Methodenartikel

3D-Mikro-CT-Bildgebung von Medicago sativa-Wurzelknöllchen

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DOI:

10.3791/71686

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28. August 2026

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1Stowers Institute for Medical Research

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hülsenfrüchte gehen Partnerschaften mit Bodenmikroben ein Bakterien, die Wurzelknöllchen bilden, in denen die Bakterien atmosphärischen Stickstoff für die Pflanze fixieren. Die Mikro-CT ermöglicht eine zerstörungsfreie 3D-Bildgebung der Gewebeorganisation, der Bakteroidzonen und der Gefäßbündel dieses opaken, harten Gewebes der Wurzelknöllchen und bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen Bildgebungsverfahren, die das Schneiden der Knöllchen erfordern.

Zusammenfassung

Die symbiotische Beziehung zwischen der Leguminose Medicago sativa und dem Bodenbakterium Sinorhizobium meliloti führt zur Bildung von stickstofffixierenden Wurzelknöllchen. Traditionelle zerstörende Methoden wie Paraffinschnitte, Vibratomschnitte und Kryoschnitte wurden angewendet, um darzustellen, wie Bakterien das Knöllchen besiedeln, was es äußerst schwierig macht, zuverlässige dreidimensionale Informationen zu erhalten. Diese Ansätze werden häufig mit fluoreszenzmarkierten Färbungen kombiniert, die zusätzlichen Stress verursachen und das Pflanzenwachstum sowie die Knöllchenbildung beeinträchtigen können. Die Mikro-Computertomographie (MicroCT) hat sich als relativ schnelles, einfaches und robustes Werkzeug in der Pflanzenbiologie etabliert, das pflanzliche histologische Strukturen dreidimensional (3D) zerstörungsfrei visualisieren kann, wodurch zerstörende Artefakte während der Probenvorbereitung vermieden und eine hochgenaue 3D-Rekonstruktion gewährleistet wird. Obwohl die MicroCT bereits auf Wurzelknöllchen von Leguminosen angewendet wurde, fehlt bisher ein detailliertes, etabliertes Protokoll, das den gesamten Prozess von der Pflanzenernte und Probenvorbereitung bis hin zur Durchführung des Scans und der Software-gestützten Visualisierung dokumentiert.

In dieser Studie zeigen wir eine schrittweise Mikro-CT-Arbeitsabfolge unter Verwendung von Medicago sativa als Modell. Das Protokoll umfasst die Entfernung von Knöllchen aus den Wurzeln, Fixierung, Kontrastverbesserung, Montage, Scannen und dreidimensionale Rekonstruktion. Kritische Parameter, die Einfluss auf Aspekte wie Bildqualität, Gewebeerhaltung und Kontrast haben, werden hervorgehoben. Mit diesem Ansatz ist es möglich, die gesamte Gewebeorganisation, bakteroidenbesiedelte Zellen und Gefäßbündel dreidimensional darzustellen, ohne die Knöllchen physisch zu schneiden. Die hier beschriebene Arbeitsabfolge stellt eine reproduzierbare Methode für zerstörungsfreie, hochauflösende Abbildung nativer Wurzelknöllchen dar und kann wahrscheinlich auf andere Leguminosenarten übertragen werden, wodurch Forschenden ein praktisches Werkzeug zur Untersuchung der Knöllchenstruktur und der bakteriellen Organisation innerhalb der Knöllchen in 3D zur Verfügung steht.

Einleitung

Pflanzen der Familie Leguminosae (oder Fabaceae) wie Medicago sativa (Luzerne) gehen eine symbiotische Beziehung mit stickstofffixierenden Bodenbakterien der Familie Rhizobiaceae, beispielsweise Sinorhizobium meliloti, ein, wodurch Wurzelknöllchen entstehen. Die Pflanze setzt Flavonoide frei, um die Bakterien unter stickstofflimitierenden Bedingungen anzulocken. Dies aktiviert die Expression von Nod-Faktoren in den symbiotischen Bakterien und führt zur Krümmung der Wurzelhaare sowie anschließend zur Bildung einer Infektionskammer, die die Bakterien umgibt1,2,3,4. Aus einem geschwächten Bereich der Kammerwand bildet sich ein Infektionsstrang, der ein sich verlängerndes Röhrchen darstellt und die Bakterien durch die Wurzelhaartzelle transportiert5. Wenn der Infektionsstrang die innere Rinde erreicht, initiiert eine Abfolge von Zellteilungen die Entwicklung eines spezialisierten Wurzelorgans, des Wurzelknöllchens1,2,5. Anschließend infizieren die Bakterien die Knöllchenzellen und leben intrazellulär, von der Symbiosomenmembran innerhalb der Zelle umgeben. Hier versorgt die Pflanze die Bakterien mit Kohlenstoff und anderen Nährstoffen. Im Gegenzug fixieren die Bakterien Stickstoff für die Pflanze, indem sie den nicht verwertbaren atmosphärischen Stickstoff in Ammoniak umwandeln, eine für die Pflanze nutzbare Form2,3,4. Somit fungiert das Wurzelknöllchen als eine lebenswichtige biologische Fabrik zur Stickstofffixierung und ermöglicht das Pflanzenwachstum auch ohne synthetische Stickstoffdünger. Dieser Prozess der biologischen Stickstofffixierung ist ökonomisch und ökologisch bedeutsam, da er es Leguminosen erlaubt, ohne synthetische Düngemittel zu wachsen6. Zudem bilden einige Leguminosen unbestimmte Knöllchen, die deutlich abgegrenzte Zonen ausbilden, in denen sich die Bakterien differenzieren und effizienter Stickstoff fixieren4. Daher ist es wichtig, sowohl das Äußere als auch das Innere des Knöllchens (wo die Bakterien physisch Pflanzenzellen innerhalb des Knöllchens besiedeln) sichtbar zu machen, um die biologische Stickstofffixierung detailliert untersuchen zu können. Allerdings handelt es sich um ein undurchsichtiges Organ, das mit dem rotgefärbten pflanzlichen Protein Leghämoglobin gefüllt ist, was herkömmliche Bildgebungsverfahren erschwert.

