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Methodenartikel

Magnetische Nano-Aktuierungsplattform zur ferngesteuerten und kontrollierbaren Mechanostimulation von Schwann-Zellen mit konfokaler Echtzeit-Bildgebung

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DOI:

10.3791/71685

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8. September 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, 2Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, 3International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin University, 4Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine mikroskopkompatible magnetische Nano-Aktuator-Plattform vor, die fluoreszierende überparamagnetische Nanopartikel, einen kalibrierten Elektromagneten und eine Echtzeit-Konfokalmikroskopie integriert, um Schwann-Zellen ferngesteuert und kontrolliert zu stimulieren und ihre dynamischen mechanosensorischen Reaktionen zu überwachen.

Zusammenfassung

Mechanische Kräfte regulieren das zelluläre Verhalten entscheidend, doch viele bestehende Methoden zur mechanischen Stimulation beruhen auf direktem physischem Kontakt oder künstlich konstruierten extrazellulären Umgebungen, wodurch ihre Flexibilität in dynamischen Live-Zell-Studien eingeschränkt ist. Hier stellen wir eine magnetische Nano-Aktuationsplattform zur Fernsteuerung, berührungslosen und kontrollierbaren Mechanostimulation von Schwann-Zellen in vitro vor. Diese integrierte Versuchsanordnung ermöglicht die ferngesteuerte magnetische Stimulation und synchronisierte Live-Zell-Bildgebung innerhalb derselben Experimentiersitzung. In dieser Arbeit wird die Herstellung fluoreszierender superparamagnetischer Nanopartikel (SPIONs), optional auch die Herstellung von aktinzielgerichteten funktionalisierten SPIONs (f-SPIONs), der Aufbau und die Kalibrierung einer mikroskopkompatiblen elektromagnetischen Stimulationsvorrichtung, die Abschätzung magnetischer Kräfte auf Ebene einzelner Partikel und einzelner Zellen sowie die Kombination der magnetischen Aktuation mit Echtzeit-Konfokalmikroskopie beschrieben. Schwann-Zellen sind hochgradig mechanosensitive Gliazellen, die wesentliche Rollen bei Entwicklung, Aufrechterhaltung und Reparatur peripherer Nerven spielen. Die Echtzeit-Beobachtung ihrer Reaktionen auf mechanische Stimulation ist entscheidend, um zu verstehen, wie mechanische Kräfte die Organisation des Zytoskeletts und das zelluläre Verhalten beeinflussen. Diese Plattform bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Untersuchung der Mechanobiologie von Schwann-Zellen und kann bei Bedarf an andere mechanisch reagierende Zelltypen sowie an multizelluläre Systeme angepasst werden.

Einleitung

Mechanische Reize regulieren eine breite Palette zellulärer Prozesse, darunter Adhäsion, Migration, Proliferation, Differenzierung und phänotypische Plastizität1,2,3. Studien zur Mechanobiologie haben gezeigt, dass sowohl Neuronen als auch Gliazellen während der gesamten Entwicklung eine ausgeprägte Mechanosensitivität und -reaktivität aufweisen4,5,6,7. Um zu untersuchen, wie Zellen mechanische Kräfte wahrnehmen und darauf reagieren, wurden mehrere experimentelle Ansätze entwickelt, darunter Rasterkraftmikroskopie (AFM), Mikropipettenaspiration, optische Pinzetten, dehnungsbasierte Kultursysteme und mikrofluidische Plattformen8,9,10,11,12. Diese Techniken haben das Studium der Mechanotransduktion erheblich vorangebracht. Viele von ihnen erfordern jedoch direkten physischen Kontakt mit den Zellen oder beruhen auf vordefinierten, künstlichen mechanischen Umgebungen, wodurch sie weniger geeignet für eine räumlich getrennte, dynamisch steuerbare und bildgebungsverträgliche Stimulation sind.

Die Kraftübertragung mithilfe magnetischer Nanopartikel bietet eine alternative Strategie zur Fern-Mechanostimulation13,14,15,16,17,18. Da die meisten biologischen Gewebe eine geringe magnetische Suszeptibilität aufweisen, können äußere Magnetfelder biologische Proben durchdringen, ohne direkten Kontakt herzustellen, und gezielt auf magnetisch ansprechbare Partikel wirken, die in Zellen oder Gewebe eingebracht wurden. In Gegenwart eines magnetischen Feldgradienten erfahren diese Partikel gerichtete Kräfte, die genutzt werden können, um mechanische Störungen auf subzellulärer, zellulärer oder geweblicher Ebene hervorzurufen8,9. Dieser Ansatz ist attraktiv, weil er berührungslos, justierbar, mit der Live-Bildgebung kompatibel ist und potenziell auf komplexere biologische Systeme erweiterbar ist.

