Einzelzell-Massenspektrometrie-Bildgebung mit Desorptions-Elektrospray-Ionisation gekoppelt an Orbitrap-Massenspektrometer

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Einzelzell-Massenspektrometrie-Bildgebung von OVCAR-8-Zellen unter Verwendung von Desorptionselektrospray-Ionisation, gekoppelt mit Orbitrap-Massenspektrometern für hochauflösende metabolomische Analysen.

Zusammenfassung

Die Desorptionselektrospray-Ionisation–Massenspektrometrie-Bildgebung (DESI–MSI) ermöglicht eine umgebungsfreie, matrixfreie molekulare Bildgebung mit minimaler Probenvorbereitung. Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf für Einzelzell-MSI von OVCAR-8-Zellen unter Verwendung von DESI, gekoppelt mit Orbitrap-Massenspektrometern. Das System integriert einen DESI-Sprüher, eine modifizierte Massenspektrometerschnittstelle, eine motorisierte XYZ-Stufe und ein optisches Breadboard für hochauflösende Bildgebung. Die Zellen werden auf gegitterten Glasdeckschichten kultiviert, mit Ammoniumformiatlösung gewaschen, um Salzstörungen zu reduzieren, getrocknet und unter Umgebungsbedingungen analysiert. Das Lösungsmittel wird kontinuierlich mittels eines Nano-Flüssig-Chromatographiesystems geliefert, und das vernebelnde Stickgas wird so geregelt, dass die Sprühstabilität aufrechterhalten wird. Das Protokoll beschreibt außerdem Rasterbildgebung, Pixelsteuerung und optisch-zu-Massenspektrometrie-Bildregistrierung für die Einzelzelllokalisierung. Die hohe Massenauflösung und Massengenauigkeit durch Orbitrap-Detektion ermöglichen die Differenzierung enger verwandter Molekularspezies und unterstützen die Metabolomanalyse einzelzelliger. Dieses Protokoll bietet eine anpassungsfähige Strategie zur Implementierung hochauflösender Einzelzell-MSI mit mehreren Orbitrap-Massenspektrometerplattformen.

Einleitung

Die Metabolomik versucht, kleine Molekülmetaboliten, die den funktionalen Zustand biologischer Systeme widerspiegeln,^umfassend zu charakterisieren ^1,2,3,4,5. Da Metaboliten direkte Produkte enzymatischer Aktivität sind, liefern sie eine dynamische Anzeige des zellulären Phänotyps und der biochemischen Regulation. Konventionelle metabolomische Arbeitsabläufe basieren jedoch typischerweise auf Massenextraktionsmethoden, die Signale über Tausende bis Millionen von Zellen durchschneiden und so die zelluläre Heterogenität ^6,7,8 verdecken.

Die Einzelzell-Metabolomik behebt diese Einschränkung, indem sie molekulare Profilierungen auf Ebene einzelner Zellen ermöglicht, metabolische Vielfalt innerhalb komplexer Populationen offenbart und das mechanistische Verständnis des Krankheitsverlaufs, der Arzneimittelantwort und der zellulären Differenzierung verbessert. Massenspektrometrie (MS) ist ein unverzichtbares Werkzeug für die molekulare Analyse biologischer Proben. Jüngste Fortschritte in MS-Techniken, einschließlich Probenvorbereitung, Instrumentierung und Datenanalyse, ermöglichen die Durchführung von MS-Metabolomik-Studien auf Einzelzellniveau 9,10,11,12.

Die MS-Bildgebung (MSI), die räumlich aufgelöste molekulare Analyse biologischer Proben ermöglicht, integriert präzise Probenbewegungen, minimierte Probenahme, effiziente Ionisation und Datenvisualisierung, indem an jeder definierten räumlichen Koordinate ein vollständiges Massenspektrum über eine Probenoberfläche 12,13,14 erfasst wird. MS-Bilder werden rekonstruiert, indem die Intensität ausgewählter Massen-zu-Ladungs-Verhältniswerte (m/z) über x–y-Koordinaten dargestellt werden, wodurch chemische räumliche Informationen innerhalb komplexer biologischer Systeme^{erhalten bleiben.} Die räumlich aufgelöste Einzelzell-Metabolomik erfordert analytische Plattformen, die die molekulare Lokalisierung erhalten und gleichzeitig ausreichend Empfindlichkeit und Massenauflösung erhalten, um Arten mit geringer Häufigkeit ^zu erkennen^.

Single-Cell-MSI stellt zusätzliche Herausforderungen dar, da einzelne Zellen typischerweise zwischen 5 und 20 μm im Durchmesser ^8,21 liegen. Auf dieser räumlichen Skala ist die Analytenhäufigkeit pro Stichprobenereignis extrem begrenzt. Daher sind mehrere Faktoren, darunter eine genaue Kontrolle der Probenbewegung, minimierte Probenahme, hohe Ionisationseffizienz und effiziente Ionenübertragung, ebenso entscheidend, um interpretierbare molekulare Informationen aus einzelnen Zellen^{zu erhalten.} Matrizenunterstützte Laser-Desorption/-Ionisation (MALDI)–MSI, eine vakuumbasierte Technik, die routinemäßig für hochauflösende MSI-Studien verwendet wird, erfordert Matrixabscheidung und Vakuumbetrieb; Matrixkristallisation in MALDI kann jedoch Analytendelokalisierung und -variabilität auf der Einzelzellskala 23,24,25,26,27 einführen. Im Gegensatz dazu arbeiten Umgebungs-MSI-Ansätze unter Umgebungsbedingungen, und Proben behalten nahezu natürliche chemische Zustände, da kaum oder keine Probenvorbereitung erforderlich ist. Unter den Ambient-MSI-Methoden wurden DESI²⁸, Nano-DESI²¹, pneumatisch unterstützte Nano-DESI²⁹ und Single-Probe ^{8,30,31,32,33,33,34,35} bereits für Einzelzell-MSI-Studien verwendet. Obwohl Techniken, die auf Mikro-Flüssigkeitsextraktion basieren, einschließlich Nano-DESI, pneumatisch unterstützter Nano-DESI und Single-Probe, eine hohe Probe- und Ionisationseffizienz bieten, beruhen sie auf der Aufrechterhaltung einer stabilen Flüssigkeitsbrücke an der Spitze der Probeprobenproben, während Störungen der Flüssigkeitsbrücke, wie Veränderungen der Oberflächenmorphologie oder Verstopfungen der Sonde, die Qualität von MSI-Experimenten ^5,8 beeinflussen können^{, 21, 30, 35}.