Bisher verwendete Bildgebungsverfahren waren destruktiv. Zur Herstellung von Gewebeschnitten kamen Paraffinschnitte, Vibratomschnitte und Kryoschnitte zum Einsatz, die jedoch den nativen Zustand des Gewebes stören und Artefakte erzeugen, die die dreidimensionale (3D) Rekonstruktion erschweren6,7,8,9,10. Eine Rekonstruktion anhand von Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten von Knöllchen ist bereits erfolgreich durchgeführt worden, erfordert jedoch die Verwendung dehydrierter Proben und mehr als 200 einzelne Schnitte8. In einzelnen Schnitten sind zwar Teile des Gefäßsystems sichtbar, nicht jedoch, wie sich die Bündel teilen und das Knöllchen umschließen. Verschiedene fluoreszierende Markierungs- und Färbemethoden wurden an Gewebeschnitten vor der konfokalen Mikroskopie angewandt, weisen jedoch typischerweise folgende Probleme auf8,9,10: (i) Pflanzliche Knöllchengewebe weisen eine starke Autofluoreszenz auf, (ii) viele Methoden erfordern eine Gewebeaufhellung vor der Bildgebung, (iii) fluoreszierende Färbungen können das Knöllchengewebe beschädigen, (iv) die Inokulation von Pflanzen mit grün fluoreszierendem Protein (GFP)-markierten Bakterien verursacht Stress, der sowohl das Pflanzenwachstum als auch die Knöllchenbildung beeinträchtigt, und (v) native Knöllchen sind zu groß, um die gesamte Probe problemlos zu schneiden5,11.

In der Medizin häufig eingesetzt, dient die Computertomographie (CT) sowohl diagnostischen als auch therapeutischen Zwecken12,13. Eine kleinere Variante davon, die Röntgen-Mikrotomographie (MicroCT), ist eine bildgebende Technik, die eine zerstörungsfreie dreidimensionale (3D) Visualisierung kleiner Objekte ermöglicht. Während beim CT die Maschine um das größere Objekt rotiert, wird beim MicroCT das kleinere Objekt nahe der Röntgenquelle gedreht. Dies ermöglicht eine deutlich höhere Auflösung. MicroCT wurde bereits in der Entwicklungsbiologie von Tieren angewandt, hat sich aber auch als vielversprechendes Werkzeug in der Pflanzenbiologie etabliert6,10,14,15,16,17,18,19. Insbesondere wurden MicroCT und synchrotronbasierte Röntgentomographie umfassend in der Pflanzenphysiologie eingesetzt, um Xylemembolien zu untersuchen und bildbasierte Schätzungen mit herkömmlichen hydraulischen Durchflussmessungen zu vergleichen und gegenseitig zu validieren20,21,22. Da sie intakte Organe in Maßstäben abbildet, ohne physische Schnitte vorzunehmen, erhält die MicroCT räumliche Beziehungen innerhalb des gesamten Knöllchens bei. Mit geeigneten Kontrastmitteln kann sie gewebeebene Strukturen wie Gefäßbündel und Infektionszonen auflösen und tiefer eindringen, als es bei herkömmlichen optischen Verfahren durch Lichtstreuung möglich ist – was besonders wertvoll für undurchsichtige und autofluoreszierende Knöllchen ist. Proben können außerdem erneut gescannt, in nachgeschaltete korrelative Arbeitsabläufe nach der Bearbeitung für Licht- oder Elektronenmikroskopie integriert oder für zukünftige Analysen archiviert werden. Obwohl einige Studien MicroCT und synchrotronbasierte Röntgen-CT zur Untersuchung von Sojabohnenwurzelknöllchen verwendet haben, gibt es bisher keine detaillierte Dokumentation, die den gesamten Prozess von der Gewinnung und Färbung der Knöllchen bis zur Bildgebung und Rekonstruktion abdeckt, insbesondere nicht für kleinere Knöllchen wie jene von Luzerne6,14. Der Röntgenkontrast hängt von der Gewebedichte ab, und das meiste Pflanzengewebe weist eine geringe Dichte auf und attenuiert Röntgenstrahlung schlecht. Ohne ein Kontrastmittel können Knöllchen auf einem herkömmlichen Labormikro-CT nicht vom Hintergrund unterschieden werden. Wir verwendeten Phosphormolybdänsäure (PTA), einen unspezifischen Farbstoff, der Proteine und andere Biomoleküle bindet und sich bereits als hochkontrastverstärkend in Pflanzengewebe erwiesen hat14.

