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Methodenartikel

Etablierung eines STAT6-Reporter-Assays zum Screening von Umwelttoxikanten, die die allergische Atemwegsentzündung beeinflussen

144 Aufrufe

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DOI:

10.3791/71694

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25. August 2026

 ,  ,  ,  , 
1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung und Validierung eines stabilen STAT6-Luciferase-Reporterassays in menschlichen Atemwegsepithelzellen. Die Methode ermöglicht ein effizientes Screening von Umwelttoxinen und Bestandteilen der Luftverschmutzung, die die STAT6-Aktivität unter kontrollierten in vitro-Bedingungen modulieren.

Zusammenfassung

Die durch Luftverschmutzung verursachte allergische Atemwegsentzündung ist ein zunehmendes Problem der öffentlichen Gesundheit. Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13), die den Signaltransduktor und Transkriptionsaktivator 6 (STAT6)-Signalweg aktivieren – einen zentralen Vermittler der allergischen Atemwegsentzündung –, könnten die Atemwegstoxizität von Schadstoffen modulieren. Die vorliegende Studie beschreibt die Erzeugung und Validierung eines stabilen STAT6-Luciferase-Reporterassays in menschlichen Atemwegsepithelzellen zur Bewertung umweltbedingter Toxine, die die STAT6-Signalübertragung beeinflussen. Menschliche bronchiale Epithelzellen 16HBE14o− wurden mit einem STAT6-reaktiven Luciferase-Reporter mittels eines lentiviralen Vektors transduziert, gefolgt von der Optimierung der Puromycin-Selektion und der Multiplizität der Infektion sowie der monoklonalen Isolierung durch Grenzverdünnung. Ein stabiler Klon mit starker und reproduzierbarer Induktion über mehrere Zellpassagen hinweg wurde ausgewählt. Die Reaktionsfähigkeit des Reporters wurde durch Stimulation mit IL-4/IL-13 validiert, und die Abhängigkeit von STAT6 wurde unter Verwendung selektiver STAT6-, STAT5- und STAT3-Inhibitoren bestätigt. Die Assay-Leistung wurde mittels Z′-Faktor-Analyse quantifiziert, die eine reproduzierbare Signalabtrennung anzeigte. Darüber hinaus wurde der Assay auf einzelne Bestandteile der Luftverschmutzung angewandt, wobei Benzo[b]fluoranthen und Feinstaub die STAT6-Reporteraktivität signifikant erhöhten. Diese Methode bietet einen skalierbaren Ansatz zur Messung der STAT6-Aktivität in Atemwegsepithelzellen und zur Priorisierung umweltbedingter Toxine, die die allergische Atemwegssignalübertragung modulieren.

Einleitung

Luftverschmutzung stellt eine der dringendsten globalen Herausforderungen für die öffentliche Gesundheit dar und hat erhebliche gesundheitliche sowie sozioökonomische Auswirkungen. Derzeit wird sie als zweithäufigster Risikofaktor für Sterblichkeit eingestuft und ist für jährlich 8,1 Millionen Todesfälle verantwortlich1,2,3. Unter den Luftschadstoffen birgt feiner Partikelmatter mit einem Durchmesser von weniger als 2,5 Mikrometern (PM2,5) das größte Gesundheitsrisiko, da er tief in die Atemwege eindringen kann4,5. Eine erhöhte Exposition gegenüber PM2,5 ist eindeutig mit beeinträchtigter Lungenfunktion sowie höheren Krankenhauseinweisungsraten aufgrund von Atemwegserkrankungen verbunden6. Die Häufigkeit allergisch-entzündlicher Erkrankungen wie Asthma, allergischer Rhinitis und atopischer Dermatitis nimmt weltweit zu und ist in stark verschmutzten Megastädten überdurchschnittlich hoch4.

Allergische Atemwegserkrankungen wie atopisches Asthma werden hauptsächlich durch eine Typ-2-entzündliche Reaktion vermittelt, die durch erhöhte Spiegel der Zytokine Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sowie durch die Aktivierung des Signaltransduktor- und Transkriptionsaktivator-6-(STAT6)-Signalwegs gekennzeichnet ist7. In Atemwegs-Epithelzellen fördert die von IL-4 und IL-13 abhängige Phosphorylierung von STAT6 die übermäßige Schleimsekretion und die Störung der epithelialen Barrierefunktion, wodurch STAT6 als zentraler Vermittler der allergischen Atemwegspathologie und als relevanter therapeutischer Ansatzpunkt identifiziert wird8,9. Experimentelle Befunde aus Mausmodellen zeigen, dass die Exposition gegenüber PM2,5 und Schwefeldioxid die STAT6-Signalübertragung verstärkt und die allergische Atemwegsentzündung verschlimmert10,11. Es wurde jedoch bisher nicht systematisch untersucht, ob einzelne Bestandteile der Luftverschmutzung die transkriptionelle Aktivität von STAT6 in menschlichen Atemwegs-Epithelzellen direkt modulieren können.

