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Methodenartikel

Ein auf Fibroblasten basierendes adenovirales Reporter-System unter der Kontrolle des Maus-Kollagen-Typ-I-Alpha-1-Promotors für das Screening antifibrotischer Wirkstoffe

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DOI:

10.3791/71678

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14. August 2026

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1Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Ministry of Education, Shihezi University School of Medicine, 2NHC Key Laboratory of Cardiopulmonary Rehabilitation and Functional Recovery; Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), 3School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences, 4Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, 5State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University Institute of Advanced Clinical Medicine, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 7Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, 8Haihe Laboratory of Cell Ecosystem

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines auf Fibroblasten basierenden adenoviralen Reportersystems, das durch einen Promotor für mausartiges Kollagen vom Typ I gesteuert wird, um eine Langzeitüberwachung der Fibroblastenaktivierung zu ermöglichen und die Hochdurchsatz-Screening von antifibrotischen Substanzen zu erleichtern.

Zusammenfassung

Kardiale Fibrose, gekennzeichnet durch eine fehlgeleitete Aktivierung von Fibroblasten und eine übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix, verfügt über keine zielgerichteten Therapien, hauptsächlich aufgrund des Fehlens longitudinaler, skalierbarer und nicht-destruktiver in vitro Screening-Plattformen. Herkömmliche Endpunkt-Assays und ressourcenintensive Stammzellmodelle schließen eine Echtzeitüberwachung des fibrotischen Fortschritts von vornherein aus. Um diese Einschränkungen zu überwinden, beschreibt dieses Protokoll die Erzeugung, Optimierung und Validierung eines maus-spezifischen Kollagen Typ I alpha 1 (Col1a1) Promotor-gesteuertes adenovirales mCherry fluoreszierendes Reportersystem (Ad-mCol1a1p-mCherryin NIH/3T3-Fibroblasten. Die entscheidenden Schritte für die Verpackung rekombinanter Adenoviren, die Optimierung der Transduktion (Multiplizität der Infektion) zur Minimierung der Zytotoxizität sowie die Einrichtung eines robusten, durch transformierendes Wachstumsfaktor-beta (TGF-β) induzierten Fibrosemodells werden detailliert beschrieben. Durch den Verzicht auf Zellfixierung ermöglicht dieses System eine direkte und longitudinale Beobachtung der Kollagen-Transkription in lebenden Zellen. Die Spezifität und Zuverlässigkeit des Modells werden pharmakologisch mittels des TGF-β-Typ-I-Rezeptor-(ALK5-)Inhibitors SB431542 validiert, wobei die fluoreszenten Signale mit endogenen fibrotischen Markern korrelieren, die durch umgekehrte Transkription und quantitative Polymerase-Kettenreaktion sowie Enzym-gekoppelte Immunosorbens-Assay quantifiziert wurden. Letztendlich stellt diese kostengünstige Plattform ein leicht zugängliches Werkzeug für das Hochdurchsatz-Screening neuartiger antifibrotischer Wirkstoffe dar und beschleunigt damit die translationale kardiovaskuläre Forschung.

Einleitung

Die Behandlung der kardialen Fibrose stellt erhebliche klinische Herausforderungen dar. Sie ist gekennzeichnet durch die fehlgeleitete Aktivierung ruhender Fibroblasten zu Myofibroblasten und eine übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM) und stellt einen irreversiblen Endweg dar, der bei Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt und anderen kardiovaskulären Erkrankungen gemeinsam auftritt1,2,3. Aktuelle Behandlungsstrategien stoßen jedoch an erhebliche Grenzen. Herkömmliche Therapieansätze – wie Diuretika, β-Blocker und Inhibitoren des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems – lindern hauptsächlich den systemischen hämodynamischen Stress und verringern die neurohumorale Aktivierung4,5,6,7. Diese Therapien greifen die Fibroblastenaktivierung nicht direkt an und können die andauernde Kollagenablagerung nicht stoppen. Zudem bleibt die Umsetzung der Erkenntnisse über pathologische Signalwege – wie den Transforming-Growth-Factor-beta (TGF-β)/Smad-Weg, oxidativen Stress und metabolische Umprogrammierung – in direkte antifibrotische Therapien aufgrund systemischer Toxizitäten und unspezifischer Abgabemechanismen schwierig8,9,10. Daher besteht dringender Bedarf an neuartigen, zielgerichteten antifibrotischen Therapien. Eine wesentliche translatationale Engstelle ist das Fehlen funktioneller Evaluierungssysteme, die in der Lage sind, die Fibroblastenaktivierung empfindlich und dynamisch zu erfassen. Traditionelle experimentelle Modelle weisen erhebliche Einschränkungen auf, die ein effizientes pharmakologisches Screening verhindern11,12. Obwohl in vivo-Tiermodelle die globale kardiale Remodellierung nachbilden, leiden sie unter artspezifischen Unterschieden, langen Versuchszeiträumen, hohen Kosten und geringer Durchsatzkapazität11.

