Hybridisierungskettenreaktion FISH im sich entwickelnden Drosophila-Optikuslappen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erforderlich sind, um die Hybridisierungskettenreaktion mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (HCR-FISH) in den optischen Lappen der Drosophila melanogaster-Larve durchzuführen. Verfahren für Sondendesign, Hybridisierung, Amplifikation und Gewebemontage werden detailliert beschrieben, um die Visualisierung des sich entwickelnden Optikuslappens zu erleichtern.

Zusammenfassung

Das Verständnis neuronaler Entwicklung erfordert eine präzise Charakterisierung des Zeitpunkts und Ortes von Genen. Techniken wie die In-situ-Hybridisierung ermöglichen seit langem die Visualisierung der Genexpression in sich entwickelnden Geweben. Obwohl die In-situ-Hybridisierung in Drosophila melanogaster-Embryonen weit verbreitet eingesetzt wird, wurde ihre Anwendung auf die Entwicklung visueller Systeme durch mehrere technische Herausforderungen eingeschränkt. Zum Beispiel dringen lange Sonden oft schlecht in den optischen Lappen ein, und Protokolle, die auf diffusibele katalytische Reporter wie Meerrettichperoxidase setzen, liefern in Ganzmontagen häufig niedrige Signal-Rausch-Verhältnisse. Die Hybridisierungskettenreaktion mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (HCR-FISH) überwindet viele dieser Einschränkungen und ermöglicht eine robustere Signalerkennung. Wie bei herkömmlicher FISH hybridisieren sich DNA-Probe-Monomere zu RNA-Sequenzen innerhalb von Geweben. In HCR-FISH hingegen bilden fluoreszenzkonjugierte Verstärkersonden stabile Haarnadelstrukturen, die die Polymerisation zusätzlicher Monomere auslösen und so die Signalintensität verstärken. Der Einsatz multiplexierter Sondensätze ermöglicht zudem den Einsatz kürzerer Oligonukleotide (~45 nt, verglichen mit bis zu 1.000 nt bei herkömmlichem FISH), was die Durchdringung der Sonden verbessert und eine gleichmäßigere Färbung in ganzmontierten Proben erzeugt. Dieser Artikel beschreibt ein HCR-FISH-Protokoll, das für den optischen Lappen der Drosophila-Larve optimiert ist. Das Protokoll passt bestehende HCR-FISH-Ansätze an, indem es die Fixationsbedingungen optimiert und die Konzentration von Sonden und Haarnadeln erhöht, um die Signalintensität und die Gewebepenetration zu verbessern. Reagenzlisten und Schritt-für-Schritt-Verfahren werden bereitgestellt. Potenzielle Anwendungen in der Entwicklungsneurobiologie werden ebenfalls vorgestellt, darunter die Visualisierung von Neugeborenenneuronen und die Charakterisierung von Genexpressionsmustern in Fällen, in denen herkömmliche Methoden wie endogen markierte Proteine oder Antikörperfärbungen nicht ausreichend Informationen liefern.

Einleitung

Um zu verstehen, wie das Gehirn zusammengesetzt ist, muss sowohl die Vielfalt der vorhandenen Zelltypen als auch die in jeder Zelle exprimierten Genrepertoire identifiziert werden. Typ¹. Jüngste Fortschritte in der Einzelzell-RNA-Sequenzierung haben es Forschern ermöglicht, diese Fragen mit hoher Auflösung^zu bearbeiten. Viele Einzelzellansätze bewahren jedoch keine räumliche Informationen, weshalb zusätzliche Experimente erforderlich sind, um transkriptionelle Zelltypencluster auf ihre Positionen im sich entwickelnden Gehirn abzubilden.

Binäre Genexpressionssysteme wie GAL4-UAS können positionsbezogene Informationen liefern, sind aber nicht quantitativ³. Darüber hinaus können Verzögerungen zwischen Genexpression und Berichterdetektion physiologisch relevante Expressionsmuster in frühen Entwicklungsstadien verschleieren. Immunfärbung ist ein weiterer weit verbreiteter Ansatz zur Bestimmung gewebespezifischer Expressionsmuster⁴. Allerdings sind ausgeschiedene Proteine oft diffus und schwer genau zu lokalisieren.