Luftverschmutzung umfasst ein chemisch komplexes Gemisch aus Bestandteilen, darunter Feinstaub, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAHs), Schwermetalle und anorganische Salze, deren individuelle Beiträge zur Aktivierung von STAT6 in den Atemwegen bisher nur unzureichend bekannt sind12,13. Gängige Methoden zur Messung der STAT6-Aktivität in Atemwegs-Epithelzellen, wie Endpunkt-Phosphorylierungsassays oder auf transienter Transfektion basierende Reportersysteme, eignen sich nicht für großangelegte chemische Screening-Verfahren. Eine stabile, zellbasierte STAT6-Reporterplattform in menschlichen Atemwegs-Epithelzellen würde daher ein skalierbares Werkzeug darstellen, um Schadstoffe aus der Umwelt zu identifizieren, die allergische Signalwege in den Atemwegen beeinflussen. Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung eines stabilen STAT6-Luciferase-Reporterassays in 16HBE14o−-Atemwegs-Epithelzellen, der eine quantitative Bewertung der STAT6-Aktivierung zur systematischen Untersuchung von Umweltproben und einzelnen chemischen Toxinen ermöglicht.

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Protokoll

Die Genehmigung nach dem Humanforschungsethikgesetz ist nicht anwendbar, da diese Studie die etablierte humane Bronchialepithelzelllinie 16HBE14o− verwendete.

1. Erzeugung von 16HBE14o−-Zellen, die stabil einen STAT6-Aktivitätsreporter exprimieren

HINWEIS: Abbildung 1 gibt einen Überblick über den Arbeitsablauf.