Um diese Hürden zu überwinden, sind verschiedene in vitro-Screening-Plattformen entstanden; kritische methodische Mängel bestehen jedoch weiterhin. Immunfluoreszenz-Verfahren mit hohem Informationsgehalt erfordern die zerstörerische Fixierung von Zellen und einen aufwändigen Prozessablauf, wodurch lediglich eine statische Momentaufnahme und nicht die Echtzeit-Kinetik der Fibroblastenaktivierung erfasst wird. Ebenso weisen Plattformen, die markierungsfreie Impedanzüberwachung mit Massenspektrometrie (MS/MS) kombinieren, eine mangelnde Spezifität und geringe Skalierbarkeit auf, da durch allgemeine zelluläre Toxizität verursachte Impedanzabnahmen leicht mit einer echten antifibrotischen Wirksamkeit verwechselt werden können. Darüber hinaus zeigen CRISPR-(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-basierte Reportersysteme, die unter Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zytoskelettale Marker (z. B. alpha-smooth muscle actin [α-SMA]/ACTA2) verfolgen, erhebliche translative Barrieren13. Diese auf iPSCs basierenden Modelle sind prohibitiv teuer, technisch anspruchsvoll und für routinemäßige Hochdurchsatz-Screenings weitgehend unzugänglich. Zudem spiegelt die alleinige Abhängigkeit von zytoskelettalen Markern wie α-SMA möglicherweise nicht genau den pathologischen Endpunkt wider, da ihre Expression nicht strikt mit der funktionellen Sekretion und übermäßigen Ablagerung der ECM korreliert14. Daher sind diese Systeme ungeeignet, um zelluläre Reaktionen in frühen Stadien auf pharmakologische Interventionen über einen längeren Zeitraum hinweg zu verfolgen.

Im Gegensatz dazu beschreibt dieses Protokoll ein longitudinales funktionelles Reportersystem, das durch den Promotor von Kollagen Typ I alpha 1 (Col1a1) angetrieben wird und darauf abzielt, eine nicht destruktive und robuste Plattform zur Überwachung der Fibroblastenaktivierung einzurichten. Da Kollagen Typ I die vorherrschende im extrazellulären Matrix (ECM) abgelagerte Komponente während der kardialen Remodeling-Prozesse ist, ermöglicht die Erfassung der transkriptionellen Aktivierung des kodierenden Gens Col1a1 eine direkte und pathologisch relevante Messung der Fibroblastenaktivierung. Dieses auf dem Col1a1-Promotor basierende Modell erlaubt eine kontinuierliche, molekulare Überwachung fibrotischer Prozesse und bietet eine empfindliche, longitudinale und quantifizierbare Plattform, die für die mechanismenbasierte Wirkstoffscreening optimiert ist.

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Protokoll

Wir bestätigen, dass alle Experimente gemäß den institutionellen und nationalen Richtlinien durchgeführt wurden. Da diese Studie ausschließlich die etablierte Mausembryofibroblasten-Zelllinie NIH Swiss (NIH/3T3) und das mCol1a1p-mCherry-Reportersystem verwendete und keine Wirbeltiere, Embryonen oder menschlichen Probanden einbezog, war eine ethische Genehmigung durch eine institutionelle Prüfkommission für die in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren nicht erforderlich.

Alle Verfahren mit rekombinanten adenoviralen Vektoren wurden gemäß den institutionellen Biosicherheitsvorschriften und den Standardpraktiken der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Der Umgang mit Viren, die Transduktion, Lagerung und Entsorgung von Abfällen erfolgten unter Verwendung zertifizierter Sicherheitswerkbänke und der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung. Flüssige Abfälle, die adenovirales Material enthielten, wurden vor der Entsorgung mit frisch zubereiteter Bleichlösung dekontaminiert, und kontaminierte Verbrauchsmaterialien wurden gemäß den institutionellen Biosicherheitsprotokollen autoklaviert. Bei versehentlichen Verschüttungen wurde unverzüglich gemäß den institutionellen Verfahren zur Unfallbeseitigung mit zugelassenen viruziden Mitteln desinfiziert.

1. Übersicht über den experimentellen Arbeitsablauf

  1. Erzeugen Sie ein maus-spezifisches, vom Col1a1-Promotor gesteuertes rekombinantes Adenovirus, wie in Schritt 2 beschrieben.
  2. Optimieren Sie die Virus-Transduktionsbedingungen in NIH/3T3-Fibroblasten, wie in Schritt 3 beschrieben.
  3. Stellen Sie ein TGF-β-antwortfähiges in vitro-Fibrose-Reportersystem auf, wie in Schritt 4 beschrieben.
  4. Überprüfen Sie die Stabilität, Spezifität und biologische Reproduzierbarkeit des Modells mittels zeit- und dosisabhängiger Stimulation mit TGF-β, wie in Schritt 4 beschrieben.
  5. Führen Sie eine pharmakologische Hemmung mit SB431542 durch, wie in Schritt 5 beschrieben.
  6. Führen Sie downstream Analysen mittels Enzym-gekoppelter Immunosorbent-Assay (ELISA) und quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) durch, wie in Schritt 5 beschrieben.
    HINWEIS: Siehe Abbildung 1A für eine schematische Übersicht des experimentellen Arbeitsablaufs. Siehe die Materialtabelle für experimentelle Geräte und Reagenzien.

