Herstellung von membranproteinfunktionalisierten Polymeren und Polymer/Lipid-Hybriden großen und riesigen unilamellen Vesikeln

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die detergent-vermittelte Rekonstitution eines Membranproteins, Cytochrom-Bo3-Ubicinoloxidase, in große unilamellare Vesikel aus PDMS-g-PEO und deren Umwandlung in riesige Vesikel mittels Fusions-Elektroformation. Die daraus resultierenden funktionalen polymerbasierten Kompartimente sind für fortgeschrittene biochemische und biophysikalische Studien geeignet.

Zusammenfassung

Vesikel, die aus amphiphilen Copolymeren bestehen, allein oder mit Phospholipiden gemischt, bieten eine überlegene mechanische und chemische Stabilität im Vergleich zu herkömmlichen Lipidvesikeln. Dies macht sie zu einem attraktiven Chassis, das weiterentwickelt und erweitert werden kann, um spezifische Anwendungen wie Arzneimittelabgabe, diagnostisches Biosensorik, den Bau künstlicher Zellen und bioinspirierte Mikro- und Nanoreaktoren zu ermöglichen. Insbesondere ist die Funktionalisierung durch Membranprotein-Einbau für viele dieser Anwendungen unerlässlich. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung von membran-proteinfunktionalisierten großen unilamellaren Vesikeln (LUVs) aus dem Graft-Copolymer PDMS-g-PEO mittels detergent-vermittelter Rekonstitution. Außerdem beschreiben wir, wie diese großen Vesikel mithilfe eines Fusions-Elektroformationsansatzes in riesige unilamelläre Vesikel (GUV) umgewandelt werden können. Das Protokoll umfasst die Fluoreszenzkennzeichnung von Membranproteinen, die Herstellung von Polymer- und Hybrid-LUVs, die Rekonstitution von Membranproteinen, die Analyse der Größenverteilung mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS), die Bewertung der Proteinaktivität mittels Sauerstoffverbrauchsmessungen, die Herstellung von proteinfunktionalisierten GVs sowie die Analyse der Proteineinschleusung und Protonenpumpaktivität in GUVs mittels Konfokalmikroskopie. Repräsentative Ergebnisse zeigen die Bildung monodisperser Proteo-LUVs mit einem Polydispersitätsindex (PDI) unter 0,2 sowie die erfolgreiche Erzeugung von Proteo-GUVs mit einem Durchmesser von 5–35 μm. Die Proteinaktivität wird durch Sauerstoffverbrauchsmessungen sowohl in Polymer-LUVs (18,2 nmol/min/mL) als auch in hybriden LUVs (26,9 nmol/min/mL) bestätigt. Die Proteineinfügung in GUVs wird durch Fluoreszenzintensität quantifiziert, was 20,6 ± 3,7 a.u. für Polymer-GUVs und 26,2 ± 5,0 a.u. für hybride GUVs ergibt. Die Protonenpumpaktivität in GUVs, überwacht mit einem kapselten, pH-sensitiven Farbstoff, entspricht der Proteinfunktionalität, wobei das Einwärtspumpen von Protonen vorherrscht. Die mechanische Weichheit des Copolymers und die lipidähnliche Doppelschichtdicke (~5,3 nm) unterstützen eine effiziente Proteineinfügung und Funktionserhaltung.

Einleitung

Amphiphile Blockcopolymere können sich in wässriger Lösung zu Membranen selbst zusammensetzen, die sich spontan krümmen und sich schließen, um kugelförmige, membranumschlossene Kompartimente zu bilden, die als Polymersomen (Polymervesikel) bekannt sind. Im Vergleich zu Lipidmembranen bieten polymerbasierte Kompartimente eine erhöhte chemische Vielseitigkeit sowie verbesserte chemische¹ und mechanische Stabilität², was sie für Anwendungen wie Arzneimittelabgabe, Nano- und Mikroreaktoren sowie den Bau langlebiger künstlicher Zellen äußerst attraktiv macht. Sowohl unsere Gruppe als auch andere haben Polymermembranen funktionalisiert, indem sie Membranproteine eingesetzt haben, um künstliche Organellen und Zellen zu erzeugen: 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Polymere, die einen poly(dimethylsiloxan) (PDMS) hydrophoben Kern enthalten, eignen sich besonders gut für die Einbindung von Membranproteinen aufgrund der hohen Kettenflexibilität und der Möglichkeit, die hydrophobe Dicke der Membran besser an die Transmembrandomäne⁵ des Proteins anzupassen. Während unser Labor sich hauptsächlich auf das Graft-Copolymer poly(dimethylsiloxan)-graft-poly(ethylenoxid) (PDMS-g-PEO) konzentriert hat, das hochdynamische Membranen ^4,16,17 bildet, die weicher als herkömmliche Lipiddoppelschichten sind und eine Dicke von etwa 5,3 nm¹ aufweisen, haben andere Gruppen erfolgreich PDMS-basierte Triblock-Copolymere wie PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA⁵ eingesetzt^,6,7,8,9,10,11 und PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹² zur Membranprotein-Rekonstitution. Sogar vergleichsweise starre Diblock-Copolymere wie PBD-b-PEO, insbesondere in hybriden Systemen, die mit Lipiden gemischt sind, wurden für eine erfolgreiche Proteineinbindung¹³ eingesetzt. Diese Beispiele verdeutlichen die Vielseitigkeit polymerbasierter Membranen als Rekonstitutionsplattformen, die zudem eine verbesserte chemische Stabilität¹ und eine verlängerte funktionelle Lebensdauer¹⁴ für integrierte Membranproteine bieten können. Obwohl Polymer-/Lipid-Hybridmembranen nicht immer die chemische Stabilität reiner Polymersysteme¹ erreichen, bieten sie einen attraktiven Kompromiss, indem sie die mechanische Robustheit von Polymeren mit der biologischen Bedeutung von Lipiden verbinden. Dies führt zu einer Membranumgebung, die den natürlichen biologischen Membranen näher ähnelt und gleichzeitig die wichtigsten Vorteile synthetischer Materialien bewahrt. Solche hybriden Architekturen können zusätzliche Vorteile bieten, darunter eine reduzierte Protonenpermeabilität, die durch die nanoskalige^{Umlagerung 1} und die Domänenbildung innerhalb der^{Membran 15} entsteht.

