Ein auf Fibroblasten basierendes adenovirales Reporter-System unter der Kontrolle des Maus-Kollagen-Typ-I-Alpha-1-Promotors für das Screening antifibrotischer Wirkstoffe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines auf Fibroblasten basierenden adenoviralen Reportersystems, das durch einen Promotor für mausartiges Kollagen vom Typ I gesteuert wird, um eine Langzeitüberwachung der Fibroblastenaktivierung zu ermöglichen und die Hochdurchsatz-Screening von antifibrotischen Substanzen zu erleichtern.

Zusammenfassung

Kardiale Fibrose, gekennzeichnet durch eine fehlgeleitete Aktivierung von Fibroblasten und eine übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix, verfügt über keine zielgerichteten Therapien, hauptsächlich aufgrund des Fehlens longitudinaler, skalierbarer und nicht-destruktiver in vitro Screening-Plattformen. Herkömmliche Endpunkt-Assays und ressourcenintensive Stammzellmodelle schließen eine Echtzeitüberwachung des fibrotischen Fortschritts von vornherein aus. Um diese Einschränkungen zu überwinden, beschreibt dieses Protokoll die Erzeugung, Optimierung und Validierung eines maus-spezifischen Kollagen Typ I alpha 1 (Col1a1) Promotor-gesteuertes adenovirales mCherry fluoreszierendes Reportersystem (Ad-mCol1a1p-mCherryin NIH/3T3-Fibroblasten. Die entscheidenden Schritte für die Verpackung rekombinanter Adenoviren, die Optimierung der Transduktion (Multiplizität der Infektion) zur Minimierung der Zytotoxizität sowie die Einrichtung eines robusten, durch transformierendes Wachstumsfaktor-beta (TGF-β) induzierten Fibrosemodells werden detailliert beschrieben. Durch den Verzicht auf Zellfixierung ermöglicht dieses System eine direkte und longitudinale Beobachtung der Kollagen-Transkription in lebenden Zellen. Die Spezifität und Zuverlässigkeit des Modells werden pharmakologisch mittels des TGF-β-Typ-I-Rezeptor-(ALK5-)Inhibitors SB431542 validiert, wobei die fluoreszenten Signale mit endogenen fibrotischen Markern korrelieren, die durch umgekehrte Transkription und quantitative Polymerase-Kettenreaktion sowie Enzym-gekoppelte Immunosorbens-Assay quantifiziert wurden. Letztendlich stellt diese kostengünstige Plattform ein leicht zugängliches Werkzeug für das Hochdurchsatz-Screening neuartiger antifibrotischer Wirkstoffe dar und beschleunigt damit die translationale kardiovaskuläre Forschung.

Einleitung

Die Behandlung der kardialen Fibrose stellt erhebliche klinische Herausforderungen dar. Sie ist gekennzeichnet durch die fehlgeleitete Aktivierung ruhender Fibroblasten zu Myofibroblasten und eine übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM) und stellt einen irreversiblen Endweg dar, der bei Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt und anderen kardiovaskulären Erkrankungen gemeinsam auftritt^1,2,3. Aktuelle Behandlungsstrategien stoßen jedoch an erhebliche Grenzen. Herkömmliche Therapieansätze – wie Diuretika, β-Blocker und Inhibitoren des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems – lindern hauptsächlich den systemischen hämodynamischen Stress und verringern die neurohumorale Aktivierung^4,5,6,7. Diese Therapien greifen die Fibroblastenaktivierung nicht direkt an und können die andauernde Kollagenablagerung nicht stoppen. Zudem bleibt die Umsetzung der Erkenntnisse über pathologische Signalwege – wie den Transforming-Growth-Factor-beta (TGF-β)/Smad-Weg, oxidativen Stress und metabolische Umprogrammierung – in direkte antifibrotische Therapien aufgrund systemischer Toxizitäten und unspezifischer Abgabemechanismen schwierig^8,9,10. Daher besteht dringender Bedarf an neuartigen, zielgerichteten antifibrotischen Therapien. Eine wesentliche translatationale Engstelle ist das Fehlen funktioneller Evaluierungssysteme, die in der Lage sind, die Fibroblastenaktivierung empfindlich und dynamisch zu erfassen. Traditionelle experimentelle Modelle weisen erhebliche Einschränkungen auf, die ein effizientes pharmakologisches Screening verhindern^11,12. Obwohl in vivo-Tiermodelle die globale kardiale Remodellierung nachbilden, leiden sie unter artspezifischen Unterschieden, langen Versuchszeiträumen, hohen Kosten und geringer Durchsatzkapazität¹¹.

Um diese Hürden zu überwinden, sind verschiedene in vitro-Screening-Plattformen entstanden; kritische methodische Mängel bestehen jedoch weiterhin. Immunfluoreszenz-Verfahren mit hohem Informationsgehalt erfordern die zerstörerische Fixierung von Zellen und einen aufwändigen Prozessablauf, wodurch lediglich eine statische Momentaufnahme und nicht die Echtzeit-Kinetik der Fibroblastenaktivierung erfasst wird. Ebenso weisen Plattformen, die markierungsfreie Impedanzüberwachung mit Massenspektrometrie (MS/MS) kombinieren, eine mangelnde Spezifität und geringe Skalierbarkeit auf, da durch allgemeine zelluläre Toxizität verursachte Impedanzabnahmen leicht mit einer echten antifibrotischen Wirksamkeit verwechselt werden können. Darüber hinaus zeigen CRISPR-(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-basierte Reportersysteme, die unter Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zytoskelettale Marker (z. B. alpha-smooth muscle actin [α-SMA]/ACTA2) verfolgen, erhebliche translative Barrieren¹³. Diese auf iPSCs basierenden Modelle sind prohibitiv teuer, technisch anspruchsvoll und für routinemäßige Hochdurchsatz-Screenings weitgehend unzugänglich. Zudem spiegelt die alleinige Abhängigkeit von zytoskelettalen Markern wie α-SMA möglicherweise nicht genau den pathologischen Endpunkt wider, da ihre Expression nicht strikt mit der funktionellen Sekretion und übermäßigen Ablagerung der ECM korreliert¹⁴. Daher sind diese Systeme ungeeignet, um zelluläre Reaktionen in frühen Stadien auf pharmakologische Interventionen über einen längeren Zeitraum hinweg zu verfolgen.

Im Gegensatz dazu beschreibt dieses Protokoll ein longitudinales funktionelles Reportersystem, das durch den Promotor von Kollagen Typ I alpha 1 (Col1a1) angetrieben wird und darauf abzielt, eine nicht destruktive und robuste Plattform zur Überwachung der Fibroblastenaktivierung einzurichten. Da Kollagen Typ I die vorherrschende im extrazellulären Matrix (ECM) abgelagerte Komponente während der kardialen Remodeling-Prozesse ist, ermöglicht die Erfassung der transkriptionellen Aktivierung des kodierenden Gens Col1a1 eine direkte und pathologisch relevante Messung der Fibroblastenaktivierung. Dieses auf dem Col1a1-Promotor basierende Modell erlaubt eine kontinuierliche, molekulare Überwachung fibrotischer Prozesse und bietet eine empfindliche, longitudinale und quantifizierbare Plattform, die für die mechanismenbasierte Wirkstoffscreening optimiert ist.