Nukleotid-Labeling-Ansätze wie die In-situ-Hybridisierung (ISH) wurden ebenfalls weit verbreitet eingesetzt, um räumliche Informationen über Genexpression⁵ zu erhalten. In ISH binden markierte DNA-Oligonukleotide an rückkomplementäre RNA-Sequenzen von Interesse. Frühe ISH-Methoden verwendeten radiomarkierte DNA-Sonden⁶, während spätere Protokolle sicherere Etiketten wie Digoxigenin, Fluorescein und Rhodamin ^7,8,9 verwendeten. Wissenschaftler passten ISH rasch für den Einsatz bei Drosophila melanogaster an, wo es zur Charakterisierung der polytänen Chromosomenorganisation und zur Kartierung der Expressionsmuster von Gap-Genen wie Buckel in Whole-Mount-Embryonen^{10,11 angewendet} wurde.

Trotz seiner weitverbreiteten Verwendung erschwerten mehrere technische Einschränkungen die Einführung von ISH in dickeren Ganzmontagepräparaten wie dem Larvenoptikum. Viele In-situ-Protokolle setzten auf diffuse katalytische Reporter, wie Meerrettichperoxidase, was oft zu niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen^{führte – 12}. Darüber hinaus verwendeten viele Ansätze lange Sonden, die auf einzelne Sequenzen abzielten, um die Spezifität zu verbessern. Obwohl sie in Drosophila-Embryonen und polytene Chromosomen wirksam sind, dringen lange Sonden schlecht in das Larvenhirn ein und erzeugen oft ungleichmäßige Markierungen 10,11,13.

Die Entwicklung der einmolekulären fluoreszierenden ISH (smFISH) und der Hybridisierungskettenreaktion der fluoreszenten In-situ-Hybridisierung (HCR-FISH) löste viele dieser Einschränkungen ^14,15. Durch die Verwendung von Sätzen kurzer Sonden, die über eine einzelne Genregion getilelt sind, reduziert smFISH die durchschnittliche Sondenlänge von etwa 1.000 nt auf etwa 40 nt¹⁶. Dies verbessert die Durchdringung der Sonde erheblich, während die starke Signalintensität erhalten bleibt. HCR-FISH verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis weiter durch den Einsatz fluoreszenzkonjugierter Verstärkerproben, die die Positionsgenauigkeit erhöhen und den Signalausgang verstärken. Wichtig ist, dass dieser Amplifikationsschritt offenbar linear mit der Transkriptkonzentration skaliert und so quantitative Messungen der Genexpressionsniveaus¹⁷ ermöglicht.

HCR-FISH beginnt mit Initial-Sonden, die komplementär zur Zielsequenz sind. Diese unmarkierten DNA-Oligonukleotide enthalten eine einzelsträngige Initiatorsequenz, die an die Eingangsdomäne einer fluoreszenzmarkierten H1-Verstärkersonde bindet. H1-Verstärker nehmen eine Haarnadelstruktur an, die die katalytische Inaktivität aufrechterhält, bis sie an die Initiatorsequenz binden. Beim Binden öffnet sich der H1-Verstärker und belichtet eine Sequenz, die an eine Partnersonde, H2, bindet. Diese Wechselwirkung öffnet die H2-Haarnadel, sodass sie eine weitere H1-Sonde binden kann (Abbildung 1)¹⁵. Wiederholte H1/H2-Bindungszyklen erzeugen ein stabiles Polymer, das das Fluoreszenzsignal verstärkt und gleichzeitig Hintergrundrauschen reduziert. Da jede Initiatorsequenz spezifisch für ein entsprechendes H1/H2-Paar ist, können mehrere Sonden mit unterschiedlichen Initiatorsequenzen und Fluorophoren gleichzeitig verwendet werden, um mehrere Gene innerhalb derselben Probe zu markieren.

