und eine anhaltende chronische Neuroentzündung weiterhin zu einer schweren neuronalen Verschlechterung führt. Epidemiologische Daten zeigen, dass bis zu 28–32 % der Patienten während der^{verlängerten Genesungsphase 4} schwere affektive Störungen entwickeln. In diesem Artikel bezieht sich rmTBI auf das Paradigma der Induktion von wiederholten leichten traumatischen Hirnverletzungen, während die anschließende chronische Post-Verletzungsphase, gekennzeichnet durch anhaltende Verhaltensänderungen, hier als chronische traumatische Hirnverletzung (c-TBI) bezeichnet wird. Der Begriff c-TBI wird hier verwendet, um den chronischen Zustand nach der Verletzung zu beschreiben, der durch anhaltende Verhaltensänderungen nach rmTBI gekennzeichnet ist, anstatt ein eigenständiges Verletzungsparadigma. Diese Verwendung entspricht konzeptionell unserer früheren Arbeit, die zeigt, dass experimentelle TBI als fortschreitender chronischer Prozess mit langfristigen histopathologischen und Verhaltensanomalien entstehen können.

Diese chronischen neuropsychiatrischen Folgen beeinträchtigen die Lebensqualität und funktionellen Ergebnisse der Patienten erheblich⁵. Die genaue Pathogenese hinter diesen sekundären affektiven Störungen bleibt jedoch unklar, und die klinischen Behandlungsmöglichkeiten sind stark eingeschränkt. Daher ist die Untersuchung der Mechanismen c-TBI-induzierter depressiv-ähnlicher Verhaltensweisen und die Identifizierung präziser therapeutischer Ziele von dringendem klinischer Notwendigkeit und von erheblicher praktischer Bedeutung.

Um die pathologischen Mechanismen von TBI zu erläutern, haben Forscher verschiedene Tiermodelle entwickelt, von denen das Modell mit kontrolliertem kortikalem Effekt (CCI) derzeit zu den am weitesten verbreiteten ^6,7 ist. CCI ermöglicht eine präzise Steuerung der Aufprallparameter, um hochreproduzierbare fokale Läsionen zu erzeugen. Sowohl CCI- als auch traditionelle Fluid-Percussion-Verletzungsmodelle (FPI) erfordern jedoch typischerweise eine Kraniotomie. Diese Ansätze sind besonders nützlich zur Untersuchung von fokalen Prellungen, Gewebeverlust und schweren läsionsbedingten neuroinflammatorischen Reaktionen, simulieren jedoch in der Regel schwere offene TBI, die sich deutlich von den häufigsten klinischen Erscheinungen milder geschlossener Kopfverletzungen wie sportbedingten Gehirnerschütterungen^{unterscheidet.} Entscheidend ist, dass die Nekrose des Hirngewebes, die Gliumnarben und die späte Kavitation durch Kraniotomie und Impact zwei wesentliche Einschränkungen aufweisen. Erstens führen schwere strukturelle Defizite oft zu motorischen Dysfunktionen, was die genaue Bewertung von Verhaltensergebnissen direkt erschwert. Zweitens unterbricht der physische Gewebeverlust die Langstreckenprojektionen der neuronalen Projektion. Wie in früheren Studien mit dem CCI-induzierten TBI-Modell gezeigt, zeigten Mäuse signifikante fokale Gehirnprellungen⁴. Diese strukturelle Störung behindert die Anwendung fortschrittlicher neuroanatomischer Techniken wie der viralen Verfolgung erheblich, sodass es weitgehend unmöglich ist, psychiatrische Symptome und deren zugehörige neuronale Schaltkreise zu untersuchen. Dementsprechend bleiben diese Modelle zwar für Studien zu schweren oder fokalen TBI wertvoll, sind aber möglicherweise weniger geeignet, wenn das Ziel ist, chronische affektive Anomalien nach wiederholten milden geschlossenen Kopfverletzungen zu untersuchen, insbesondere wenn die Erhaltung der strukturellen Integrität für Verhaltens- und Schaltungsanalysen wichtig ist.