Protokoll

Wir bestätigen, dass alle Experimente gemäß den institutionellen und nationalen Richtlinien durchgeführt wurden. Da diese Studie ausschließlich die etablierte Mausembryofibroblasten-Zelllinie NIH Swiss (NIH/3T3) und das mCol1a1p-mCherry-Reportersystem verwendete und keine Wirbeltiere, Embryonen oder menschlichen Probanden einbezog, war eine ethische Genehmigung durch eine institutionelle Prüfkommission für die in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren nicht erforderlich.

Alle Verfahren mit rekombinanten adenoviralen Vektoren wurden gemäß den institutionellen Biosicherheitsvorschriften und den Standardpraktiken der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Der Umgang mit Viren, die Transduktion, Lagerung und Entsorgung von Abfällen erfolgten unter Verwendung zertifizierter Sicherheitswerkbänke und der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung. Flüssige Abfälle, die adenovirales Material enthielten, wurden vor der Entsorgung mit frisch zubereiteter Bleichlösung dekontaminiert, und kontaminierte Verbrauchsmaterialien wurden gemäß den institutionellen Biosicherheitsprotokollen autoklaviert. Bei versehentlichen Verschüttungen wurde unverzüglich gemäß den institutionellen Verfahren zur Unfallbeseitigung mit zugelassenen viruziden Mitteln desinfiziert.

1. Übersicht über den experimentellen Arbeitsablauf

1. Erzeugen Sie ein maus-spezifisches, vom Col1a1-Promotor gesteuertes rekombinantes Adenovirus, wie in Schritt 2 beschrieben.
2. Optimieren Sie die Virus-Transduktionsbedingungen in NIH/3T3-Fibroblasten, wie in Schritt 3 beschrieben.
3. Stellen Sie ein TGF-β-antwortfähiges in vitro-Fibrose-Reportersystem auf, wie in Schritt 4 beschrieben.
4. Überprüfen Sie die Stabilität, Spezifität und biologische Reproduzierbarkeit des Modells mittels zeit- und dosisabhängiger Stimulation mit TGF-β, wie in Schritt 4 beschrieben.
5. Führen Sie eine pharmakologische Hemmung mit SB431542 durch, wie in Schritt 5 beschrieben.
6. Führen Sie downstream Analysen mittels Enzym-gekoppelter Immunosorbent-Assay (ELISA) und quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) durch, wie in Schritt 5 beschrieben.
   HINWEIS: Siehe Abbildung 1A für eine schematische Übersicht des experimentellen Arbeitsablaufs. Siehe die Materialtabelle für experimentelle Geräte und Reagenzien.

Abbildung 1. Arbeitsablauf zur Herstellung und Validierung des mCol1a1p-mCherry-Adenovirus-Reportersystems in Fibroblasten. (A) Schematische Übersicht über den Aufbau des adenoviralen (AdV) mCol1a1p-mCherry-Reportersystems und den experimentellen Arbeitsablauf zur Modellvalidierung in NIH/3T3-Fibroblasten. Der Arbeitsablauf umfasst die Promotorklonierung, die Herstellung rekombinanter Adenoviren, die virale Verpackung in HEK293-Zellen, die Optimierung der Multiplizität der Infektion (MOI) sowie anschließende Fluoreszenz-Screenings mit hoher Inhaltsgenauigkeit. (B) Vertretende Fluoreszenzbilder von NIH/3T3-Fibroblasten, die mit dem Ad-mCol1a1p-mCherry-Adenovirus bei MOIs von 0, 1, 10, 100 und 1000 infiziert wurden. Die Kerne wurden mit Hoechst 33342 (blau) angefärbt, und die mCherry-Fluoreszenz (rot) zeigt die Aktivität des Col1a1-Promotors an. Die Fluoreszenzintensität wurde mittels Bildgebung mit hoher Inhaltsgenauigkeit quantifiziert und auf die Anzahl der Kerne normalisiert. Basierend auf einer robusten und homogenen Reportergenexpression mit minimalen morphologischen Veränderungen wurde eine MOI von 100 für nachfolgende Experimente ausgewählt. Maßstabsbalken = 200 µm. Diese Abbildung wurde mit BioRender.com unter Verwendung lizenzierter Inhalte erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Konstruktion, Verpackung und Amplifikation des mCol1a1-Promotor-Adenovirus