Schwann-Zellen sind hochgradig mechanosensitive Gliazellen19,20, die entscheidende Rollen bei der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Reparatur peripherer Nerven spielen21,22. Die dynamische Beobachtung der Reaktionen von Schwann-Zellen auf mechanische Reize ist wichtig, um zu verstehen, wie mechanische Kräfte die Organisation des Zytoskeletts und das Zellverhalten regulieren. Viele herkömmliche Systeme zur Kraftübertragung sind jedoch nur bedingt mit der Echtzeit-Mikroskopie in hoher Auflösung kompatibel. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir eine magnetische Nano-Aktuationsplattform entwickelt, die fluoreszierende magnetische Superpartikel (f-SPIONs), die gezielt das Aktin-Zytoskelett ansprechen, mit einer speziell angefertigten elektromagnetischen Vorrichtung, die mit einem konfokalen Mikroskopständer kompatibel ist, sowie einem quantitativen Rahmenwerk zur Kraftabschätzung kombiniert. Diese integrierte Anordnung ermöglicht eine ferngesteuerte magnetische Stimulation und synchronisierte Live-Cell-Abbildungen innerhalb derselben Experimentiersitzung.

Der hier beschriebene Arbeitsablauf umfasst die Herstellung fluoreszenter magnetischer Superpartikel (SPIONs), eine optionale, auf Phalloidin basierende Funktionalisierung zur gezielten Markierung von Aktin zur Erzeugung von f-SPIONs, die Charakterisierung der Nanopartikel, den Aufbau eines elektromagnetischen Geräts und die Kalibrierung des Feldes, die Abschätzung der magnetischen Kraft sowie die kombinierte magnetische Stimulation mit Echtzeit-Konfokalmikroskopie. Obwohl dieser Ansatz hier für Schwann-Zellen optimiert wurde, könnte er einen praktischen Rahmen für verwandte Untersuchungen in anderen mechanisch empfindlichen lebenden Systemen bieten.

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Protokoll

Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente verwendeten eine etablierte Ratten-Schwann-Zelllinie (RSC96) und beinhalteten keine menschlichen Probanden oder lebende Tiere. Diese Studie wurde als Teil eines umfassenderen Forschungsprojekts durchgeführt, das Tierversuche umfasste und von dem Ausschuss für Tierschutz und Ethik des Ersten Krankenhauses der Jilin-Universität genehmigt wurde (Genehmigungsnummer: 2022-0045).