  1. Zellkultur
    HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter Verwendung aseptischer Technik in einem Biosicherheitswerkbank der Klasse II durch. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vor der Verwendung frei von Mykoplasmenkontamination sind.
    1. Aufrechterhaltung der 16HBE14o− Zellen in Minimum Essential Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin, kultivieren. Die Zellen inkubieren bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂2und wechseln Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag.
    2. Lassen Sie die Zellen bis zu einer Konfluenz von etwa 80 % wachsen. Aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellmonoschicht einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung.
    3. Geben Sie so viel phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu, dass die Zellmonoschicht bedeckt ist, und inkubieren Sie die Zellen 20 min bei 37 °C. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung vollständig abpipettieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine 20-minütige Inkubation mit phosphatgepufferter Salzlösung, um die Auflösung der engen interzellulären Junctions dieser Zelllinie zu erleichtern. Diese Dauer stellt eine intern optimierte Modifikation dar.
    4. Geben Sie ausreichend 0,25%ige Trypsin-Ethylenendiamintetraessigsäure-Lösung zu, um die Zellmonoschicht zu bedecken. Inkubieren Sie die Zellen 10 min bei 37 °C.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Zellablösung mit einem umgekehrten Lichtmikroskop. Klopfen Sie bei Bedarf vorsichtig auf das Kulturgefäß, um die Ablösung zu erleichtern.
    5. Geben Sie etwa fünf Volumina vollständiges Kulturmedium im Verhältnis zum Volumen der Trypsin-Ethylenendiamintetraessigsäure-Lösung hinzu, um die enzymatische Aktivität zu beenden. Pipettieren Sie die Suspension vorsichtig, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.
    6. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 300 × g 5 min bei 25 °C.
    7. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in frischem Kulturmedium. Pipettieren Sie die Suspension vorsichtig mehrmals auf und ab und überprüfen Sie unter einem invertierten Lichtmikroskop, ob eine Einzelzell-Suspension vorliegt.
    8. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Zellkonzentration auf die für das nachfolgende Experiment erforderliche Dichte ein. Verwenden Sie ein übliches Aufteilungsverhältnis von 1:8.
      HINWEIS: Siehe Zusatz-Tabelle 1 und Zusatz-Tabelle 2 für die Wachstumsflächen der Kulturgefäße und die entsprechenden Volumina an phosphatgepufferter Kochsalzlösung und Trypsin–Ethylenendiamintetraessigsäure-Lösung.
  2. Bestimmung der Puromycin-induzierten Zytotoxizität
    HINWEIS: Wählen Sie das Antibiotikum entsprechend dem Resistenzgen aus, das durch den lentiviralen Konstrukt kodiert wird.
    1. Pflanzen Sie die 16HBE14o-Zellen− Zellen bei 2 × 104 Zellen pro Vertiefung in einer 96-Vertiefungs-Kulturplatte enthaltend 100 µL pro Gut mit vollständigem Kulturmedium. Die Zellen über Nacht inkubieren.
    2. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium, das Puromycin in Endkonzentrationen von 0,5, 1, 2 oder 4 µg/mL. Bereiten Sie separate Platten für die Zeitpunkte von 24, 48 und 72 Stunden vor.
    3. Hinzufügen 5 µL des Zellzählreagenz zu jedem Well. Inkubieren Sie die Platte 1 h bei 37 °C.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen in den Vertiefungen, da diese die Absorptionsmessungen stören können.
    4. Messen Sie die Extinktion bei 450 nm unter Verwendung von 650 nm als Referenzwellenlänge. Schütteln Sie die Platte unmittelbar vor der Aufnahme der Extinktion im Endpunktmodus 15 s lang.
    5. Berechnung der Zellviabilität14 unter Verwendung von Gleichung 1.
      Formel zur Zellviabilität, OD450-650 für Proben, Kontrolle, Leerwert; Formel zur Bioassay-Analyse.
      wobei:
      Absorbanzgleichung OD450-650, Subtraktionsmethode, verwendet in der Spektrophotometrie, Formel
      Formel für die optische Dichte (OD450-650) zur Absorptionsanalyse in Spektroskopieexperimenten.
      Gleichung zur optischen Dichte, OD450-650blank = OD450blank - OD650blank, zur spektroskopischen Datenanalyse.
      HINWEIS: Definieren Sie die Kontrolle als unbehandelte Zellen und die Leerprobe als zellfreies Medium, das das Assay-Reagenz enthält. Wählen Sie die niedrigste Puromycin-Konzentration, die die nicht-transduzierten Zellen innerhalb von 48–72 h vollständig eliminiert.
  3. Bestimmung der optimalen Infektionsmultiplizität
    ACHTUNG: Lentivirale Partikel müssen unter Bedingungen der Sicherheitsstufe 2 in einer registrierten Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2 und gemäß den institutionellen Vorschriften zum Bioschutz gehandhabt werden. Alle Arbeiten mit dem Virus sind in einem Sicherheitswerkbank der Klasse II durchzuführen. Viruskontaminierte Verbrauchsmaterialien und Verschüttungen sind vor der Entsorgung als biohazardöser Abfall mindestens 1 Stunde lang mit 10 %iger Bleichlauge abzudecken.
    HINWEIS: Optimieren Sie die Multiplizität der Infektion, da sie die Transduktionseffizienz direkt beeinflusst.
    1. Berechnen Sie das erforderliche Volumen der Lentivirus-Stammlösung15 unter Verwendung von Gleichung 2.
      Formel zur Berechnung der Multiplikationsfaktor (MOI), Verhältnis von Viruspartikeln zu Zielzellen, Gleichung der Molekularbiologie.
      wobei:
      Formel für die funktionelle Virus-Titerbestimmung, T_Virus = TFU/mL, Gleichung zur Datenanalyse in der Virologieforschung.
      Virusvolumen-Gleichung, V_Virus=Virusvolumen in mL, Formel, Virologiestudie, Berechnungsmethode