1. Konstruktion des rekombinanten adenoviralen Vektors
   1. Klonen Sie das 2354 bp lange Fragment des murinen Col1a1-Promotors (genomische Koordinaten: chr11:94824779–94827132; −2271 bis +83 bp relativ zur Transkriptionsstartstelle [TSS]) upstream des mCherry-Reportergens in den pDC315-Adenovirus-Shuttlevektor.
      HINWEIS: Die vollständige Sequenz des Col1a1-Promotors sowie die detaillierte Plasmidkarte von pDC315-mCol1a1p-mCherry sind in der Zusatzdatei 1 und Zusatzabbildung 1 enthalten.
   2. Linearisieren Sie den pDC315-Vektor mit BamHI und KpnI. Amplifizieren Sie das Promoter-Insert mithilfe von Primern, die 15–25 bp lange Homologiearme enthalten.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine auf homologer Rekombination basierende nahtlose Klonierungsstrategie, um die in vitro-Rekombination zu erleichtern.
   3. Überprüfen Sie das resultierende Plasmid durch PCR-Analyse und Sanger-Sequenzierung.
      HINWEIS: Untersuchen Sie sorgfältig die Sequenz an der Übergangsstelle zwischen Promotor und Reporter, um sicherzustellen, dass keine Leserasterverschiebungen oder vorzeitigen Stoppcodons vorliegen.
   4. Erzeugen Sie das rekombinante Adenovirus unter Verwendung des AdMax-Systems durch intrazelluläre, Cre-vermittelte Rekombination.
      HINWEIS: Das pBHGloxΔE1,3Cre-Backbone-Plasmid enthält ein nicht replikationsfähiges Ad5-Genom mit Deletionen der E1/E3-Regionen sowie eine Expressionskassette für die Cre-Rekombinase, die die standortspezifische Rekombination an der loxP-Stelle des Shuttlevektors ermöglicht.
   5. Kotransfizieren Sie HEK293-Zellen mit dem validierten pDC315-mCol1a1p-mCherry-Shuttlevektor und dem pBHGloxΔE1,3Cre-Adenovirus-Backbone-Plasmid.
2. Adenovirus-Verpackung und Amplifikation
   1. Kultivieren Sie HEK293-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS). Verwenden Sie Zellen mit niedriger Passagezahl (<20 Passagen) für die Adenovirus-Verpackung.
   2. Säen Sie HEK293-Zellen 24 h vor der Transfektion mit einer Konfluenz von 30–40 % aus, um zum Zeitpunkt der Transfektion eine Konfluenz von 50–60 % zu erreichen.
   3. Kotransfizieren Sie HEK293-Zellen mit jeweils 5 µg Shuttleplasmid und 5 µg pBHGloxΔE1,3Cre-Hilfsplasmid unter Verwendung des Lipofectamine-2000-Transfektionsreagenzes.
      HINWEIS: Halten Sie ein Verhältnis von DNA zu Reagenz von 1:1 ein (10 µg Gesamt-DNA zu 10 µL Transfektionsreagenz).
   4. Kultivieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und überwachen Sie sie täglich auf zytopathische Effekte.
      HINWEIS: Die ersten zytopathischen Effekte können 7–14 Tage benötigen, um sichtbar zu werden. Falls das Medium sauer wird (gelbliche Färbung), führen Sie einen vorsichtigen Halbaustausch des Mediums durch, ohne die Zellen zu stören.
   5. Sammlen Sie die Zellen und das Überstandmedium, sobald typische zytopathische Effekte – gekennzeichnet durch Zellrundung und Schrumpfung – beobachtet werden und mindestens 50 % der Zellen sich von der Kulturoberfläche gelöst haben.
      HINWEIS: Dieser Zustand wird typischerweise 10–15 Tage nach der Transfektion erreicht.
   6. Führen Sie drei Gefrier-Tau-Zyklen durch, indem Sie die Proben 30 Minuten lang bei −70 °C einfrieren und anschließend in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen.
   7. Vortexen Sie die Suspension nach jedem Auftauschvorgang 30 Sekunden lang, um die Zelllyse zu unterstützen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine verlängerte Inkubation bei 37 °C während des Auftauens, um die Virusstabilität zu erhalten.
   8. Stellen Sie zehnfache serielle Verdünnungen des Viruslysats (10⁻¹ bis 10⁻¹³) in vollständigem DMEM her. Geben Sie 90 µL jeder Virusverdünnung auf HEK293-Zellen, die in 96-Well-Platten ausgesät wurden, jeweils mit 10 Wiederholungswells pro Verdünnung.
      HINWEIS: Eine Viruslast von ≥1 × 10⁹ PFU/mL wurde als ausreichender Amplifikationsendpunkt für die nachfolgende Reinigung definiert.
   9. Klären Sie 10 mL rohes Viruslysat durch Filtration über einen 0,45 µm-Filter, um zelluläre Trümmer zu entfernen.
   10. Behandeln Sie das geklärte Lysat mit Benzonase-Nuklease (10 U/mL) bei 37 °C für 30 Minuten.
   11. Reinigen Sie das rekombinante Adenovirus mithilfe des Adeno-X-Virus-Reinigungs-Kits gemäß den Herstelleranweisungen.
       HINWEIS: Mischen Sie das Lysat vor dem Auftragen auf den vorgleichgewichteten Reinigungsfilter mit 1× Verdünnungspuffer. Waschen Sie den Filter mit 1× Waschpuffer und eluieren Sie das gereinigte Virus mit 3 mL 1× Elutionspuffer.
   12. Inkubieren Sie die Platten 10 Tage lang und bewerten Sie die zytopathischen Effekte (CPE) unter dem Lichtmikroskop. Bewerten Sie positive CPE anhand charakteristischer Zellrundung und -ablösung. Berechnen Sie die infektiöse Viruslast nach der Spearman-Karber-Methode basierend auf der CPE-Bewertung.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der endgültige Virusstamm mindestens 1 × 10¹¹ PFU/mL erreicht, um für nachfolgende Anwendungen geeignet zu sein.
   13. Portionieren Sie das gereinigte Adenovirus und lagern Sie den Virusstamm bei −80 °C.
       HINWEIS: Lagern Sie die gereinigten Adenovirus-Aliquote langfristig bei −80 °C. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen, um die Virusinfektiosität zu erhalten.

3. Zellkultur und Optimierung der Virusinfektionsbedingungen

1. Nähren Sie NIH/3T3-Fibroblasten in DMEM/Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F12), ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin.
   ANMERKUNG: Verwenden Sie Zellen zwischen den Passagen 3 und 8, die im Ausgangsfläschchen eine Konfluenz von 70 %–80 % erreicht haben, um einen konsistenten Zellzustand sicherzustellen.
2. Säen Sie NIH/3T3-Fibroblasten in 384-Well-Platten mit jeweils 4 × 10³ Zellen pro Well in 40 µL vollständigem Kulturmedium aus.
3. Incubieren Sie die Zellen 12 h lang bei 37 °C mit 5 % CO₂, um die Zelladhäsion und den Eintritt in die exponentielle Wachstumsphase zu ermöglichen.
   ANMERKUNG: Um eine ungleichmäßige Zellverteilung und Randeffekte zu minimieren, stellen Sie die Platten vor der Inkubation 20–30 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhend ab. Füllen Sie die äußersten Wells mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder sterilen Wasser.
4. Infizieren Sie die Zellen mit dem rekombinanten Adenovirus bei Multiplizitäten der Infektion (MOIs) im Bereich von 1–1.000 zusammen mit einer nicht infizierten Kontrolle.
   ANMERKUNG: Berechnen Sie das erforderliche Adenovirus-Volumen anhand der folgenden Formel:
   
   
   Dabei ist V das Volumen der Adenovirus-Stammlösung (mL), N die Anzahl der ausgesäten Zellen pro Well (4 × 10³), MOI die gewünschte Multiplizität der Infektion und T die infektiöse Virus-Titer (PFU/mL). Die in dieser Studie verwendete Virusstammlösung wies einen infektiösen Titer von 1 × 10¹¹ PFU/mL auf, wie durch die in Schritt 2.2.12 beschriebene Spearman-Karber-Methode bestimmt.
5. Stellen Sie sicher, dass das zugegebene Volumen der Virusstammlösung 10 % des Gesamtvolumens pro Well nicht überschreitet.
   ANMERKUNG: Zu große Volumina der Virusstammlösung können den pH-Wert des Mediums verändern und unspezifische Zytotoxizität hervorrufen.
6. Ersetzen Sie das virushaltige Medium 24 Stunden nach der Infektion durch jeweils 40 µL frisches, vollständiges Kulturmedium.
   ANMERKUNG: Verwenden Sie DMEM/F12, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, wie in Schritt 3.1 beschrieben.
7. Führen Sie den Mediumwechsel mittels eines automatisierten Flüssigkeitshandlers mit niedriger Geschwindigkeit durch oder kippen Sie die Spitzen eines Mehrkanalpipettiersystems vorsichtig an der oberen Seitenwand jedes Wells an.
   ANMERKUNG: Vermeiden Sie die Standard-Vakuumaspiration beim Umgang mit 384-Well-Platten, um Zellablösungen zu minimieren.
8. Definieren Sie die optimale MOI als die niedrigste virale Dosis, die eine sichtbare und homogene mCherry-Fluoreszenz erzeugt, während die Zellmorphologie und die Kernanzahlen mit denen der nicht infizierten Kontrollzellen vergleichbar bleiben.
   ANMERKUNG: Bewerten Sie die Reporterexpression anhand der mit Hoechst gefärbten Kernanzahlen und der Fluoreszenzbildgebung. Die Zellen sollten ihre charakteristische spindelförmige Morphologie beibehalten, ohne Abrundung oder Ablösung. Zu hohe MOIs können eine basale mCherry-Aktivierung über zelluläre Stressreaktionen hervorrufen. Repräsentative Fluoreszenzresultate bei verschiedenen MOIs sind in Abbildung 1B dargestellt.
9. Wählen Sie die optimierte MOI für alle nachfolgenden Experimente aus.
   ANMERKUNG: In dieser Studie wurde eine MOI von 100 für nachfolgende Experimente gewählt.