Um die Einschränkungen der oben genannten schweren offenen TBI-Modelle zu überwinden, beschreibt diese Studie ein Protokoll zur Etablierung eines repetitiven leichten traumatischen Hirnverletzungsmodells (rmTBI) mit einer Gewichtsabfallmethode am freiliegenden, intakten Schädel ohne Kraniotomie. Dieses Protokoll verwendet präzise definierte Aufprallparameter: eine Fallhöhe von 25 cm und ein Gewicht von 20 g. Die Einschlagstelle wurde auf 2 mm links der sagittalen Naht und 2 mm hinter der koronalen Naht ausgerichtet, wobei eine gebogene Metall-Imporspitze mit einem Durchmesser von 4 mm verwendet wurde, um die Genauigkeit und Gleichmäßigkeit der Aufprallkraft sicherzustellen. Darüber hinaus gewährleistet die spezifische Häufigkeit wiederholender Auswirkungen über fünf aufeinanderfolgende Tage die Stabilität chronischer pathologischer Veränderungen. Umfassende Untersuchungen mit MRT, Histopathologie und Verhaltensanalysen zeigen, dass dieses Mausmodell signifikant depressiv-ähnliche Verhaltensweisen aufweist und dabei die grobe strukturelle Gehirnintegrität bewahrt, ohne offensichtliche fokale Prellungen oder motorische Defizite. Dieses phänotypische Profil erfasst ausgewählte Verhaltensmerkmale wiederholter leichter Kopfverletzungen, einschließlich neuropsychiatrisch ähnlicher Veränderungen, obwohl keine offensichtlichen strukturellen Auffälligkeiten auf routinemäßiger Neurobildgebung 10,11,12,13 vorliegen. Da das gegenwärtige Paradigma jedoch hauptsächlich lineare Auswirkungen auf eine kopffixierte Maus liefert, sollte es als geschlossenes Kopf-rmTBI-Modell interpretiert werden, das für die Untersuchung chronischer affektiver Ergebnisse optimiert ist, und nicht als direkte biomechanische Nachahmung sportbedingter Gehirnerschütterungen oder kleinerer Verkehrsunfälle.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Institute of Artificial Intelligence, Hefei Comprehensive National Science Center, genehmigt (Genehmigungsnummer IAI2024071004). Alle Verfahren wurden gemäß institutionellen und nationalen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt. Ein schematisches Diagramm des experimentellen Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Vergleichbare Ausrüstung anderer Hersteller kann verwendet werden, sofern die kritischen Leistungsmerkmale beibehalten werden, wie etwa das Aufschlaggewicht von 20 g, die Fallhöhe von 25 cm, der Durchmesser der Schlagvorspitze von 4 mm, die zuverlässige Isofluranabgabe und die MRT-Einstellungen, die mit denen hier vergleichbar sind. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tiervorbereitung

1. Bereitet die Tiere vor.
   1. Verwenden Sie männliche C57BL/6N-Mäuse im Alter von 8–10 Wochen und mit einem Gewicht von 20–25 g.
   2. Halten Sie die Mäuse in einzeln belüfteten Käfigen (IVCs) in einer speziellen, pathogenfreien (SPF) Tieranlage. Stellen Sie Nahrung und Wasser ad libitum bereit und halten Sie einen 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus unter kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit aufrecht.
   3. Gewöhnen Sie die Mäuse vor dem Experiment an den Unterbringungsraum und führen Sie routinemäßige Gesundheitsuntersuchungen gemäß den institutionellen Tierpflegevorschriften durch.
2. Teile die Gruppen zu.
   1. Zufällig werden die Mäuse der Naiv-Gruppe, der Sham-Gruppe und der c-TBI-Gruppe zugeteilt. Die für MRT-Interpretation, groben pathologischen Beurteilungen und Verhaltensbewertung/Datenanalyse verantwortlich waren, waren für Gruppenzuweisungen blind.
   2. Tragen Sie die Tieridentifikationsnummer und die Gruppenzuweisung vor der ersten Verletzungssitzung auf.