      Statisches Gleichgewicht, Gleichung: N_Zellen = Anzahl der Zielzellen, Diagramm für bildungswissenschaftliche Forschungszwecke.
      HINWEIS: Die funktionelle Titerkonzentration des in diesem Protokoll verwendeten STAT6-Luciferase-Reporter-Lentivirusstamms betrug 5 × 107 transduzierende Einheiten/mL. Für 2 × 104 Zielzellen entspricht ein MOI von 20 einer 8 µL pro Gut. Das Volumen des Virus sollte für Viruspräparationen mit unterschiedlichen Titer neu berechnet werden.
    2. Pflanzen Sie die 16HBE14o-Zellen− Zellen bei 2 × 104 Zellen pro Vertiefung in einer 96-Loch-Platte mit weißer Beschichtung und klarem Boden enthaltend 100 µL pro gut abgepuffertem Kulturmedium. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht, bis sie eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen.
    3. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium mit 5 µg/mL Polybrene und STAT6-Luciferase-Reporter-Lentivirus mit MOIs von 1, 5, 10 und 20. Einschließen eines nicht transduzierten Kontrollansatzes ohne Lentivirus.
      HINWEIS: Berechnen Sie das für jedes MOI erforderliche Lentivirusvolumen anhand der funktionellen Titerbestimmung der Stammlösung.
    4. Inkubieren Sie die Zellen mit den Lentivirenpartikeln für 48 h. Ersetzen Sie das Transduktionsmedium durch frisches Kulturmedium und inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 h.
    5. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium, das jeweils 10 ng/mL Interleukin-4 und Interleukin-13 enthält. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.
    6. Hinzufügen 25 µL des Luciferase-Assay-Reagenz zu jedem Brunnen16Schützen Sie die Platte vor Licht und inkubieren Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur.
    7. Platte 20 s linear schütteln. Lumineszenz im Endpunktmodus mittels Vollplattenmessung und einer Verstärkungseinstellung von 120 messen.
      ACHTUNG: Messen Sie die Lumineszenz innerhalb von 1 h nach Zugabe des Luciferase-Assay-Reagenz, um das maximale Signal zu erfassen. Befolgen Sie die Sicherheits- und Handhabungshinweise des Reagenzherstellers.
      HINWEIS: Verwenden Sie denselben Multimode-Mikroplattenreader und dieselben Aufnahmeeinstellungen für alle Absorptions- und Lumineszenzmessungen.
  4. Selektion transduzierter Zellen
    1. Pflanzen Sie die 16HBE14o-Zellen− Zellen bei 2 × 105 Zellen/mL in einer 24-Loch-Kulturplatte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.
    2. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium, das das STAT6-Luciferase-Reporter-Lentivirus mit einem MOI von 20 enthält, und 5 µg/mL Polybrene. Die Zellen 48 h inkubieren.
    3. Ersetzen Sie das Transduktionsmedium durch frisches Kulturmedium. Inkubieren Sie die Zellen weitere 24 h.
    4. Kulturmedium abpipettieren und frisches Medium hinzufügen, das 1 µg/mL Puromycin. Inkubieren Sie die Zellen für 5 Tage und erneuern Sie das Selektionsmedium alle 2 Tage.
    5. Führen Sie die Puromycin-Selektion fort, bis alle Zellen in der nicht-transduzierten Mock-Kontrollmulde eliminiert sind.
      HINWEIS: Warten Sie mindestens 24 Stunden nach der Transduktion, bevor Sie die Antibiotikaselektion durchführen, um die Expression des Resistenzgens zu ermöglichen.
  5. Isolierung einzelner Zellklone durch limitierende Verdünnung
    1. Trennen und zählen Sie die mit Puromycin selektierten STAT6-Reporterzellen. Bereiten Sie eine Einzelzell-Suspension mit 5 Zellen/mL durch serielle Verdünnung vor.
      HINWEIS: Verhindern Sie Zellagglomeration während der Verdünnung. Leiten Sie die Suspension bei Bedarf durch einen Zellfilter.
    2. Abgeben 200 µL der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Loch-Kulturplatte, um eine durchschnittliche Dichte von etwa einer Zelle pro Vertiefung zu erreichen.
    3. Untersuchen Sie jedes Well unter dem umgekehrten Mikroskop innerhalb von 24 Stunden und identifizieren Sie Wells, die eine einzelne Zelle enthalten. Schließen Sie Wells aus, die mehr als eine Zelle oder mehrere räumlich getrennte Zellfoki enthalten.
    4. Überwachen Sie die ausgewählten Wells während der ersten Woche, um das klonale Wachstum zu bestätigen. Ersetzen Sie das Kulturmedium alle 3 Tage.
    5. Vermehren Sie jeden Klon in der ursprünglichen 96-Well-Platte etwa 20 Tage lang oder bis die Zellen Konfluenz erreichen. Überführen Sie jeden Klon nacheinander in eine 6-Well-Platte und anschließend in einen T-25-Kulturgefäßkolben.
      HINWEIS: Kultivieren Sie die Zellen in der 6-Loch-Platte etwa 6 Tage lang, bevor Sie sie in den T-25-Flasche überführen, oder überführen Sie sie, sobald sie die geeignete Konfluenz erreicht haben.
      PAUSE-PUKT: Setzen Sie die Klonvermehrung fort oder kryokonservieren Sie die Klone bei 1 × 106 Zellen pro Vial in 1 ml Kryokonservierungsmedium, das 90 % fetalen Rinderserum und 10 % Dimethylsulfoxid enthält.
    6. Pflanzen Sie jeden erweiterten Klon mit 2 × 105 Zellen/mL in einer 96-Loch-Weißplatte mit klarem Boden. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.
    7. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium, das jeweils 10 ng/mL IL-4 und IL-13 enthält. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h.
    8. Bestimmen Sie die Luciferase-Aktivität wie in den Schritten 1.3.6–1.3.7 beschrieben. Vergleichen Sie die induzierte Reporteraktivität zwischen den einzelnen Klonen.
    9. Wiederholen Sie den Luciferase-Assay über steigende Zellpassagen. Wählen Sie Klone aus, die über die Passagen hinweg eine konsistente, zytokininduzierte Reporteraktivität aufweisen.
      HINWEIS: Klon 3 wurde aufgrund seiner geringen basalen Lumineszenz und seiner Fähigkeit ausgewählt, über mehrere Serien von Passagen hinweg ein konsistentes, zytokininduziertes Aktivierungssignal aufrechtzuerhalten.