4. Bewertung der Modellstabilität mittels TGF-β-Stimulation

1. Infizieren Sie NIH/3T3-Fibroblasten mit dem rekombinanten Adenovirus bei dem optimierten MOI von 100, wie in Schritt 3.9 bestimmt.
2. Entziehen Sie die Fibroblasten dem Serum, indem Sie sie 12 h vor der TGF-β-Stimulation in DMEM/F12 mit 0,2 % FBS serumfrei kultivieren.
   ANMERKUNG: Die Serumentzug-Behandlung diente der Synchronisierung der Zellen und zur Minimierung der basalen Aktivierung des Col1a1-Promotors.
3. Bereiten Sie eine Stammlösung aus rekombinantem humanem TGF-β bei 100 µg/mL mit 4 mM HCl und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) vor.
   ANMERKUNG: Portionieren Sie die TGF-β-Stammlösung in kleine Volumina und lagern Sie sie bei −80°C, um wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen zu vermeiden.
4. Behandeln Sie die Zellen mit einem Konzentrationsgradienten an TGF-β im Bereich von 0–40 ng/mL in sechs unabhängigen biologischen Wiederholungen.
   ANMERKUNG: Die Bedingung mit 0 ng/mL diente als nicht stimulierter Kontrollansatz.
5. Inkubieren Sie die stimulierten Zellen bei 37°C mit 5 % CO₂ für 24, 48 oder 72 h. Verwenden Sie separate parallele Platten für jeden Bildaufnahmezeitpunkt, um die kumulative Phototoxizität zu minimieren.
6. Färben Sie die Zellen 15 min vor der Bildaufnahme mit einer Hoechst-33342-Lösung bei einer endgültigen Arbeitskonzentration von 2,5 µg/mL.
   ANMERKUNG: Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie die Stammlösung von 10 mg/mL Hoechst 33342 im Verhältnis 1:4.000 in steriler PBS verdünnen. Führen Sie die Färbung lichtgeschützt durch, um Photobleichen zu minimieren.
7. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder mit einem High-Content-Imaging-System, ausgestattet mit einem 10×-Trockenobjektiv, auf.
8. Nehmen Sie je fünf nicht überlappende Felder pro Vertiefung im 384-Loch-Plattenformat für jede experimentelle Bedingung auf.
   ANMERKUNG: Verwenden Sie identische Bildaufnahme-Einstellungen für alle Versuchsgruppen, um Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Nutzen Sie einen automatisierten, laserbasierten Autofokus und halten Sie die Umgebungsbedingungen während der Live-Cell-Imaging-Phase bei 37°C mit 5 % CO₂ konstant.
9. Nehmen Sie mCherry-Fluoreszenzbilder mit 561 nm Anregung, einem Bandpass-Emissionsfilter 600/52 (BP600/52) und einer Belichtungszeit von 200 ms auf.
10. Nehmen Sie Hoechst-Fluoreszenzbilder mit 405 nm Anregung, einem BP445/45-Emissionsfilter und einer Belichtungszeit von 30 ms auf.
    ANMERKUNG: Stellen Sie die Kamera-Verstärkung auf 1,0 ein und nehmen Sie alle Bilder mit voller Kameraauflösung und 1 × 1 Binning auf, um eine lineare Fluoreszenzerfassung zu gewährleisten und die räumliche Auflösung zu maximieren.
11. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit der Bildanalyse-Software CellPathfinder.
12. Identifizieren Sie die Kerne im Hoechst-Kanal als primäre Objekte unter Verwendung eines referenziellen Kerndurchmessers von 20 µm und eines Flächenbereichs von 20–400 µm².
13. Definieren Sie zytoplasmatische Regionen von Interesse (ROIs) im mCherry-Kanal, indem Sie vom Kernrand ausgehend unter Verwendung eines referenziellen Zelldurchmessers von 60 µm erweitern.
    ANMERKUNG: Wenden Sie während der Segmentierung einen „Exclude Edge“-Filter an, um teilweise Zellen, die den Bildrand berühren, auszuschließen.
14. Berechnen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für jede identifizierte Zelle und ermitteln Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Vertiefung aus allen fünf aufgenommenen Feldern.

5. Überprüfung der Modellzuverlässigkeit mithilfe von ELISA und quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion

1. Infizieren Sie NIH/3T3-Fibroblasten mit dem rekombinanten Adenovirus bei einem optimierten MOI von 100, wie in Schritt 3.9 beschrieben.
2. Behandeln Sie die Zellen vor der Stimulation mit TGF-β für 30–60 min mit SB431542.
   ANMERKUNG: Bereiten Sie eine 20 mM SB431542-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor und lagern Sie Aliquots bei −20°C.
3. Behandeln Sie die Zellen mit 10 ng/mL TGF-β und SB431542 in Endkonzentrationen von 1, 5, 10 und 15 µM. Führen Sie eine Fahrzeugkontrollgruppe mit 0,1 % (v/v) DMSO ohne SB431542-Behandlung ein.
   ANMERKUNG: Halten Sie die Endkonzentration an DMSO in allen Behandlungsgruppen bei 0,1 % (v/v).
4. Bereiten Sie die TGF-β-Arbeitslösung mit einer zweistufigen Verdünnungsmethode vor.
   ANMERKUNG: Verdünnen Sie die 100 µg/mL TGF-β-Stammlösung (hergestellt in 4 mM HCl mit 0,1 % BSA) 1:100 in steriler PBS, bevor sie weiter in komplettes Kulturmedium verdünnt wird, um die Endarbeitskonzentration von 10 ng/mL zu erreichen.
5. Inkubieren Sie die behandelten Zellen 24 h bei 37°C mit 5 % CO₂ in 6-Well-Platten.
6. Sammeln Sie 2 mL Kulturüberstand aus jedem Well für die ELISA-Analyse.
7. Zentrifugieren Sie die gesammelten Überstände bei 1.000 × g für 5 min bei 4°C, um zelluläre Trümmer zu entfernen.
8. Aliquotieren Sie die geklärten Überstände und lagern Sie sie bei −80°C bis zur ELISA-Analyse.
   ANMERKUNG: Geklärte Überstände können vor der ELISA-Analyse bei −80°C gelagert werden.
9. Waschen Sie die anhaftenden Zellen vorsichtig mit eiskalter PBS nach Entfernung des Überstands.
10. Geben Sie 1 mL TRIzol-Reagenz direkt in jedes Well, um die Zellen zu lysieren.
    ANMERKUNG: Pipettieren Sie das Lysat mehrmals, um eine vollständige Homogenisierung sicherzustellen, bevor Sie die Proben in Mikrozentrifugenröhrchen überführen. RNA-Lysate können vor der RNA-Extraktion bei −80°C gelagert werden.
11. Extrahieren Sie die gesamte RNA aus den Lysaten zur Analyse mittels umgekehrter Transkription und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR).
12. Führen Sie die umgekehrte Transkription mit 1 µg Gesamt-RNA durch.
    ANMERKUNG: Führen Sie die umgekehrte Transkription unter folgenden Reaktionsbedingungen durch: 25°C für 10 min, 42°C für 15 min und 85°C für 2 min.
13. Führen Sie die quantitative PCR mit PerfectStart Green qPCR SuperMix durch. Bereiten Sie jede Reaktion in einem Endvolumen von 20 µL mit 5 µL komplementärer DNA (cDNA)-Vorlage vor.
14. Führen Sie die qPCR-Reaktionen mit folgenden Zyklenbedingungen durch: anfängliche Denaturierung bei 94°C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen mit 94°C für 5 s, 60°C für 15 s und 72°C für 10 s.
    ANMERKUNG: Führen Sie nach der Amplifikation eine Schmelzkurvenanalyse durch, um die Produktspezifität zu bestätigen.
15. Normalisieren Sie die Genexpression von Col1a1 auf 18S rRNA als interne Kontrolle.
    ANMERKUNG: Alle Primersequenzen sind in Ergänzungstabelle 1 angegeben.
16. Quantifizieren Sie die sekretierten Collagen-I-Proteinspiegel in den geklärten Überständen mittels ELISA gemäß den Herstelleranweisungen. Der Standardkurvenbereich für den Maus-Collagen-Typ-I-ELISA beträgt 0,78–50 ng/mL, mit einer Nachweisempfindlichkeit des Assays von 0,37 ng/mL.
17. Analysieren Sie alle Standards und Proben im technischen Duplikat und messen Sie die optische Dichte (OD) bei 450 nm mit einem Mikroplattenreader.
    ANMERKUNG: Verwenden Sie ungezählte geklärte Überstände, um die Empfindlichkeit des Assays für den Nachweis sekretierten Col1a1 zu maximieren.

Ergebnisse

Eine schematische Übersicht über die Konstruktion und Verpackung des rekombinanten Adenovirus mCol1a1p-mCherry ist in Abbildung 1A dargestellt. Der Maus-Col1a1-Promotor wurde upstream des mCherry-Reportergens kloniert und in einen adenoviralen Vektor eingefügt, gefolgt von der viralen Verpackung und Amplifikation in HEK293-Zellen. Der Arbeitsablauf veranschaulicht wichtige experimentelle Schritte, einschließlich viraler Infektion, fibrotischer Stimulierung, pharmakologischer Intervention und fluorescencebasierten Signalabgleichs. Dieses Schema bietet einen visuellen Rahmen für die Implementierung des Reportersystems und unterstützt die Interpretation nachfolgender funktioneller Validierungsexperimente.

Um die optimalen Virusinfektionsbedingungen zu bestimmen, wurden NIH/3T3-Fibroblasten mit dem mCol1a1p-mCherry-Adenovirus über einen Bereich unterschiedlicher MOIs infiziert. Wie in Abbildung 1B gezeigt, nahm die mCherry-Fluoreszenzintensität mit steigendem MOI zu. Bei niedrigen MOIs war die Reporterexpression schwach und heterogen, was eine suboptimale Bedingung für die quantitative Analyse darstellt. Bei hohen MOIs zeigten die Zellen veränderte Morphologie, einschließlich Abrundung und Ablösung, was auf zytotoxische Effekte hindeutet. Ein MOI von 100 führte zu starker und homogener Fluoreszenz bei gleichzeitig erhaltener Zellmorphologie und wurde daher als optimale Bedingung für nachfolgende Experimente ausgewählt.

Bei dem optimierten MOI wurden NIH/3T3-Fibroblasten mit steigenden Konzentrationen von TGF-β stimuliert. Die Reporter-Fluoreszenz wurde 24, 48 und 72 h nach der Stimulation gemessen. Wie in Abbildung 2A–C dargestellt, nahm die Fluoreszenzintensität von mCherry bei allen Zeitpunkten in konzentrationsabhängiger Weise zu. Die Signalintensität stieg kontinuierlich von 24 bis 72 h an, was eine zeitabhängige Antwort zeigt. Diese Ergebnisse stellen ein positives Ergebnis dar und zeigen, dass das Reporter-System über einen längeren Zeitraum hinweg und reproduzierbar auf fibrotische Stimuli reagiert.

Abbildung 2. Zeit- und dosisabhängige Aktivierung des mCol1a1p-mCherry-Reporters durch Stimulierung mit Transforming Growth Factor Beta (TGF-β). NIH/3T3-Fibroblasten, die mit dem Ad-mCol1a1p-mCherry-Adenovirus bei optimierter MOI infiziert wurden, wurden mit steigenden Konzentrationen von TGF-β stimuliert. Dargestellt sind repräsentative Fluoreszenzbilder und die entsprechenden quantitativen Analysen der mCherry-Reporteraktivität nach 24 h (A), 48 h (B) und 72 h (C) nach Stimulation. Die mCherry-Fluoreszenz (rot) spiegelt die Aktivität des Col1a1-Promotors wider; die Kerne wurden mit Hoechst 33342 (blau) kontragefärbt. Die Fluoreszenzintensität wurde mittels Hochdurchsatzbildgebung quantifiziert und auf die Anzahl der Kerne normalisiert. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus sechs unabhängigen biologischen Wiederholungen pro Bedingung dargestellt. Statistische Vergleiche erfolgten im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt vom Tukey’schen Test für multiple Vergleiche. Die Bildgebungseinstellungen blieben über alle experimentellen Bedingungen hinweg konstant. Maßstabsbalken = 200 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zur Beurteilung der Wegspezifität wurden NIH/3T3-Fibroblasten unter TGF-β-Stimulation mit dem Hemmstoff SB431542 für den TGF-β-Typ-I-Rezeptor (ALK5) behandelt. Wie in Abbildung 3A–C dargestellt, verringerte SB431542 die mCherry-Fluoreszenzintensität dosisabhängig. Eine Hemmung der Reportertätigkeit wurde zu allen untersuchten Zeitpunkten beobachtet, wobei eine stärkere Unterdrückung bei höheren Hemmstoffkonzentrationen auftrat. Diese Ergebnisse stellen ein positives Ergebnis dar und zeigen, dass die Aktivierung des Reporters von der TGF-β-Signalübertragung abhängt und pharmakologisch moduliert werden kann.