2. Vorbereitung auf Operation und Anästhesie

1. Bereiten Sie die chirurgischen Instrumente und das Anästhesiesystem vor.
   1. Bereiten Sie ein steriles Skalpell vor, das mit einer Klinge Nr. 11, sterilen Wattestäbchen, steriler physiologischer Kochsalzlösung, 10%iger Povidon-Jod-Lösung, 5-0 nicht absorbierbarer Polypropylen-Monofilamentnaht, Klebeband und Chlortetracyclin-Ophthalmsalbe ausgestattet ist.
   2. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente vor der Benutzung, legen Sie sie auf ein sauberes Operationsfeld und halten Sie während des gesamten Eingriffs eine aseptische Technik aufrecht. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, darunter Handschuhe, einen Laborkittel und Augenschutz.
   3. Bereiten Sie ein thermostatisches Heizkissen vor und stellen Sie es auf 37 °C ± 0,5 °C ein.
   4. Verbinden Sie die Induktionskammer und den Nasenkegel mit dem Labortier-Gasanästhesiesystem.
   5. Stellen Sie den Sauerstofffluss auf 0,5–1,0 L/min ein und bereiten Sie den Isofluran-Verdampfer für Induktion und Wartung vor. Führen Sie eine Anästhesie in einem gut belüfteten Bereich durch oder verwenden Sie ein zugelassenes Abgasabfuhrsystem.
2. Bereite die Maus auf die Operation vor.
   1. Verabreichen Sie Buprenorphin HCl (0,1 mg/kg, intraperitoneal) 30 Minuten vor Narkose und Operation gemäß dem genehmigten Tierprotokoll.
   2. Setzen Sie die Maus in die Induktionskammer und leiten Sie mit Isofluran eine Anästhesie ein. Stellen Sie den Verdampfer auf 3 %–5 % für die Induktion ein und überwachen Sie die Maus kontinuierlich, bis der Aufrichtreflex verloren geht und die spontane Gliedmaßenbewegung aufhört. Überschreiten Sie während der Induktion nicht mehr als 5 % Isofluran.
   3. Die Maus wird in der Bauchlage in einen stereotaxischen Rahmen übertragen und durch einen Nasenkegel anästhetisch gehalten. Reduzieren Sie die Einstellung des Verdampfers auf 1 %–2 % zur Erhaltung, während der Sauerstofffluss bei 0,5–1,0 L/min bleibt.
      1. Während des Eingriffs sollten Sie eine stabile Atemfrequenz von etwa 60–100 Atemzügen pro Minute aufrechterhalten. Wenn die Atemfrequenz unter 60 Atemzüge pro Minute fällt oder die Atmung flach oder unregelmäßig wird, reduzieren Sie sofort die Isoflurankonzentration, sorgen für unterstützende Erwärmung und verzögern Sie die Wirkung, bis die Atmung wieder stabil ist. Überschreiten Sie während der Pflege nicht mehr als 2 % Isofluran.
   4. Überprüfen Sie eine ausreichende Anästhesie durch das Fehlen eines Pedalrückzugsreflexes, sichern Sie den Kopf mit den Ohrbügeln des stereotaxischen Rahmens, ohne die Trommelfellhäute zu schädigen (Abbildung 2A), und halten Sie die Maus in Bauchlage aufrecht. Wenn eine ausreichende Anästhesie innerhalb der angegebenen Einleitungs- und Erhaltungsbereiche nicht erreicht wird oder eine übermäßige Atemdepression auftritt, sollten Sie das Tier von dieser Verletzungssitzung ausschließen.
   5. Tragen Sie Chlortetracyclin-Ophthalmusalbe auf beide Augen auf, rasieren Sie die Kopfhaut und desinfizieren Sie die Operationsstelle mit 10% Povidon-Jod-Lösung.