Es existieren mehrere Techniken zur Rekonstituierung von Membranproteinen in nanosizeden Vesikeln (LUVs), darunter organisch-lösungsmittelvermittelte Rekonstitution (z. B. Umkehrphasenverdunstung, Rehydratierung von Lipid-Protein-Filmen), mechanische Ansätze (z. B. Sonikation, French Press, Gefrier-Tau) und detergent-vermittelte Rekonstitution (durch Reinigungsmittelentfernung, Verdünnung oder direkte Einbau)¹⁸ sowie neuere Strategien wie der direkte Transfer von Styrol-Maleinsäure-Copolymer-Nanodiscs¹⁹. Während Porine erfolgreich in Polymer-LUVs durch direkte Einfügung integriert wurden, zum Beispiel durch Zugabe des Proteins an den Polymerfilm während der Rehydratation⁸. Dieser Ansatz führt in der Regel zu einer geringen Einfügungseffizienz bei größeren oder komplexeren Membranproteinen und führt oft zu einer zufälligen Proteinorientierung. Folglich bleibt die detergent-vermittelte Rekonstitution, bei der gezielt Waschmittel hinzugefügt und anschließend entfernt wird, die am weitesten verbreitete Methode. Es ist auch die bevorzugte Strategie, größere Membranproteine in polymerbasierte LUVs einzubauen, insbesondere bei asymmetrischen Proteinen, bei denen eine kontrollierte Orientierung für die Funktion entscheidend ist. Bei diesem Ansatz werden die Membranen von Vesikeln zunächst mit dem bevorzugten Waschmittel gesättigt (die sättigbare Reinigungskonzentration wird als R_sat) bezeichnet), teilweise löslich (Koexistenz von Vesikeln und Mizellen) oder vollständig löslich, d. h. in Mizellen zerlegt (Waschmittelkonzentration wird als R_sol bezeichnet). Diese erste Membranbehandlung wird dann von der Proteinzufuhr, Inkubation und der Entfernung des Waschmittels¹⁸ gefolgt. Letzteres kann durch Dialyse, Größenausschlusschromatographie oder Adsorption auf hydrophobe Polystyrolperlen (z. B. Bio-Beads) erreicht werden. Die Wahl des Waschmittels, seine Konzentration und die Entfernungsmethode werden für jeden Membrantyp und jedes Protein optimiert, um die Einbaueffizienz zu maximieren und die Proteinorientierung^zu steuern.

Während LUVs gut für Massenaktivitätsmessungen geeignet sind, erfordern Einzelvesikel-Studien und optische mikroskopische Analysen, dass Membranproteine zu riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) rekonstituiert werden. Fünf Hauptansätze werden für die Proteineinbindung in GUVs verwendet: Koformation in Anwesenheit von Protein und organischem Lösungsmittel²¹, Koformation in Anwesenheit eines Waschmittels²², Einfügung in vorgefertigte GUVs mittels Detergent-Verdünnung²³, Einfügung durch Membranfusion mit Proteo-LUVs^16,24 und Fusion-Elektroformation²⁵. Obwohl diese Ansätze erfolgreich auf Lipid-GUVs angewendet wurden, ist ihr Transfer auf Polymer- oder Polymer/Lipid-Hybrid-GUVs oft eine Herausforderung. Insbesondere führen Koformations- und Reinigungs-Verdünnungsmethoden häufig zu geringen Einfügungswirkungsgraden in Polymermembranen oder sind mit bestimmten Polymerzusammensetzungen nicht kompatibel¹⁵. Fusionsbasierte Strategien 4,16,24,26,27, die auf zusätzliche fusogene Substanzen setzen, können ebenfalls problematisch sein, da synthetische kationische Lipide/Polymere oder fusogene Peptide die Stabilität des Membranproteins beeinträchtigen, die Membraneigenschaften verändern oder die Einbaueffizienz des Zielproteins verringern können. Die Fusionselektroformation überwindet viele dieser Einschränkungen und hat sich als robuste und effiziente Methode zur Integration von Membranproteinen in Polymer- und Polymer/Lipid-Hybrid-GUVs ^1,5,15 erwiesen. Dieser Ansatz ermöglicht eine kontrollierte Proteineinbindung bei gleichzeitiger Erhaltung der Membranintegrität und Proteinfunktionalität, was es besonders geeignet für die Erzeugung von proteinfunktionalisierten Polymer-GUVs macht.

Die Rekonstituierung von Protonenpumpen in polymerbasierte Vesikel ist entscheidend für den Aufbau langlebiger künstlicher Zellen, da sie die Erzeugung transmembraner Protonengradienten ermöglicht – der fundamentalen Energie-Währung lebender Systeme. Durch die Nachbildung der chemiosmotischen Energieumwandlung in einer kontrollierten Minimalmembranumgebung^können diese Vesikel die ATP-Synthese, den aktiven Transport und die Stoffwechselreaktionen antreiben und so die energetische Grundlage schaffen, die für eine autonome, lebensnahe Funktionalität erforderlich ist. Eine repräsentative Protonenpumpe, die in solchen Systemen verwendet wird, ist die Cytochrom-Bo3-Oxidase aus E. coli, einem terminalen respiratorischen Enzym, das Sauerstoffreduktion mit Protonentranslokation über die Membran koppelt. Da Elektronentransfer und Protonenpumpung eng gekoppelt sind, kann ihre Aktivität in synthetischen Vesikeln quantitativ entweder durch Sauerstoffverbrauch ^1,20 oder durch Verfolgung der Protonengradientenbildung¹ überwacht werden.

In diesem Protokoll präsentieren wir einen detaillierten Arbeitsablauf für die Herstellung von PDMS-g-PEO-basierten LUVs, einschließlich reiner Polymer- und Polymer/Lipid-Hybridmembranen, deren Funktionalisierung mit Membranproteinen, der Skalierung auf GUVs sowie Aktivitätsmessungen der rekonstituierten Protonenpumpen-Cytochrom-bo3-Oxidase sowohl durch Massen-Sauerstoffverbrauchs-Assays als auch Einzelvesikel-Protonenpumpmessungen.

Protokoll

HINWEIS: Alle während dieses Protokolls entstandenen gefährlichen chemischen Abfälle müssen gemäß institutionellen und lokalen Vorschriften entsorgt werden.

1. Vorbereitung für Bio-Beads SM-2

HINWEIS: Bio-Beads SM-2 werden mit Methanol vorgewaschen, um Konservierungsstoffe und organische Verunreinigungen vor der Desorption des Waschmittels zu entfernen.