Abbildung 3. SB431542 hemmt die durch TGF-β induzierte Aktivierung des mCol1a1p-mCherry Reporter in einer zeit- und dosisabhängigen Weise. Mit Ad-m infizierte NIH/3T3-FibroblastenCol1a1p-mCherry Adenovirus-infizierte Zellen wurden mit TGF-β (10 ng/mL) in Gegenwart steigender Konzentrationen des Transforming Growth Factor Beta Type I Rezeptor (ALK5)-Inhibitors SB431542 (0, 1, 5, 10 und 15 µM; abgekürzt als SB43 in den Abbildungspanels). Repräsentative Fluoreszenzbilder und entsprechende quantitative Analysen werden nach 24 h gezeigt (A), 48 h (B) und 72 h (C) nach der Behandlung. mCherry Fluoreszenz (rot) spiegelt wider Col1a1 Promotoraktivität und Kerne wurden mit Hoechst 33342 (blau) kontrastgefärbt. Die Fluoreszenzintensität wurde mittels hochinformativer Bildgebung quantifiziert und auf die Anzahl der Kerne normalisiert. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM aus sechs unabhängigen biologischen Wiederholungen pro Bedingung dargestellt. Statistische Vergleiche erfolgten relativ zur mit TGF-β behandelten Gruppe mittels einfaktorieller ANOVA, gefolgt von Tukeys Test für multiple Vergleiche. Die Bildgebungsparameter wurden für alle experimentellen Bedingungen konstant gehalten. Maßstabsbalken = 200 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Um zu beurteilen, ob die Reporteraktivität die endogenen fibrotischen Reaktionen widerspiegelt, wurden NIH/3T3-Fibroblasten unter optimierten Bedingungen für Infektion, Stimulierung und Hemmung analysiert. Der experimentelle Arbeitsablauf zur Validierung des Reportersystems ist in Abbildung 4A zusammengefasst. Fibroseassoziierte Marker wurden auf Protein- und mRNA-Ebene gemessen. Wie in Abbildung 4B–C dargestellt, zeigte die ELISA eine erhöhte Sekretion fibroseassoziierter Proteine nach TGF-β-Stimulierung, die durch die Behandlung mit SB431542 reduziert wurde. In Übereinstimmung damit zeigte die RT-qPCR entsprechende Veränderungen in der Expression fibroserelater Genen, einschließlich Col1a1. Die Übereinstimmung zwischen Fluoreszenzsignal, Proteinsekretion und Genexpression stellt ein positives Validierungsergebnis dar und zeigt an, dass das Reportersystem die fibrotische Aktivierung unter diesen Bedingungen widerspiegelt.

Abbildung 4. Validierung des mCol1a1p-mCherry-Reportersystems mittels umgekehrter Transkription und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) sowie enzymgekoppelter Immunosorbent-Assay (ELISA). (A) Schematische Übersicht des experimentellen Arbeitsablaufs zur Validierung des Reportersystems. NIH/3T3-Fibroblasten wurden mit TGF-β (10 ng/mL) stimuliert und mit steigenden Konzentrationen des TGF-β-Rezeptorinhibitors SB431542 (SB43) behandelt. Zelllysate und Kulturüberstände wurden für nachfolgende Analysen gesammelt. (B) Quantitative Analyse der Col1a1-Boten-RNA (mRNA)-Expression mittels RT-qPCR unter TGF-β-Stimulation entlang eines Konzentrationsgradienten von SB431542. Die relativen Col1a1-mRNA-Expressionsniveaus wurden auf die 18S-ribosomale RNA (18S rRNA) normalisiert und als relativer Anstieg im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe angegeben. (C) Quantifizierung der sezernierten Mengen an Typ-I-Kollagen in den Kulturüberständen mittels ELISA unter denselben experimentellen Bedingungen wie in Panel B. Die Konzentrationen von Typ-I-Kollagen sind in ng/mL angegeben. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM aus sechs unabhängigen biologischen Wiederholungen pro Bedingung dargestellt. Statistische Vergleiche erfolgten im Vergleich zur TGF-β-behandelten Gruppe mittels einfaktorieller ANOVA, gefolgt vom Tukey’schen Test für multiple Vergleiche. Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zusatzdatei 1. Vollständige Nukleotidsequenz des für die Konstruktion des adenoviralen Reportervektors verwendeten Promotorfragments von Maus Col1a1. Der 2354 bp lange Promotorbereich entspricht den genomischen Koordinaten chr11:94824779–94827132 (NC_000077.7) und umfasst die Region von −2271 bis +83 bp relativ zum Transkriptionsstartpunkt (TSS). Das Promotorfragment wurde upstream des mCherry-Reportergens in den pDC315-Shuttlevektor kloniert, um das rekombinante adenovirale Reportersystem zu erzeugen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatz-Tabelle S1. Primersequenzen für die RT-qPCR-Analyse. Die Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärtsprimer für Col1a1 sowie das interne Referenzgen 18S rRNA sind in 5′–3′-Orientierung angegeben.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S1. Plasmidkarte des pDC315-mCol1a1p-mCherry-Adenovirus-Shuttlevektors. Das 2354 bp lange Fragment des Maus-Col1a1-Promotors wurde mittels einer auf homologer Rekombination basierenden, lückenlosen Klonierungsstrategie upstream des mCherry-Reportergens eingefügt, um den rekombinanten adenoviralen Reporterkonstrukt herzustellen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Kardiale Fibrose trägt zur Progression der Herzinsuffizienz bei, und die Entwicklung wirksamer antifibrotischer Therapien wird durch den Mangel an longitudinalen Screening-Plattformen begrenzt^2,13. Herkömmliche Methoden zur Beurteilung der antifibrotischen Wirksamkeit, einschließlich Western Blot, RT-qPCR und immunfluoreszenzbasierter Färbung, beruhen auf Endpunkt-Messungen, die eine Zelllyse oder Fixierung erfordern. Diese Ansätze verhindern eine Echtzeit-Überwachung der fibrotischen Progression in lebenden Zellen und schränken ihre Anwendbarkeit für longitudinale und hochdurchsatzfähige Analysen ein. Zudem ist die Erzeugung stabiler Reportergezellinien mittels Plasmidtransfektion oder lentiviraler Integration häufig durch eine geringe Transfektionseffizienz in Fibroblasten, Variabilität aufgrund zufälliger genomischer Integration und eine fortschreitende Abschaltung der Reportergenexpression über kontinuierliche Passagen hinweg eingeschränkt¹⁵.