Abbildung 1: Grafische Darstellung des HCR-FISH-Workflows. DNA-Sonden, die Initiatorsequenzen enthalten, hybridisieren zu einem Ziel-RNA-Transkript. Fluoreszierend markierte DNA-Verstärker-Haarnadeln binden an die Initiatorsequenz und durchlaufen sequentielle Polymerisation, um stabile doppelsträngige Amplifikationsketten zu bilden. Die direkte Fluorophorkonjugation verbessert die Signalverstärkung und das Signal-Rausch-Verhältnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Jüngste Verbesserungen an HCR-FISH haben seine Nützlichkeit weiter erhöht. Das Design der Split-Initiator-Sonde verbessert die Spezifität der Verstärker, und sekundäre Antikörper, die an HCR-Initiatoren konjugiert sind, ermöglichen simultane Immunhistochemie und HCR-FISH¹⁸. Darüber hinaus ermöglichen erweiterte Fluorophor-Optionen nun die multiplexierte Bildgebung von bis zu 10 Genen gleichzeitig^19,20.

Obwohl erste Proof-of-Concept-Experimente für HCR-FISH an Zebrafischen (Danio rerio) durchgeführt wurden, hat die Methode in vielen Systemen breite Anwendung gefunden, insbesondere bei Nicht-Modellorganismen, bei denen Antikörper teuer oder^{nicht verfügbar sind}. Die Sondensynthese bietet zudem eine schnellere Alternative zur Antikörperbildung, die monatelange Entwicklung erfordern kann. Daher bietet HCR-FISH einen schnellen Ansatz zur Validierung von Kandidatengenen, die durch Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdatensätze identifiziert wurden²¹. Selbst bei etablierten genetischen Modellorganismen bietet HCR-FISH eine wertvolle Methode, um neugeborene Neuronen räumlich zu kartieren, wenn GAL4-Reporter oder die Immunhistochemie bestimmte Zellpopulationen nicht ausreichend markieren.

Dieser Artikel beschreibt ein HCR-FISH-Protokoll, das für den Optikuslappen der Drosophila-Larve im dritten Larvenstadium optimiert ist. Das Protokoll passt Methoden an, die zuvor in anderen Organismen veröffentlicht wurden, für den Einsatz im visuellen System Drosophila ²². Fixationsbedingungen, die häufig für die Drosophila-Immunhistochemie verwendet werden, wurden für FISH-Anwendungen optimiert. Die Konzentrationen von Sonden und Haarnadeln wurden erhöht, um die Signalintensität und die Gewebepenetration zu verbessern. PCR-Tuben wurden anstelle von Spotplatten verwendet, um den Reagenzienverbrauch zu reduzieren und die Handhabung kleiner Gewebeproben zu vereinfachen. Außerdem wurden Wasch- und Hybridisierungszeiten verkürzt, um der kleineren Größe des Drosophila-Gehirns im Vergleich zu anderen Insektensystemen, die häufig für HCR-FISH verwendet werden, gerecht zu werden.

Repräsentative Anwendungen zeigen, wie dieser Ansatz positionsbezogene Informationen für bestimmte neuronale Populationen während der Entwicklung liefern kann. Diese Experimente zeigen, dass bestimmte Transkripte, wie etwa abrupte, mit HCR-FISH früher nachgewiesen werden können als mit Antikörperfärbungen oder Reporterlinien. Mögliche Herausforderungen, Fehlersuchstrategien und Anwendungen von HCR-FISH zur Untersuchung der Entwicklung visueller Systeme in Drosophila werden ebenfalls diskutiert.

Protokoll

Alle Drosophila melanogaster-Experimente wurden gemäß den Richtlinien des City College of New York, der Columbia University und der New York University für die Pflege und Nutzung von Forschungsorganismen durchgeführt. Die in diesem Protokoll verwendeten Forschungswerkzeuge sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Puffer bereiten

HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien in nukleasefreien Röhren mit Filterspitzen vor.
HINWEIS: Tragen Sie während des gesamten Eingriffs Handschuhe. Reinigen Sie Arbeitsflächen vor Beginn mit einer RNase-Dekontaminationslösung.

1. Bereite nukleasefreie Lösungen vor
   1. Bereiten Sie 1x PBS-T vor, indem Sie 20x PBS, Triton X-100 und Glycin in nukleasefreiem Wasser auf Endkonzentrationen von 1x PBS, 1% (v/v) Triton X-100 und 1 mM Glycin verdünnen.
   2. Bereiten Sie 5x SSCT vor, indem Sie 20x SSC und Tween-20 in nukleasefreiem Wasser verdünnen, um 5x SSC mit 0,1 % (v/v) Tween-20 herzustellen.
   3. Verdünne 20x PBS in nukleasefreiem Wasser, um 1x PBS herzustellen.