DESI ist eine Umgebungs-Ionisationstechnik, bei der geladene Lösungsmitteltröpfchen auf eine Oberfläche treffen, Analyte extrahieren und sekundäre Tröpfchen erzeugen, die die ionisierte Spezies³⁶ enthalten. DESI bietet kontaktlose, verstopfungsfreie Probenahme mit Kompatibilität für rasterbasierte Bildgebungs-Workflows und eignet sich daher gut für hochauflösende, multiionenbasierte molekulare Kartierung optisch identifizierter Einzelzellen, wenn sie an hochauflösende Orbitrap-Plattformen 20,37,38,39,40 gekoppelt sind. DESI wird häufig für Gewebebildgebung eingesetzt, aber selten auf Einzelzell-MSI angewendet, hauptsächlich aufgrund technischer Herausforderungen^20,28. Jüngste Studien, die mit einem kommerziellen Setup aus einem Waters DESI XS kombiniert mit einem SELECT SERIES Cyclic IMS Massenspektrometer durchgeführt wurden, zeigten, dass eine Einzelzellauflösung für mehrere Zelllinien erreicht werden kann. Um eine hohe räumliche Auflösung in DESI–MSI zu erreichen, ist eine koordinierte Steuerung der Ionisationseffizienz, der Ionenübertragung, der Aufnahmerate und der Ausrichtung des Sprühapparats 12,20,28 erforderlich. Insbesondere haben Fortschritte im Design neuer Generationen von DESI-Sprühern, darunter DESI XS und Desorption Electro-Flow Focusing Ionization (DEFFI), die Probenahme um^41,42 deutlich reduziert. Darüber hinaus kann die Reduzierung der Durchflussraten von Lösungsmitteln, wie etwa die Nanoliter-pro-Minute-Durchflussraten, die durch Nanoflüssigchromatographie (LC)-Pumpen geliefert werden, die räumliche Einschließung erheblich verbessern, um eine einzellige molekulare Delineation²⁸ zu erreichen. Obwohl dieser Ansatz eine MSI mit Einzelzellauflösung erreichte, basiert er auf Instrumentierung eines bestimmten Anbieters (Waters). Eine breitere Implementierung von Einzelzell-DESI–MSI erfordert daher Strategien, die mit weit verbreiteten hochauflösenden Massenspektrometern wie Orbitrap-Systemen integriert werden können, um eine hohe Empfindlichkeit, Massengenauigkeit und Auflösungskraft zu gewährleisten. Die Kombination von DESI mit Orbitrap-Massenspektrometern eröffnet neue Möglichkeiten in Einzelzell-MSI-Studien, einschließlich der Differenzierung eng beieinanderliegender und isobarer Spezies in komplexen zellulären Extrakten 20,43,44.

Dieses Protokoll beschreibt eine modulare Strategie zur Integration eines Waters DESI XS-Sprühapparats mit Orbitrap-Massenspektrometern für Einzelzell-MSI-Studien. Der Workflow integriert gittergebundene Deckschichten für Zellbefestigung und optische Korrelation, eine motorisierte XYZ-Stufe für kontrollierte Rasterscans, nanoskalige Lösungsmittelabgabe für stabile Sprühbildung und hochauflösende Orbitrap-Detektion. Obwohl ein Thermo Orbitrap Tribrid Lumos-Massenspektrometer als Plattform ausgewählt wurde, könnten viele andere Orbitrap-Massenspektrometermodelle mit kompatiblen Quell-Schnittstellen-Geometrien potenziell mit ähnlich angepassten DESI XS-Konfigurationen nach geeigneter mechanischer Anpassung und Optimierung gekoppelt werden.

Protokoll

OVCAR-8-Zellen wurden aus der American Type Culture Collection (ATCC) gewonnen. Alle Zellkulturverfahren wurden gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien durchgeführt. Die Zellen wurden routinemäßig mit einem Mycoplasma-Detektionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Mycoplasma-Kontamination getestet.

HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien durch. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung. Organische Lösungsmittel in einer chemischen Abzugshaube handhaben.

1. Kultivieren und bereiten Sie OVCAR-8-Zellen auf gerasterten Deckblättern vor

1. Bereiten Sie das vollständige Medium vor, indem Sie RPMI-1640 Medium mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin–Streptomycin ergänzen. Erhitze die mittlere Temperatur auf 37°C.
2. Bewahren Sie OVCAR-8-Zellen in 10 cm großen Zellkulturschalen mit 10 ml vollständigem Medium auf. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2.
3. Passage der Zellen, wenn etwa 80 % der Kulturoberfläche visuell von haftenden Zellen besetzt sind, typischerweise alle zwei Tage unter den beschriebenen Kulturbedingungen.
   1. Aspirieren Sie das Medium aus der 10 cm großen Kulturschale und spülen Sie die Zellen einmal mit 5 mL 1× phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
   2. Fügen Sie der Kulturschale 2 ml 0,25 % Trypsin–Ethylendiaminetetraessigsäure hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für etwa 3 Minuten oder bis die Mehrheit der Zellen sichtbar von der Kulturoberfläche abgelöst wird, wenn sie unter dem Mikroskop untersucht werden.
   3. Gib 8 ml vorgewärmtes Vollmedium zur Schüssel, um das Trypsin zu neutralisieren. Mit einer 10-ml-serologischen Pipette pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig etwa 15–20 Mal auf und ab, um die Zellen zu verteilen.
   4. Übertragen Sie 1 ml der Federung in 9 ml frisches Vollmedium.
   5. Zähle die Zellen mit einem automatischen Zellzähler. Laden Sie 10 μL der neu suspendierten Zellsuspension direkt in den Zählrutsche ein, ohne zusätzliche Verdünnung, und führen Sie die Zellzählung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
      HINWEIS: Zellviabilitätsfarbe wie Trypanblau wurden in diesem Protokoll nicht verwendet. Untersuchen Sie den Zellzustand visuell durch Überwachung der Zellmorphologie und Anhaftung vor der Trypsinisierung.
4. Säe die Zellen auf den Deckblättern.
   1. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von ~1 × 10⁶ Zellen/ml mit einem vollständigen Medium. Berechnen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension mit C₁V₁ = C₂V₂, wobei C₁ die gezählte Zellkonzentration ist, V₁ das benötigte Volumen der Zellsuspension, C₂ die Zielkonzentration und V₂ das gewünschte Endvolumen.
   2. Platzieren Sie einzelne 28 mm gegitterte Glasabdeckfolien mit einem Gitterabstand von 50 μm in Mulden einer 6-Bohrloch-Platte.
      HINWEIS: Autoklaven werden die Glasdeckfolien vor der Verwendung zur Zellkultur verwendet. Platziere die Gitterseite nach unten, um Störungen beim Zellwachstum zu minimieren.
   3. Fügen Sie jedem Bohrloch 2 ml vollständiges Medium und 200 μL der Zellsuspension (~2 × 10⁵ Zellen/Brunnen) hinzu. Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig in einem "X"-Muster, um die Zellen gleichmäßig über die Deckungsfläche zu verteilen.
   4. Inkubieren Sie die Zellen etwa 15–20 Stunden, um eine Zellanhaftung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Zellmorphologie routinemäßig mit einem Mikroskop, um ein normales Zellwachstum sicherzustellen. Untersuchen Sie eine mögliche Mycoplasma-Kontamination mit einem Mycoplasma-Detektionsset, falls die Zellen schlecht wachsen.

2. Zellreinigung mit Ammoniumformiat (AF)-Lösung

HINWEIS: Bereiten Sie vor jeder Anwendung eine frische AF-Lösung vor.