Diese Studie stellt einen ausführlichen, Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Mikro-CT-Bildgebung von Hülsenfrüchternodulen unter Verwendung von Luzerne als Modellorganismus bereit, das auf einem herkömmlichen, laborbasierten System durchgeführt wird und eine leichter zugängliche Alternative zu Röntgenmikroskopie (XRM) und Synchrotron-basierten Plattformen darstellt6,14. Der Workflow umfasst spezifische Anweisungen für die Gewinnung der Noduli von der Wurzel, Fixierung, Färbung, Kontrastverbesserung, Montage, Scannen, 3D-Rekonstruktion und Analyse (Abbildung 1). Zwischen diesen Schritten werden detaillierte Parameter bereitgestellt, um eine stabile Montage, Feuchthaltefähigkeit und einen guten Kontrast sicherzustellen. Letztendlich handelt es sich bei dieser Mikro-CT-Methode um ein reproduzierbares Verfahren, das eine zerstörungsfreie, hochauflösende Visualisierung dreidimensionaler histologischer Merkmale ermöglicht, einschließlich der gesamten Gewebeorganisation, der Besiedlung pflanzlicher Zellen durch Bakterien, der unterschiedlichen Stickstofffixierungs-Zonen sowie der Gefäßbündel ganzer Luzerne-Wurzelnoduli im nativen Zustand. Wir sind der Ansicht, dass dieses Protokoll auf andere Hülsenfrüchte anwendbar sein wird und Forschern eine praktische, intakte Methode zur Visualisierung der dreidimensionalen Struktur und Organisation dieses äußerst wichtigen Wurzelorgans bietet.

Protokoll

1. Ernte und Fixierung von Knöllchen

  1. Verwenden Sie ein Skalpell (siehe Tabelle der Materialien), um eine gerade Schnittfläche durch die Wurzel auf beiden Seiten des interessierenden Knöllchens zu erzeugen, wobei das Knöllchen an der Wurzel befestigt bleibt (Abbildung 2).
  2. Überführen Sie acht bis zwölf Knöllchen in ein 20-mL-Glasfläschchen mit 10 mL 70%igem (v/v) Ethanol (siehe Tabelle der Materialien).

2. Färbung von Knöllchen

  1. Stellen Sie 1 % (w/v) PTA in 70 % Ethanol her, indem Sie 2 g PTA-Pulver in 200 mL 70 % Ethanol in einer 200-mL-Weithalsflasche (siehe Tabelle der Materialien) geben. Schütteln Sie, bis sich die Substanz vollständig gelöst hat, und lagern Sie dann bei 4 °C. Bereiten Sie die Färbung einen Tag vor der Verwendung zu.
  2. Entfernen Sie das 70 %ige Ethanol, das während der Fixierung verwendet wurde, und ersetzen Sie es durch 10 mL 1 %ige PTA-Lösung (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Stellen Sie das Glasröhrchen auf einen rotierenden Schüttler bei Raumtemperatur mit 80 U/min für 4 Wochen. Ersetzen Sie wöchentlich die Färbelösung durch 10 mL frische 1 %ige PTA-Lösung (siehe Tabelle der Materialien, Abbildung 2).

3. Montage der Knöllchen

  1. Paraffin mit einem Heizplatte bei 100 °C in einem 100 mL offenen Glasbecher schmelzen (Siehe Tabelle der Materialien).
  2. 200 µL Pipettenspitzen für die Probeneinbettung auswählen. Die Spitzen an der engen Seite versiegeln, indem sie flach (1–2 mm) in geschmolzenes Paraffin getaucht werden (Siehe Tabelle der Materialien).
  3. Die Probe in einer 35 mm Mikroplatte 5 min lang mit 2 mL 70 %igem Ethanol spülen (Siehe Tabelle der Materialien).
  4. 0,2 g Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in einen 25 mL Erlenmeyerkolben geben und mit 20 mL entmineralisiertem Wasser mischen, um eine 1 %ige (w/v) Agaroselösung mit niedrigem Schmelzpunkt herzustellen. Auf einer Heizplatte bei 50 °C erhitzen und mehrmals schütteln, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Anschließend den Kolben in ein Wasserbad bei 40 °C stellen (Siehe Tabelle der Materialien).
  5. Etwa 25 µL der 1 %igen Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in die nach oben gerichteten, verschlossenen Pipettenspitzen geben und 1 min abkühlen lassen (Siehe Tabelle der Materialien).
  6. Eine Knöllchenprobe mit feiner Pinzette aufnehmen und in die Pipettenspitze überführen, um sie in der 1 %igen Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt zu fixieren. Mit einer Gel-Ladepipettenspitze das Knöllchen so nah wie möglich an die mit Paraffin versiegelte Seite der Pipettenspitze heranführen, ohne das Wurzelknöllchen zu beschädigen (Siehe Tabelle der Materialien).
  7. Die Pipettenspitzen mit den Wurzelknöllchen in einen Halter stellen, damit die Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt erstarrt. Nach dem Erstarren die offene Seite der Pipettenspitzen mit Parafilm verschließen, um Feuchtigkeit zu bewahren (Siehe Tabelle der Materialien). Die Probe im Kühlschrank bei 4 °C lagern und die eingebetteten Proben innerhalb einer Woche scannen.