3. Etablierung des repetitiven Modell der leichten traumatischen Hirnverletzung

1. Den Schädel freilegen.
   1. Machen Sie einen längsliegenden Mittellinienschnitt von etwa 0,5 cm bis 1 cm Länge in der Kopfhaut mit einem sterilen Skalpell mit einer Klinge Nr. 11.
   2. Schneiden Sie das subkutane Gewebe und das Periost stumpf mit sterilen Pinzetten oder Wattestäbchen auf, um den Schädel vollständig freizulegen, ohne die Knochenoberfläche zu zerkratzen.
   3. Wischen Sie die Schädeloberfläche mit einem sterilen Wattestäbchen, das mit physiologischer Kochsalzlösung befeuchtet wurde, um die Schädelmarken, einschließlich Bregma und der koronalen Naht, sichtbar zu machen.
2. Bereite das Aufprallgerät vor.
   1. An der freifallenden Gewichts-Drop-Vorrichtung wird eine gebogene Metall-Schlagvorrichtung mit 4 mm Durchmesser montiert.
   2. Stellen Sie die Fallhöhe auf 25 cm ein und verwenden Sie ein Aufschlaggewicht von 20 g (Abbildung 2B).
3. Liefern Sie die Wirkung.
   1. Identifizieren Sie die Einschlagstelle an einem Punkt 2 mm links der sagittalen Naht und 2 mm hinter der koronalen Naht auf der Schädeloberfläche (Abbildung 2C).
   2. Richten Sie die Impaktorspitze vertikal über der Zielstelle aus, senken Sie sie sanft ab, bis sie die Schädeloberfläche berührt, und stellen Sie sicher, dass die Spitze zentriert und senkrecht zum Schädel bleibt, bevor Sie das Gewicht abgeben.
   3. Lösen Sie das 20-g-Gewicht aus einer Höhe von 25 cm, um einen einzigen Aufprall zu erzielen.
   4. Für die naive Gruppe sollte keine Anästhesie oder Operation durchgeführt werden. Für die Sham-Gruppe verabreichen Sie eine Anästhesie und machen Sie einen Schnitt auf der Kopfhaut, aber liefern Sie keinen Effekt.
4. Nähen Sie den Schnitt und leisten Sie postoperative Pflege.
   1. Entfernen Sie die Schlagspitze sofort nach dem Aufprall und inspizieren Sie die Operationsstelle.
   2. Schließen Sie den Kopfhautschnitt mit einer unterbrochenen 5-0 nicht resorbierbaren Polypropylen-Monofilamentnaht und desinfizieren Sie die Schnittstelle mit einer 10%igen Povidon-Jod-Lösung.
   3. Stellen Sie die Maus auf ein thermostatisches Heizkissen, das bei 37 °C ± 0,5 °C gehalten wird, überwachen Sie die Atmung bis zur vollständigen Bewusstseinswiederholung und freien Bewegungsfreiheit und bringen Sie die Maus dann zurück in ihren Stammkäfig.
      HINWEIS: Die Erholung ist definiert durch die Rückkehr regelmäßiger spontaner Atmung, die Wiederherstellung des Aufrichtreflexes und die spontane Bewegung. Akute Apnoe und sichtbare Blutungen sollten sofort nach jedem Aufprall und während der frühen Genesung überwacht werden. Tiere mit längerer Apnoe, sichtbarer Blutung, die den Aufrichtungsreflex innerhalb von 10 Minuten nach Absetzen des Isoflurans nicht wiedererlangen oder nicht innerhalb von 15 Minuten spontan bewegen, sollten von weiteren Eingriffen ausgeschlossen und gemäß dem genehmigten Tierprotokoll behandelt werden.
   4. Entsorgen Sie gebrauchte Klingen und Nadeln in einem zugelassenen Behälter für scharfe Gegenstände. Entsorgung von Tierabfällen und kontaminierten Materialien gemäß den institutionellen Biosicherheitsvorschriften.
5. Wiederhole die Verletzung.
   1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1–3.4 alle 24 Stunden für 5 aufeinanderfolgende Tage, um insgesamt 5 Effekte zu erzielen.
   2. Überwachen Sie während der gesamten postoperativen Erholungsphase kontinuierlich das Körpergewicht und die Aktivität. Tiere sollten von weiteren Analysen ausgeschlossen werden, wenn sie einen Schädelbruch, eine sichtbare Blutung, einen Krampfanfall, anhaltendes Kreisen oder die Unfähigkeit, selbstständig zu fressen oder zu trinken, entwickeln.