Schema des mCol1a1p-mCherry-Adenovirus-Reportersystems; PCR, Plasmidklonierung, Fibroblasten-Screeningprozess.
Abbildung 1. Arbeitsablauf zur Herstellung und Validierung des mCol1a1p-mCherry-Adenovirus-Reportersystems in Fibroblasten. (A) Schematische Übersicht über den Aufbau des adenoviralen (AdV) mCol1a1p-mCherry-Reportersystems und den experimentellen Arbeitsablauf zur Modellvalidierung in NIH/3T3-Fibroblasten. Der Arbeitsablauf umfasst die Promotorklonierung, die Herstellung rekombinanter Adenoviren, die virale Verpackung in HEK293-Zellen, die Optimierung der Multiplizität der Infektion (MOI) sowie anschließende Fluoreszenz-Screenings mit hoher Inhaltsgenauigkeit. (B) Vertretende Fluoreszenzbilder von NIH/3T3-Fibroblasten, die mit dem Ad-mCol1a1p-mCherry-Adenovirus bei MOIs von 0, 1, 10, 100 und 1000 infiziert wurden. Die Kerne wurden mit Hoechst 33342 (blau) angefärbt, und die mCherry-Fluoreszenz (rot) zeigt die Aktivität des Col1a1-Promotors an. Die Fluoreszenzintensität wurde mittels Bildgebung mit hoher Inhaltsgenauigkeit quantifiziert und auf die Anzahl der Kerne normalisiert. Basierend auf einer robusten und homogenen Reportergenexpression mit minimalen morphologischen Veränderungen wurde eine MOI von 100 für nachfolgende Experimente ausgewählt. Maßstabsbalken = 200 µm. Diese Abbildung wurde mit BioRender.com unter Verwendung lizenzierter Inhalte erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Konstruktion, Verpackung und Amplifikation des mCol1a1-Promotor-Adenovirus