4. Mikro-CT-Bildgebung

  1. Befestigen Sie die Pipettenspitzen verkehrt herum an einem passenden Probenträger, um eine möglichst nahe Positionierung zur Röntgenquelle zu ermöglichen und eine genaue Zentrierung der Probe sicherzustellen (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Öffnen Sie die CT-Software. Schrauben Sie die Probe fest auf dem Träger am Rotationsstadium des Mikro-CT ein (siehe Tabelle der Materialien, Abbildung 3, Zusatzabbildung 1).
  3. Schalten Sie die Kameraansicht und die Röntgenquelle ein, anschließend aktivieren Sie den kontinuierlichen Röntgenbildschirm (Zusatzabbildung 1).
  4. Stellen Sie die Probenhöhe vertikal so ein, dass der interessierende Bereich in der Mitte des kontinuierlichen Röntgenbildschirms liegt. Notieren Sie sich diese Höhe für den späteren Schritt 4.10 (Zusatzabbildung 1).
  5. Stellen Sie bei einer Binning-Einstellung von 512 × 512 die Pixelgröße ein (siehe Zusatz-Tabelle 1), sodass die Probe den größten Teil des Sichtfeldes der kontinuierlichen Röntgenansicht ausfüllt, mit etwas freiem Raum an jeder Seite (Zusatzabbildung 1).
  6. Zentrieren Sie die Probe auf dem kontinuierlichen Röntgenbildschirm, indem Sie alle 45° drehen und jeweils zur Mitte ausrichten (Zusatzabbildung 1).
  7. Ändern Sie das Binning auf 2048 × 2048 (siehe Zusatz-Tabelle 1, Zusatzabbildung 1).
  8. Wählen Sie im Menü Scan-Modi keinen Filter aus und stellen Sie die Spannung auf 50 kV sowie den Strom auf 40 µA ein (siehe Zusatz-Tabelle 1, Zusatzabbildung 1).
  9. Führen Sie eine Flachfeldkorrektur durch, indem Sie die Probe auf 68 mm absenken, sodass sie nicht mehr im Sichtfeld des kontinuierlichen Röntgenbildschirms liegt. Schalten Sie die Flachfeldkorrektur aus und stellen Sie die Belichtungszeit so ein, dass die durchschnittliche Röntgentransmission 55 % beträgt. Schalten Sie anschließend die Flachfeldkorrektur wieder ein (siehe Zusatz-Tabelle 1, Zusatzabbildung 1).
  10. Bewegen Sie die Probe zurück auf die in Schritt 4.4 ermittelte Höhe (Zusatzabbildung 1).
  11. Legen Sie im Menü Scan-Optionen den Dateinamen und den Speicherort fest (Zusatzabbildung 1).
  12. Stellen Sie den Rotations-Schritt auf 0,200° ein. Setzen Sie den Mittelwert pro Bild auf 3 und die zufällige Bewegung auf 30. Wählen Sie den 360°-Scan-Modus (siehe Zusatz-Tabelle 1, Zusatzabbildung 1).
  13. Passen Sie gegebenenfalls die Teilbreite an, um übermäßigen Leerraum auszuschließen und die Datengröße zu reduzieren (Zusatzabbildung 1).
  14. Klicken Sie auf Scannen, um den Scanvorgang zu starten (Zusatzabbildung 1).

5. Bildrekonstruktion

  1. Öffnen Sie die Bildrekonstruktionssoftware und laden Sie alle 2D-Projektionen aus der Aufnahme (siehe Materialtabelle, Abb. 4).
  2. Klicken Sie auf Vorschau, um die Rekonstruktionsergebnisse an der Position der grünen Linie zu visualisieren (ergänzende Abbildung 2).
  3. Passen Sie das Histogramm im Reiter Ausgabe an. Schneiden Sie den flachen Bereich rechts ab und halten Sie den Wert links bei 0 oder leicht unter 0 (ergänzende Abbildung 2).
  4. Im Reiter Start klicken Sie auf Feinabstimmung, um eine Nachausrichtung durchzuführen. Beginnen Sie mit dem Parameter-Schritt bei eins und der Anzahl der Versuche bei fünf. Klicken Sie auf Start und OK. Wenn die Ergebnisse im Reiter Ausgabe erscheinen, klicken Sie auf das Vorschaufenster und blättern Sie durch die Ergebnisse, um die beste Ausrichtung auszuwählen. Belassen Sie die Ansicht bei dem besten Bild (ergänzende Abbildung 2).
  5. Aktivieren Sie die ROI im Reiter Ausgabe, indem Sie das Kästchen neben „ROI verwenden“ ankreuzen. Wählen Sie Kreis als ROI-Form. Passen Sie die ROI-Größe an die Probengröße über das gesamte Datenvolumen an, indem Sie zum Reiter Start zurückkehren und die grüne Linie verschieben, um verschiedene Positionen vorab anzuzeigen. Lassen Sie etwas Leerraum um die Probe herum (ergänzende Abbildung 2).
  6. Wechseln Sie zurück zum Reiter Start. Verschieben Sie die roten Linien oben und unten, um die Bereiche abzuschneiden, die nicht für die Rekonstruktionsdaten benötigt werden. Überprüfen Sie, ob wichtige Daten ausgeschlossen wurden, indem Sie die grüne Linie in die Nähe der roten Linien verschieben und die Rekonstruktionen im Reiter Ausgabe vorab anzeigen (ergänzende Abbildung 2).
  7. Speichern Sie im Reiter Ausgabe die Rekonstruktion als TIFF-Bilder (16 Bit) am gewünschten Speicherort (ergänzende Abbildung 2).
  8. Gehen Sie zurück zum Reiter Start und klicken Sie auf Start (ergänzende Abbildung 2).