1. Herstellung fluoreszierender magnetischer Superpartikel

  1. Synthetisieren Sie oleinsäurebeschichtete Fe₃O₄-Nanopartikel.
    ​HINWEIS: Oleinsäurebeschichtete Fe₃O₄-Nanopartikel wurden durch thermische Zersetzung wie zuvor beschrieben synthetisiert20,23.
    1. Geben Sie 2 mmol Fe(acac)₃, 6 mmol Oleinsäure, 6 mmol Oleylamin und 5 mmol 1,2-Hexade candiol in 20 mL Benzylether in einen Reaktionskolben.
    2. Rühren Sie die Mischung unter einer Stickstoffatmosphäre 15 min lang, bis eine homogene Vorläuferlösung erhalten wird.
    3. Erhitzen Sie die Mischung mit einer Rate von 20 °C/min auf 200 °C.
    4. Halten Sie die Reaktion 30 min lang bei 200 °C.
    5. Erhöhen Sie die Temperatur auf 265 °C und lassen Sie die Mischung 30 min lang rückfließen.
    6. Lassen Sie das Reaktionsgemisch natürlich auf Raumtemperatur abkühlen.
    7. Sammeln Sie die Fe₃O₄-Nanopartikel durch magnetische Trennung ein.
    8. Waschen Sie die Nanopartikel dreimal mit Ethanol.
    9. Dispergieren Sie die gereinigten Nanopartikel erneut in Toluol.
  2. Stellen Sie Fe₃O₄·Cy3.5-Superpartikel her.
    ​HINWEIS: Fe₃O₄·Cy3.5-Superpartikel wurden wie zuvor beschrieben hergestellt20,24,25.
    1. Dispergieren Sie 28 mg oleinsäurebeschichteter Fe₃O₄-Nanopartikel in 4 mL Toluol in einem 50-mL-Dreihals-Rundkolben.
    2. Stellen Sie eine wässrige Phase her, die 12,5 mg Natriumdodecylsulfat und 3 mg Cyanin 3.5 (Cy 3.5) in 12,5 mL Wasser enthält.
    3. Vermischen Sie die Fe₃O₄-Nanopartikelsuspension in Toluol (28 mg in 4 mL; 7 mg/mL) mit der wässrigen Tensid/Farbstoff-Lösung, um eine Öl-in-Wasser-Mikroemulsion zu bilden.
    4. Mischen Sie gründlich, bis eine stabile Emulsion erhalten ist.
    5. Erhitzen Sie den Dreihals-Rundkolben auf 60 °C und rühren Sie kontinuierlich bei 300 U/min für 6 h.
      HINWEIS: Es ist kein Vakuum- oder Rotationsverdampfungsverfahren erforderlich.
    6. Verdampfen Sie das Toluol unter den oben beschriebenen Bedingungen, um die Aggregation der Fe₃O₄-Nanopartikel zu induzieren. Überführen Sie mithilfe einer Einweg-Transferpipette eine kleine Aliquot aus der Lösung in ein Reagenzglas und lassen Sie es stehen. Das Fehlen einer Phasentrennung zeigt an, dass das Toluol vollständig entfernt wurde.
    7. Überführen Sie die Fe₃O₄·Cy3.5-Superpartikelsuspension in 15-mL-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie 5 min bei 2.370 × g bei Raumtemperatur, um die Superpartikel zu sammeln, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
    8. Dispergieren Sie das Pellet erneut in ultrareinem entionisiertem Wasser und zentrifugieren Sie erneut 5 min bei 2.370 × g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschschritt dreimal, um restlichen freien Cy3.5-Farbstoff und Natriumdodecylsulfat zu entfernen.
  3. Beschichten Sie die Superpartikel mit Polydopamin (PDA).
    ​HINWEIS: Mit Polydopamin beschichtete Superpartikel wurden wie zuvor beschrieben hergestellt20,26.
    1. Zentrifugieren Sie die Fe₃O₄·Cy3.5-Superpartikelsuspension 5 min bei 2.370 × g bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.
    2. Dispergieren Sie das Pellet in 10 mM Tris-Puffer (pH 8,5).
    3. Fügen Sie 26 mg Dopaminmonomer zur Suspension hinzu.
    4. Rühren Sie die Mischung 3 h lang bei Raumtemperatur unter alkalischen Bedingungen.
    5. Zentrifugieren Sie die Suspension 5 min bei 2.370 × g bei Raumtemperatur.
    6. Entfernen Sie den Überstand und dispergieren Sie das Pellet in ultrareinem Wasser, um Fe₃O₄·Cy3.5@PDA-Partikel (SPIONs) zu erhalten.
  4. Funktionalisieren Sie die Partikel optional mit Phalloidin-Alexa Fluor 350.
    ​HINWEIS: Die Superpartikel wurden oberflächenfunktionalisiert unter Verwendung von kommerziell erhältlichem Phalloidin-Alexa Fluor 35020.
    1. Stellen Sie 5 mL wässrige Lösung her, die 100 Einheiten Phalloidin-Alexa Fluor 350 enthält.
    2. Geben Sie 200 µL Fe₃O₄·Cy3.5@PDA-Suspension, die 2 mg Partikel enthält, zu der Lösung hinzu.
    3. Rühren Sie die Mischung vorsichtig 24 h lang bei Raumtemperatur.
    4. Zentrifugieren Sie die Mischung 5 min bei 2.370 × g bei Raumtemperatur.
    5. Entfernen Sie den Überstand und dispergieren Sie das Pellet in entionisiertem Wasser.
    6. Lagern Sie die endgültige Formulierung Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidin (f-SPIONs) lichtgeschützt bis zur Verwendung.