2. Designsonden

1. Um Sonden kommerziell zu entwerfen, wählen Sie die interessante Isoform für die betreffende Art aus und bestellen Sie, die Sonden über die Weboberfläche des Anbieters mit dem gewünschten Verstärker abgestimmt werden.
   HINWEIS: Kommerzielle HCR-Probechemikalien und Initiatorsequenzen sind proprietär und von Molecular Instruments patentiert.
   1. Verändern Sie die Zielregion in der Webschnittstelle, wenn eine transkriptspezifische oder pre-mRNA-Erkennung gewünscht ist.
   2. Bestellen Sie etwa 20 Sonden für hochexprimierte Transkripte. Verwenden Sie bis zu 40 Sonden für Transkripte mit niedriger Häufigkeit in Ganzmontage-Drosophila-Präparaten .
      HINWEIS: Bestellen Sie spezialisierte Oligos für kürzere Transkripte, die weniger Sondenbindungsstellen aufnehmen.
2. Um Sonden manuell zu entwerfen, laden Sie die FASTA-Sequenz für das Zieltranskript herunter. Bestimmen Sie, ob Sie eine einzelne Isoform oder alle Isoformen des Gens anvisieren.
   HINWEIS: Priorisieren Sie konstitutive Exonen oder hoch exprimierte Isoformen, die aus RNA-Sequenzierungsdatensätzen identifiziert wurden, um das Signal zu verbessern.
   1. Wenn Sonden für die Pre-mRNA-Detektion entworfen werden, entwerfen Sie Sonden, die sich über Intron-Exon-Übergänge erstrecken. Entwickeln Sie Sonden, die Verbindungsverbindungen überspannen, um reife Transkripte zu erkennen. Verwenden Sie intronische Sonden, um entstehende Transkripte in den Kernen zu erkennen.
      HINWEIS: Intronische Sonden können nicht mit reifen zytoplasmatischen Transkripten kolokalisieren und benötigen möglicherweise zusätzliche Marker zur Zellidentifikation.
   2. Bestimme die Größe des Sondensatzes. Verwenden Sie mindestens etwa 5 Sonden für kurze Transkripte, wenn größere Sondensätze nicht entworfen werden können. Verwenden Sie 20 Sonden für Standardanwendungen und etwa 40 Sonden für optimale Empfindlichkeit in Ganzmontageproben^18,23.
   3. Wenn du deine eigenen Sonden entwirfst, verwende 25-NT-Sequenzen, die durch einen 2bp-Abstandsabstand getrennt sind, und füge Split-Initiator-Sequenzen am 5-Fuß-Ende jedes Oligos hinzu.
      HINWEIS: Obwohl Split-Initiator-Sequenzen der ersten Generation öffentlich verfügbar sind, sind kommerzielle Initiator-Sequenzen der nächsten^{Generation proprietär}.
   4. Wenn du deine eigenen Sonden entwirfst, validiere die Sondensequenzen. Stellen Sie sicher, dass die Sonden in jedem Set ähnliche Schmelztemperaturen aufweisen. Bestätigen Sie die 100%ige Identität zwischen den Sonden.
      HINWEIS: Vermeiden Sie starke G-reiche Regionen und halten Sie einen ähnlichen GC-Anteil unter^{den Sonden 24}. Minimiere wiederholte Sequenzen und evaluiere abweichende Bindung mit BLAST²⁵.
   5. Verwenden Sie bei Bedarf öffentlich verfügbare Probe-Design-Software^26,27.
      HINWEIS: Open-Source-Designtools reproduzieren möglicherweise nicht die optimierte Leistung kommerzieller Probe-Design-Pipelines.