Während lentivirale Vektoren häufig für die Genübertragung in NIH/3T3-Fibroblasten eingesetzt werden, verwendete unsere Studie speziell ein adenovirales Reportersystem, um die physiologische Integrität der Fibroblasten zu bewahren. Lentiviren integrieren dauerhaft in das Wirts-Genom und bergen ein inhärentes Risiko der insertionalen Mutagenese, das möglicherweise unbeabsichtigt endogene Signalnetzwerke stören könnte – ein entscheidender Aspekt bei der Untersuchung komplexer Kaskaden wie der TGF-β-induzierten Fibrogenese. Im Gegensatz dazu verbleiben adenovirale Vektoren episomal und gewährleisten somit die genomische Integrität. Zudem vermeidet die Umgehung der langwierigen antibiotischen Selektion, die für stabile lentivirale Zelllinien erforderlich ist, therapieinduzierte phänotypische Veränderungen und ermöglicht eine schnelle, robuste und hochgradig effiziente transiente Expression, die sich für Hochdurchsatz-Screenings eignet.

Um diese technischen Einschränkungen zu beheben, wird das mCol1a1 promotorgetrieben mCherry Das adenovirale Reportersystem bietet eine Methode zur Überwachung der Fibroblastenaktivierung in vitro. Das System kombiniert die adenovirale Abgabe mit der Maus Col1a1 Promotor, ein transkriptioneller Marker, der mit der Fibroblastenaktivierung und der Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM) assoziiert ist¹⁶. Kopplung Col1a1 Die Kopplung der Promotoraktivität an einen fluoreszierenden Reporter ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung fibrotischer transkriptioneller Antworten in lebenden Zellen. Die Reporterfluoreszenz nimmt nach Stimulation mit TGF-β zu mehreren Zeitpunkten zu und spiegelt damit den longitudinalen Verlauf der Fibroblastenaktivierung wider. Die Hemmung der Reporteraktivität durch den ALK5-Inhibitor SB431542 weist auf eine pfadabhängige Regulation hin. Die Übereinstimmung zwischen der Reporterfluoreszenz und der Expression endogener fibroseassoziierter Gene und Proteine, gemessen mittels RT-qPCR und ELISA, untermauert die Eignung dieser Methode zur Überwachung fibrotischer Antworten unter diesen Bedingungen.

Kürzliche Studien haben iPSC-abgeleitete Herzzellen in Kombination mit genetischen Eingriffen auf Basis von CRISPR-Cas9 für die Wirkstoffscreening und Zielstruktoraufklärung genutzt^11,13. Beispielsweise wurden mit CRISPR modifizierte, fluoreszierende Reportergene in iPSC-abgeleiteten kardialen Fibroblasten in groß angelegten Verbindungsscreenings eingesetzt^11,17. Obwohl diese Methoden eine hohe genetische Präzision bieten, sind sie mit langen Differenzierungszeiträumen, technischer Komplexität, Variabilität zwischen Chargen und höheren experimentellen Kosten verbunden^13,18. Im Vergleich dazu ermöglicht die hier beschriebene adenovirale Reportertechnologie eine schnellere Anwendung, ohne dass eine Genomeditierung oder längere Zelldifferenzierung erforderlich ist. Diese Ansätze können komplementär eingesetzt werden, wobei das mCol1a1p-mCherry-Reportersystem als erstes Screening-Tool dient und iPSC-basierte Modelle für die anschließende Validierung verwendet werden¹¹.

Das hier beschriebene mCol1a1p-mCherry-Reportersystem bietet eine Methode zur Untersuchung von Wirkstoffkandidaten, einschließlich Stoffwechselmodulatoren und Naturstoffen, in einem auf Fibroblasten basierenden Modell. Um die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls sicherzustellen, sind mehrere kritische Schritte und Überlegungen zur Fehlerbehebung zu beachten. Zunächst ist die Reinheit der Adenovirus-Präparation entscheidend. Die Verwendung unreiner Viruslysate kann Wirtszelltrümmer und zytotoxische Komponenten einführen, was zu unspezifischen Effekten in NIH/3T3-Fibroblasten führt und die Reporter-Auswertung beeinträchtigt. Darüber hinaus wurde jede Viruspräparation zur Gewährleistung strenger Reproduzierbarkeit und Konsistenz zwischen Chargen für nachfolgende Screening-Anwendungen einer standardisierten Reinigung unterzogen und mittels einer Endpunkt-Verdünnungsanalyse exakt quantifiziert. Durch die Anwendung einer präzise definierten Multiplizität der Infektion (MOI), basierend auf funktionellen Virustitern (PFU/mL) anstelle volumetrischer Mengen, konnten wir Chargenunterschiede erfolgreich ausgleichen und so die Reporterantwort über alle unabhängigen Experimente hinweg standardisieren. Zweitens ist es während der Optimierung dieser MOI wichtig sicherzustellen, dass das Volumen des Virusinokulums 10 % des Gesamtkulturvolumens nicht überschreitet. Ein zu großes Volumen an Viruspuffer kann den pH-Wert und die Osmolarität des Kulturmediums verändern und dadurch zelluläre Stressreaktionen unabhängig von der TGF-β-Stimulation auslösen.

Darüber hinaus ergeben sich bei der Handhabung von 384-Well-Platten für die hochauflösende Bildgebung technische Herausforderungen. NIH/3T3-Fibroblasten neigen während des Mediumwechsels und der Waschschritte zur Ablösung. Eine schonende Flüssigkeitsmanipulation, beispielsweise durch den Einsatz automatisierter Flüssigkeitshandler mit niedrigen Abgabegeschwindigkeiten oder durch Anlegen der Pipettenspitzen an die Seitenwände der Vertiefungen, kann den Zellverlust verringern. Um die basale Aktivierung des Col1a1-Promotors zu minimieren und das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, kann eine Serumverarmung für 12–24 h vor der TGF-β-Stimulation durchgeführt werden. Bei der sequenziellen Live-Cell-Bildgebung über mehrere Zeitpunkte hinweg (z. B. 24, 48 und 72 h) sollten die kumulative Phototoxizität und DNA-bindenden Effekte durch wiederholte Hoechst-Färbung minimiert werden, indem die Belichtungsbedingungen optimiert oder parallele Versuchsplatten für jeden Zeitpunkt verwendet werden¹⁹.