2. Etablierung und Validierung des STAT6-Aktivitäts-Reporter-Assays

HINWEIS: Abbildung 2 gibt einen Überblick über den Arbeitsablauf.

  1. Validierung des STAT6-Aktivitäts-Reporter-Assays
    1. Pflanzen Sie die STAT6-Reporterzellen mit 2 × 105 Zellen/mL in eine 96-Well-Platte mit weißem, klarem Boden unter Verwendung von je 100 µL vollständigem Kulturmedium pro Well. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.
    2. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium, das IL-4 und IL-13 in Endkonzentrationen von jeweils 10 ng/mL enthält. Fügen Sie gleichzeitig die selektiven Inhibitoren wie folgt hinzu: 100 nM AS1517499 (STAT6-Inhibitor), 2,5 µM AC-4-130 (STAT5-Inhibitor) oder 2,5 µM Stattic (STAT3-Inhibitor).
    3. Führen Sie eine Fahrzeugkontrolle mit 0,1 % Dimethylsulfoxid (DMSO) ein. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h.
    4. Bestimmen Sie die Zellviabilität mithilfe des Zellzähltests, wie in den Schritten 1.2.3–1.2.5 beschrieben.
    5. Messen Sie die Luciferase-Aktivität, wie in den Schritten 1.3.6–1.3.7 beschrieben.
    6. Normalisieren Sie das Lumineszenzsignal jedes Wells anhand der entsprechenden Zellviabilität. Geben Sie die normalisierten Werte relativ zur cytokinbehandelten Kontrollgruppe an.
      HINWEIS: Eine verminderte Zellviabilität kann das Luciferase-Signal unabhängig von der STAT6-Aktivität verringern. Interpretieren Sie die Reporteraktivität erst, nachdem Sie eine akzeptable Zellviabilität bestätigt haben.
  2. Beurteilung der Assay-Robustheit
    1. Beurteilen Sie die Assay-Robustheit, indem Sie den Z′-Faktor anhand von 21 Wiederholungswells für die positiven und negativen Kontrollgruppen berechnen.
    2. Berechnen Sie den Z′-Faktor mithilfe von Gleichung 3.
      Gleichgewichtsgleichung im statischen Zustand, Z-Faktor-Formel, mathematischer Ausdruck zur Qualitätskontrolle im Assay.
      wobei:
      Gleichgewichtsgleichung im statischen Zustand, σₚ bezeichnet die Standardabweichung in der Kontrolle, veranschaulichende Formel für den Unterricht.
      Standardabweichungsformel, σn, verwendet in der statistischen Analyse zur Genauigkeit der Negativkontrolle.
      Gleichung μ<sub>p</sub>=Mittelwert-Signal der Positivkontrolle; Konzept der statistischen Datenanalyse.
      Statisches Gleichgewicht, Gleichung μn= Mittelwert-Signal der Negativkontrolle, pädagogische Analyse.
      HINWEIS: Ein Z′-Faktor zwischen 0,5 und 1,0 zeigt an, dass der Assay für Hochdurchsatz-Screenings geeignet ist.