1. Legen Sie das Filterpapier in einen Glastrichter, der über einem sauberen Glasbecher oder -kolben positioniert ist.
2. Fügen Sie mindestens 600 mg Bio-Beads SM-2 in den Trichter hinzu (ausreichend für drei Wiederholungen der Rekonstitution bei Hybrid- und Polymer-LUVs).
   HINWEIS: Mindestens 90 mg Bio-Beads SM-2 sind pro Rekonstitution erforderlich, wie in Schritt 4.4.1 angegeben. Eine größere Menge kann vorbereitet werden, wenn weitere Rekonstruktionen geplant sind.
3. Waschen Sie die Perlen dreimal mit reinem Methanol und verwenden Sie genug Volumen, um die Perlen jedes Mal vollständig einzutauchen.
   VORSICHT: Führen Sie alle Methanol-Handhabungsschritte in einer chemischen Abzugshaube durch.
4. Waschen Sie die Perlen sofort dreimal mit Milli-Q-Wasser, um den Rest von Methanol zu entfernen.
   HINWEIS: Lassen Sie die Perlen während des Waschvorgangs nicht austrocknen. Beim Entfernen der Waschmittel sollten Sie darauf achten, dass die Perlen feucht bleiben und nicht vollständig austrocknen.
5. Füllen Sie die gewaschenen Perlen in einen geeigneten Aufbewahrungsbehälter (z. B. ein steriles 50-mL-Polypropylen-Zentrifugenrohr oder eine Glasflasche mit fest verschlossenem Deckel), geben Sie Milli-Q-Wasser, bis die Perlen vollständig untergetaucht sind, und lagern Sie bis zu 3 Monate bei 4 °C.

2. Fluoreszenzkennzeichnung von Membranproteinen

1. Proteinverdünnung
   1. Zytochrom _bo3-Oxidase auf 2,2 mg/mL in einem 20 mM HEPES-Puffer auflösen, der 0,05 % n-Dodecyl β-D-Maltosid (DDM) (w/v), pH 8,3 enthält. Dieser pH-Wert sorgt für einen ausreichenden Anteil unprotonierter (reaktiver) primärer Amine für eine effiziente Markierung.
      HINWEIS: Für eine optimale Markierung mit ATTO N-Hydroxysuccinimidyl (NHS)-Farbstoffen halten Sie den Puffer-pH-Wert zwischen 8,3 und 8,5. Für andere Farbstoffe folgen Sie den Anweisungen des Herstellers zur Proteinkonjugation, einschließlich der empfohlenen Etikettierungsbedingungen.
2. Farbstoffzugabe
   1. Fügen Sie der Proteinlösung einen achtfachen molaren Überschuss an aminreaktivem ATTO 643 N-Hydroxysuccinimidyl (NHS) Ester, gelöst mit 2 mg/mL in wasserfreiem DMSO, hinzu.
      HINWEIS: Für andere Farbstoffe befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Proteinkonjugation, einschließlich des empfohlenen Farbstoff-zu-Protein-Molar-Überschusses.
   2. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Mikrozentrifugenrohr dreimal anklopfen, um eine homogene Verteilung des Farbstoffs zu gewährleisten.
3. Inkubation
   1. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur (20–25 °C) 1,5 Stunden lang unter sanftem Rühren (250 U/min) in einem Thermomixer, im Dunkeln, um Photobleaching zu verhindern.
4. Entfernung des ungebundenen Farbstoffs
   1. Gleiche die Superdex 200 10/300 GL-Säule (CV: 23,562 mL) mit mindestens 2 Spaltenvolumen (ca. 48 mL) Membranprotein-Eluationspuffer (20 mM HEPES, pH 7,5, 200 mM KCl, 0,05% DDM (w/v)) bei einer Durchflussrate von 0,3 mL/min mit einem ÄKTA-Reinigungssystem aus.
      HINWEIS: Zur Entfernung überschüssigen fluoreszierenden Farbstoffs reichen kürzere Gelfiltersäulen (10–20 cm Bettlänge) in der Regel aus, insbesondere bei weniger hydrophilen Farbstoffen. Der Farbstoffhersteller empfiehlt das Entsalzen mit einer Sephadex G-25-Matrix. In dieser Studie wurde aufgrund der Verfügbarkeit des Instruments eine Superdex 200 10/300 GL-Säule verwendet.
   2. Lade bis zu 500 μL des markierten Proteins mit einer 1-mL Kapillarschleife auf und eluere mit demselben Puffer bei 0,3 mL/min.
   3. Überwachen Sie die Elution, indem Sie die Absorption bei 280 nm für Protein und 643 nm für ATTO 643 Farbstoff messen.
   4. Sammeln Sie 0,5 ml Fraktionen über 1,5 Spaltenvolumen. Identifizieren Sie Fraktionen, die sowohl Protein als auch Farbstoff enthalten. Verwenden Sie direkt bei ausreichender Konzentration oder konzentrieren Sie sie mit Amicon Zentrifugalfiltereinheiten. Für die Konzentration mit Amicon-Filtern verwenden Sie einen Zentrifugalfilter mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 30 kDa und zentrifugieren Sie mit 14.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C.
5. Bestimmung der Proteinkonzentration und des Grads der Markierung (DOL)
   1. Misse die Absorptionsspektren des gereinigten Konjugates.
   2. Berechnen Sie die Proteinkonzentration und die durchschnittliche Anzahl der Farbstoffmoleküle pro Enzym mit:
      
      wobei A_max die Absorption des Konjugierten am Farbstoffabsorptionsmaximum (λ_abs; ATTO 643, λ = 643 nm), A₂₈₀ ist die Absorption bei 280 nm (Absorptionsmaximum von Proteinen), ε_Prot ist der molare Extinktionskoeffizient des denaturierten Cytochrom-Bo3-Oxidases (184.720 M⁻¹cm⁻¹), ε_Farbstoff ist der molare Extinktionskoeffizient des Farbstoffs (150.000 M⁻¹cm⁻¹), und CF₂₈₀ ist der Korrekturfaktor für die ATTO-643-Absorption bei 280 nm (0,04).