Mehrere Einschränkungen dieser Methode sollten berücksichtigt werden. Erstens basiert das System auf einer immortalisierten Fibroblasten-Zelllinie und stellt die zelluläre Heterogenität kardialer Fibroblasten in vivo nicht vollständig dar. Zweitens spiegelt der Reporter die transkriptionelle Aktivierung von Col1a1 wider und erfasst keine posttranskriptionelle Regulation oder Reifung der extrazellulären Matrix. Zukünftige Anpassungen könnten die Verwendung primärer kardialer Fibroblasten, Ko-Kultursysteme oder dreidimensionale Modelle umfassen, um die physiologische Relevanz zu verbessern. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll ein auf dem Col1a1-Promotor basierendes adenovirales Reportersystem zur Überwachung der Fibroblastenaktivierung. Die Methode kombiniert virale Transduktion, pharmakologische Modulation und komplementäre molekularbiologische Analysen, um eine longitudinale und nicht-destruktive Untersuchung in lebenden Zellen zu ermöglichen. Dieser Ansatz kann für die Wirkstoffscreening und die Untersuchung fibrotischer Signalprozesse unter kontrollierten in vitro-Bedingungen eingesetzt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
384-Well-Glasboden-Mikroplatte	Cellvis, USA	P384-1.5H-N	384-Well-Platte mit Glasboden, verwendet für die Zellseeding, virale Infektion, Färbung und Fluoreszenzbildgebung.
Adenovirales Trägerplasmid	Microbix, Kanada	pBHGloxΔE1,3Cre	Plasmid zur Erzeugung des vollständigen rekombinanten adenoviralen Genoms verwendet.
Adenoviraler Shuttle-Vektor: pDC315-mCol1a1p-mCherry	GeneChem, China	Individueller Service	Rekombinanter adenoviraler Shuttle-Vektor, der den 2354 bp langen murinen Col1a1-Promotor enthält, der die Expression von mCherry steuert.
Benzonase-Nuklease	Merck Millipore, USA	70664-3	Endonuklease, die während der Adenovirusreinigung zur Entfernung kontaminierender Nukleinsäuren verwendet wird.
Biosicherheitswerkbank (Klasse II)	Esco Lifesciences Group, Singapur	AC2-4S1	Zertifizierter Biosicherheitswerkbank zur Handhabung rekombinanter Adenoviren und steriler Zellkulturverfahren.
Zellkulturmedium (komplett ergänztes DMEM/F12)	HyClone, USA	12800-017	Vollständiges Kulturmedium zur Pflege von NIH/3T3- und HEK293-Zellen.
CellPathfinder-Bildanalyse-Software	Yokogawa Electric Corporation, Japan	Version 3.08.01	Bildanalyse-Software zur automatisierten Fluoreszenzquantifizierung und Zellsegmentierung
CellVoyager CV8000 High-Content-Screening-System	Yokogawa Electric Corporation, Japan	CV8000	Hochdurchsatzmikroskopie-System zur Erfassung der mCherry- und Hoechst-Fluoreszenz.
CO2 Zellkultur-Inkubator	Thermo Fisher Scientific, USA	3111	Feuchteinklimatisierter Inkubator, gehalten bei 37 °C mit 5 % CO2 für die Kultivierung von Säugetierzellen
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich, USA	D2650	Lösungsmittel zur Herstellung von SB431542
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F-12)	Servicebio, China	G4610	Basales Kulturmedium, das für NIH/3T3-Fibroblasten verwendet wird.
Fötales Kälberserum (FBS)	Ausbian, Australien	VS500T	Serumzusatz, der bei der Herstellung des kompletten Kulturmediums zu 10 % (v/v) verwendet wird.
Hoechst 33342 Fluoreszenzfarbstoff	Invitrogen, USA	H3570	Kernfärbung zur Fluoreszenzbildgebung und zur Normalisierung der Kernzählung
HEK293-Zellen	ATCC, USA	CRL-1573	Verpackungszelllinie, die für die Herstellung und Amplifikation von Adenoviren verwendet wird.
Menschliches rekombinantes TGF-β1	MedChemExpress, China	HY-P78214	Zytokin zur Induktion der fibrotischen Aktivierung in NIH/3T3-Fibroblasten verwendet.
Software zur Bildaufnahme	Yokogawa Electric Corporation, Japan	Version 3.08.01.03	Software zur automatisierten Aufnahme von Fluoreszenzbildern und Steuerung des Mikroskops.
Lipidbasiertes Transfektionsreagenz	Invitrogen, USA	11668-019	Transfektionsreagenz zur Übertragung von adenoviralen Plasmiden in HEK293-Zellen
Mikrozentrifugenröhrchen	Axygen, USA	MCT-150-C	Gefäße zur Lagerung von RNA-Lysaten und Probenaufbereitung.
Mikroplattenreader	Tecan, Schweiz	Funke	Multimode-Mikroplattenreader zur Messung der ELISA-Absorbanz.
Maus Typ I Kollagen ELISA Kit	Meike Biotechnology, China	MK6778A	ELISA-Kit zur Quantifizierung von sezerniertem Kollagen Typ I in Kulturüberständen.
NIH/3T3-Mausfibroblasten	Procell Life Science, China	CL-0171	Mausfibroblasten-Zelllinie, die zur Etablierung und Validierung des Reportermodells verwendet wird.
PacI Restriktionsenzym	New England Biolabs, USA	R0547S	Restriktionsenzym zur Linearisierung des adenoviralen Plasmids.
Penicillin–Streptomycin-Lösung	Gibco, USA	15140-122	Antibiotikallösung, ergänzt zu 1 % (V/V), zur Verhinderung bakterieller Kontamination.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen Biotech, China	AQ602	SYBR Green-basierte qPCR-Mastermixlösung zur quantitativen PCR-Analyse.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Servicebio, China	G4202	Puffer zum Waschen von Zellen und zur Reagenzherstellung.
pDC315-EGFP Shuttle-Vektor	GeneChem, China	N/V	Ursprünglicher adenoviraler Shuttlevektor, der für die Konstruktion des Reportergekons verwendet wurde.
qPCR-System	Applied Biosystems, USA	QuantStudio 5	Echtzeit-PCR-System, das für die quantitative Genexpressionsanalyse verwendet wird.
Restriktionsenzyme (BamHI und KpnI)	Abclonal, China	RK21101, RK21104	Restriktionsenzyme, die für die Linearisierung von Shuttle-Vektoren verwendet werden.
Reverse Transkription Kit	TransGen Biotech, China	AT311	Reverse-Transkriptionskit, das für die cDNA-Synthese vor der RT-qPCR verwendet wird.
RNA-Lysereagenz	Invitrogen, USA	15596026	Reagenz zur Gesamt-RNA-Extraktion aus kultivierten Zellen.
SB431542	MedChemExpress, China	301836-41-9	TGF-β Typ-I-Rezeptorinhibitor, verwendet für pharmakologische Inhibierungsexperimente.
Sanger-Sequenzierungsdienst/Reagenzien	Shanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., China	Individueller Service	Sequenzierungsdienst/Reagenzien, die für die Plasmidsequenzverifikation verwendet wurden.
Serologische Pipetten	Corning, USA	4488	Sterile Pipetten, die beim Umgang mit Flüssigkeiten während der Zellkulturverfahren verwendet werden.
T30 Thermocycler	LongGene Scientific Instruments, China	T30	Thermocycler für die Reverse Transkription und die PCR-Amplifikation
Trypsin-EDTA-Lösung	Gibco, USA	25200-056	Zell-Dissociationsreagenz, das für die routinemäßige Zellpassage verwendet wird.
Viral Purification Kit	Takara Bio USA	631533	Kit zur Aufreinigung rekombinanter Adenoviren verwendet.
Wasserbad	Shanghai Yiheng Scientific Instruments, China	HWS-12	Temperaturgesteuerter Wasserbad, verwendet während des Einfrierens von Adenoviren–Auftauzyklen.