  1. Konstruktion des rekombinanten adenoviralen Vektors
    1. Klonen Sie das 2354 bp lange Fragment des murinen Col1a1-Promotors (genomische Koordinaten: chr11:94824779–94827132; −2271 bis +83 bp relativ zur Transkriptionsstartstelle [TSS]) upstream des mCherry-Reportergens in den pDC315-Adenovirus-Shuttlevektor.
      HINWEIS: Die vollständige Sequenz des Col1a1-Promotors sowie die detaillierte Plasmidkarte von pDC315-mCol1a1p-mCherry sind in der Zusatzdatei 1 und Zusatzabbildung 1 enthalten.
    2. Linearisieren Sie den pDC315-Vektor mit BamHI und KpnI. Amplifizieren Sie das Promoter-Insert mithilfe von Primern, die 15–25 bp lange Homologiearme enthalten.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine auf homologer Rekombination basierende nahtlose Klonierungsstrategie, um die in vitro-Rekombination zu erleichtern.
    3. Überprüfen Sie das resultierende Plasmid durch PCR-Analyse und Sanger-Sequenzierung.
      HINWEIS: Untersuchen Sie sorgfältig die Sequenz an der Übergangsstelle zwischen Promotor und Reporter, um sicherzustellen, dass keine Leserasterverschiebungen oder vorzeitigen Stoppcodons vorliegen.
    4. Erzeugen Sie das rekombinante Adenovirus unter Verwendung des AdMax-Systems durch intrazelluläre, Cre-vermittelte Rekombination.
      HINWEIS: Das pBHGloxΔE1,3Cre-Backbone-Plasmid enthält ein nicht replikationsfähiges Ad5-Genom mit Deletionen der E1/E3-Regionen sowie eine Expressionskassette für die Cre-Rekombinase, die die standortspezifische Rekombination an der loxP-Stelle des Shuttlevektors ermöglicht.
    5. Kotransfizieren Sie HEK293-Zellen mit dem validierten pDC315-mCol1a1p-mCherry-Shuttlevektor und dem pBHGloxΔE1,3Cre-Adenovirus-Backbone-Plasmid.
  2. Adenovirus-Verpackung und Amplifikation
    1. Kultivieren Sie HEK293-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS). Verwenden Sie Zellen mit niedriger Passagezahl (<20 Passagen) für die Adenovirus-Verpackung.
    2. Säen Sie HEK293-Zellen 24 h vor der Transfektion mit einer Konfluenz von 30–40 % aus, um zum Zeitpunkt der Transfektion eine Konfluenz von 50–60 % zu erreichen.
    3. Kotransfizieren Sie HEK293-Zellen mit jeweils 5 µg Shuttleplasmid und 5 µg pBHGloxΔE1,3Cre-Hilfsplasmid unter Verwendung des Lipofectamine-2000-Transfektionsreagenzes.
      HINWEIS: Halten Sie ein Verhältnis von DNA zu Reagenz von 1:1 ein (10 µg Gesamt-DNA zu 10 µL Transfektionsreagenz).
    4. Kultivieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und überwachen Sie sie täglich auf zytopathische Effekte.
      HINWEIS: Die ersten zytopathischen Effekte können 7–14 Tage benötigen, um sichtbar zu werden. Falls das Medium sauer wird (gelbliche Färbung), führen Sie einen vorsichtigen Halbaustausch des Mediums durch, ohne die Zellen zu stören.
    5. Sammlen Sie die Zellen und das Überstandmedium, sobald typische zytopathische Effekte – gekennzeichnet durch Zellrundung und Schrumpfung – beobachtet werden und mindestens 50 % der Zellen sich von der Kulturoberfläche gelöst haben.
      HINWEIS: Dieser Zustand wird typischerweise 10–15 Tage nach der Transfektion erreicht.
    6. Führen Sie drei Gefrier-Tau-Zyklen durch, indem Sie die Proben 30 Minuten lang bei −70 °C einfrieren und anschließend in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen.
    7. Vortexen Sie die Suspension nach jedem Auftauschvorgang 30 Sekunden lang, um die Zelllyse zu unterstützen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine verlängerte Inkubation bei 37 °C während des Auftauens, um die Virusstabilität zu erhalten.
    8. Stellen Sie zehnfache serielle Verdünnungen des Viruslysats (10−1 bis 10−13) in vollständigem DMEM her. Geben Sie 90 µL jeder Virusverdünnung auf HEK293-Zellen, die in 96-Well-Platten ausgesät wurden, jeweils mit 10 Wiederholungswells pro Verdünnung.
      HINWEIS: Eine Viruslast von ≥1 × 109 PFU/mL wurde als ausreichender Amplifikationsendpunkt für die nachfolgende Reinigung definiert.
    9. Klären Sie 10 mL rohes Viruslysat durch Filtration über einen 0,45 µm-Filter, um zelluläre Trümmer zu entfernen.
    10. Behandeln Sie das geklärte Lysat mit Benzonase-Nuklease (10 U/mL) bei 37 °C für 30 Minuten.
    11. Reinigen Sie das rekombinante Adenovirus mithilfe des Adeno-X-Virus-Reinigungs-Kits gemäß den Herstelleranweisungen.
      HINWEIS: Mischen Sie das Lysat vor dem Auftragen auf den vorgleichgewichteten Reinigungsfilter mit 1× Verdünnungspuffer. Waschen Sie den Filter mit 1× Waschpuffer und eluieren Sie das gereinigte Virus mit 3 mL 1× Elutionspuffer.
    12. Inkubieren Sie die Platten 10 Tage lang und bewerten Sie die zytopathischen Effekte (CPE) unter dem Lichtmikroskop. Bewerten Sie positive CPE anhand charakteristischer Zellrundung und -ablösung. Berechnen Sie die infektiöse Viruslast nach der Spearman-Karber-Methode basierend auf der CPE-Bewertung.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der endgültige Virusstamm mindestens 1 × 1011 PFU/mL erreicht, um für nachfolgende Anwendungen geeignet zu sein.
    13. Portionieren Sie das gereinigte Adenovirus und lagern Sie den Virusstamm bei −80 °C.
      HINWEIS: Lagern Sie die gereinigten Adenovirus-Aliquote langfristig bei −80 °C. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen, um die Virusinfektiosität zu erhalten.

3. Zellkultur und Optimierung der Virusinfektionsbedingungen

  1. Nähren Sie NIH/3T3-Fibroblasten in DMEM/Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F12), ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin.
    ANMERKUNG: Verwenden Sie Zellen zwischen den Passagen 3 und 8, die im Ausgangsfläschchen eine Konfluenz von 70 %–80 % erreicht haben, um einen konsistenten Zellzustand sicherzustellen.
  2. Säen Sie NIH/3T3-Fibroblasten in 384-Well-Platten mit jeweils 4 × 103 Zellen pro Well in 40 µL vollständigem Kulturmedium aus.
  3. Incubieren Sie die Zellen 12 h lang bei 37 °C mit 5 % CO₂, um die Zelladhäsion und den Eintritt in die exponentielle Wachstumsphase zu ermöglichen.
    ANMERKUNG: Um eine ungleichmäßige Zellverteilung und Randeffekte zu minimieren, stellen Sie die Platten vor der Inkubation 20–30 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhend ab. Füllen Sie die äußersten Wells mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder sterilen Wasser.
  4. Infizieren Sie die Zellen mit dem rekombinanten Adenovirus bei Multiplizitäten der Infektion (MOIs) im Bereich von 1–1.000 zusammen mit einer nicht infizierten Kontrolle.
    ANMERKUNG: Berechnen Sie das erforderliche Adenovirus-Volumen anhand der folgenden Formel:

    Formel für die Viruslast V=N×MOI/T, mathematische Gleichung für die Virologieforschung und -analyse
    Dabei ist V das Volumen der Adenovirus-Stammlösung (mL), N die Anzahl der ausgesäten Zellen pro Well (4 × 103), MOI die gewünschte Multiplizität der Infektion und T die infektiöse Virus-Titer (PFU/mL). Die in dieser Studie verwendete Virusstammlösung wies einen infektiösen Titer von 1 × 1011 PFU/mL auf, wie durch die in Schritt 2.2.12 beschriebene Spearman-Karber-Methode bestimmt.
  5. Stellen Sie sicher, dass das zugegebene Volumen der Virusstammlösung 10 % des Gesamtvolumens pro Well nicht überschreitet.
    ANMERKUNG: Zu große Volumina der Virusstammlösung können den pH-Wert des Mediums verändern und unspezifische Zytotoxizität hervorrufen.
  6. Ersetzen Sie das virushaltige Medium 24 Stunden nach der Infektion durch jeweils 40 µL frisches, vollständiges Kulturmedium.
    ANMERKUNG: Verwenden Sie DMEM/F12, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, wie in Schritt 3.1 beschrieben.
  7. Führen Sie den Mediumwechsel mittels eines automatisierten Flüssigkeitshandlers mit niedriger Geschwindigkeit durch oder kippen Sie die Spitzen eines Mehrkanalpipettiersystems vorsichtig an der oberen Seitenwand jedes Wells an.
    ANMERKUNG: Vermeiden Sie die Standard-Vakuumaspiration beim Umgang mit 384-Well-Platten, um Zellablösungen zu minimieren.
  8. Definieren Sie die optimale MOI als die niedrigste virale Dosis, die eine sichtbare und homogene mCherry-Fluoreszenz erzeugt, während die Zellmorphologie und die Kernanzahlen mit denen der nicht infizierten Kontrollzellen vergleichbar bleiben.
    ANMERKUNG: Bewerten Sie die Reporterexpression anhand der mit Hoechst gefärbten Kernanzahlen und der Fluoreszenzbildgebung. Die Zellen sollten ihre charakteristische spindelförmige Morphologie beibehalten, ohne Abrundung oder Ablösung. Zu hohe MOIs können eine basale mCherry-Aktivierung über zelluläre Stressreaktionen hervorrufen. Repräsentative Fluoreszenzresultate bei verschiedenen MOIs sind in Abbildung 1B dargestellt.
  9. Wählen Sie die optimierte MOI für alle nachfolgenden Experimente aus.
    ANMERKUNG: In dieser Studie wurde eine MOI von 100 für nachfolgende Experimente gewählt.