2. Charakterisierung der Nanopartikel

  1. Bestimmen Sie die Morphologie und Größe.
    1. Bereiten Sie Nanopartikelproben gemäß den Anforderungen des Geräts für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) oder die hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) vor.
    2. Erstellen Sie Aufnahmen, um die allgemeine Partikelmorphologie, die Kern-Schale-Struktur und den mittleren Durchmesser zu bestimmen (Abbildung 1).
    3. Bereiten Sie wässrige Nanopartikelsuspensionen für die dynamische Lichtstreuung (DLS) vor.
    4. Messen Sie den hydrodynamischen Durchmesser und den Polydispersitätsindex (PDI).
    5. Vergleichen Sie die Ergebnisse der Elektronenmikroskopie und der DLS, um die Formulierungshomogenität und das kolloidale Verhalten zu beurteilen.
  2. Bestimmen Sie die magnetischen Eigenschaften.
    1. Bereiten Sie getrocknete oder konzentrierte Nanopartikelproben vor, die für die Analyse mittels supraleitender Quanteninterferenzvorrichtung (SQUID) geeignet sind.
    2. Aufzeichnen der magnetischen Hysteresekurven bei 300 K.
    3. Bestimmen Sie die Sättigungsmagnetisierung, Remanenz und Koerzitivfeldstärke.
    4. Bestätigen Sie, dass die Partikel ein superparamagnetisches Verhalten mit vernachlässigbarer Remanenz und Koerzitivfeldstärke zeigen.
  3. Bestimmen Sie die Fluoreszenzeigenschaften.
    1. Bereiten Sie eine f-SPION-Suspension in ultrareinem deionisiertem Wasser vor und geben Sie die Suspension in eine Quarzküvette.
    2. Nehmen Sie Photolumineszenzspektren mit einem Fluoreszenzspektralphotometer auf.
    3. Bestätigen Sie, dass das fluoreszierende Signal nach Waschen und erneuter Suspension nachweisbar bleibt.
  4. Validieren Sie die Aktin-assoziierte Lokalisation bei Verwendung der gezielten Formulierung.
    1. Beziehen Sie RSC96-Zellen.
      ​HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten RSC96-Zellen, eine spontan transformierte Ratte-Schwann-Zelllinie, die durch Langzeitkultur primärer Ratten-Schwann-Zellen etabliert wurde, stammten aus der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6) und wurden negativ auf Mykoplasmen- und Pilzkontamination getestet. Es wurden Zellen der Passagen 3–10 verwendet.
    2. Kultivieren Sie die Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin).
    3. Säen Sie RSC96-Zellen mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen pro 35-mm-Zellkulturgefäß für die Mikroskopie aus und kultivieren Sie sie 24 h bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO₂, um die Zelladhäsion zu ermöglichen.
    4. Aspirieren Sie das vorhandene Kulturmedium, waschen Sie die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und geben Sie frisches Kulturmedium, das 15 µg/mL f-SPIONs enthält. Inkubieren Sie die Zellen 12 h mit den f-SPIONs.
    5. Aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskalter PBS, die 1 mM Deferoxamin enthält, um nicht internalisierte Partikel gründlich zu entfernen.
    6. Erstellen Sie konfokale Aufnahmen, um die intrazelluläre Verteilung der Partikel zu bewerten. Stellen Sie die Bildgebungsparameter auf eine Blende von 1 Airy-Einheit (AU) und eine z-Schrittweite von 0,43 µm ein, um hochauflösende optische Schnitte der intrazellulären Strukturen zu erhalten.
    7. Prüfen Sie, ob die Partikel eine Anreicherung in Aktin-assoziierten zellulären Bereichen zeigen.

3. Konstruktion und Kalibrierung der elektromagnetischen Stimulationsvorrichtung (Abbildung 2)

  1. Bauen Sie die elektromagnetische Vorrichtung zusammen.
    1. Konstruieren Sie ein kompaktes elektromagnetisches Spulensystem, das auf den Objekttisch des konfokalen Mikroskops und die Kammer für Lebendzellen abgestimmt ist (Abbildung 2A,B).
    2. Schließen Sie die Spule an eine regelbare Stromversorgung oder eine externe Stromquelle an.
    3. Numerische Simulation der Gradienten-Magnetfeldumgebung unter Verwendung von COMSOL Multiphysics 4.3b (Abbildung 2C,D).
    4. Bestätigen Sie, dass der Elektromagnet unter verschiedenen Eingangsströmen das entsprechende Gradientmagnetfeld (GMF) erzeugt (Abbildung 2G).
  2. Messen Sie die magnetische Flussdichte und kalibrieren Sie das Gradientenmagnetfeld.
    1. Platzieren Sie den Elektromagneten neben die Kulturschale, wobei die Polspitze auf die Mitte der Schale gerichtet ist und sich 1 mm von der Außenwand der Schale entfernt befindet (Abbildung 2E,F).
    2. Beibehalten Sie diese relative geometrische Anordnung zwischen dem Elektromagneten und der Kulturschale während sämtlicher nachfolgender Live-Cell-Magnetkraftstimulations- und Bildgebungsexperimente.
    3. Verwenden Sie ein digitales Gauß-Messgerät, um die magnetische Flussdichte an vordefinierten Positionen innerhalb des Stimulationsbereichs zu messen, wobei das Positionierungsraster auf der Unterseite der Kulturschale als räumliche Referenz dient.
    4. Berechnen Sie den lokalen Feldgradienten aus der räumlichen Änderung der magnetischen Flussdichte.
    5. Kalibrieren und validieren Sie den numerisch simulierten magnetischen Feldgradienten anhand der experimentell gemessenen und berechneten Werte des magnetischen Feldgradienten.