6. 3D-Visualisierung

  1. Öffnen Sie die Dragonfly-Software (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Weitere Informationen zu Dragonfly und seinen Funktionen finden Sie unter https://dragonfly.comet.tech/
  2. Importieren Sie die rekonstruierten TIFF-Bilder.
  3. Wählen Sie alle Bilder aus und vergewissern Sie sich, dass der Bildabstand mit der Skalierten Pixelgröße des Bildes in der Scan-Textdatei übereinstimmt (Ergänzende Abbildung 3).
  4. Passen Sie die Fensterebene an, um eine 3D-Ansicht mit gutem Kontrast zu erhalten (Ergänzende Abbildung 3).
  5. Blättern Sie durch die verschiedenen 2D-Schnittebenen (XY, transversal; XZ, koronal; YZ, sagittal) (Ergänzende Abbildung 3).
  6. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und exportieren Sie bei Bedarf einen Screenshot der Ansicht, um Schnittansichten zu speichern (Abbildung 4).

Ergebnisse

Wir entnahmen jeweils zwei Wurzelknöllchen von drei M. sativa-Pflanzen. Zwei Knöllchen wurden für Vergleiche der Färbedauer verwendet, vier weitere wurden nach der vollständigen 28-tägigen Färbung mit 1 % PTA in 70 % Ethanol zur Kontrastverbesserung abgebildet. Durch die Verwendung von 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt als Einbettmedium in Pipettenspitzen schufen wir eine Umgebung mit geringer Röntgendichte um die Probe herum. Die Färbelösung erhöhte erfolgreich den Kontrast des Pflanzengewebes (Abbildung 5A,B, ergänzende Abbildung 4). Das Signal der Probe ließ sich mithilfe des Datenhistogramms leicht vom Hintergrund und der Pipettenspitze trennen, wodurch eine ungehinderte 3D-Visualisierung der äußeren und inneren Struktur des gesamten Wurzelknöllchens möglich war (Abbildung 5A,B).

Die äußere Epidermis ist sichtbar, weist jedoch einen geringeren Kontrast auf als die anderen Gewebe (Abbildung 5C–E). Dagegen sind die Gefäßbündel deutlich und gut verbunden vom unteren bis zum oberen Ende der Probe (Abbildung 5A,B). In Querschnitten können wir die Anzahl und Aufspaltung dieser Bündel klar erkennen (Abbildung 5C). Außerdem zeigt das innere Gewebe einen guten Kontrast, der die Identifizierung der Rinde und der pflanzlichen Vakuolen ermöglicht (Abbildung 5C–E). Der hohe Kontrast erleichtert zudem die Unterscheidung zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen (Abbildung 5C–E). Koronale und sagittale Schnitte zeigen die Verteilung der meristematischen, infektiösen und Differenzierungszone (Abbildung 5D). Supplementäres Video 1 zeigt eine 360°-Ansicht eines dreidimensional rekonstruierten Knöllchens.