1. Bereite sofort vor der Anwendung isotonen AF-Waschpuffer vor. Wäge 0,45 g AF und löse es in 50 mL LC/MS-Qualitätswasser, um eine endgültige AF-Konzentration von 0,14 m (0,9 % W/W) herzustellen. Stellen Sie den pH-Wert^{von 5,45} nicht ein.
   HINWEIS: Verwenden Sie die frisch zubereitete AF-Lösung am selben Tag der Zubereitung. Halten Sie die Lösung bis zur Anwendung eiskalt (0°C–4°C).
2. Aspiratiere das Kulturmedium aus jedem Brunnen der 6-Well-Platte. Geben Sie jedem Brunnen sofort 2 ml kalte AF-Lösung hinzu.
3. Mit steriler Pinzette heben Sie vorsichtig jede Deckschicht mit haftenden Zellen aus dem Brunnen, während die zellbeschichtete Oberfläche nach oben zeigt. Geben Sie den Deckmantel kurz für 2–3 Sekunden in einen separaten Brunnen, der mit 2 ml kalter 0,9% AF-Lösung vorgefüllt ist.
4. Wiederholen Sie den Spülvorgang für insgesamt zwei Spülungen mit frischer AF-Lösung pro Spülung. Nach der letzten Spülung wird der Deckmantel aus der AF-Lösung entfernt und etwa 20–30 Minuten an der Luft in einer chemischen Abzugshaube an der Luft getrocknet, bevor die DESI–MSI-Analyse durchgeführt wird.
   HINWEIS: Spülen Sie die Zellen vorsichtig ab, um eine Störung während des Waschschritts zu vermeiden.

3. Herstellung einer modifizierten FAIMS-basierten MS-Schnittstelle

1. Zerlegen Sie den FAIMS Pro Elektroden-Ionenquellen-Gehäuseadapter, um Zugang zum internen Elektrodenbereich zu erhalten. Bestätigen Sie, dass der Adapter mit Thermo Orbitrap-Massenspektrometern kompatibel ist, die mit der FAIMS Pro-Schnittstellenkonfiguration ausgestattet sind.
2. Entfernen Sie die FINS-Elektrodenkomponenten, einschließlich der internen Drähte, Elektrodenbaugruppen, O-Ringe und tragenden inneren Strukturen. Behalten Sie die äußere Gehäuseschale, die Montageflansche und den Interface-Detektionsstift, der für die Massenspektrometererkennung des Adapters erforderlich ist.
3. Modifizieren Sie die kreisförmige Öffnung mit standardmäßigen Maschinenwerkstatt-Bearbeitungsverfahren. Vergrößern Sie die Öffnung, bis sie genügend Platz um die hervorstehende Orbitrap-Einlass-/Ionentrichter-Einheit bietet.
4. Glätten und entgraten Sie die bearbeitete Kante nach dem Schneiden. Bestätigen Sie, dass die modifizierte Öffnung eine ungehinderte Positionierung des Gehäuseadapters auf dem Massenspektrometer ermöglicht.
5. Ändern Sie die Länge der beiden Beine des Gehäuseadapters mit einer Säge. Schneiden Sie die Beine auf eine Endlänge von etwa 2 1/4 Zoll, um die Verbindung mit dem optischen Breadboard zu ermöglichen.
   HINWEIS: Verwenden Sie geeignete Bearbeitungswerkzeuge und vermeiden Sie es, die strukturelle Integrität des verbleibenden Gehäuses zu beschädigen.
6. Bereite ein optisches Aluminium-Breadboard vor (10 Zoll × 12 Zoll × 0,5 Zoll, 1/4"-20 gezackte Löcher). Positioniere das Breadboard horizontal unter dem modifizierten FIMIS-Adapter.
7. Verwenden Sie zwei Halterungen, um den modifizierten FIMIS-Adapter mit dem optischen Breadboard zu verbinden. Trimmen Sie die Halterungen bei Bedarf, um das Gewicht zu reduzieren und die richtige Position des Breadboards relativ zum Orbitrap-Einlass zu ermöglichen.
8. Sichern Sie die modifizierte FIMIS-Schnittstelle auf dem optischen Breadboard mit mechanisch kompatibler Befestigungshardware, die mit dem 1/4"-20 getappten Lochmuster des Breadboards ausgerichtet ist. Sicherstellen Sie eine stabile Positionierung während der Bildgebungsexperimente.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Schnittstelle starr befestigt ist, um Vibrationen während der Bühnenbewegung und Datenerfassung zu minimieren.
9. Maschinerie oder schneiden Sie eine flache Nut in das optische Breadboard direkt unter dem Kontaktbereich des FIMIS-Gehäuses. Größe und Positionierung der Nut so, dass ausreichend Platz für stabile Sitzplätze und Ausrichtung des modifizierten FIMIS-Gehäuses auf den Orbitrap-Einlass gewährleistet sind.
   HINWEIS: Dimensionieren Sie die Rille so, dass sie die Basis des FIMIS-Gehäuseadapters aufnehmen und die Positionsreproduzierbarkeit verbessert.
10. Richte die montierte Schnittstelle mit dem Massenspektrometer-Einlass aus. Überprüfen Sie, dass die festgehaltenen Befestigungsflansche korrekt auf dem Instrument sitzen und dass das optische Breadboard unter der Schnittstelle waagerecht bleibt.
11. Überprüfen Sie vor der Installation des DESI-Sprühers, dass die modifizierte runde Öffnung ungehinderten Freiraum um die Orbitrap-Einlass-/Ionentrichter-Baugruppe bietet.