4. Schätzung der vom Plattform erzeugten magnetischen Kräfte.

  1. Definieren Sie das Kraftschätzungsmodell.
    1. Verwenden Sie die Kraftgleichung für magnetische Nanopartikel in einem inhomogenen Magnetfeld27,28:
      Magnetische Kraftgleichung F=(m·∇)B, Formeldarstellung in der Physikforschung.
    2. Unter der Annahme einer superparamagnetischen Ausrichtung mit dem angelegten Feld vereinfachen Sie die Gleichung zu
      Magnetische Kraftgleichung zur Berechnung der SPION-Dynamik, zeigt \( F_{f-SPION} = m \frac{dB}{dr} \).
      wobei:
      F die nanomagnetische Kraft ist,
      m das magnetische Dipolmoment ist,
      Divergenz des Magnetfeldsymbols ∇·B=0 für die Magnetfeldtheorie, Gleichungsdiagramm. der Magnetfeldgradient ist,
      dB/dr der Magnetfeldgradient (T/m) ist, der vom entsprechenden Magnetfelderzeugungsgerät erzeugt wird.
    3. Verwenden Sie den gemessenen Feldgradienten aus dem kalibrierten Gerät für alle Berechnungen.
  2. Schätzen Sie die Kraft ab, die auf ein einzelnes Nanopartikel wirkt.
    1. Bestimmen Sie die durchschnittlichen Partikelabmessungen aus HRTEM-Aufnahmen.
    2. Berechnen Sie das Volumen des magnetischen Kerns unter Annahme einer sphärischen Geometrie.
    3. Schätzen Sie das Fe₃O₄-spezifische magnetische Volumen basierend auf dem magnetischen Anteil des Kerns.
    4. Berechnen Sie das magnetische Dipolmoment gemäß Massenberechnungsformel, m=ρ·V·Mm, Gleichung.
      wobei:
      Mm die Massenmagnetisierung der f-SPIONs (16 A·m2/kg) bei der gegebenen Feldstärke darstellt;
      ρ die Dichte von Fe₃O₄ (5,24 g/cm3) ist;
      V das Volumen des Fe₃O₄-magnetischen Kerns innerhalb jedes f-SPIONs (5,89 × 10⁻17 cm3) ist.
    5. Multiplizieren Sie das Dipolmoment mit dem gemessenen Feldgradienten, um die auf ein einzelnes Nanopartikel wirkende Kraft abzuschätzen (Statische Reibung von SPIONs; Formel \(F_{f-SPION}\); Konzept in der Analyse magnetischer Nanopartikelkräfte.).
  3. Schätzen Sie die Nanopartikelaufnahme pro Schwann-Zelle ab.
    1. Säen Sie RSC96-Schwann-Zellen mit 5 × 105 Zellen pro Vertiefung in 35-mm-Zellkultur-Mikroskopieplatten aus.
    2. Inkubieren Sie die Zellen 24 h unter Standardkulturbedingungen.
    3. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium, das 15 µg/mL f-SPIONs enthält.
    4. Inkubieren Sie die Zellen weitere 12 h.
    5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 1 mM Deferoxamin enthält.
    6. Sammeln und zählen Sie die Zellen.
    7. Messen Sie den intrazellulären Eisengehalt mittels Atomemissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES).
    8. Berechnen Sie die Anzahl der internalisierten Partikel pro Zelle, indem Sie die durchschnittliche Eisenmasse pro Zelle durch die Eisenmasse pro Partikel dividieren Formel für statisches Gleichgewicht, ΣFx=0, Diagramm, pädagogisches physikalisches Verfahren, Kraftanalysekonzept..
  4. Schätzen Sie die auf eine einzelne Schwann-Zelle übertragene Kraft ab.
    1. Berechnen Sie die Kraft auf Zellebene gemäß
      Gleichung zur Veranschaulichung der magnetischen Kraft in der Wechselwirkung von Zellen mit SPIONs-Anordnung.
      wobei:
      Statische Reibung von SPIONs; Formel \(F_{f-SPION}\); Konzept in der Analyse magnetischer Nanopartikelkräfte. die auf einen einzelnen f-SPION ausgeübte magnetische Kraft ist,
      Quantifizierungsformel für Nanopartikel; n^f-SPIONs_cell; verwendet in biomedizinischen Zellverfolgungsstudien. die Anzahl der pro Zelle internalisierten f-SPIONs ist,
      Fcell die auf eine einzelne Zelle ausgeübte magnetische Kraft ist.
    2. Geben Sie den resultierenden Wert als geschätzte magnetische Kraft an, die auf eine einzelne Schwann-Zelle übertragen wird (Fcell).
    3. Stellen Sie klar, dass der Wert eine modellbasierte Schätzung und keine direkte intrazellulare Kraftmessung darstellt.