4. Erfassung von Magnetresonanzbildern

HINWEIS: In dieser Studie wurde am 7. Tag nach der letzten Verletzung ein MRT durchgeführt. Mäuse wurden unter Isofluran-Anästhesie gescannt und vor der Bildgebung nicht geopfert. Die Gewebeentnahme erfolgte nach der Bildgebung gemäß dem experimentellen Zeitplan.

1. Bereiten Sie das Tier für das MRT vor.
   1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran und legen Sie sie auf ein MRT-kompatibles Tierbett mit einem Nasenkegel.
   2. Überwachen Sie die Atmung während des gesamten Scans und halten Sie die Körpertemperatur bei 37 °C ± 0,5 °C.
2. Erfassung von T2-gewichteten Bildern
   1. Aufnahme von Bildern auf einem 9,4 T supraleitenden Magneten mit 30 cm Bohrung und einem Gradientensystem mit einer maximalen Gradientenstärke von 1000 mT/m und einer maximalen Slew-Rate von 10.000 T/m/s.
   2. Verwenden Sie eine 86-mm-Lautstärkespule für die Hochfrequenzübertragung und eine 15-mm-Planar-Oberflächenspule für den Signalempfang.
   3. Erfassung von T2-gewichteten, hochauflösenden Mehrschnitt-Schnell-Spin-Echo-Bildern unter Verwendung folgender Parameter: Wiederholungszeit = 3000 ms, Echozeit = 46,34 ms, Echozuglänge = 13, Empfängerbandbreite = 220 Hz/Pixel, Sichtfeld = 20 × 20 mm², Erfassungsmatrix = 208 × 208, Schnittdicke = 0,5 mm, Schnittspalt = 0 mm und Anzahl der Anregungen = 2.
   4. Nehmen Sie 30 Scheiben, um das gesamte Gehirn zu bedecken. Nutze eine Gesamtaufnahmezeit von 1 Minute 33 Sekunden. In der vorliegenden Studie wurde das T2-gewichtete MRT ausschließlich für die qualitative Bewertung verwendet. Es wurde keine quantitative MRT-Analyse durchgeführt.
      HINWEIS: MRT-Bilder wurden qualitativ von einem Prüfer überprüft, der für Gruppenzuweisungen blind war.

5. Bewertung der groben Neuropathologie

1. Führen Sie Gewebeentnahme durch.
   1. Betäuben Sie die Maus gründlich gemäß dem genehmigten Tierprotokoll.
   2. Öffnen Sie die Brusthöhle, legen Sie das Herz frei, führen Sie eine Perfusionsnadel in den linken Ventrikel ein und schneiden Sie den rechten Vorhof.
   3. Perfuse mit normaler Kochsalzlösung, dann mit 4 % Paraformaldehyd (PFA). Führen Sie das gesamte Perfusionsverfahren in einer zertifizierten chemischen Abzughaube durch und vermeiden Sie direkten Haut- oder Blickkontakt mit PFA. Entsorgung von Geweben und flüssigen Abfällen gemäß den Vorschriften für gefährliche Abfälle und Biosicherheit.
   4. Sammeln Sie den Schädel und das intakte Gehirn und machen Sie grobe Bilder mit einer hochauflösenden Kamera.
      HINWEIS: Eine grobe pathologische Untersuchung wurde von einem Prüfer durchgeführt, der für die Gruppenzuweisung blind war.

6. Körpergewicht überwachen

1. Nimm das Körpergewicht auf.
   1. Wiegen Sie jede Maus vor der ersten Verletzungssitzung sowie an den Tagen 1, 3, 7, 14, 21 und 30 nach der Verletzung und notieren Sie die Werte, um den allgemeinen Gesundheitszustand über die Zeit zu beurteilen.