4. Montage des DESI-Sprühers und der Orbitrap-Schnittstelle

1. Installieren Sie den DESI-Sprüher auf das integrierte Setup, das aus dem individuell angepassten FIMIS-Rahmen, der motorisierten XYZ-Stufe, dem Gasregler und dem optischen Breadboard besteht. Verwenden Sie eine motorisierte Stufe, die von einem CONEX-MFACC-Controller gesteuert wird.
2. Definieren Sie die x-Achse als die Raster-Scan-Richtung von links nach rechts und definieren Sie die y-Achse als die Linien-Schritt-Richtung von oben nach unten. Stellen Sie die z-Achse vor der Aufnahme ein und halten Sie sie während der Bildaufnahme fest.
3. Verwenden Sie einen Stage-Hub von etwa 1 mm in x-Richtung und 1 mm in y-richtung. Wenden Sie während der Aufnahme keine z-Achsen-Bewegung an.
4. Positionieren Sie den DESI-Sprüher in einem Winkel von etwa 70° zur Probenoberfläche. Legen Sie die Probe direkt unter den Sprüher und positionieren Sie die Sprühspitze so nah wie möglich am Orbitrap-Einlass ohne physischen Kontakt.
5. Verbinden Sie das DESI-Erdungsmetall mit einer Erdungsquelle unter dem Massenspektrometer. Steuer die Rasterbewegung mit der Bühnensteuerungssoftware (Abbildung 1).
   HINWEIS: Der in dieser Studie verwendete DESI-Sprüher ist nur für Nutzer mit DESI–MSI-Instrumenten verfügbar.
6. Verwenden Sie einen motorisierten XYZ-Stage-Controller für die Bühnenbewegung und -positionierung. Schließen Sie vor dem Betrieb die Spannungsleitung, die Stickstoffgasleitung, die Lösungsmittelleitung und die Erdungsleitung an.
7. Installieren Sie ein maßgefertigtes Edelstahl-Ionentransferrohr (1/16 Zoll OD × 0,033 Zoll ID), das zum Orbitrap-Ionenquelleneinlass passt. Positionieren Sie das Ionentransferrohr so, dass es direkt mit dem Orbitrap-Einlass ausgerichtet ist, während es sich ausreichend nach außen streckt, um einen ungehinderten Zugang zur DESI-Fahne zu ermöglichen.
   HINWEIS: Passen Sie die Ionentransferröhre entsprechend der Konfiguration des Massenspektrometers an. Fertigung des Ionentransferrohrs mit geeigneten Bearbeitungsverfahren.
8. Verwenden Sie ein Ionentransferrohr mit gebogener Geometrie, um die Position des DESI-Sprühers relativ zur Probenoberfläche und zum Orbitrap-Einlass zu verbessern.
9. Richten Sie den Sprüher in einem Winkel von etwa 70° relativ zur Probenoberfläche aus, sodass die DESI-Sprühfahne den Orbitrap-Einlassbereich schneidet, ohne die Probenoberfläche zu berühren.
10. Definieren Sie eine stabile Spritzfahne durch das Vorhandensein stabiler Massenspektren und konsistenter normalisierter Werte (NL) während der Aufnahme. Stellen Sie die Position des Sprühgeräts ein, bis ein stabiles Ionensignal festgestellt wird.
11. Stellen Sie den Abstand zwischen Sprüher und Oberfläche als Ausgangsbedingung auf etwa 1,0–1,5 mm ein. Manuell die Position des Sprühgeräts feinjustieren und gleichzeitig die NL-Werte überwachen, um das stabilste Ionensignal zu erzielen.

Abbildung 1. Integriertes Desorptions-Elektrospray-Ionisationssystem (DESI)–Massenspektrometrie-Bildgebungssystem (MSI), gekoppelt an ein Orbitrap-Massenspektrometer. Der DESI-Sprüher ist auf einer integrierten Plattform montiert, die aus einem modifizierten Hochfeld-Adapter für asymmetrische Wellenform-Ionenmobilitätsspektrometrie (FAIMS),  einer motorisierten XYZ-Stufe, einem Gasregler und einem optischen Breadboard besteht. Das Lösungsmittel wird mittels eines Nano-Flüssig-Chromatographiesystems geliefert, und Stickstoffgas wird mit etwa 12 psi zur Spritzstabilisierung zugeführt. Die Abbildung zeigt außerdem die Ionisationsspannungsverbindung, die Lösungsmittelleitung und die Position des Sprühgeräts relativ zum Orbitrap-Einlass. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

5. Lösungsmittelabgabe und Sprühbedingungen konfigurieren

1. Bereiten Sie vor der DESI–MSI-Analyse ein frisches Sprühlösungsmittel aus Methanol/Wasser/Ameisensäure (98:2:0,1, v/v/v) vor.
   HINWEIS: Andere DESI-kompatible Lösungsmittelsysteme, darunter acetonitrilbasierte Lösungsmittel und unterschiedliche Methanol/Wasser-Verhältnisse, können nach der Optimierung verwendet werden. Methanol/Wasser/Ameisensäure (98:2:0,1, v/v/v) wurde als Standardstartbedingung in diesem Protokoll verwendet, da sie stabile Säulenbildung, reduzierte Lösungsmittelverteilung und reproduzierbare positiv-ionenartige Lipidsignale während einzelzelliger DESI–MSI-Experimente ermöglichte.
   VORSICHT: Methanol ist brennbar und giftig. Ameisensäure ist ätzend. Behandle die Lösungsmittel in einer chemischen Abzugshaube.
2. Das Lösungsmittel wird mit einem Ultimate 3000 Nano-LC-System geliefert, das als isokratische Lösungsmittelpumpe mit 750 nL/min für die gemeldeten Experimente betrieben wird. Verbinden Sie die Nano-LC-Steckdose mit dem DESI-Sprüher über einen PEEK-Schlauch (1/16 Zoll OD × 0,005 in ID).
3. Installieren Sie eine C18-Säule (z. B. nanoEase M/Z Peptide BEH; 130 Å, 1,7 μm, 300 μm × 150 mm) in die Leitung, um ausreichenden Gegendruck für eine stabile Sprühbildung bei niedrigen Durchflussraten zu gewährleisten.
4. Stellen Sie die Massenspektrometermethode auf positiven Ionenmodus mit Orbitrap-Detektion, einer Sprühspannung von 0,85 kV, einer Orbitrap-Auflösung von 120.000 bei m/z 200 und einem m/z-Bereich von 150–1200 ein.
5. Stellen Sie das normalisierte AGC-Ziel auf 100 %, maximale Injektionszeit auf 100 ms, die RF-Linse auf 45 % und Mikroscans auf 1. Deaktivieren Sie die Quadrupolisolierung und Quellfragmentierung.
6. Liefern Sie Stickstoffmantelgas aus einem Stickstoffgenerator oder einer flüssigen Stickstoffquelle mit etwa 12 psi, um die DESI-Sprühfahne zu stabilisieren. Verwenden Sie 12 psi als Anfangsbetriebsdruck und nehmen Sie nur bei Bedarf kleinere manuelle Anpassungen vor, um die NL-Werte zu verbessern und ein stabiles Massenspektrum zu erhalten.