5. Kombination der magnetischen Stimulation mit der Echtzeit-Konfokalmikroskopie (CLSM)

  1. Beladen Sie die Schwann-Zellen mit magnetischen Nanopartikeln.
    1. Säen Sie Schwann-Zellen in bildgebungskompatiblen ibidi-Kulturschalen oder mikrofluidischen Kulturkammern aus.
    2. Lassen Sie die Zellen anhaften und sich erholen.
    3. Ersetzen Sie das vorhandene Medium durch frisches Kulturmedium, das 15 µg/mL f-SPIONs enthält.
    4. Incubieren Sie die Zellen 12 h lang, um das Beladen mit f-SPIONs zu ermöglichen.
    5. Überprüfen Sie die Zellmorphologie, bevor Sie fortfahren.
  2. Entfernen Sie nicht internalisierte Partikel.
    1. Entfernen Sie das nanopartikelhaltige Medium.
    2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, der 1 mM Deferoxamin enthält.
    3. Ersetzen Sie die Waschlösung durch bildgebungskompatibles Medium für Lebendzellkultur.
    4. Stellen Sie vor der Bildgebung sicher, dass der extrazelluläre Partikelhintergrund gering ist.
  3. Integrieren Sie die Elektromagnetvorrichtung in das CLSM-Bildgebungssystem.
    1. Bauen Sie den Elektromagneten mit der Lebendzellkulturkammer zusammen und positionieren Sie den Elektromagneten an seiner vorkalibrierten Stelle.
    2. Platzieren Sie die montierte Lebendzellkulturkammer auf dem Objekttisch des konfokalen Mikroskops (Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass sich die Kulturschale innerhalb des wirksamen Stimulationsbereichs befindet (Abbildung 3A).
    3. Aktivieren Sie den Elektromagneten gemäß den voreingestellten Parametern und bestätigen Sie die Exposition gegenüber einem wirksamen magnetischen Gradientenfeld im Bereich der Kulturschale (Abbildung 3B).
    4. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv die Fokusebene ohne Behinderung erreichen kann.
    5. Stellen Sie sicher, dass die Vorrichtung die Positionierung des Objektivs oder die Bewegung des Objekttischs nicht behindert.
    6. Da während des Betriebs des Elektromagneten Wärme entsteht, passen Sie die Temperatur der Komponenten der Lebendzellkammer gemäß den vorab bestimmten optimalen Kulturbedingungen an, um eine Innenumgebung von 37 °C und 5 % CO₂ sicherzustellen (Abbildung 3C).
    7. Stellen Sie sicher, dass das gesamte System normal und stabil funktioniert.
  4. Funktionelle Ca2⁺-Bildgebung in lebenden Zellen.
    1. Incubieren Sie die Zellen 30 min lang bei 37 °C mit Krebs-Ringer-Lösung (pH 7,4), die 3 µM Fluo-4 AM und 0,1 % Pluronic F-127 enthält.
    2. Waschen Sie die Kulturen nach der Inkubation zweimal mit PBS und überführen Sie sie auf die Lebendzell-Bildgebungsplattform des CLSM-Systems zur Bildgebung (Abbildung 4A).
    3. Bildgebungspositionen: Nutzen Sie das Positioniergitter auf dem Boden der ibidi-Kulturschale, um fünf vordefinierte Positionen abzubilden.
    4. Teilen Sie jedes Bildfeld gleichmäßig in 25 Bereiche ein und wählen Sie je nach tatsächlicher Zelldichte in diesem Bereich 0–3 Zellen pro Bereich für die Fluoreszenzquantifizierung aus.
    5. Definieren Sie die vollständige Kontur einer einzelnen Zelle als interessierende Region (ROI) und überwachen Sie die magnetisch induzierte Kalziumantwort, indem Sie die Änderungen der Fluoreszenzintensität (ΔF) innerhalb der ROI analysieren.
    6. Berechnen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität als ΔF = (Fstim - F0). Eine Änderung der Fluoreszenzintensität vor und nach der Stimulation (ΔF/F0), die 10 % übersteigt, gilt als Kalzium-Response-Ereignis.