7. Durchführung des Beam-Walk-Tests

1. Bereitet das Gerät vor.
   1. Verwenden Sie einen horizontalen Holzbalken, der 1 m lang und 1 cm breit ist, und hängen Sie ihn 30 cm über dem Boden auf.
2. Teste motorische Koordination.
   1. Platziere die Maus am Startende des Strahls, lasse sie bis zum Endpunkt fahren und notiere die Zeit, die benötigt wird, um den Balken zu überqueren.
   2. Führen Sie den Test vor der Verletzung sowie an den Tagen 1, 3, 7, 14, 21 und 30 nach der Verletzung durch.
      HINWEIS: Verhaltenstests wurden so geplant, dass die Übertragungseffekte zwischen den Tests minimiert werden. Da der Heckaufhängungstest (TST) und der Zwangsschwimmtest (FST) stressanregender sind als der Open-Field-Test (OFT), wurden sie zuerst durchgeführt, gefolgt vom OFT- und Barnes-Labyrinth zu späteren Zeitpunkten. Diese Sequenz wurde ausgewählt, um potenzielle Störungen durch vorherige Gewöhnung oder wiederholte explorative Exposition bei nachfolgenden Verhaltensanalysen zu reduzieren.

8. Durchführung des Heckaufhängungstests

1. Bereitet das Gerät vor.
   1. Führen Sie den Test am Tag 7 nach der Verletzung durch und setzen Sie einen Plexiglaszylinder über den Heck, um das Klettern des Schwanzes zu verhindern. Verwenden Sie einen Zylinder von 4 cm Länge mit einem Außendurchmesser von 1,6 cm, einem Innendurchmesser von 1,2 cm und einem Gewicht von 1,6 g.
2. Nimm das Verhalten auf.
   1. Befestige den Schwanz mit Klebeband an der Aufhängungsbox, stelle sicher, dass die Maus den Boden der Box nicht erreicht, und hänge die Maus 3 Minuten lang auf.
   2. Nehmen Sie die gesamte Sitzung mit einer hochauflösenden Kamera auf und analysieren Sie die Mobilitäts- und Unbeweglichkeitszeit manuell anhand des aufgenommenen Videos durch einen geblendeten Beobachter.

9. Durchführung des erzwungenen Schwimmtests

1. Bereitet das Gerät vor.
   1. Führen Sie den Test am Tag 10 nach der Verletzung durch und füllen Sie einen transparenten Zylinder von 25 cm Höhe und 15 cm Durchmesser mit Wasser, das bei 23–25 °C gehalten wird. Verwenden Sie eine Wassertiefe, die verhindert, dass Schwanz und Hinterbeine den Boden berühren.
2. Nimm das Verhalten auf.
   1. Setzen Sie die Maus für 6 Minuten ins Wasser und nehmen Sie die gesamte Sitzung mit einer hochauflösenden Kamera auf.
   2. Analysieren Sie die letzten 4 Minuten der Aufzeichnung manuell durch einen geblendeten Beobachter und quantifizieren Sie Mobilitäts- und Unbeweglichkeitszeit.
   3. Definieren Sie Unbeweglichkeit nur als die minimalen Bewegungen, die notwendig sind, um den Kopf über Wasser zu halten.

10. Durchführung des Open-Field-Tests

1. Bereitet das Gerät vor.
   1. Führen Sie den Test am Tag 14 nach der Verletzung in einem ruhigen Raum unter gleichmäßiger Beleuchtung durch. Dieser spätere Zeitpunkt wurde gewählt, um eine Trennung von den vorherigen TST- und FST-Sitzungen zu ermöglichen und so die Übertragung von akutem Stress in die OFT zu verringern.
   2. Verwenden Sie eine offene Feldbox mit den Maßen 40 cm × 40 cm × 40 cm.
2. Erfassen und analysieren Sie exploratives Verhalten.
   1. Stelle die Maus in die Mitte der Arena und lass sie 6 Minuten lang frei erkunden.
   2. Verfolgen Sie das Verhalten 6 Minuten lang mit einer Verhaltensverfolgungs- und Analysesoftware. Kalibrieren Sie die Arenamaße in der Software so, dass sie mit dem 40-cm-×-40-cm-Gerät übereinstimmen, und teilen Sie die Arena virtuell in ein 5-×-5-Gitter auf.
   3. Definieren Sie die 16 äußeren Quadrate als periphere Zone und die 9 inneren Quadrate als Mittelzone. Stelle die Tierfarbe dunkler als die Hintergrundfarbe. Verfolgen Sie nur den Körper des Tieres; Verfolgen Sie weder Kopf noch Schwanz. Erfassen Sie den Hintergrund manuell.
   4. Verwenden Sie die Software, um die mittlere Geschwindigkeit, die Zeit in der Mittelzone, die Zeit in der peripheren Zone und die gesamte zurückgelegte Strecke während des gesamten Testzeitraums zu messen.
   5. Reinigen und deodorieren Sie das Gerät vor und nach jedem Versuch, um Riechspuren zu entfernen.