6. Durchführung von Rasterabbildung und Pixelsteuerung

1. Identifizieren Sie ein Interessengebiet mit optisch sichtbaren Einzelzellen anhand der gerasterten Überdeckungen als Referenz. Wählen Sie isolierte Zellen mit klarer visueller Trennung von benachbarten Zellen, intakter adhärenter Morphologie und ohne offensichtliche Überschneidung mit Trümmern oder Zellclustern.
2. Definieren Sie den Rasterbereich mit der Fance Stage Controller^{Software 46}. Setze die Rasterschrittgröße auf 0,01 mm, die Bühnengeschwindigkeit auf 0,01 mm/s und die Verweilzeit auf 20 s.
3. Verwenden Sie ein Rasterscannen von links nach rechts über jede Linie und anschließend Bewegung zur nächsten Linie in y-Richtung. Stellen Sie die orthogonale Schrittweite zwischen den Rasterlinien auf 10 μm ein.
4. Stellen Sie die Stufengeschwindigkeit entsprechend der Orbitrap-Aufnahmerate an, um die gewünschte Pixeldimension in Scanrichtung zu erreichen (z. B. etwa 2,5–6,5 μm). Berechnen Sie die Pixeldimension der Scanrichtung mit der folgenden Beziehung: Scan-Richtung Pixeldimension = Stufengeschwindigkeit × Aufnahmezeit pro Scan.
5. Bei einer Stufengeschwindigkeit von 0,01 mm/s (10 μm/s) werden 376 Scans über 102 Sekunden erfasst, was eine Aufnahmezeit von 0,271 s pro Scan und eine entsprechende Scanrichtungspixeldimension von etwa 2,7 μm ergibt. Synchronisieren Sie die Bühnenbewegung und die Massenspektralaufnahme, indem Sie den Orbitrap-Aufnahmezeitpunkt etwas kürzer als die kombinierten Parameter für Bühnenbewegung und Verweilzeit einstellen.
   HINWEIS: Die orthogonale Pixeldimension wird durch die programmierte Schrittweite sowie die physikalischen und mechanischen Grenzen der Stufe bestimmt, während die Scanrichtungsdimension durch Stufengeschwindigkeit und spektrale Erfassungsrate bestimmt wird.
6. Erfassung von Bilddaten über den gewählten Massenbereich bis zur Fertigstellung des vordefinierten Rasterbereichs. Für einen Bildgebiet von 1 mm × 1 mm, der mit einem Linienschritt von 0,01 mm und einer Stufengeschwindigkeit von 0,01 mm/s aufgenommen wird, beträgt die Gesamtaufnahmezeit etwa 4–5 Stunden.
7. Generiere RAW-Datendateien während der Erfassung und stoppe die Erfassung nach Abschluss der angegebenen x–y-Rasterkoordinaten und der entsprechenden Dauer der Instrumentmethode. Unter den hier beschriebenen Bedingungen im positiven Ionenmodus erzeugt jede Rasterlinie typischerweise eine etwa 50 MB lange RAW-Datei, was insgesamt etwa 5 GB für 101 Rasterlinien ergibt.

7. Optisch-zu-MS-Bildregistrierung

1. Aufnahme von Hellfeldbildern der Zellen im ausgewählten Gitterbereich nach dem AF-Waschen und Trocknen sowie vor der DESI-Erfassung mit einem Hellfeldmikroskop mit einem 10×-Objektiv.
2. Konvertiere RAW-Dateien in mzML-Dateien mit msConvert aus ProteoWizard⁴⁸. Konvertiere die mzML-Dateien mit dem imzML-Konverter⁴⁹ in das imzML-Format.
3. Verwenden Sie Schwerpunkt-/Profil-Umwandlungseinstellungen, die mit dem erfassten Datenformat übereinstimmen. Laden Sie die imzML-Dateien direkt in METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ zur Bildvisualisierung hoch.
4. Wenden Sie vor der Visualisierung keine Normalisierung, Hotspot-Entfernung oder zusätzliche Bildbearbeitungskorrekturen an. Richten Sie die optischen und MS-Bilder manuell anhand der Raster-Orientierungspunkte als Positionsreferenzen aus.
5. Skalieren Sie das optische Bild anhand der bekannten Bildmaße und des Rasterabstands. Manuell überlagern Sie das MS-Bild, um die Entsprechung zwischen optisch sichtbaren Zellpositionen und lokalisierten Ionensignalen zu bewerten.
6. Bestätigen Sie die Einzelzelllokalisierung durch visuelle Übereinstimmung zwischen isolierten Zellen im Brightfield-Bild und den entsprechenden MS-Ionenverteilungen.

Ergebnisse

Eine erfolgreiche Ausführung dieses Protokolls erzeugt DESI–MSI-Datensätze, in denen optisch identifizierte Einzelzellen räumlich mit lokalisierten molekularen Ionensignalen übereinstimmen (Abbildung 2). Brightfield-Mikroskopiebilder, die vor der DESI–MSI-Analyse aufgenommen wurden, ermöglichen die visuelle Identifikation einzelner OVCAR-8-Zellen und erleichtern die optische zu MS-Bildregistrierung unter Verwendung des gitterierten Coverslips als Positionsreferenz. Repräsentative DESI–MSI-Ionenbilder zeigen lokalisierte Ionenverteilungen, die räumlich mit einzelnen Zellen korrelieren, die im entsprechenden Brightfield-Bild identifiziert wurden (Abbildung 2A–2D).

Abbildung 2. Vergleich von Hellfeldmikroskopie und MSI von OVCAR-8-Zellen. (A) Brightfield-Mikroskopiebild von OVCAR-8-Zellen, aufgenommen mit 10× Vergrößerung. (B–D) MS-Bilder, die mit DESI–MSI mit einer Pixelgröße von 5,5 μm × 10 μm aufgenommen wurden. Repräsentative Ionenverteilungen sind für (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562 und (D) m/z 788.616 dargestellt. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Einzelne Zellen erzeugen vollständige Massenspektren mit mehreren lipidbezogenen Ionen und kleinen Molekülen. Anstatt sich auf einen einzelnen molekularen Marker zu verlassen, zeigt jede Zelle ein multi-ionenartiges Molekularprofil, das als chemischer Fingerabdruck fungiert. Repräsentative Ionenbilder bei m/z 317.111, m/z 808.562 und m/z 788.616 zeigen heterogene molekulare Verteilungen über benachbarte Zellen hinweg und deuten auf messbare metabolische Heterogenität auf Einzelzellebene hin (Abbildung 2B–2D). METASPACE-basierte Annotationen deuteten darauf hin, dass bei m/z 808.562 und m/z 788.616 detektierten Ionen hauptsächlich mit Phosphatidylcholin- und Phosphatidylethanolamin-Lipidspezies assoziiert waren, während m/z 317.111 mehreren potenziellen kleinen Molekülen und dipeptidbezogenen Spezies entsprach. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Plattform den Nachweis räumlich lokalisierter molekularer Merkmale von optisch identifizierten Einzelzellen unter Umgebungsbedingungen ermöglicht. Weitere Ergebnisse, darunter vorläufig annotierte Arten, MS/MS-identifizierte Arten, repräsentative MS-Bilder und Massenspektren, sind in früheren Studien^{enthalten 20}.

Die integrierte DESI–MSI-Plattform besteht aus einem DESI-Sprüher, einem modifizierten FIMISS-Adapter, einer motorisierten XYZ-Stufe und einem optischen Breadboard, das neben dem Orbitrap-Einlass montiert ist (Abbildung 1). Das Setup ermöglicht eine stabile Lösungsmittelabgabe, kontrollierte Stufenbewegung und die Ausrichtung der DESI-Spritzfahne mit dem Massenspektrometer-Einlass für Umgebungs-Einzelzellbildgebungsexperimente. Das in Abbildung 3 gezeigte maßgeschneiderte Ionentransferröhre ermöglicht die Ionenübertragung zwischen der DESI-Quellregion und dem Orbitrap-Einlass. Die gebogene Kapillargeometrie erleichtert die Positionierung des DESI-Sprühers relativ zur Probenoberfläche und zum Einlassbereich, während ein ungehinderter Ionentransfer gewährleistet bleibt.