3. Vorbereitung großer unilamellärer Vesikel (LUVs)

1. Herstellung von dünnem Polymer oder Polymer/Lipidfilm
   1. Verwenden Sie Verdrängungspipetten mit lösungsmittelbeständigen Spitzen oder gasdichte Glasspritzen, um Polymer-, Lipid- und fluoreszierende Farbstofflösungen, die in Chloroform:methanol (2:1, v/v) gelöst sind, gemäß den in Tabelle 1 aufgeführten Zusammensetzungen in ein sauberes Glasfläschchen zu übertragen.
      VORSICHT: Führen Sie alle Lösungsmittel unter einer Abzugshaube mit Schutzhandschuhen und Schutzbrillen durch.
   2. Mischen Sie die Lösung gründlich durch sanftes Vortexen und halten Sie das Fläschchen aufrecht, um die Homogenität zu gewährleisten.
      VORSICHT: Stellen Sie die Wirbelgeschwindigkeit sorgfältig ein, um zu verhindern, dass die Flüssigkeit spritzt oder aus dem Fläschchen auf Ihre Hände spritzt.
   3. Verdampfen Sie die organischen Lösungsmittel etwa 1 Stunde lang unter einem sanften Stickstoffstrom in der Dampfhaube, bis sich ein gleichmäßiger Dünnfilm an der Fläschchenwand bildet (Abbildung 1).
      HINWEIS: Stellen Sie den Stickstofffluss so an, dass die Flüssigkeit sich sanft bewegt, ohne zu spritzen; Ein zu hoher Fluss kann zu ungleichmäßiger Filmbildung führen. Nach 5–10 Minuten kann der Durchfluss leicht erhöht werden, um eine vollständige Trocknung und gleichmäßige Verbreitung der Vesikelmischung entlang des Fläschchenbodens zu gewährleisten.
2. Filmrehydration
   1. Rehydratieren Sie den getrockneten Film mit 1 ml Rehydrationspuffer (1 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM Saccharose), um eine endgültige Amphiphilkonzentration von 5 mg/mL zu erhalten (entsprechend 1,67 mM für Polymersomen und 2,14 mM für hybride Vesikel). Wenn Polymersomen zur Rekonstitution verwendet werden, ergänzen Sie den Rehydrationspuffer mit 0,1 % Natriumcholat.
      VORSICHT: Natriumcholat ist ein leichter Reizstoff. Vermeiden Sie längeren Hautkontakt und das Einatmen von Pulver. Führen Sie gemäß dem Sicherheitsdatenblatt (SDS) des Herstellers.
   2. Vortexen energisch, bis der Film vollständig abgelöst und aufgehängt ist, wodurch multilamellare Vesikel (MLVs) entstehen.
3. Frost-Tau-Zyklen (nur Hybridvesikel)
   1. Hybride MLV-Suspensionen werden fünf Gefrier-Tau-Zyklen wie folgt unterzogen: Die Proben für 1 Minute in flüssigem Stickstoff einfrieren, sie in einem 35 °C Wasserbad auftauen, bis sie vollständig geschmolzen sind, und 3000 U/min 30 Sekunden lang mit einem Rohrschüttler vortexen. Wiederholen Sie dieses Verfahren insgesamt fünf Zyklen.
      HINWEIS: Überspringe diesen Schritt für reine Polymersome.
      VORSICHT: Flüssigstickstoff (−196 °C) kann schwere kryogene Verbrennungen verursachen. Führen Sie sie in einem gut belüfteten Bereich mit geeigneter PSA (kryogene Handschuhe, Schutzbrille und Laborkittel). Vermeiden Sie Kontakt mit Haut und Augen.
4. Extrusion
   1. Übertragen Sie die Vesikelsuspension auf einen Mini-Extruder, der mit einer 100 nm porengroßen Polycarbonatmembran ausgestattet ist.
   2. Die Suspension 21 Mal extrudieren, um größenhomogene LUVs zu erhalten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der letzte Extrusionstritt die LUV-Suspension in der Spritze gegenüber der initialen Ladespritze zurücklässt. Dies minimiert die Kontamination der Endprobe mit größeren Vesikeln oder Restmaterial, das möglicherweise nicht vollständig durch die Membran gegangen ist.
5. Lagerung
   1. Lagern Sie die LUV-Suspension bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb einer Woche, um die Verteilung der Vesikelgröße aufrechtzuerhalten und Aggregation oder mikrobielles Wachstum im saccharosehaltigen Puffer zu verhindern.
   2. Vor der Anwendung wird die LUV-Suspension vorsichtig durch Vortex homogenisiert.

4. Rekonstituierung des Membranproteins in LUVs

1. Vorbehandlung von Vesikeln mit Waschmittel
   1. Übertragen Sie 200 μL LUVs in ein 2-mL Mikrozentrifugenrohr (Abbildung 1). Bei Verwendung von Hybrid-LUVs wird 1 μL 20 % (w/v) Natriumcholat hinzugefügt, um eine endgültige Waschmittelkonzentration von 0,1 % (w/v) zu erhalten. Bei Verwendung von Polymer-LUVs ist kein zusätzliches Waschmittel erforderlich, da bereits Natriumcholat vorhanden ist.
      HINWEIS: Bereiten Sie das Waschmittel im gleichen Puffer vor, der für die Experimente verwendet wurde, um die Kompatibilität mit den Vesikeln sicherzustellen.
   2. Vorsichtig mischen, indem du das Mikrozentrifugenrohr dreimal leicht anklopfst. Vermeiden Sie starkes Umrühren oder Wirbeln, da Schaum entstehen und Luftblasen entstehen können.
2. Einführung von Protein in detergentisch behandelte Vesikel
   1. Geben Sie Cytochrom-bo-3-Oxidase (für Aktivitätsmessungen) oder Cytochrom-bo-3-Oxidase–ATTO 643 (für Fluoreszenzbildgebung) zu den detergentisch destabilisierten Vesikeln, um folgende Endproteinkonzentrationen zu erreichen: für Polymersomen, 0,556 μM für LUV-Experimente und 1,112 μM für GUV-Experimente; für hybride Vesikel, 0,714 μM für LUV-Experimente und 1,428 μM für GUV-Experimente.
      HINWEIS: Diese Konzentrationen entsprechen einem Protein-zu-Polymer-Molarverhältnis von 1:3.000 für LUVs und 1:1.500 für GUVs.
   2. Fügen Sie das Protein langsam hinzu und mischen Sie es vorsichtig, mit dem Ziel, es gleichmäßig über die Lösung zu verteilen und eine lokale Überkonzentration zu vermeiden.
      HINWEIS: Das Volumen des zugesetzten Proteins kann je nach Fraktion aufgrund von Unterschieden in der Proteinkonzentration variieren.
3. Zusammensetzung von Protein-Detergent-Polymer-Komplexen
   1. Inkubieren Sie das Gemisch bei 4 °C für 30 Minuten mit leichtem Rühren (400 U/min) in einem Thermomixer, um die Bildung von gemischten Protein-, Reinigungsmittel-Polymer-Baugruppen vor der Entfernung des Reinigungsmittels zu ermöglichen.
4. Waschmittelentfernung
   1. Entfernen Sie Waschmittel durch sequentielles Hinzufügen von Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad). Entfernen Sie 30 mg Bio-Beads aus der Aufbewahrungslösung und sorgen Sie dafür, dass sie feucht bleiben (nass, aber ohne überschüssige Flüssigkeit). Fügen Sie die Perlen zur Probe hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 4 °C mit sanftem Rühren bei 600 U/min in einem Thermomixer. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal weiter, insgesamt 90 mg Bio-Beads und eine Gesamtinkubationszeit von 1,5 Stunden.
      HINWEIS: Verwenden Sie nur vollständig hydrierte Bioperlen. Übertragen Sie keine trockenen Perlen, die an den Wänden des Bio-Beads-Lagerrohrs haften, oder Perlen, die an der Oberfläche schwimmen. Wenn Perlen nach der Zugabe an der Wand des Rekonstituierungs-Reaktionsrohrs oberhalb des Flüssigkeitsniveaus haften, zentrifugieren Sie das Rohr kurzzeitig (z. B. 3–5 s in einer Minizentrifuge auf der Werkbank), um die Perlen am Boden vor der Inkubation zu sammeln.
   2. Pelletiere die Bio-Beads durch Zentrifugation bei 2.000 × g für 2 Minuten mit einer Mini-Zentrifuge auf der Werkbank. Sammeln Sie das Supernatant vorsichtig auf, ohne das Perlenpellet zu stören.
      HINWEIS: Als Alternative zur Zentrifugation lassen Sie die Perlen etwa 5 Minuten durch die Schwerkraft absinken und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstandsmittel.
5. Lagerung
   1. Rekonstituierte Bo 3-LUVs bei 4 °C aufbewahren und am selben Tag für Proteinaktivitätsmessungen verwenden.