11. Aufführung des Barnes-Labyrinths

1. Bereitet das Gerät vor.
   1. Beginnen Sie am 30. Tag nach der Verletzung mit der Barnes-Labyrinth-Bewertung.
   2. Verwenden Sie eine runde Edelstahlplattform mit 1 m Durchmesser und 20 gleichmäßig verteilten Löchern.
   3. Platziere die Fluchtbox unter einem bestimmten Zielloch, platziere visuelle Hinweise rund um das Labyrinth und halte die Ziellochposition für alle Versuche konstant.
2. Durchführung der Ausbildungsphase
   1. Schalte während des Trainings 90 dB weißes Rauschen als aversiven Reiz ein.
   2. Platziere die Maus für 120 Sekunden unter einen transparenten Zylinder in der Mitte der Plattform.
   3. Entferne den Zylinder und lass die Maus bis zu 180 Sekunden erkunden.
   4. Einen erfolgreichen Versuch aufzeichnen, wenn alle vier Pfoten in die Fluchtbox eintreten.
   5. Führe die Maus in den Escape-Box, falls sie das Ziel innerhalb von 180 Sekunden nicht findet, und notiere die Latenz mit 180 Sekunden.
   6. Lass die Maus 60 Sekunden in der Escape-Box bleiben.
   7. Wiederholen Sie die Trainingsprobe jeweils einmal nach einem 4–5-Stunden-Intervall an jedem Trainingstag und trainieren Sie an 4 aufeinanderfolgenden Tagen.
3. Durchführung der Ruhetags- und Testphase
   1. Pausieren Sie das Training für einen Tag nach der Trainingsphase.
   2. Stelle die Maus am Testtag in die Mitte der Plattform und ermögliche Erkundung bis zu 180 Sekunden.
   3. Stellen Sie den Labyrinthdurchmesser für die Kalibrierung der Skala auf 100 cm ein und stellen Sie sicher, dass die Tracking-Arena im Videobild zentriert ist. Setze die Tierfarbe dunkler als den Hintergrund. Verfolgen Sie nur den Körper des Tieres; Verfolgen Sie weder Kopf noch Schwanz. Erfassen Sie den Hintergrund manuell.
   4. Zeichnen Sie die Latenz zum Eintritt in die Escape Box, die mittlere Geschwindigkeit und die gesamte zurückgelegte Distanz während der 180-Sekunden-Testsitzung mit einer Software zur Verhaltensverfolgung und -analyse auf. Definieren Sie die Fluchtzone in der Software anhand des Standorts des vorgesehenen Ziellochs vor der Analyse.