Abbildung 3. Angepasstes Ionentransferrohr für Orbitrap MSI. Fotografie des maßgefertigten Ionentransferrohrs, mit dem der DESI-Sprüher mit dem Orbitrap Fusion Lumos Massenspektrometer verbunden wird. Die Abbildung zeigt die Geometrie der gebogenen Transferkapillare und die Montageeinheit, die für die Ionenübertragung während atmosphärischer Einzelzell-MSI-Experimente verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4 zeigt den modifizierten FIMIS-Adapter, der in das optische Breadboard und die motorisierte XYZ-Stufe integriert ist. Die Draufsicht (Abbildung 4A) zeigt die Position der Probenstufe und des modifizierten Adapters relativ zum Orbitrap-Einlass, während die untere Ansicht (Abbildung 4B) die Montagehalterungen und die Stufenbaugruppe zeigt, die zur Unterstützung der Bildgebungsplattform verwendet werden. Die mechanische Stabilität der integrierten Baugruppe ist wichtig, um eine konstante Rasterbewegung aufrechtzuerhalten und die Positionsabweichung während der Bildaufnahme zu minimieren.

Abbildung 4. Modifizierter Hochfeld-Adapter für asymmetrische Wellenform der Ionenmobilitätsspektrometrie (FAIMS), integriert mit dem optischen Breadboard und der motorisierten XYZ-Stufe. (A) Draufsicht des modifizierten Adapters, der neben dem Orbitrap-Einlass und der Probenstufe montiert ist. (B) Bodenansicht, die die modifizierten Halterungen, das optische Breadboard und die motorisierte XYZ-Stufenbaugruppe zeigt, die zur Unterstützung und Ausrichtung der Bildgebungsplattform verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die hohe Massenauflösung durch Orbitrap-Detektion ermöglicht die Differenzierung enger beieinanderliegender und isobarer Lipidspezies, wodurch die molekulare Spezifität und der Bildkontrast im Vergleich zu Systemen mit niedrigerer Massenauflösung verbessert werden. Kleine Pixeldimensionen können durch Synchronisation von Stufengeschwindigkeit und spektraler Erfassungsrate erreicht werden. Beispielsweise wurden Pixelabmessungen von nur 2,7 μm × 10 μm mit Schnellerfassungs-Orbitrap-Plattformen und optimierten Rasterparametern⁴² erreicht. Hochauflösende räumliche Bildgebung ermöglicht die molekulare Abgrenzung nahe benachbarter Zellen und minimiert dabei die Signalüberlappung zwischen benachbarten zellulären Regionen.

Erfolgreiche DESI–MSI-Experimente zeichnen sich durch stabile Sprühbedingungen, eine konstante Ionenintensität über Rasterlinien und die räumliche Lokalisierung molekularer Signale aus, die den einzelnen Zellen im optischen Bild entsprechen. Suboptimale Experimente können diffuse Ionenverteilungen, geringe Signalintensität, inkonsistente Rastermuster oder Verlust der zellulären Lokalisation aufgrund instabiler Sprühbildung, falscher Ausrichtung des Sprühapparats, übermäßiger Lösungsmittelverteilung oder Probenbewegung während der Aufnahme verursachen. Eine sorgfältige Optimierung der Sprühausrichtung, der Lösungsmittelflussrate, der Stufengeschwindigkeit und der Probenpositionierung verbessert die räumliche Genauigkeit und die Stabilität des Ionensignals bei Einzelzell-Bildgebungsexperimenten.

Diskussion

Dieses Protokoll ermöglicht Umgebungs-Einzelzell-DESI–MSI mit hochauflösenden Orbitrap-Massenspektrometern durch die Integration präziser Stufensteuerung, nanoskaliger Lösungsmittelabgabe, optischer Zielerfassung und hochauflösender Massenanalyse. Die Kombination dieser Elemente adressiert mehrere technische Hürden, die historisch die Anwendung von DESI–MSI auf Einzelzellenebene eingeschränkt haben. Insbesondere ermöglicht die koordinierte Steuerung der Sprühstabilität, der Ionenübertragung und der Erfassungszeit eine zuverlässige Detektion molekularer Signale aus extrem kleinen Probevolumen, die den einzelnen Zellen entsprechen. Ein zentraler Faktor für die Leistung in diesem Arbeitsablauf ist die Stabilität und Einschließung der DESI-Sprühwolke. Bei räumlichen Auflösungen im Mikrometermaßstab können kleine Störungen in der Lösungsmittelflussrate, dem Gasdruck oder der Platzierung des Sprühapparats die effektive Probenahme erheblich verändern. Der Einsatz von nanoskaliger Lösungsmittelabgabe in Kombination mit angemessenem Gegendruck verbessert die Sprühstabilität und reduziert die Ausbreitung des Lösungsmittels, wodurch die räumliche Genauigkeit verbessert wird. Darüber hinaus ist es entscheidend, einen konstanten Abstand und Winkel zwischen Sprüher und Oberfläche aufrechtzuerhalten, um eine reproduzierbare Ionisationseffizienz zu gewährleisten. Selbst geringfügige Abweichungen in der Geometrie können zu erheblichen Unterschieden in der Signalintensität führen, insbesondere bei der Analyse heterogener zellulärer Proben. In der Praxis wurde die Optimierung der DESI-Sprühbedingungen empirisch durchgeführt, indem der Gesamtionenstrom, die spektrale Stabilität und die NL-Werte (typischerweise etwa 10⁵–10⁶) während der Aufnahme überwacht wurden. Reproduzierbare Signalqualität wurde durch iterative Anpassung der Sprühposition, der Lösungsmittelflussstabilität, des Gasdrucks und der Ausrichtung der DESI-Säule relativ zum Orbitrap-Einlass erreicht.

Die Effizienz der Ionenübertragung stellt eine weitere wichtige Einschränkung auf Einzelzellebene dar, da die Analytenhäufigkeit innerhalb einzelner Zellen von Natur aus gering ist. Auf diesen räumlichen Skalen kann die effiziente Ionenübertragung in manchen Implementierungen eine größere praktische Begrenzung als die Ionisationseffizienz darstellen, da nur ein sehr kleiner Anteil der desorbierten Ionen letztlich den Massenspektrometereinlass erreicht. Ein effizienter Transfer von Ionen aus dem Probenahmebereich in den Massenspektrometer-Einlass ist daher unerlässlich. Der modifizierte FAIMS Gehäuseadapter, der in diesem Protokoll verwendet wird, bietet eine Schnittstelle zwischen der DESI-Sprühquelle und einem Thermo-Massenspektrometer und ermöglicht so die Kompatibilität mit mehreren Instrumentenmodellen, darunter Orbitrap Tribrid, Exploris und Astral-Serienplattformen. Die Integration des modifizierten FIMISS-Gehäuseadapters mit einem optischen Breadboard sorgt ebenfalls für mechanische Stabilität und minimiert so Fehlstellungen während umfangreicher Bildgebungsexperimente. Die Synchronisation zwischen Bühnenbewegung und massenspektraler Erfassung ist ebenso entscheidend, um eine hohe räumliche Auflösung zu erreichen. In DESI–MSI wird die Pixeldimension in der Scanrichtung durch die Beziehung zwischen Stufengeschwindigkeit und Aufnahmerate bestimmt, während die orthogonale Dimension durch die programmierte Schrittweite definiert ist. Eine genaue Steuerung dieser Parameter ermöglicht präzise Stichproben. Da viele Säugetierzellen typischerweise einen Durchmesser von etwa 5–20 μm haben, sind Pixeldimensionen von nur wenigen Mikrometern erforderlich, um die Signalüberlappung zwischen benachbarten Zellen zu minimieren und die Lokalisierung molekularer Merkmale in einzelnen zellulären Regionen zu verbessern. Die nominelle Pixelgröße entspricht jedoch nicht unbedingt dem tatsächlichen Stichprobenplatz, da die Wechselwirkung der Lösungsmittelfahne mit der Probenoberfläche zu lateraler Spreizung und teilweisen Signalüberlappungen zwischen benachbarten Pixeln führen kann. Gemeldete Pixeldimensionen sollten daher im Kontext einer effektiven räumlichen Auflösung und nicht strikt geometrisch interpretiert werden. Das in dieser Studie verwendete maßgeschneiderte Ionentransferröhre wurde entsprechend der Geometrie des Standard-Ionentransferrohrs entworfen, um die Ionenübertragungseigenschaften zu erhalten und gleichzeitig die Integration in die DESI-Quellkonfiguration zu ermöglichen.