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Abbildung 1: Ablauf des Protokolls. Übersicht über den Ablauf zur Verwendung von Mikro-CT zur Abbildung von Leguminosenwurzelknöllchen und die für jeden Schritt erforderliche Zeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: M. sativa-Wurzelknöllchen für dieses Protokoll. (A) M. sativa-Pflanze 28 Tage nach Inokulation mit S. meliloti-Bakterien (28 dpi). Die schwarzen gepunkteten Linien zeigen die empfohlenen Schnittlinien zum Entfernen der abgebildeten Knöllchen an. Pro Pflanze wurden zwei Knöllchen von drei Pflanzen entfernt, und vier Proben wurden gescannt. (B) M. sativa-Knöllchen 28 dpi nach vierwöchiger PTA-Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Übersicht über die Probenvorbereitung für die Mikro-CT. Die mit einem Kontrastmittel gefärbte Wurzelknöllchenprobe wird in einem Mikropipettenspitze durch Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt stabilisiert. Die Mikropipettenspitze ist an einem Ende mit Paraffinwachs verschlossen und auf der Rotationsvorrichtung innerhalb der Mikro-CT-Anlage befestigt. Die Röntgenquelle (ohne Filter) befindet sich auf einer Seite der Anlage, und die Strahlen durchlaufen die Probe, um den Röntgendetektor auf der gegenüberliegenden Seite zu erreichen. Die Aufnahme ergibt eine 2D-Projektion basierend auf der Gewebedichte. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Beispielhafte Bildrekonstruktion und 3D-Visualisierung. (Links) 2D-Projektion. (Mitte) Rekonstruierter Ausschnitt. A1, B1 und C1 zeigen rekonstruierte transversale Schnitte an den Positionen A, B und C aus der Mikro-CT-2D-Projektion. (Rechts) Eine 3D-Visualisierung des Wurzelknöllchens, erstellt aus rekonstruierten Bildern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Annotierte repräsentative Bilder. (A) Annotiert 3D-Visualisierung von M. sativa Wurzelknöllchen.B) Rote, blaue und grüne Konturen auf einem 3D-Bild, die die transversale (C), koronal (D) und sagittale (E) Ebenen. Annotierte Querschnitte (C), koronal (D) und sagittal (EAbschnitte von M. sativa Wurzelknöllchen. Abkürzungen: c – Cortex; e – Epidermis; ic – infizierte Zelle; r – Wurzel; uc – nicht infizierte Zelle; v – Vakuole; vb – Gefäßbündel; ZI – Zone I (meristematisch); ZII – Zone II (Infektion); ZIII – Zone III (Differenzierung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 1 (zusätzlich). Software-Screenshots für die Mikro-CT-Bildgebung. (A1) Öffnen und Schließen der Stufen-Tür. (A2) Aktivieren der Kameraperspektive. (A3) Einschalten der Röntgenquelle. (A4) Aktivieren der kontinuierlichen Röntgenansicht. (A5) Anpassen der Probenhöhe. (A6) Anpassen der Pixelgröße. (A7) Drehen der Probe. (A8) Ändern der Binning-Einstellung. (A9) Wechseln des Filters. (A10) Optionen zum Zugriff auf die Scan-Modi. (A11) Einstellen der Spannung und des Stroms der Röntgenquelle. (A12) Doppelklick, um die Flachfeldkorrektur auszuschalten. (A13) Scan-Optionen. (B1) Flachfeldkorrektur ausgeschaltet. (B2) Optionen zum Zugriff auf die Scan-Modi. (B3) Durchschnittliche Röntgentransmission. (B4) Anpassen der Belichtungszeit. (B5) Aktualisieren der Flachfelder. (C1) Benennen der Datei und Auswahl des Speicherorts für die Daten. (C2) Einstellen von Drehwinkelschritt, Bildmittelung, zufälliger Bewegung und 360-Grad-Scan. (C3) Anpassen der partiellen Breite. (C4) Scan starten.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 2, Zusatzmaterial. Software-Screenshots zur Bildrekonstruktion. (A1) Wählen Sie den Bereich für die Vorschau der Probe aus. (A2) Vorschau der Probe. (A3) Feinabstimmung der Parameter. (A4) Festlegen der Anzahl der Durchläufe und der Parameter-Schrittweite für die Nachausrichtung. (A5-6) Oberer und unterer Bereich des Rekonstruktionsbereichs. (A7) Rekonstruktion starten. (B1) Kontrast anpassen. (B2) Nach der Nachausrichtung Ergebnisse anzeigen und durchklicken. (B3) Kreis-förmige ROI erstellen. (B4) Dateiformat und Speicherort für die Daten auswählen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 3, Zusatzmaterial. Software-Screenshots zur 3D-Visualisierung. (A) Informationen zur Bildabstandseinstellung. (B) Werkzeuge zur Auswahl, Drehung und Vergrößerung (oben). Fensterebene zur Kontrasteinstellung (unten). (C) Anzeige der Maßstabsleiste (oben). Hintergrundfarbe ändern (unten). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 4 (Zusatzmaterial). Mikro-CT-Rekonstruktion nach PTA-Färbung für 14, 17 und 28 Tage. (A) Rekonstruierter M. sativa-Schnitt nach 14-tägiger PTA-Färbung zeigt Rauschen in der äußeren Schicht (n = 1). (B) Rekonstruierter M. sativa-Schnitt nach 17-tägiger PTA-Färbung zeigt einen höheren Kontrast in der äußeren Schicht, jedoch geringere Klarheit im Inneren im Vergleich zu (A) (n = 1). (C) Rekonstruierter M. sativa-Schnitt nach 28-tägiger PTA-Färbung zeigt einen höheren Kontrast sowohl in der äußeren als auch in der inneren Schicht im Vergleich zu (A) und (B) (n = 4).Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Tabelle 1: Parameter für die Mikro-CT-Bildgebung.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzvideo 1: 3D-Nodul-Video.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Im Folgenden finden Sie einige Empfehlungen zur Probenvorbereitung und Färbung. Bei der Probenvorbereitung für die Mikro-CT-Bildgebung ist ein sorgfältiges Auspräparieren der Knöllchen unerlässlich, um die strukturelle Integrität zu bewahren. Es wird empfohlen, auf beiden Seiten der Anheftungsstelle ein kurzes Wurzelsegment beizubehalten, um den räumlichen Kontext zu erhalten und Gewebeschäden zu minimieren. Der Einsatz eines Kontrastmittels ist entscheidend, um die Röntgenabschwächung zu erhöhen und innere anatomische Strukturen sichtbar zu machen14. Eine frühere Studie mit PTA-Färbung zeigte, dass eine minimale Färbedauer von 14 Tagen erforderlich ist, um ausreichenden Kontrast über verschiedene Pflanzenarten und Gewebetypen hinweg zu erreichen, wobei keine Anzeichen einer Überfärbung festgestellt wurden14. In dieser Studie wurden Bradyrhizobium-induzierte Sojabohnenwurzelknöllchen (fixiert am 14. Tag nach der Infektion) 35 Tage lang gefärbt14. Unter Verwendung dieses Zeitraums (14–35 Tage) als Referenz führten wir vorläufige Färbeversuche an unseren eigenen Knöllchenproben zu mehreren Zeitpunkten (14, 17 und 28 Tage) durch und verglichen den resultierenden Bildkontrast. Für dieses Protokoll wurde eine Färbedauer von 28 Tagen gewählt, da sie im Vergleich zu kürzeren Zeiträumen einen besseren Kontrast, klarere Zellgrenzen und eine gleichmäßigere Färbung ergab (Zusatzabbildung 4). Wir weisen darauf hin, dass die Rekonstruktionen nach 14 und 17 Tagen von einem einzelnen Knöllchen stammen und nicht Teil einer systematischen, replikativen Studie sind, während die Bedingung nach 28 Tagen alle vier gescannten Knöllchen umfasst, und die Färbedauer je nach erforderlicher Auflösung angepasst werden sollte. Eine Färbedauer von 28 Tagen ist zudem kein kurzer Zeitraum. Wie in früheren Studien vorgeschlagen, könnte eine mikrowellenunterstützte Färbung die PTA-Penetration beschleunigen und somit die erforderliche Färbedauer verkürzen14. Jodhaltige Mittel wie Lugolsche Lösung werden ebenfalls zur Kontrastverbesserung in Pflanzengewebe verwendet23,24. Wir wählten PTA aufgrund seiner nachgewiesenen Wirksamkeit in Knöllchengewebe und verglichen keine Färbeagentien, da das Hauptziel dieser Studie darin bestand, ein einziges reproduzierbares Protokoll zu etablieren14. Zukünftige Studien sollten andere Färbeverfahren an verschiedenen Pflanzenarten und Gewebetypen testen.