5. Größe und Dispersität von LUVs durch dynamische Lichtstreuung (DLS)

1. Laden von LUVs für DLS-Messungen
   1. Übertragen Sie 45 μL unverdünnte LUV- oder Proteo-LUV-Federung in eine saubere Quarzcuvette. Stellen Sie sicher, dass die Cuvette frei von Staub, Fingerabdrücken oder anderen Rückständen ist, um Lichtstreuungsartefakte zu minimieren.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen, da diese die DLS-Messungen beeinträchtigen können. Um Blasen zu vermeiden, pipettieren Sie die Probe langsam entlang der Cuvettewand und stoßen Sie den letzten Tropfen nicht kräftig aus. Wenn sich kleine Blasen bilden, lassen Sie sie vor der Messung aufsteigen und sich auflösen.
2. Bestimmung der LUV-Größe und -Dispersität mittels DLS
   1. Messung des hydrodynamischen Durchmessers und des Polydispersitätsindex (PDI) mit einem DLS-Instrument, das mit einem 633 nm Helium-Neon-Laser und Rückstreudetektion bei einem festen Winkel von 173° ausgestattet ist.
   2. Führen Sie mindestens drei unabhängige Messungen pro Probe durch, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
   3. Analysieren Sie die Daten mit dem allgemeinen (Normalverteilungs-)Modell, um die durchschnittliche Größe und den PDI zu erhalten.

6. Analyse des Sauerstoffverbrauchs bei LUVs

1. Temperaturanordnung
   1. Stellen Sie die Messkammer eines Clark-Typ-Sauerstoffelektrodensystems auf 22 °C ein und lassen Sie das System ausgleichen.
2. Hinzufügung eines Puffers
   1. Fügen Sie 1 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM Saccharosepuffer zur Messkammer hinzu, sodass ein Gesamtvolumen von 1.000 μL erreicht wird. Das Puffervolumen entsprechend dem Probentyp angepasst: 942,9 μL für Polymer Bo3-LUVs und 953,7 μL für Hybridbo3-LUVs.
      HINWEIS: Das verbleibende Volumen wird von LUVs und dem DTT/Q₁-Gemisch belegt, um das endgültige Messvolumen zu erreichen.
3. Hinzufügung von LUVs
   1. Fügen Sie bo 3-LUVs in die Messkammer hinzu und beginnen Sie mit dem Magnetrührer sanft mit dem magnetischen Rührer bei 100 U/min und 22 °C. Stellen Sie das Volumen der Bo3-LUVs an, um eine theoretische Bo-3-Oxidase-Konzentration von etwa 27 nM zu erreichen: 48,6 μL für Polymer-Bo-3-LUVs und 37,8 μL für Hybrid-Bo3-LUVs.
      HINWEIS: Für die negative Kontrolle ersetzen Sie bo 3-LUVs durch ein äquivalentes Volumen proteinfreier LUVs derselben Lipid-/Polymerzusammensetzung und -konzentration. Alle folgenden Schritte bleiben identisch.
4. Basismessung
   1. Lassen Sie die Sauerstoffkonzentration stabilisieren und messen Sie 3 Minuten lang unter konstantem Rühren bei 22 °C, um eine stabile Basislinie zu erhalten.
5. Herstellung einer reduktionsgebenden/Chinon-Mischung
   1. Frisch bereiten Sie die DTT/Q₁-Mischung unmittelbar vor der Verwendung vor, indem Sie 9,6 μL 1 M DTT in Milli-Q-Wasser mit 0,6 μL 80 mM Ubichinon-1 (Q₁) in DMSO mischen und anschließend gründlich vortexen, um die Homogenität sicherzustellen.
6. Enzymaktivierung
   1. Aktivieren Sie die Bo-3-Oxidase durch Zugabe von 8,5 μL des frisch hergestellten DTT/Q₁-Gemisch zur Messkammer, was zu den Endkonzentrationen von 8 mM DTT und 40 μM Q₁ führt.
7. Replikationen
   1. Missen Sie jede Probe dreimal, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
8. Datenanalyse
   1. Plotte die Sauerstoffkonzentration gegen die Zeit. Bestimme die Steigung des linearen Teils der Kurve, die der Sauerstoffverbrauchsrate entspricht.
9. Berichterstattung
   1. Geben Sie die Sauerstoffverbrauchsrate als Durchschnitt von drei Messungen mit Standardabweichung an.