3. Gehirne zerlegen, reparieren und vorhybridisieren

1. Vorwärm-Sonde-Hybridisierungspuffer auf 37 °C.
   VORSICHT: Der Probe Hybridization Buffer enthält Formamid. Unter einer chemischen Abzugshaube unter geeigneter persönlicher Schutzausrüstung führen.
2. Verdünnen Sie jede Sonde auf eine Endkonzentration von 1 μM mit nukleasefreiem destilliertem Wasser.
3. Aliquot etwa 250 μL nukleasefreies PBS auf eine Dissektionsschale.
4. Übertragen Sie eine wandernde Larve des dritten Stadiums mit einer Pinzette in die PBS. Halten Sie den Bauch mit einer Zange und greifen Sie mit einem zweiten Paar die Mundhaken. Ziehen Sie die Mundhaken vom Körper weg, um das Gehirn und das ventrale Nervenkabel (VNC) zu isolieren.
5. Fettkörper und Speicheldrüsen entfernen und gleichzeitig die VNC erhalten. Transferiere dissektionierte Gehirne in ein Rohr mit 600 μL eiskaltes, nukleasefreiem PBS.
   HINWEIS: Halten Sie die Sehlappen während der gesamten Dissektion untergetaucht, um ein Gewebetrocknen zu verhindern.
6. Wiederholen Sie die Sektion, bis etwa sechs Sehlappen gesammelt wurden. Vollständige Dissektionen innerhalb von 20 Minuten, um den Gewebeabbau zu minimieren.
7. Fügen Sie 200 μL 16 % Paraformaldehyd (PFA) hinzu, um eine Endkonzentration von 4 % PFA zu erreichen. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um es zu mischen, und brüten Sie es 15 Minuten bei Zimmertemperatur aus.
   VORSICHT: PFA ist toxisch und mutagen. Handhabung unter einer chemischen Abgashaube mit Handschuhen.
8. Entferne das Fixationsmittel aus den Proben und deponiere es als ausgewiesenen chemischen Abfall. Waschen Sie die Proben dreimal mit 600 μL kaltem nukleasefreiem PBS und verwenden Sie eine Dissektionsschale, um die Waschlösungen aufzufangen.
   HINWEIS: Untersuchen Sie Waschmittel auf Gewebeverlust und bergen Sie alle versetzten Gehirne unter einem Sezionsmikroskop.
9. Transferiere Gehirne in ein PCR-Röhrchen mit 100 μL vorgewärmtem Probe-Hybridisationspuffer.
   Mische vorsichtig durch Flicken der Tube und brüte sie 10 Minuten bei Zimmertemperatur.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gehirn untergetaucht bleibt und nicht an den Rohrwänden haftet.

4. Sonden hybridisieren

1. Bereiten Sie eine 4-nM-Sondenlösung vor, indem Sie 0,4 pmol jeder auf Probe Hybridization Buffer eingestellten Sonde hinzufügen, um ein Endvolumen von 100 μL zu erreichen.
   HINWEIS: Erhöhen Sie die Sondenkonzentration auf bis zu 16 nM, wenn die Signalintensität bei den ersten Färbungen niedrig ist.
2. Entferne den Vorhybridisierungspuffer, ohne das Gewebe zu stören. Fügen Sie jeder Probe eine verdünnte Sondenlösung hinzu.
3. Proben bei 37 °C auf einem Nutator 16–24 Stunden inkubieren.