4. Bewertung der Modellstabilität mittels TGF-β-Stimulation

  1. Infizieren Sie NIH/3T3-Fibroblasten mit dem rekombinanten Adenovirus bei dem optimierten MOI von 100, wie in Schritt 3.9 bestimmt.
  2. Entziehen Sie die Fibroblasten dem Serum, indem Sie sie 12 h vor der TGF-β-Stimulation in DMEM/F12 mit 0,2 % FBS serumfrei kultivieren.
    ANMERKUNG: Die Serumentzug-Behandlung diente der Synchronisierung der Zellen und zur Minimierung der basalen Aktivierung des Col1a1-Promotors.
  3. Bereiten Sie eine Stammlösung aus rekombinantem humanem TGF-β bei 100 µg/mL mit 4 mM HCl und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) vor.
    ANMERKUNG: Portionieren Sie die TGF-β-Stammlösung in kleine Volumina und lagern Sie sie bei −80°C, um wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen zu vermeiden.
  4. Behandeln Sie die Zellen mit einem Konzentrationsgradienten an TGF-β im Bereich von 0–40 ng/mL in sechs unabhängigen biologischen Wiederholungen.
    ANMERKUNG: Die Bedingung mit 0 ng/mL diente als nicht stimulierter Kontrollansatz.
  5. Inkubieren Sie die stimulierten Zellen bei 37°C mit 5 % CO₂ für 24, 48 oder 72 h. Verwenden Sie separate parallele Platten für jeden Bildaufnahmezeitpunkt, um die kumulative Phototoxizität zu minimieren.
  6. Färben Sie die Zellen 15 min vor der Bildaufnahme mit einer Hoechst-33342-Lösung bei einer endgültigen Arbeitskonzentration von 2,5 µg/mL.
    ANMERKUNG: Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie die Stammlösung von 10 mg/mL Hoechst 33342 im Verhältnis 1:4.000 in steriler PBS verdünnen. Führen Sie die Färbung lichtgeschützt durch, um Photobleichen zu minimieren.
  7. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder mit einem High-Content-Imaging-System, ausgestattet mit einem 10×-Trockenobjektiv, auf.
  8. Nehmen Sie je fünf nicht überlappende Felder pro Vertiefung im 384-Loch-Plattenformat für jede experimentelle Bedingung auf.
    ANMERKUNG: Verwenden Sie identische Bildaufnahme-Einstellungen für alle Versuchsgruppen, um Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Nutzen Sie einen automatisierten, laserbasierten Autofokus und halten Sie die Umgebungsbedingungen während der Live-Cell-Imaging-Phase bei 37°C mit 5 % CO₂ konstant.
  9. Nehmen Sie mCherry-Fluoreszenzbilder mit 561 nm Anregung, einem Bandpass-Emissionsfilter 600/52 (BP600/52) und einer Belichtungszeit von 200 ms auf.
  10. Nehmen Sie Hoechst-Fluoreszenzbilder mit 405 nm Anregung, einem BP445/45-Emissionsfilter und einer Belichtungszeit von 30 ms auf.
    ANMERKUNG: Stellen Sie die Kamera-Verstärkung auf 1,0 ein und nehmen Sie alle Bilder mit voller Kameraauflösung und 1 × 1 Binning auf, um eine lineare Fluoreszenzerfassung zu gewährleisten und die räumliche Auflösung zu maximieren.
  11. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit der Bildanalyse-Software CellPathfinder.
  12. Identifizieren Sie die Kerne im Hoechst-Kanal als primäre Objekte unter Verwendung eines referenziellen Kerndurchmessers von 20 µm und eines Flächenbereichs von 20–400 µm2.
  13. Definieren Sie zytoplasmatische Regionen von Interesse (ROIs) im mCherry-Kanal, indem Sie vom Kernrand ausgehend unter Verwendung eines referenziellen Zelldurchmessers von 60 µm erweitern.
    ANMERKUNG: Wenden Sie während der Segmentierung einen „Exclude Edge“-Filter an, um teilweise Zellen, die den Bildrand berühren, auszuschließen.
  14. Berechnen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für jede identifizierte Zelle und ermitteln Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Vertiefung aus allen fünf aufgenommenen Feldern.