Hohe Massenauflösungskraft und Massengenauigkeit durch Orbitrap-Massenspektrometer sind unerlässlich, um die komplexe Mischung aus Metaboliten und Lipiden in einzelnen Zellen aufzulösen. Viele entdeckte molekulare Merkmale wurden vorläufig mit genauen Massenmessungen und METASPACE-Analysen annotiert. Da mehrere Kandidatenzuweisungen einem einzigen gemessenen m/z-Wert entsprechen können, könnten zusätzliche MS/MS-Validierungs- und orthogonale molekulare Bestätigungsstrategien die molekulare Identifikation in zukünftigen Studien weiter stärken. Im positiven Ionenmodus werden DESI-Spektren oft von Phospholipidspezies mit eng beieinanderliegenden oder isobaren m/z-Werten dominiert. Die hochauflösende Orbitrap-Detektion ermöglicht die Differenzierung dieser Spezies, verbessert so die molekulare Spezifität und reduziert die spektrale Mehrdeutigkeit. Diese Fähigkeit ist besonders wichtig für Einzelzellanalysen, bei denen die Abhängigkeit von einer begrenzten Anzahl von Ionen zu einer Fehlinterpretation der zellulären Heterogenität führen kann. Diese Anpassungsfähigkeit legt nahe, dass ähnliche Strategien auf andere Massenspektrometrieplattformen anwendbar sein könnten, die entsprechende Schnittstellen mit entsprechenden Modifikationen verwenden. Trotz dieser Vorteile sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. Erstens ist die im aktuellen Werk verwendete DESI-Quelle nur für Nutzer mit DESI–MSI-Systemen verfügbar, und der Bau von DESI-Sprüher-/Orbitrap-Systemen könnte daher durch die Verfügbarkeit der DESI-Quellen eingeschränkt sein. Alternative DESI-Geräte, einschließlich DEFFI, können jedoch auch für hochauflösende MSI-Studien^42,47 implementiert werden. Zweitens erfordert die Implementierung dieser Plattform umfangreiche Anpassungen, einschließlich der Bearbeitung von Instrumentenschnittstellen und der Herstellung von Montagekomponenten. Diese Anforderungen können die Zugänglichkeit für Labore ohne Erfahrung in der Instrumentenentwicklung oder mechanischen Fertigung einschränken. In der aktuellen Umsetzung diente das FAIMS Schnittstellengehäuse als praktische mechanische Montageplattform zur Positionierung der DESI-Sprüheinheit relativ zum Orbitrap-Einlass. Daher ist die Umsetzung der beschriebenen Konfiguration für Labore mit Zugang zu FAIMS-kompatiblen Orbitrap-Systemen und grundlegender Bearbeitungsunterstützung praktischer. Das übergeordnete Konzept der mechanischen Kopplung von DESI-Quellen an Orbitrap-Einlässe kann jedoch mit alternativen Designs erreicht werden, ohne die FAIMS Schnittstellenhardware zu modifizieren. Drittens verbessern niedrige Lösungsmittelflussraten zwar die räumliche Einschließung, können aber auch die Gesamtionenausbeute verringern, was eine sorgfältige Optimierung zur Ausgleichsweise von Empfindlichkeit und räumlicher Auflösung erforderlich macht.

Ein weiterer wichtiger Aspekt ist das Potenzial für Analytendelokalisierung während der Probenahme. Obwohl DESI unter Umgebungsbedingungen arbeitet und keine Matrixanwendung erfordert, kann die Wechselwirkung von Lösungsmitteltröpfchen mit der Probenoberfläche zu einer Umverteilung der Analyte führen, insbesondere bei hochlöslichen Spezies. Die Minimierung des Lösungsmittelvolumens und die Optimierung der Sprühbedingungen sind daher entscheidend für die Erhaltung der räumlichen Integrität auf Einzelzellebene. Ähnlich kann das Waschverfahren mit isotonem Ammoniumformiat die salzassoziierte Ionensuppression reduzieren, während die Zellintegrität erhalten und zelluläre Spezies erhalten bleiben, wie zuvor in Einzelzell-MS-Workflows⁵ berichtet wurde.

Zukünftige Entwicklungen könnten die Leistung und Anwendbarkeit dieser Plattform weiter verbessern. Beispielsweise könnte die Integration mit schnelleren Datenerfassungssystemen kleinere effektive Pixelgrößen und höhere Durchsatz-MSI-Experimente ermöglichen. Die Implementierung automatisierter Ausrichtungssysteme oder Echtzeit-Rückkopplungssteuerung kann die Variabilität verringern und die Reproduzierbarkeit verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination dieses Ansatzes mit komplementären Techniken wie Fluoreszenzbildgebung oder gezielten Markierungsstrategien die Zelltypidentifikation verbessern und multimodale Analysen ermöglichen.