Eine korrekte Einbettung ist ebenso wichtig. Die Probe sollte vollständig mit Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt bedeckt bleiben, um Austrocknung zu verhindern und die natürliche Morphologie zu erhalten. Nach der Einbettung sollten die Proben über Nacht bei 4 °C gelagert werden, um die vollständige Verfestigung der Agarose sicherzustellen und während der Aufnahme Stabilität zu gewährleisten. Die montierte Probe muss sicher auf dem Scanningsystem befestigt sein, um Drift- oder Vibrationsartefakte während der Datenaufnahme zu vermeiden.

Mikro-CT ermöglicht eine zerstörungsfreie, dreidimensionale Visualisierung des gesamten Knöllchengewebes mit einer Auflösung, die gröber ist als die der Licht- und Elektronenmikroskopie. Sowohl die Röntgenmikroskopie (XRM) als auch die auf Synchrotronstrahlung basierende Röntgen-CT liefern im Allgemeinen Bilder von höherer Qualität und Auflösung als die konventionelle Mikro-CT. Die auf Synchrotronstrahlung basierende Röntgen-CT ermöglicht außerdem das direkte Scannen frischer, ungefärbter Proben, da hoher Photonenfluss und Strahlkohärenz eine schnelle Aufnahme und ausreichenden Kontrast ohne kontrastverstärkende Mittel erlauben6. Ein direkter Vergleich mit Duncan et al. (2022)14 und Nakhforoosh et al. (2024)6 ist durch Unterschiede im Studiendesign eingeschränkt: Art (Sojabohne vs. Medicago sativa), Knöllchentyp (determiniert vs. indeterminiert) und Bildgebungsmodalität (XRM und auf Synchrotronstrahlung basierende Röntgen-CT vs. konventionelle Mikro-CT). Dennoch beträgt die nominelle Pixelgröße unserer Knöllchenrekonstruktionen etwa 1,75 µm, was feiner ist als das Knöllchenscanning in Duncan et al. (2022)14 (2,2 µm, Abbildung 4A), doch zeigen deren Rekonstruktionen immer noch eine größere Klarheit als unsere. Dies spiegelt wahrscheinlich wider, dass die effektive Auflösung von mehr abhängt als nur von der nominellen Pixelgröße; die optische Vergrößerung der Objektivlinsen der XRM, die Detektorempfindlichkeit, die Quellenstabilität, die Kameraleistung und die Rekonstruktionsmethoden tragen alle bei. Während große, niedrigdichte Strukturen wie Vakuolen leicht unterscheidbar sind, wie hier gezeigt, ist die Besiedlung einzelner Zellen durch Bakteroiden sowie kleinerer oder weniger dichter Organellen nicht erkennbar, und dynamische biologische Prozesse können nicht in Echtzeit erfasst werden. PTA- und jodhaltige Kontrastmittel sind unspezifisch und können keine molekulare Identität anzeigen. Für zelluläre Fragestellungen auf subzellulärer Ebene sind weiterhin Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie erforderlich. Diese bildgebenden Verfahren ergänzen sich gegenseitig, wobei die Mikro-CT besonders gut für die Morphologie des gesamten Organs und die dreidimensionale Geweearchitektur geeignet ist und so einen Kontext für die Licht- und Elektronenmikroskopie schafft, die feinere strukturelle und molekulare Details untersuchen.