5. Überprüfung der Modellzuverlässigkeit mithilfe von ELISA und quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion

  1. Infizieren Sie NIH/3T3-Fibroblasten mit dem rekombinanten Adenovirus bei einem optimierten MOI von 100, wie in Schritt 3.9 beschrieben.
  2. Behandeln Sie die Zellen vor der Stimulation mit TGF-β für 30–60 min mit SB431542.
    ANMERKUNG: Bereiten Sie eine 20 mM SB431542-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor und lagern Sie Aliquots bei −20°C.
  3. Behandeln Sie die Zellen mit 10 ng/mL TGF-β und SB431542 in Endkonzentrationen von 1, 5, 10 und 15 µM. Führen Sie eine Fahrzeugkontrollgruppe mit 0,1 % (v/v) DMSO ohne SB431542-Behandlung ein.
    ANMERKUNG: Halten Sie die Endkonzentration an DMSO in allen Behandlungsgruppen bei 0,1 % (v/v).
  4. Bereiten Sie die TGF-β-Arbeitslösung mit einer zweistufigen Verdünnungsmethode vor.
    ANMERKUNG: Verdünnen Sie die 100 µg/mL TGF-β-Stammlösung (hergestellt in 4 mM HCl mit 0,1 % BSA) 1:100 in steriler PBS, bevor sie weiter in komplettes Kulturmedium verdünnt wird, um die Endarbeitskonzentration von 10 ng/mL zu erreichen.
  5. Inkubieren Sie die behandelten Zellen 24 h bei 37°C mit 5 % CO₂ in 6-Well-Platten.
  6. Sammeln Sie 2 mL Kulturüberstand aus jedem Well für die ELISA-Analyse.
  7. Zentrifugieren Sie die gesammelten Überstände bei 1.000 × g für 5 min bei 4°C, um zelluläre Trümmer zu entfernen.
  8. Aliquotieren Sie die geklärten Überstände und lagern Sie sie bei −80°C bis zur ELISA-Analyse.
    ANMERKUNG: Geklärte Überstände können vor der ELISA-Analyse bei −80°C gelagert werden.
  9. Waschen Sie die anhaftenden Zellen vorsichtig mit eiskalter PBS nach Entfernung des Überstands.
  10. Geben Sie 1 mL TRIzol-Reagenz direkt in jedes Well, um die Zellen zu lysieren.
    ANMERKUNG: Pipettieren Sie das Lysat mehrmals, um eine vollständige Homogenisierung sicherzustellen, bevor Sie die Proben in Mikrozentrifugenröhrchen überführen. RNA-Lysate können vor der RNA-Extraktion bei −80°C gelagert werden.
  11. Extrahieren Sie die gesamte RNA aus den Lysaten zur Analyse mittels umgekehrter Transkription und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR).
  12. Führen Sie die umgekehrte Transkription mit 1 µg Gesamt-RNA durch.
    ANMERKUNG: Führen Sie die umgekehrte Transkription unter folgenden Reaktionsbedingungen durch: 25°C für 10 min, 42°C für 15 min und 85°C für 2 min.
  13. Führen Sie die quantitative PCR mit PerfectStart Green qPCR SuperMix durch. Bereiten Sie jede Reaktion in einem Endvolumen von 20 µL mit 5 µL komplementärer DNA (cDNA)-Vorlage vor.
  14. Führen Sie die qPCR-Reaktionen mit folgenden Zyklenbedingungen durch: anfängliche Denaturierung bei 94°C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen mit 94°C für 5 s, 60°C für 15 s und 72°C für 10 s.
    ANMERKUNG: Führen Sie nach der Amplifikation eine Schmelzkurvenanalyse durch, um die Produktspezifität zu bestätigen.
  15. Normalisieren Sie die Genexpression von Col1a1 auf 18S rRNA als interne Kontrolle.
    ANMERKUNG: Alle Primersequenzen sind in Ergänzungstabelle 1 angegeben.
  16. Quantifizieren Sie die sekretierten Collagen-I-Proteinspiegel in den geklärten Überständen mittels ELISA gemäß den Herstelleranweisungen. Der Standardkurvenbereich für den Maus-Collagen-Typ-I-ELISA beträgt 0,78–50 ng/mL, mit einer Nachweisempfindlichkeit des Assays von 0,37 ng/mL.
  17. Analysieren Sie alle Standards und Proben im technischen Duplikat und messen Sie die optische Dichte (OD) bei 450 nm mit einem Mikroplattenreader.
    ANMERKUNG: Verwenden Sie ungezählte geklärte Überstände, um die Empfindlichkeit des Assays für den Nachweis sekretierten Col1a1 zu maximieren.