5. Sondensignal verstärken

1. Bring den Amplification Buffer auf Raumtemperatur. Bereiten Sie pro Probe etwa 200 μL Amplification Buffer vor.
2. Gleichgewichts-Waschpuffer. Warmer Sonden-Waschpuffer auf 37 °C mit einem Wasserbad.
   VORSICHT: Probe Wash Buffer enthält Formamid. Handle unter einer chemischen Abzugshaube.
3. Entferne die Sondenlösung und lagere sie bei -20 °C zur Wiederverwendung.
   HINWEIS: Wiederverwenden Sie Sondenlösungen, bis die Färbungsintensität abnimmt.
4. Waschen Sie die Proben jeweils viermal für 10 Minuten im vorgewärmten Probe Wash Buffer bei 37 °C. Wasche die Proben jeweils 5 Minuten lang in Raumtemperatur 5x SSCT.
5. Fügen Sie 100 μL Amplification Buffer ohne Haarnadeln hinzu. 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
6. Erhitze einen Thermocycler auf 95 °C. Fügen Sie 2 μL von jedem 3 μM Haarnadel-Schaft zu separaten PCR-Röhrchen hinzu. Bereiten Sie für jede Haarnadelart ein Rohr vor.
   HINWEIS: Erhöhen Sie die Verstärkerkonzentration, wenn die Färbung spärliche Puncta oder ein geringes Signal-Rausch-Verhältnis erzeugt.
7. Inkubieren Sie Haarnadeln bei 95 °C für 90 Sekunden. Schütze die Röhren vor Licht und brüte mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur.
8. Bereite eine Verstärkungslösung vor. Kombinieren Sie Haarnadeln im Amplification Buffer zu einem Endvolumen von 100 μL pro Probe.
9. Entferne den Amplification Buffer aus den Proben. Fügen Sie haarnadelhaltigen Amplifikationspuffer hinzu.
   Über Nacht bei Zimmertemperatur auf einem lichtgeschützten Nutator (in Folie eingewickelt) inkubieren.
10. Entferne die Verstärkungslösung. Waschen Sie die Proben zweimal für 5 Minuten in 150 μL 5x SSCT. Wasche die Proben dreimal für 10 Minuten mit 150 μL 5x SSCT auf einem Nutator. Führen Sie zwei kurze Waschphasen in nukleasefreiem PBS durch, um Waschmittel zu entfernen.

6. Montage von Gehirnen für die Bildgebung

1. Klebe einen Bildabstandsaufkleber an einem Glas-Objektträger an. Drücken Sie sanft mit dem unteren Ende einer Pinzette, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
2. Schneiden Sie das Gehirn durch das ventrale Nervenkabel mit einer Pinzette.
3. Platziere das Gehirn in die Mitte des Abstandsschachts. Richte das Gewebe seitlich aus, sodass der Sehlappen nach oben zeigt.
4. Fügen Sie ausreichend Antifade-Montagemedium (etwa 25 μL) hinzu, um den Brunnen zu füllen, ohne Luftblasen zu erzeugen. Verteilt das Montagemedium gleichmäßig mit einer Pinzette.
5. Legen Sie einen Deckzettel über die Probe und versiegeln Sie sie mit Nagellack.

Ergebnisse

Für Wissenschaftler, die Entwicklungsneurobiologie erforschen, bietet HCR-FISH eine robuste Methode zur Visualisierung von Genexpressionsmustern und zur Bestimmung der räumlichen Positionen sich entwickelnder Neuronen im optischen Lappen von Drosophila .

Im optischen Lappen Drosophila (Abbildung 2A) entstehen Neuronen im Medulla neuropil aus neuronalen Stammzellen (Neuroblasten), die aus einem räumlich gemusterte...