7. Herstellung proteinfunktionalisierter GUVs

1. Plasmareinigung von ITO-beschichteten Glasträgern
   1. Setze Indiumzinnoxid (ITO)-beschichtete Glasschlitten in den Plasmareiniger, wobei die leitfähige (ITO-beschichtete) Seite nach oben zeigt. Plasma reinigt sie für 1 Minute bei hoher Leistungseinstellung ("HI") (230 V, maximal HF-Leistung 18 W) und einem Druck von etwa 0,5 mbar.
      HINWEIS: Eine erfolgreiche Plasmazündung kann visuell durch das Erscheinen eines rosa/violetten Leuchtens im Inneren der Kammer bestätigt werden.
2. Partielle Dehydration von Proteo-LUVs
   1. Mischen Sie 20 μL proteinfreie LUVs mit 20 μL Proteo-LUVs, die rekonstituierte Bo3-Oxidase-ATTO 643 enthalten. Vortex vortexen, um eine homogene Mischung zu gewährleisten.
   2. Geben Sie sieben 2-μL-Tröpfchen der resultierenden 5 mg/mL LUV/proteo-LUV-Suspension auf die leitfähige (ITO-beschichtete) Oberfläche jedes für die Elektroformation verwendeten Objektträgers ab (Abbildung 2A). Verteilt man die Tröpfchen gleichmäßig über die 160,6 mm^2-Fläche , wobei man sie getrennt hält, um eine gleichmäßige Filmbildung zu fördern.
      HINWEIS: Für andere Polymersysteme können die LUV-Konzentration und das Tröpfchenvolumen einer Optimierung bedürfen (typischer Bereich: 5–100 mg/mL LUVs; 0,2–2 μL Tröpfchen).
   3. Lassen Sie die Tröpfchen etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur (∼22 °C) und ∼20 % Luftfeuchtigkeit teilweise dehydrieren, oder bis sich am Tropfenrand ein weißer Ring bildet (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Die Austrocknung hängt von der Umgebungsfeuchtigkeit ab. Wenn die relative Luftfeuchtigkeit über 40 % liegt, verlängern Sie die Enttrocknungszeit nach Bedarf (bis zu 20 Minuten). Bestimmen Sie den Endpunkt anhand des Auftretens eines weißen Rings am Rand des Tröpfchens und nicht auf einer festen Zeit. Unter beständigen Umweltbedingungen (Temperatur und Luftfeuchtigkeit) ist die erforderliche Austrocknungszeit reproduzierbar. Vermeiden Sie Übertrocknung, was sich als komplett flache, gleichmäßig weiße Tröpfchen zeigt, da dies zu einer Proteinausfällung führen kann.
3. Montage der Elektroformationskammer
   1. Bauen Sie die Elektroformationskammer zusammen, indem Sie zwei ITO-beschichtete Schlitten (beschichtete Seiten, die nach innen zeigen), getrennt durch einen 1,81 mm dicken Silikonabstandshalter mit einem Ausschnitt auf einer Seite, der es ermöglicht, während des Befüllens und Sammelns Puffer hinzuzufügen oder zu entfernen.
   2. Füllen Sie die Kammer mit einem Rehydrationspuffer (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM Saccharose).
      Für pH-empfindliche Experimente wird 10 μM Pyranin (8-Hydroxypyren-1,3,6-Trisulfonsäure-Trinatriumsalz, HPTS) zum Puffer hinzugefügt.
4. Elektroformation
   1. Wenden Sie ein sinusförmiges, wechselndes elektrisches Feld mit folgendem Programm an: 50 Hz bei 50, 100, 200, 300, 500, 700 und 900 mV jeweils 6 Minuten; 50 Hz bei 1,1 V für 2 Stunden.
      HINWEIS: Um die Bildung größerer Proteo-GUVs zu fördern, kann dieser Schritt auf 12 Stunden verlängert werden, und 4 Hz bei 2 V für 30 Minuten für den Ablösungsschritt. Wenn der Puffer 10 μM Pyranin enthält, wird die Frequenz während der ersten beiden Spannungssteigerungen auf 500 Hz erhöht.
5. Sammlung von GUVs
   1. Öffnen Sie die Kammer vorsichtig mit einer Pinzette und sammeln Sie die GUVs mit FineTip Ultra-Micro Pastette-Pipetten (oder gleichwertigen Pipetten mit geringer Scherung), um mechanische Belastungen zu minimieren.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Standard-Pipettenspitzen mit geringem Volumen unter 200 μL, da diese größere GUVs platzen lassen können. Alternativ können Standardspitzen am Ende abgeschnitten werden, um die Öffnung zu verbreitern und die Scherung während der Sammlung zu verringern.
6. Lagerung
   1. Lagern Sie Proteo-GUVs bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb von 48 Stunden, um die Proteinaktivität zu erhalten.
      HINWEIS: Die Rate des Aktivitätsverlusts hängt vom Typ und der Stabilität des rekonstituierten Membranproteins sowie von der Zusammensetzung der Membran ab.

8. Mikroskopie proteinfunktionalisierter GUVs

1. Mikroskop-Aufbau
   1. Schalte das Konfokalmikroskop ein. Wenn Sie das Leica-System verwenden, starten Sie die LAS X-Software. Für andere Mikroskopmarken verwenden Sie die vom Hersteller empfohlene Akquisitionssoftware.
   2. Wählen Sie ein 63× Öltauchobjektiv (NA 1,40); Passen Sie bei Bedarf eine höhere oder niedrigere Vergrößerung an, abhängig von der Größe des GUV.
   3. Öffnen Sie zwei bildgebende Kanäle, die den Fluorophoren entsprechen: Rhodamin Red (Membran) und ATTO 643 (rekonstituiertes Protein).
      HINWEIS: Für Fluorophore mit teilweise überlappenden Spektren wählen Sie geeignete Laserlinien und schmale Detektionsfenster aus, um spektrales Übersprechen zu minimieren. Erfassen Sie jeden Kanal sequentiell, um das Durchfließen des Signals zu verhindern und eine genaue Fluoreszenzquantifizierung sicherzustellen.
2. Sedimentation von GUVs
   1. Legen Sie einen Press-to-Seal Silikonisolator auf einen sauberen Glasabdecker Nr. 1,5 (0,17 mm Dicke).
      HINWEIS: Für aufrechte (nicht invertierte) Mikroskope können dickere Glasobjektträger verwendet werden.
   2. Pipette 60 μL Puffer (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM Glukose) in die Mitte des Abstands.
   3. Füge vorsichtig 20 μL GUV-Federung auf den Puffer hinzu.
   4. Decken Sie die Kammer sofort mit einem zweiten Glasdeckelverschluss ab, um Verdunstung zu vermeiden.
   5. Lassen Sie die GUVs vor der Bildgebung ~5 Minuten absinken.
3. Bildaufnahme
   1. Konzentriere dich auf den Boden der Kammer, um Querschnitte von GUVs zu erfassen.
   2. Aufnehmen Sie Bilder verschiedener GUVs in der gesamten Kammer, indem Sie systematisch von oben links bis unten rechts scannen ("Schlangen"-Muster), um eine repräsentative Population (~100 GUVs) zu erhalten. Bilden Sie alle während des Scans ohne Vorselektion auftretenden Vesikel ab, unabhängig von Größe oder Fluoreszenzintensität, um Selektionsverzerrung zu vermeiden und die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Bildgebung desselben GUV, um Photobleaching zu verhindern.
4. Bildanalyse
   1. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität eines rekonstituierten ATTO-643-markierten Proteins, indem Sie eine Polyline entlang der Membran einzelner GUVs zeichnen. Wenn Sie die LAS X-Software verwenden, wählen Sie Quantify → Line Profile, wählen Sie dann das Polyline-Werkzeug und zeichnen Sie die Membran jedes GUV nach. Um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität zu erhalten, öffnen Sie Statistics und notieren Sie den Mittelwert. Analysieren Sie nur saubere, unilamellare GUVs; schließen multivesikulare und aggregierte Vesikel aus der Analyse aus.
      HINWEIS: Wenn Messungen an verschiedenen Tagen erfasst werden, sollten die Fluoreszenzintensitäten auf die Laserleistung normalisiert werden, gemessen unter identischen Bildeinstellungen (Wellenlänge und Nennleistung). Um die täglichen Schwankungen der Laserausgabe zu berücksichtigen, wird folgende Normalisierung angewendet: , wobei F_a.u. die gemessene Fluoreszenzintensität in beliebigen Einheiten ist, P_die am Referenztag gemessene Laserleistung und die am Tag der Erwerbung gemessene Laserleistung ist. Diese Korrektur setzt eine lineare Beziehung zwischen Laserleistung und Fluoreszenzintensität unter nicht-sättigenden Beleuchtungsbedingungen aus. In der vorliegenden Studie wurden alle Bilder am selben Tag aufgenommen, sodass eine Normalisierung nicht erforderlich war.
   2. Berichte die Fluoreszenzintensität als Durchschnitt von 100 GUVs mit entsprechender Standardabweichung.