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Ergebnisse

Eine schematische Übersicht über die Konstruktion und Verpackung des rekombinanten Adenovirus mCol1a1p-mCherry ist in Abbildung 1A dargestellt. Der Maus-Col1a1-Promotor wurde upstream des mCherry-Reportergens kloniert und in einen adenoviralen Vektor eingefügt, gefolgt von der viralen Verpackung und Amplifikation in HEK293-Zellen. Der Arbeitsablauf veranschaulicht wichtige experimentelle Schritte, einschließlich viraler Infektion, fibrotischer Stimulierung...

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Diskussion

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (32371158 an H.X.), des National Key R&D Program (2023YFA1800902 an H.X.), des "Tianchi Talent"-Programms, des Open Project des National Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling (Peking University) (202404 an R.Z; 202403 an Y.M.W.) und des Open Project des Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Ministry of Education (Peking University) (KF202404 an H.X.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
384-Well-Glasboden-MikroplatteCellvis, USAP384-1.5H-N384-Well-Platte mit Glasboden, verwendet für die Zellseeding, virale Infektion, Färbung und Fluoreszenzbildgebung.
Adenovirales TrägerplasmidMicrobix, KanadapBHGloxΔE1,3CrePlasmid zur Erzeugung des vollständigen rekombinanten adenoviralen Genoms verwendet.
Adenoviraler Shuttle-Vektor: pDC315-mCol1a1p-mCherryGeneChem, ChinaIndividueller ServiceRekombinanter adenoviraler Shuttle-Vektor, der den 2354 bp langen murinen Col1a1-Promotor enthält, der die Expression von mCherry steuert.
Benzonase-NukleaseMerck Millipore, USA70664-3Endonuklease, die während der Adenovirusreinigung zur Entfernung kontaminierender Nukleinsäuren verwendet wird.
Biosicherheitswerkbank (Klasse II)Esco Lifesciences Group, SingapurAC2-4S1Zertifizierter Biosicherheitswerkbank zur Handhabung rekombinanter Adenoviren und steriler Zellkulturverfahren.
Zellkulturmedium (komplett ergänztes DMEM/F12)HyClone, USA12800-017Vollständiges Kulturmedium zur Pflege von NIH/3T3- und HEK293-Zellen.
CellPathfinder-Bildanalyse-SoftwareYokogawa Electric Corporation, JapanVersion 3.08.01Bildanalyse-Software zur automatisierten Fluoreszenzquantifizierung und Zellsegmentierung
CellVoyager CV8000 High-Content-Screening-SystemYokogawa Electric Corporation, JapanCV8000Hochdurchsatzmikroskopie-System zur Erfassung der mCherry- und Hoechst-Fluoreszenz.
CO2 Zellkultur-InkubatorThermo Fisher Scientific, USA3111Feuchteinklimatisierter Inkubator, gehalten bei 37 °C mit 5 % CO2 für die Kultivierung von Säugetierzellen
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-Aldrich, USAD2650Lösungsmittel zur Herstellung von SB431542
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F-12)Servicebio, ChinaG4610Basales Kulturmedium, das für NIH/3T3-Fibroblasten verwendet wird.
Fötales Kälberserum (FBS)Ausbian, AustralienVS500TSerumzusatz, der bei der Herstellung des kompletten Kulturmediums zu 10 % (v/v) verwendet wird.
Hoechst 33342 FluoreszenzfarbstoffInvitrogen, USAH3570Kernfärbung zur Fluoreszenzbildgebung und zur Normalisierung der Kernzählung
HEK293-ZellenATCC, USACRL-1573Verpackungszelllinie, die für die Herstellung und Amplifikation von Adenoviren verwendet wird.
Menschliches rekombinantes TGF-β1MedChemExpress, ChinaHY-P78214Zytokin zur Induktion der fibrotischen Aktivierung in NIH/3T3-Fibroblasten verwendet.
Software zur BildaufnahmeYokogawa Electric Corporation, JapanVersion 3.08.01.03Software zur automatisierten Aufnahme von Fluoreszenzbildern und Steuerung des Mikroskops.
Lipidbasiertes TransfektionsreagenzInvitrogen, USA11668-019Transfektionsreagenz zur Übertragung von adenoviralen Plasmiden in HEK293-Zellen
MikrozentrifugenröhrchenAxygen, USAMCT-150-CGefäße zur Lagerung von RNA-Lysaten und Probenaufbereitung.
MikroplattenreaderTecan, SchweizFunkeMultimode-Mikroplattenreader zur Messung der ELISA-Absorbanz.
Maus Typ I Kollagen ELISA KitMeike Biotechnology, ChinaMK6778AELISA-Kit zur Quantifizierung von sezerniertem Kollagen Typ I in Kulturüberständen.
NIH/3T3-MausfibroblastenProcell Life Science, ChinaCL-0171Mausfibroblasten-Zelllinie, die zur Etablierung und Validierung des Reportermodells verwendet wird.
PacI RestriktionsenzymNew England Biolabs, USAR0547SRestriktionsenzym zur Linearisierung des adenoviralen Plasmids.
Penicillin–Streptomycin-LösungGibco, USA15140-122Antibiotikallösung, ergänzt zu 1 % (V/V), zur Verhinderung bakterieller Kontamination.
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen Biotech, ChinaAQ602SYBR Green-basierte qPCR-Mastermixlösung zur quantitativen PCR-Analyse.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Servicebio, ChinaG4202Puffer zum Waschen von Zellen und zur Reagenzherstellung.
pDC315-EGFP Shuttle-VektorGeneChem, ChinaN/VUrsprünglicher adenoviraler Shuttlevektor, der für die Konstruktion des Reportergekons verwendet wurde.
qPCR-SystemApplied Biosystems, USAQuantStudio 5Echtzeit-PCR-System, das für die quantitative Genexpressionsanalyse verwendet wird.
Restriktionsenzyme (BamHI und KpnI)Abclonal, ChinaRK21101, RK21104Restriktionsenzyme, die für die Linearisierung von Shuttle-Vektoren verwendet werden.
Reverse Transkription KitTransGen Biotech, ChinaAT311Reverse-Transkriptionskit, das für die cDNA-Synthese vor der RT-qPCR verwendet wird.
RNA-LysereagenzInvitrogen, USA15596026Reagenz zur Gesamt-RNA-Extraktion aus kultivierten Zellen.
SB431542MedChemExpress, China301836-41-9TGF-β Typ-I-Rezeptorinhibitor, verwendet für pharmakologische Inhibierungsexperimente.
Sanger-Sequenzierungsdienst/ReagenzienShanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., ChinaIndividueller ServiceSequenzierungsdienst/Reagenzien, die für die Plasmidsequenzverifikation verwendet wurden.
Serologische PipettenCorning, USA4488Sterile Pipetten, die beim Umgang mit Flüssigkeiten während der Zellkulturverfahren verwendet werden.
T30 ThermocyclerLongGene Scientific Instruments, ChinaT30Thermocycler für die Reverse Transkription und die PCR-Amplifikation
Trypsin-EDTA-LösungGibco, USA25200-056Zell-Dissociationsreagenz, das für die routinemäßige Zellpassage verwendet wird.
Viral Purification KitTakara Bio USA631533Kit zur Aufreinigung rekombinanter Adenoviren verwendet.
WasserbadShanghai Yiheng Scientific Instruments, ChinaHWS-12Temperaturgesteuerter Wasserbad, verwendet während des Einfrierens von Adenoviren–Auftauzyklen.

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