3. Anwendung des STAT6-Reporter-Assays zum Screening umweltbedingter Toxikantien

ACHTUNG: Polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe und Schwermetallsalze sind als toxisch und potenziell karzinogen einzustufen. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, führen Sie alle Arbeiten in einer zertifizierten chemischen Abzugshaube durch und entsorgen Sie kontaminierte Materialien gemäß den internen Vorschriften für gefährliche Abfälle.

  1. Screening auf umwelttoxische Substanzen
    1. Seede die STAT6-Reporterzellen mit 2 × 105 Zellen/mL in eine 96-Well-Platte mit weißem Boden und klarem Untergrund, wobei pro Vertiefung 100 µL vollständiges Kulturmedium verwendet werden. Inkubiere die Zellen über Nacht.
    2. Ersetze das Kulturmedium durch frisches Medium, das jede Testverbindung in der gewünschten Endkonzentration enthält (für dieses Protokoll 10 µM), und behandle die Zellen in Abwesenheit von IL-4 und IL-13.
    3. Stelle eine Negativkontrollgruppe mit 0,1 % Dimethylsulfoxid und eine Positivkontrollgruppe mit jeweils 10 ng/mL IL-4 und IL-13 bei. Inkubiere die Zellen 24 Stunden lang.
    4. Bestimme die Zellviabilität mithilfe des Zellzähltests, wie in den Schritten 1.2.3–1.2.5 beschrieben.
    5. Messe die Luciferase-Aktivität, wie in den Schritten 1.3.6–1.3.7 beschrieben.
    6. Normalisiere das Lumineszenssignal jedes Wells entsprechend dem jeweiligen Wert der Zellviabilität. Drücke das normalisierte Ergebnis relativ zur Negativkontrollgruppe aus.
    7. Ausschluss von Verbindungen, die die Zellviabilität unter 80 % senken, bei der Interpretation der STAT6-Reporteraktivität.
      HINWEIS: Behandle Reporter-Signale, die unter zytotoxischen Bedingungen erhalten wurden, als unzuverlässig, da eine verminderte Zellviabilität die Lumineszenz unabhängig von der STAT6-Signalwegaktivität beeinflussen kann.

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Ergebnisse

Um die optimale Puromycin-Konzentration für die stabile Selektion zu bestimmen, wurden die ursprünglichen 16HBE14o−-Zellen mit steigenden Puromycin-Konzentrationen (0,5–4 µg/mL) behandelt, und die Zellviabilität wurde nach 24, 48 und 72 h mittels eines Zellviabilitätsassays bewertet. Puromycin verringerte die Zellviabilität dosis- und zeitabhängig, wobei alle Konzentrationen die Viabilität nach 48–72 h auf unter 20 % senkten (Abbildung 3). Eine Konzentration von 1 µg/mL war die ni...

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Diskussion

Die IL-4/IL-13–JAK–STAT6-Signalübertragung ist nicht nur ein wichtiges therapeutisches Ziel, sondern auch ein zentraler Treiber der Pathogenese allergischer Erkrankungen, einschließlich Asthma und allergischer Rhinitis22. Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen, auf stabiler Zelllinie basierenden Reporterassey zur Identifizierung von Modulatoren der STAT6-Aktivität. Der Assay kann zur Bewertung der STAT6-modulierenden Wirkung einer breiten Palette umweltbedingter Substanzen eingesetzt werden u...