      ​HINWEIS: Funstim steht für die Fluoreszenzintensität vor der magnetischen Kraftstimulation, F0 für die Baseline-Fluoreszenzintensität und Fstim für die hervorgerufene Fluoreszenzintensität nach der magnetischen Kraftstimulation.
    7. Subtrahieren Sie zur Hintergrundkorrektur die mittlere Hintergrundfluoreszenzintensität, gemessen in einem zellfreien Bereich, von dem Fluoreszenzintensitätswert jedes ROI.
    8. Führen Sie drei unabhängige Experimente durch, wobei jeweils eine Kulturschale pro Experiment eingeschlossen wird.
  5. Führen Sie eine Zeitrafferaufnahme durch und wenden Sie während der Bildgebung eine magnetische Stimulation an.
    1. Stellen Sie die Parameter für die Zeitrafferaufnahme wie folgt ein: einen Akquisitionsintervall von 2,1 s pro Bild, eine Gesamtdauer der Aufnahme von 650 s und eine standardmäßige hochauflösende optische Schnittbildgebung mit 1 AU.
    2. Während der zellulären Bildgebung nehmen Sie kontinuierlich 50 s lang Bilder auf, ohne Stromzufuhr, um die intrazelluläre Kalzium-Fluoreszenzintensität in Abwesenheit einer magnetischen Kraftstimulation (Funstim) zu erfassen (Abbildung 2H und Abbildung 4B).
    3. Normalisieren Sie die während der ersten 50 s aufgezeichnete Fluoreszenzintensität und definieren Sie diese als Baseline-Fluoreszenzintensität (F0).
    4. Anschließend wird eine konstante Stromzufuhr von 3,0 A an den Elektromagneten angelegt, wodurch die mit magnetischen Nanopartikeln beladenen Schwann-Zellen einem magnetischen Gradientenfeld von 3,25 T/m ausgesetzt werden und somit einer magnetischen Kraftstimulation unterzogen werden. Setzen Sie die Zeitrafferaufnahme 10 min lang fort, um die intrazelluläre Kalzium-Fluoreszenzintensität während der magnetischen Kraftstimulation (Fstim) aufzuzeichnen (Abbildung 2H und Abbildung 4C).
    5. Berechnen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität quantitativ als ΔF/F0 (Abbildung 4D,E).
  6. Führen Sie eine statistische Analyse durch und analysieren Sie die Ca2⁺-Fluoreszenzdaten.
    1. Berechnen Sie für jede Zelle den medianen ΔF/F₀-Wert über die analysierte Zeitreihe und verwenden Sie diesen Wert als zelluläres Ca2⁺-Response-Maß.
    2. Führen Sie für jede experimentelle Bedingung drei unabhängige Experimente durch, wobei jeweils eine Kulturschale pro Bedingung in jedem Experiment verwendet wird. Kombinieren Sie die Zellen aus den drei unabhängigen Experimenten für die deskriptive Darstellung und geben Sie n als Gesamtanzahl der analysierten Zellen pro Gruppe an.
    3. Prüfen Sie die Normalverteilung der zellulären ΔF/F₀-Daten mithilfe des Kolmogorov-Smirnov-Tests.
    4. Da die Ca2⁺-Fluoreszenz-Response-Daten nicht normalverteilt sind, stellen Sie die Daten als Median und Interquartilsabstand (IQR) dar.
    5. Analysieren Sie Unterschiede zwischen den Gruppen mit dem nichtparametrischen Friedman-Test, gefolgt von Wilcoxon-Test für paarweise Vergleiche, wie zuvor beschrieben.
    6. Ein Wert von P < 0,05 gilt als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Die hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) zeigte, dass die finale Nanopartikel-Formulierung nach der Oberflächenmodifikation einen agglomerierten magnetischen Kern und eine äußere Hülle aufwies (Abbildung 1). Die endgültigen f-SPIONs wiesen einen durchschnittlichen Gesamtdurchmesser von 63,36 ± 16,65 nm auf, mit einem eisenreichen magnetischen Kern aus Fe₃O₄ von etwa 56,60 ± 6,19 nm und einer äußeren Hülle aus Polydopamin und Phalloidin-Alexa Fluor 350 mit einer durchschn...