Wir haben diesen Workflow erfolgreich mit Knöllchen zu ähnlichen Zeitpunkten und Entwicklungsstadien von M. sativa, die mit anderen S. meliloti-Stämmen inoculiert wurden, sowie von M. truncatula und Trigonella foenum-graecum, die mit verschiedenen S. meliloti-Stämmen inoculiert wurden, repliziert (unveröffentlichte Daten). Wir haben keine Knöllchen unterschiedlicher Entwicklungsstadien getestet, da unser Ziel darin bestand, einen charakterisierten und reproduzierbaren Protokollablauf für reife, stickstofffixierende Knöllchen bereitzustellen. Dennoch sollte der Workflow auch auf Knöllchen unterschiedlicher Entwicklungsstadien anwendbar sein, da die entscheidendere Einschränkung die Knöllchengröße darstellt. Die von uns untersuchten Knöllchen waren etwa 2,5 mm lang (Zusätzliche Tabelle 1). An dem in dieser Studie verwendeten Mikro-CT empfehlen wir eine minimale Länge von 1 mm. Die abbildbare Größe hängt von dem verwendeten Gerät ab, da die Vergrößerungen variieren können.

Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Besiedlungsdichte innerhalb des Knöllchens ein wichtiger Parameter ist, der direkt mit der Effizienz der Stickstofffixierung korreliert. Knöllchen mit einem höheren Anteil infizierter Zellen fixieren Stickstoff besser als solche, in denen weniger Zellen von Bakterien besiedelt sind25. Zudem hängt die Gesundheit der Knöllchen vom Ausmaß der Gefäßversorgung ab, und eine gestörte oder eingeschränkte Gefäßstruktur weist auf defekte Knöllchen und eine verminderte Pflanzengesundheit hin26. Angesichts der Möglichkeit, die Besiedlung und die Gefäßarchitektur sichtbar zu machen, schließt die Mikro-CT eine wichtige Lücke im Bereich der Stickstofffixierung. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht den routinemäßigen, zerstörungsfreien Blick auf die inneren und äußeren Strukturen von Wurzelknöllchen, die direkte Bestimmungsfaktoren für die Effizienz der Fixierung sind und somit die symbiotische Stickstoffversorgung von Nutzpflanzen beeinflussen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Stephanie Sage für ihre Hilfe bei der Pflanzenpräparation. Xia Zhao unterstützte bei der Probeneinbettung. Wir sind Madi Mitchell für die anfängliche Projektdiskussion dankbar. Wir danken Tom Kleist und Kexi Yi für ihre Beratung zur Dateninterpretation. Wir danken außerdem Keith Duncan (Donald Danforth Plant Science Center) für seine Beratung zu Protokollen. Dieses Projekt wird vom Stowers Institute for Medical Research finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
20 mL GlasfläschchenSigma-AldrichZ190527Wird verwendet, um Knöllchen für die Fixierung und Färbung aufzubewahren.
200 µL PipettenspitzenFisherbrand02-717-144Wird verwendet, um Knöllchen für die Bildgebung aufzubewahren.
35 mm Mikroplatten-SchaleFisher Scientific507532924Wird verwendet, um Knöllchen nach der Färbung zu waschen.
Dragonfly-SoftwareComet Technologies Canada Inc.V2022.2Wird verwendet, um 2D-Rekonstruktionen in einer 3D-Ansicht zu visualisieren und zu bearbeiten.
ÄthanolDecon LabsV1001Wird verwendet, um Knöllchen zu fixieren und zu waschen.
Feine PinzetteDumontAA-Inox-EWird verwendet, um Knöllchen in der Pipettenspitze zu positionieren.
Gel-Load-SpitzeCorning (Costar)4853Wird verwendet, um das Knöllchen innerhalb des Agarosegels in der Pipettenspitze zu manipulieren.
HeizplatteMirakSP72725Wird verwendet, um Paraffin zu schmelzen und LowMelt-Agarose aufzulösen.
LowMelt-AgaroseGeneMate490001-602Wird zur Einbettung von Wurzelknöllchen verwendet, um Orientierung und Feuchtigkeit zu bewahren.
MicroCTBrukerBruker SkyScan 1272Wird zum Scannen des Knöllchens verwendet.
NRecon-SoftwareBrukerV2.2.0.6Wird zur Rekonstruktion der 2D-Projektionen verwendet.
Rüttelapparat mit RotationVWR77591-858Wird verwendet, um das Wurzelknöllchen zu schütteln, um das Eindringen der Färbung zu beschleunigen.
ParaffinMcCormick Scientific39503002Wird verwendet, um das schmale Ende der Pipettenspitze abzudichten.
ParafilmAlkali ScientificPM996Wird verwendet, um Pipettenspitzen abzudichten, um zu verhindern, dass die Probe austrocknet.
PhosphorwolframsäureElectron Microscopy Science (EMS)19500Wird zur Färbung von Knöllchen verwendet.
Probenhalter – L 3,4 cm D 0,63 mmBrukerSet von Bruker mit GerätWird verwendet, um Pipettenspitze und Probe während der Bildgebung zu halten.
SkalpellFisher ScientificS07890Wird verwendet, um Wurzelknöllchen zu entnehmen.
Skyscan-SoftwareBrukerv1.5.1.0Wird zur Steuerung des MicroCT verwendet.
WasserbadBoekel Grant640013001Wird verwendet, um Agarose während der Einbettung der Knöllchen flüssig zu halten.

Referenzen

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