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Offenlegungen

Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Nationalen Forschungsrat von Thailand (NRCT) (Zuschussnummer N42A680388) unterstützt, und dieses Forschungsprojekt wird von der Mahidol-Universität (Strategischer Forschungsfonds: 2025) (Zuschussnummer 35) gefördert. Die Abbildungen 1 und 2 wurden mit BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h) erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTAGibco25200072Reagenz zur Zelldissoziation
Kegel-Zentrifugenröhrchen, 15 mLCorningCLS430791Steriles Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen
16HBE14o- menschliche bronchiale epitheliale ZelllinieGeschenk von Dr. Nawiya Huipao (Prince of Songkla University, Thailand) und Prof. Dr. Dieter C. Gruenert (University of California San Francisco, USA)RRID:CVCL_0112Menschliche bronchiale epitheliale Zelllinie (Passagen 35–40); mykoplasmafrei bestätigt und behält differenzierte Atemwegs-Epithel-Morphologie und Barriereeigenschaften. Referenz: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
24-Loch-Platte, klar, flachbodig, zellkulturbehandeltCorning3527Zellkulturplatte
6-Loch-Platte, klar, flachbodig, zellkulturbehandeltCorning3516Zellkulturplatte
96-Loch-Mikrotiterplatte, klar, flachbodig, aus Polystyrol, zellkulturbehandeltCorning3599Platte für Zellviabilitätsassay
96-Loch-Mikrotiterplatte, weiß, klarbodig, aus Polystyrol, zellkulturbehandeltCorning3610Platte für Lumineszenzassay
AC-4-130 (STAT5-Inhibitor)MedChemExpressHY-124500Selektiver STAT5-Inhibitor
AS1517499 (STAT6-Inhibitor)MedChemExpressHY-100614Selektiver STAT6-Inhibitor
Benzo[b]fluoranthenAccuStandardH-128NPolycyclisches aromatisches Kohlenwasserstoff
Biologischer Sicherheitswerkbank, Klasse IINuaireNU-543-400EFür aseptische Zellkulturverfahren
Cadmiumchlorid (CdCl2)Sigma202908Schwermetallverbindung
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301Zellviabilitätsassay
Zellkulturgefäß, 25 cm² (T-25)Corning430639Gefäß für Gewebekultur
CO2-InkubatorNuaireNU-5710EGehalten bei 37 °C, 5 % CO2, feuchter Atmosphäre
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaD2650Lösungsmittel (endgültige Konzentration 0,1 %) und Kryoschutzmittel (10 %)
Fötales Rinderserum (FBS)SigmaF7524Mediumzusatz (10 %) und Kryokonservierungsmedium (10 %)
HämozytometerBOECOBOE14Manuelle Zellzählung
Invertiertes Phasenkontrast-LichtmikroskopZEISSPrimovertBeobachtung der Zellmorphologie
Luciferase-Assay-System (ONE-Step)BPS Bioscience60690Luciferase-Reporterassay
Quecksilberchlorid (HgCl2)Sigma215465Schwermetallverbindung
MikroplattenreaderBioTekSynergy Neo2Multimode-Mikroplattenreader/Luminometer, gesteuert durch Gen5-Software (v3.08.01). Absorption bei 450 nm mit Referenz bei 650 nm nach 15–20 s linearem Schütteln gemessen. Lumineszenz im Endpunktmodus mit Detektorverstärkung von 120 nach 20 s linearem Schütteln gemessen.
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Gibco11095-080Grundmedium für die Zellkultur
Nickelsulfat (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203Schwermetallverbindung
Partikulater Stoff (PM)National Institute of Standards and TechnologySRM 2975Standardreferenzmaterial für partikulare Stoffe
Penicillin-Streptomycin (100×)Gibco15140122Antibiotikazusatz (endgültige Konzentration 1 %)
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco18912014Spülpuffer
PolybreneSigmaTR-1003-GVerstärker der lentiviralen Transduktion
PuromycinMedChemExpressHY-B1743AAntibiotikum zur stabilen Zellselektion
Rekombinanter humaner IL-13Thermo Fisher ScientificA42526Zytokin zur Stimulation
Rekombinanter humaner IL-4Thermo Fisher ScientificA42602Zytokin zur Stimulation
STAT6-Luciferase-Reporter-LentivirusBPS Bioscience78799Lentiviraler Reporterkonstrukt; Stammtiter 5 × 107 TFU/mL
Stattic (STAT3-Inhibitor)MedChemExpressHY-13818Selektiver STAT3-Inhibitor

Referenzen

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  2. Thailand Pollution Control Department. Air Quality Assessments for Health and Environment Policies in Thailand. Thailand Pollution Control Department; Bangkok; 2018.
  3. Health Effects Institute. State of Global Air Report 2024. Available at: https://www.stateofglobalair.org/resources/report/state-global-air-report-2024
  4. State of Global Air. Trends in Air Quality and Health Impacts: Insights from Central, South, and Southeast Asia. 2025. Available at: https://www.stateofglobalair.org/
  5. Shi X. Acute effects of air pollution on human health in China: Evidence and prospects. China CDC Wkly. 2021;3(45):941-942.
  6. Tsai YG, et al. Long-term PM2.5 exposure impairs lung growth and increases airway inflammation in Taiwanese school children. ERJ Open Res. 2025;11(4).
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