9. Protonenpumpanalyse in Proteo-GUVs

1. Mikroskop-Aufbau
   1. Schalten Sie das konfokale Mikroskop ein und starten Sie die entsprechende Erfassungssoftware (z. B. LAS X für Leica-Systeme).
   2. Wählen Sie ein 63× Ölimmersionsobjektiv (NA 1,40). Passen Sie bei Bedarf eine höhere oder niedrigere Vergrößerung ein, abhängig von der Größe des GUV.
   3. Konfigurieren Sie drei Bildgebungskanäle, die den Fluorophoren entsprechen. Für Rhodamin Rot (Membranmarker) verwenden Sie eine Anregung von 561 nm und einen Emissionsbereich von 570–620 nm. Für Pyranin (ein kapseltes, pH-empfindliches Farbstoff) werden Anregungen bei 448 nm und 405 nm verwendet und die Emission über 499–551 nm gesammelt.
      HINWEIS: Wenn ein 458-nm-Laser verfügbar ist, verwenden Sie ihn anstelle von 448 nm, um die deprotonierte (basische) Form von Pyranin anzuregen.
   4. Passen Sie die Laserleistung und den Detektorverstärkung an, um Pixelsättigung zu vermeiden und Photobleaching zu minimieren. Halte die Erwerbseinstellungen während des gesamten Experiments konstant.
2. Sedimentation von GUVs
   1. Fügen Sie 280 μL Puffer (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM Glukose) zu einem Brunnen eines 8-Bohrloch-Objektträgers hinzu (Gesamtbohrlochvolumen: ~874 μL).
      HINWEIS: Verwenden Sie nicht weniger als 200 μL, da Volumina unter 200 μL die Verdunstung und die pH-Drift erhöhen. Überschreiten Sie 400 μL nicht, um Verschüttungen zu vermeiden und ein angenehmes Pipettern zu gewährleisten. Wenn du ein anderes Kammerformat verwendest, passe die Lautstärke entsprechend an. Für invertierte Mikroskope verwenden Sie Kammer-Objektträger, die mit der Deckungsdicke #1,5H kompatibel sind.
   2. Füge vorsichtig 20 μL der bo-3-GUV-Federung auf den Puffer hinzu, ohne Luftblasen zu erzeugen.
      HINWEIS: Für die Negativkontrolle wird die bo-3-GUV-Suspension durch ein äquivalentes Volumen (20 μL) proteinfreier GUVs derselben Lipid-/Polymerzusammensetzung ersetzt, die unter identischen Bedingungen vorbereitet und sedimentiert wurden. Diese Kontrolle berücksichtigt etwaige unspezifische Effekte von DTT und Q1_{auf das} Pyranin-Fluoreszenzverhältnis, die unabhängig von der Aktivität der Bo3-Oxidase.
   3. Lassen Sie die GUVs etwa 5 Minuten vor der Bildgebung sedimentieren.
3. Baseline-Übernahme
   1. Konzentrieren Sie sich auf die untere Ebene der Kammer, in der sich die GUVs abgesetzt haben.
   2. Zoomen Sie an, um 3–6 GUVs im Sichtfeld zu erhalten.
   3. Zeichnen Sie die Basisfluoreszenz in allen Kanälen für 5 Minuten vor der Aktivierung auf.
4. Aktivierung der Protonenpumpung
   1. Bereiten Sie unmittelbar vor der Verwendung eine frische DTT–Q₁-Mischung vor, indem Sie 4,8 μL 1 M DTT mit 0,3 μL 80 mM Q₁ in DMSO mischen und anschließend gründlich durch Vortex mischen.
   2. Aktivieren Sie die Cytochrom-bo3-Oxidase, indem Sie vorsichtig 2,6 μL des DTT–Q₁-Gemisch auf die Oberfläche der Lösung geben, ohne die Pipettenspitze in den Puffer einzusetzen, was zu den Endkonzentrationen von etwa 8 mM DTT und 40 μM Q₁ in der Kammer führt.
   3. Überwachung der intravesikulären Pyraninfluoreszenz für 30 Minuten unter kontinuierlicher Aufnahme.
5. Analyse der intravesikulären Pyraninfluoreszenz
   1. Für jedes GUV definieren Sie ein Interessengebiet (ROI) innerhalb des Vesikellumens. In der LAS X-Software gehen Sie zu Quantify → Stack Profile, wählen Sie Ellipse zeichnen und zeichnen Sie innerhalb jedes GUV eine kreisförmige ROI.
   2. Um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität bei 499–551 nm für beide Anregungswellenlängen (448 nm und 405 nm) zu bestimmen, öffnen Sie Statistik in der Software und notieren Sie den Mittelwert.
   3. Berechnen Sie das Fluoreszenzverhältnis als R = I₄₄₈/I₄₀₅.
   4. Plotte das Verhältnis über die Zeit, um kinetische Spuren einer intravesikulären pH-Veränderung zu erhalten.