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Diskussion

Eisenoxid-Nanopartikel gelten weithin als magnetische Nanomaterialien mit günstiger Biokompatibilität. Als weit verbreitete Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie wurden superparamagnetische Fe₃O₄-Nanopartikel in der klinischen bildgebenden Diagnostik umfassend eingesetzt29,30. In einer kürzlich durchgeführten Studie unserer Arbeitsgruppe20 zeigte sich, dass f-SPIONs äußerst geringe Zytotoxizität und hervorragende Biosicherheit a...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Förderzahlen 82571677 und 82001304 an Y.W.), dem Sonderprogramm für medizinische und gesundheitliche Fachkräfte in der Provinz Jilin (Förderzahl JLSRCZX2025-134 an Y.W.) und dem Bethune-Programmprojekt der Jilin-Universität (Förderzahl 2024B19 an Y.W.). Die Autoren danken dem College of Chemistry der Jilin-Universität (Staatliches Schlüssellaboratorium für supramolekulare Struktur und Materialien) sowie dem Changchun Institute of Applied Chemistry der Chinesischen Akademie der Wissenschaften für die Unterstützung bei der Gestaltung, Synthese und Charakterisierung von Nanomaterialien. Die Autoren danken außerdem dem Institut für Translationale Medizin am Ersten Krankenhaus der Jilin-Universität für die Unterstützung bei CLSM-Aufnahmen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,2-HexadecandiolSigma-Aldrich213748Technische Qualität, 90 %; verwendet in der thermischen Zersetzungssynthese
35-mm-ibidi-µ-Dishesibidi80156Verwendet für die Kultur und Bildgebung von Schwann-Zellen
BenzyletherSigma-Aldrich10801498 %; Lösungsmittel für die Synthese von Fe3O4-Nanopartikeln
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopNikonAXR (Ti2-E)Verwendet für Live-Cell- und Fluoreszenzbildgebung 
Individueller ElektromagnetIndividuell gebautN/VKompakter unipolarer Elektromagnet zur Erzeugung eines Gradienten-Magnetfelds in vitro 
Cyanin3.5-CarbonsäureDuofluor Inc.D10128Fluoreszierender Farbstoff zur Assembly von Fe3O4·Cy3.5-Superpartikeln; MW 593,20; bei -20 °C lagern, vor Licht geschützt 
Deferoxamin-Mesylat-SalzSigma-AldrichD9533Eisenchelatisierendes Mittel zur Entfernung von nicht internalisiertem und membranassoziiertem Eisen
Digitaler Gauß-MeterWEITE MAGNETICWT103Wird zur Messung der magnetischen Flussdichte und zur Kalibrierung des Gradienten-Magnetfelds verwendet, das durch den individuellen Elektromagneten erzeugt wird
Dopamin-HydrochloridSigma-AldrichH8502≥98 % (Dünnschichtchromatographie); verwendet für die Polydopamin-Beschichtung
Dynamisches LichtstreuungsinstrumentMalvern InstrumentsZetasizer Nano-ZSWird zur Messung des hydrodynamischen Durchmessers und des PDI verwendet 
Fluo-4 AM Invitrogen, Thermo Fisher ScientificF14201Calciumindikator für die Live-Cell-Ca2+-Bildgebung
Fluoreszenz-SpektrophotometerShimadzuRF-6000Wird zur photolumineszenzanalytischen Charakterisierung verwendet 
Transmissionselektronenmikroskop mit hoher AuflösungJEOLJEM-F200Wird für die HRTEM-Bildgebung der Nanopartikelmorphologie und der Kern–Schale-Struktur verwendet 
Induktiv gekoppeltes Plasma-AtomemissionsspektrometerPerkinElmerOptima 3300 DVWird zur Quantifizierung intrazellulären Eisens verwendet
Eisen(III)-acetylacetonat, Fe(acac)3Sigma-AldrichF30097 %; Vorstufe für die Synthese von Fe3O4-Nanopartikeln
Live-Cell-Inkubator für MikroskoptischTOKAI HITTENP&CO2Wird für die konfokale Live-Cell-Bildgebung während der magnetischen Stimulation verwendet 
ÖlsäureSigma-AldrichO1008≥99 % (GC); Oberflächenligand für die Synthese von Fe3O4-Nanopartikeln
OleylaminSigma-AldrichO7805Technische Qualität, 70 %; Ligand für die Nanopartikelsynthese
Phalloidin–Alexa Fluor 350Invitrogen, Thermo Fisher ScientificA22281Optionales Reagenz zur Aktin-gezielten Funktionalisierung 
Pluronic F-127 Invitrogen, Thermo Fisher ScientificP3000MPWird zur Unterstützung der Fluo-4-AM-Ladung für die Live-Cell-Ca2+-Bildgebung verwendet
Programmierbare DC-Stromversorgung mit RegelungTongmeneTM-L605SPL (60 V, 5 A)Wird verwendet, um den individuellen Elektromagneten zur Erzeugung eines Gradienten-Magnetfelds in vitro zu speisen
RSC96-Schwann-ZellenCell Bank of the Chinese Academy of SciencesN/VVon Ratten abstammende Schwann-Zelllinie 
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma-Aldrich436143ACS-Reagenz, ≥99,0 %; Tensid für Öl-in-Wasser-Mikroemulsionen
SQUID-MagnetometerQuantum Design Inc.MPMS-XLWird zur Messung der magnetischen Hysterese bei 300 K verwendet 
ToluolSigma-Aldrich244511Wasserfrei, 99,8 %; Lösungsmittel für die Assembly von Superpartikeln
TransmissionselektronenmikroskopFEIEP 5018/40, Tecnai Spirit BiotwinWird zur Beobachtung der Ultrastruktur von Zellen und Nervengewebe verwendet 

Referenzen

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