12. Datenanalyse

1. Bereiten Sie den Datensatz vor.
   1. Sammeln Sie die Verhaltens-, Bildgebungs- und Körpergewichtsdaten in einer statistischen und grafischen Software.
   2. Drücken Sie die Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus.
2. Führen Sie statistische Analysen durch.
   1. Analysieren Sie in dieser Studie Daten zum Longitudinalen Körpergewicht und zum Strahlgang mit einem linearen Mixed-Effects-Modell mit Gruppe, Zeit und deren Wechselwirkung als feste Effekte und Tier als Zufallseffekt, gefolgt von post-hoc-Mehrfachvergleichstests, sofern anwendbar.
   2. Analysieren Sie TST-, FST-, OFT- und Barnes-Labyrinth-Ergebnisse mit gewöhnlicher Einweg-ANOVA für normalverteilte Daten mit homogenen Varianzen, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test, wenn die Gesamt-ANOVA signifikant war. Für nichtparametrische Daten verwenden Sie den Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Dunns Post-hoc-Test.
   3. Berichte exakte p.-Werte, wann immer verfügbar, zusammen mit der Teststatistik, Freiheitsgraden und einem Effektgrößenmaß (R² für Einweg-ANOVA). Leiten Sie alle gemeldeten p-Werte aus den oben genannten statistischen Tests ab und führen Sie alle Analysen in der Statistik- und Grafiksoftware durch.
   4. Setze die statistische Signifikanz auf S. < 0,05.

Ergebnisse

Bildgebende und neuropathologische Beurteilung von C-TBI-Mäusen

Um den allgemeinen Gesundheitszustand und die basale motorische Funktion der Tiere zu bewerten, wurden Körpergewichte und Balkenlaufleistungen gemäß dem in Abbildung 1 dargestellten Zeitplan überwacht. Longitudinale Gruppenunterschiede wurden mit einem linearen Mixed-Effects-Modell analysiert, bei dem Tier als Zufallseffekt diente. Vor der Modellierun...

Diskussion

Diese Studie beschreibt ein standardisiertes experimentelles Protokoll zur Etablierung eines Mausmodells für wiederholte leichte traumatische Hirnverletzungen (rmTBI) mittels einer wiederholten Freifall-Gewichts-Drop-Methode. Durch das Festhalten der schädelexponierten Maus in einem stereotaxischen Gerät und wiederholtes Aufschlagen auf definierte Koordinaten mit einem 20-g-Gewicht, das aus einer Höhe von 25 cm für fünf aufeinanderfolgende Tage abgesetzt wurde, wurde ein Verhaltensphänot...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5-0 nicht resorbierbare Polypropylen-Monofilament-Naht	Jinhuan Medical	I303	Wundverschluss
Anästhesiegerät	RWD Life Science	R550	Konstruktion von Tiermodellen
ANY-maze Verhaltensverfolgungssoftware	Stoelting	Version 7	Verhaltenssoftware
Barnes-Labyrinth	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XB108	Verhaltenssoftware
Biorender	BioRender	https://biorender.com	Wissenschaftliche Forschungszeichnungssoftware
Buprenorphin	Sigma-Aldrich	Y0001108	postoperative Analgesie
Elektrorasierer	AUX	AUX-C5-1	voroperative Haarentfernung
Zwangsschwimmtest	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	Verhaltenssoftware
GraphPad Prism 9.5	La Jolla	9.5	Statistische Software
Isofluran	RWD Life Science	R510-22-10	Konstruktion von Tiermodellen
Mäuse	Charles river	C57/6N	Versuchstier
Offenes Feld Test	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XZ301	Verhaltenssoftware
Ophthalmische Salbe	BEIJING TWINLUCK PHARMACEUTICAL	H11021342	Verhinderung des Austrocknens der Hornhaut während der Narkose
Paraformaldehyd (PFA), 4%	Biosharp	BL539A	Perfusion und Gewebefixierung
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Biosharp	BL1425A	Perfusion und Gewebewaschung
Povidon-Iod-Lösung, 10%	Beyotime	27883-25g	Hautdesinfektion vor der Operation
Präklinisches Magnetresonanztomographie-System	United Imaging Life Science Instrument	uMR9.4T	Bildgebungssoftware
Skalpellklinge Nr. 11	Jinhuan Medical	K3-11	Hautschnitt während der Operation
Skalpellgriff	Jinhuan Medical	K6-10	Verwendet mit Skalpellklinge Nr. 11
Stereotaktisches Instrument	RWD Life Science	68025	Konstruktion von Tiermodellen
Steriles Gaze	HYNAUT	BK05	Blutstillung und chirurgische Reinigung
Schwanzsuspensionstest	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	Verhaltenssoftware
Gewichtsabwurf-Impaktor	RWD Life Science	68093	Konstruktion von Tiermodellen