Diskussion

Diese Studie beschreibt eine Anpassung von HCR-FISH für den Einsatz im optischen Lappen der Drosophila melanogaster-Larven . Konventionelle In-situ-Hybridisierungsansätze schneiden im gesamten Larvenhirngewebe oft schlecht ab, da die Sondendurchdringung und die geringe Signalintensität begrenzt sind. Das hier vorgestellte Protokoll optimiert mehrere kritische Schritte zur Verbesserung der Färbungsqualität im sich entwickelnden optischen Lappen. Fixationsbedingungen, die...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10% Tween-20	Bio-Rad Laboratories	1662404	NA
20x PBS, pH7.4	Growcells.com	MRGF-6396	2,74 M NaCl, 53,7 mM KCl, 20,3 mM Na2HPO4, 29,4 mM KH2PO4
20x SSC	Quality Biological	351-003-131	3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat
37 °C Inkubator	Fisher Scientific (Isotemp)	15-015-2633	NA
37 °C Wasserbad	Fisher Scientific	FSGPD15D	NA
Aluminiumfolie	Reynolds Wrap/Fisher Brand	15-078-291	NA
Antikörper: Maus-anti-Abrupt	DSHB	Abrupt; RRID: AB_528344	Verdünnung: 1:20
Antikörper: Hühner-anti-GFP	Millipore Sigma	Catalog# 06-896; RRID: AB-619712	Verdünnung: 1:500
Antikörper: Kaninchen-anti-GFP	Life Technologies	#11122; RRID: AB_221569	Verdünnung: 1:500
Antikörper: Kaninchen-anti-Dll	Genscript/Desplan lab	-	Verdünnung: 1:200
Antikörper: Ratten-anti-NCadherin	DSHB	DN-Ex #8, RRID: AB_528121	Verdünnung: 1:50
Antikörper: Kaninchen-anti-SoxN	Genscript/Desplan lab	-	Verdünnung: 1:200
Antikörper: Meerschweinchen-anti-Traffic jam	Geschenk von D. Godt	-	Verdünnung: 1:2.000
Antikörper: Esel-anti-Ratte 405	Jackson ImmunoResearch	Code # 712-475-150; RRID: AB_2340680	Verdünnung: 1:100
Antikörper: Esel-anti-Hühner 488	Jackson ImmunoResearch	Code #703-545-155; RRID: AB_2340375	Verdünnung: 1:200
Antikörper: Esel-anti-Maus 488	Jackson ImmunoResearch	Code #715-545-151; RRID: AB_2341099	Verdünnung: 1:200
Antikörper: Esel-anti-Kaninchen 488	Jackson ImmunoResearch	Code #711-545-152; RRID: AB_2313584	Verdünnung: 1:200
Antikörper: Esel-anti-Kaninchen A555	Thermo Scientific	Catalog #A-31572; RRID: AB_162543	Verdünnung: 1:200
Antikörper: Esel-anti-Ratte Cy3	Jackson ImmunoResearch	Code #712-165-153; RRID: AB_2340667	Verdünnung: 1:200
Antikörper: Esel-anti-Meerschweinchen 647	Jackson ImmunoResearch	Code #706-605-148; RRID: AB_2340476	Verdünnung: 1:200
Antikörper: Esel-anti-Ratte 647	Jackson ImmunoResearch	Code #712-605-153; RRID: AB_2340694	Verdünnung: 1:200
Antifade-Montagemittel	Thermo Fisher Scientific	S36940 (SlowFade Gold Antifade Montagemittel)	Andere Slowfades funktionieren ebenfalls, einschließlich solche mit DAPI (S36936)
Konfokalmikroskop	Zeiss	LSM-880	NA
Deckgläser (22 x 30)	VWR	16004-332	NA
Fliege: D. melanogaster: ab-GFP-FLAG	BDSC	38626; RRID: BDSC_38626	NA
Fliege: D. melanogaster: Canton S	BDSC	64349; RRID: BDSC_64349	NA
Fliege: D. melanogaster: dpp-Gal4	BDSC	1553; RRID: BDSC_1553	NA
Fliege: D. melanogaster: ham-GFP.FPTB	BDSC	83660; RRID: BDSC_83660	NA
Fliege: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;	BDSC	32198; RRID: BDSC_32198	NA
Fliege: D. melanogaster: UAS-Stinger	BDSC	84277; RRID: BDSC_84277	NA
Fliege: D. melanogaster: wit-KO-Gal4	BDSC	600136; RRID: BDSC_600136	NA
Pinzette	Dumont	#5 oder #55s	NA
Glasplatten	VWR	16005-106	NA
Glycin	Millipore Sigma	G7126-10MG	NA
HCR-Amplifikationspuffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR-Gold-Amplifer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR HiFi-Sonden	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR-Sonden-Hybridisierungspuffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Enthält Formamid
HCR-Sonden-Waschpuffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Enthält Formamid
Nagellack (klar)	Electron Microscopy Sciences	72180	NA
Nukleasenfreies Wasser (nicht mit DEPC behandelt)	Thermo Fisher Scientific	AM9937	NA
Nutating-Mischer	Corning/Fisher Scientific	10-320-100	NA
Paraformaldehyd, 16% (w/v)	Electron Microscopy Sciences	15710	Giftig
PCR-Maschine/Thermocycler	Bio-Rad	1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)	NA
PCR-Pull-Apart-Röhrchenstreifen mit Kuppelkappenstreifen (0,2 ml)	USA Scientific	#1402-2400	NA
Petrischalen (150 x 15 mm; zur Herstellung von Präparierschalen)	Fisher Scientific	FB0875714	NA
RNase ZAP	ThermoFisher Scientific	AM9780