Über technische Überlegungen hinaus hat diese Plattform weitreichende Auswirkungen auf die biologische und biomedizinische Forschung. Die Fähigkeit, molekulare Profile auf Ebene einzelner Zellen unter Umgebungsbedingungen zu charakterisieren, eröffnet neue Möglichkeiten zur Untersuchung der zellulären Heterogenität in komplexen Systemen. DESI–MSI wurde bereits erfolgreich auf Gewebeebene in Studien zu Tumormikroumgebungen, neurologischen Erkrankungen, Wirts-Pathogen-Interaktionen und arzneimittelresistenten zellulären Populationen^angewandt 12,15,16,35. Die Erweiterung von DESI–MSI auf Einzelzellebene könnte die Fähigkeit weiter verbessern, lokale chemische Heterogenität zwischen benachbarten Zellen zu erkennen, seltene zelluläre Subpopulationen zu identifizieren und molekulare Marker zu entdecken, die sonst bei Massengewebemessungen verdeckt wären. Die vorliegende Studie wurde jedoch mit einem vereinfachten Monoschicht-Zellkulturmodell durchgeführt, und weitere Studien sind erforderlich, um die Kompatibilität mit anderen komplexen biologischen Systemen, darunter verschiedene Zellmodelle, Gewebe, Organoide und 3D-Kulturen, nachzuweisen. Der aktuelle Workflow könnte eine Grundlage für die Erweiterung hochauflösender DESI-Messungen auf zunehmend heterogene biologische Umgebungen nach weiterer Validierung und Optimierung bieten. Da diese Methode den räumlichen Kontext bewahrt und detaillierte molekulare Informationen liefert, kann sie als Brücke zwischen Bildgebung und Omics-basierten Ansätzen dienen. Zusammenfassend schafft dieses Protokoll einen flexiblen und anpassungsfähigen Rahmen zur Erreichung von DESI–MSI mit Einzelzellauflösung auf Orbitrap-Massenspektrometern. Indem zentrale Herausforderungen in Bezug auf Ionisationseffizienz, Ionenübertragung, räumliche Kontrolle und Massenauflösung adressiert werden, ermöglicht dieser Ansatz eine detaillierte molekulare Charakterisierung einzelner Zellen. Obwohl weitere Optimierung und Validierung erforderlich sind, bietet die Methodik eine Grundlage für die Ausweitung der Nutzung von ambient MSI in Einzelzell- und räumlichen Metabolomikstudien.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
−80 °C Gefriertruhe	Eppendorf New Brunswick	U700	Lagerung biologischer Proben vor der Vorbereitung.
6" vertikale Halterung für Breadboards, 1/4"-20 Löcher (2 Stück)	Millipore Sigma	VB01A	Mechanische Unterstützung und Stabilisierung der kundenspezifischen Sprüher-Montagebaugruppe
Acetonitril	Fisher Chemical	240744	Organisches Lösungsmittel für DESI-kompatible Lösungsmittelvorbereitung und -optimierung
Ammoniumformiat	Thermo Fisher Scientific	401152500	Herstellung eines isotonischen Ammoniumformiat-Spülpuffers für die Zellwäsche vor DESI–MSI
Hellfeldmikroskop	Fisher Scientific	12575252	Optische Bildgebung und Visualisierung von adhärenten Zellen vor der DESI–MSI-Erfassung
C18-Säule	Waters	186009259	Erzeugung des Rückdrucks in der Leitung für die stabile nano-Flow DESI-Sprühbildung
Kupferdraht	N/A	N/A	Elektrische Verbindung und Erdung während der Herstellung der Sprüher-Montage
DESI XS-Sprüher	Waters	700014033	Ambiente DESI-Ionisationsquelle für Einzelzell-DESI–MSI-Experimente
Epoxidharz	Devcon	20945	Mechanische Stabilisierung und Fixierung von kundenspezifischen Sprüher-Montagebauteilen
FAIMS Pro Elektroden-Ionenquellengehäuseadapter	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Modifikation und Herstellung der kundenspezifischen Orbitrap-kompatiblen DESI-Schnittstelle
Ameisensäure	Ward’s Science	470301-120	Säuremodifikater für die DESI-Sprühlösungsmittelvorbereitung
Methanol	Fisher Chemical	A456-4 Optima	Organisches Lösungsmittel für die DESI-Sprühlösungsmittelvorbereitung
Gasregler	Millipore Sigma	23831-U	Regulierung des Stickstoff-Sheath-Gasdrucks während des DESI-Betriebs
Rasterglasdeckglas	Ibidi	10817	Zellkulturunterlage und Positionsreferenz für die optische Bildregistrierung zur MS-Bildgebung
Erdungsdraht	N/A	N/A	Elektrische Erdung der DESI-Sprüheinheit und der Schnittstellenbaugruppe
Inkubator	HeraCell	51026282	Aufrechterhaltung von Säugerzellkulturen unter kontrollierten Temperatur- und CO2-Bedingungen
LC/MS-Grad Wasser	Thermo Fisher Scientific	W6500	Herstellung des Ammoniumformiat-Spülpuffers und der DESI-Sprühlösung
METASPACE Plattform	METASPACE	https://metaspace2020.eu	Cloudbasierte MS-Bildvisualisierung und Analyse von räumlichen Metabolomikdaten
Modifizierte FAIMS-Schnittstelle	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Kundenspezifische Schnittstelle für die Kopplung des DESI-Sprühers mit Orbitrap-Massenspektrometern
Motorisierte XYZ-Plattform	Newport Corporation	CONEX-MFACC	Gesteuerte Rasterbewegung während der DESI–MSI-Erfassung
MycoAlert PLUS Mykoplasmen-Detektionskit	Lonza	LT07-703	Routinemäßige Überwachung von Mykoplasmenkontamination in kultivierten Zellen
Nano-Flüssigkeitschromatographie-System	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	Nano-Flow-Lösungsmittelversorgungssystem für die DESI-Sprühbildung
Optisches Breadboard	Thorlabs	MB1012	Mechanische Unterstützungsplattform für DESI-Sprüher und modifizierte Schnittstellenbaugruppe
Orbitrap Fusion Lumos Massenspektrometer	Thermo Fisher Scientific	UVPD	Hochauflösendes Orbitrap-Massenspektrometer für die DESI–MSI-Datenerfassung
PEEK-Rohr	IDEX	1535	Lösungsmittelleitungsverbindung zwischen Nano-LC-System und DESI-Sprüher
Penicillin–Streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotikaergänzung für Säugerzellkulturmedium
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	VWR	0780-50L	Spüllösung für kultivierte Zellen während des Überimpfens
RPMI-1640 Medium	Gibco	11875093	Säugerzellkulturmedium für die Aufrechterhaltung von OVCAR-8-Zellen
Plattformsteuerungssoftware	Lasken Group	Version 6	Softwaresteuerung der Rasterabtastung, der Plattformbewegung und der Bilderfassungsparameter
Edelstahlrohr	MicroGroup	316H16H	Spezialgefertigtes Ionentransferrohr (1/16" OD, 0,033" ID) für die Integration der Orbitrap-Schnittstelle
Spritze, 250 µL	Hamilton	1725LTN250UL	Lösungsmittelbefüllung und nano-Flow-Lösungsmittelversorgung
Synthetisches fetales Kälberserum (FBS)	HyClone	SH3006603	Serumergänzung für die Herstellung eines vollständigen Säugerzellkulturmediums
Automatisierter TC20-Zellzähler	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	Automatisiertes Zählen kultivierter Zellen vor dem Aussäen auf Deckgläsern
Zellkulturschale, 100 mm	Fisher Scientific	FB012924	Erweiterung und Aufrechterhaltung von adhärenten OVCAR-8-Zellkulturen
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	Enzymatische Ablösung adhärenter Zellen während des Überimpfens
UV-härtendes Harz	Prime Dental	6.03	Herstellung und Stabilisierung kundenspezifischer DESI-Sprüher-Montagebauteile
Xcalibur-Software	Thermo Fisher Scientific	4.7	Gerätesteuerung, Orbitrap-Methodeneinrichtung und Massenspektralen Datenerfassung