Ergebnisse

Die E. coli Cytochrom _bo3 Oxidase wurde aus dem Plasmid pETcyo im E. coli-Stamm C43 (DE3) ΔcyoABCDE exprimiert und wie zuvor beschrieben^gereinigt. Gereinigte Bo-3-Oxidase wurde entweder direkt für Rekonstitutions- und Aktivitätsmessungen verwendet oder mit fluoreszierenden Farbstoffen wie ATTO 643 (diese Studie) oder anderen ATTO-Farbstoffen ^1,15 markiert. Für hochhydrophile Farbstoffe wie ATTO 643 wurde eine 30 cm lange Säule verwendet, um eine effiziente Trennung des ungebundenen Farbstoffs vom markierten Protein zu erreichen (Abbildung 3A). Der Grad der Markierung (DOL), berechnet aus Absorptionsspektren, lag typischerweise zwischen 1,1–1,3 Farbmolekülen pro Enzym, abhängig vom verwendeten ATTO-Farbstoff. Für Bo-3-Oxidase, die mit ATTO 643 markiert ist, war der DOL 1,16 (Abbildung 3B).

Für die Proteinrekonstitution wurden LUVs zunächst mittels Dünnschichtrehydrierung vorbereitet, gefolgt von Gefrier-Tau-Zyklen und Extrusion, um gleichmäßige Vesikelgrößen zu erhalten. Bei Polymersomen wurde der Rehydrationspuffer mit Reinigungsmittel ergänzt. Die Größenverteilungen der Vesikel wurden vor der Rekonstitution durch dynamische Lichtstreuung analysiert (Abbildung 4, Tabelle 2). Sowohl hybride als auch polymere LUVs wiesen typischerweise durchschnittliche Durchmesser von 85–95 nm mit schmalen Größenverteilungen (PDI < 0,2) auf. PDMS-g-PEO-basierte Vesikel sollen etwas kleiner sein als die nominale Porengröße der Extrusionsmembran. Typische Polymersomen zeigten sehr einheitliche Größen, mit PDI-Werten unter 0,1, während hybride Vesikel relativ einheitliche Populationen bildeten, deren PDI-Werte gelegentlich über 0,1, aber konstant unter 0,2 lagen.

Das Membranprotein _bo3-Oxidase wurde anschließend in Anwesenheit von Waschmittel (in dieser Studie Natriumcholat) in LUVs eingebracht. Das Waschmittel wurde anschließend mit Bio-Beads entfernt. Nach der Rekonstitution nahm die Größe des Polymersums nur geringfügig an (Abbildung 4A), während die Größe der hybriden Vesikel unverändert blieb (Abbildung 4B). In beiden Systemen wurde ein kleiner Anstieg des PDI beobachtet (Tabelle 2). Solche geringfügigen Größenänderungen sind zu erwarten, da detergent-vermittelte Löslichkeit und Entfernung die Polymerketten in der Membran neu organisieren können. Die Proteinaktivität wurde durch Messung des Sauerstoffverbrauchs bewertet, was zeigt, ob das Protein die funktionelle Aktivität behielt (Abbildung 5A). Das Fehlen des Sauerstoffverbrauchs in der proteinfreien LUV-negativen Kontrolle bestätigt, dass das beobachtete Signal speziell aus der Aktivität von Bo3-Oxidase stammt. Bei der natriumcholatvermittelten Rekonstitution bei den hier verwendeten Konzentrationen war die Proteinaktivität in Hybridvesikeln typischerweise etwas höher als in Polymersomen (Abbildung 5B). Zwischen Reinigungschargen und sogar zwischen Fraktionen innerhalb derselben Charge wurde eine gewisse Variabilität in der Proteinaktivität beobachtet. Daher sollte für vergleichende Studien – wie zum Vergleich der Proteinaktivität in verschiedenen Membransystemen – derselbe Anteil gereinigtes Proteins verwendet werden, um Konsistenz sicherzustellen.

Um proteinfunktionalisierte PDMS-g-PEO- und PDMS-g-PEO/Soja-PC-GUVs zu erzeugen, wurde ein Fusions-Elektroformationsansatz angewandt. Bei dieser Methode wurden Proteo-LUVs mit proteinfreien LUVs gemischt und auf ITO-beschichtete Glasobjektträger deponiert, gefolgt von einer partiellen Dehydrierung, um die Vesikelfusion und die Bildung eines Polymers/Proteins oder eines Polymer-/Lipid-/Proteinfilms zu fördern. Unzureichende Dehydration führte zu geringer Proteo-GUV-Ausbeute, kleinerer GUV-Größe und dem Vorhandensein von nicht fusionierten (Proteo-)LUVs.

Die erfolgreiche Einbindung des markierten Proteins bo₃ Oxidase–ATTO 643 in die Membran wurde durch Konfokalmikroskopie bestätigt, nachdem die GUVs in einem Saccharose-/Glukosedichtegradient abgelagert wurden (Abbildung 6A, B). Die Quantifizierung membranassoziierter Fluoreszenz mit einem einfachen Linienprofil kann verzerrt werden, da die gemessene Intensität vom Winkel abhängt, in dem die Linie gezogen wird. Um diesen Effekt zu minimieren, wurde die Fluoreszenzintensität mittels einer Polyline bewertet, die entlang der gesamten Membrankontur jedes GUV gezeichnet wurde.

Um mögliche Korrelationen zwischen Vesikelgröße und Proteineinbau zu bewerten, wurde der GUV-Durchmesser parallel analysiert (Abbildung 6C, D). Größere GUVs (über 20 μm) wiesen typischerweise eine niedrigere membranassoziierte Proteinfluoreszenz auf im Vergleich zu kleineren Vesikeln. Diese Beobachtung könnte dem Fusions-Elektroformationsmechanismus zugeschrieben werden: Kleinere Vesikel bilden sich früher und können Proteine effizienter integrieren, während größere Vesikel durch nachfolgende Fusionsereignisse und Membranwachstum entstehen, was potenziell zur Verdünnung mit proteinarmem Material führen kann.

Die gesamte Proteinaufnahme wird hauptsächlich in der früheren Phase der Rekonstitution in LUVs bestimmt, insbesondere durch die Art des Waschmittels, die Konzentration und den Schritt, in dem es zugesetzt wird. Bei Polymer-LUVs wurde eine etwas geringere Einbindung beobachtet, wenn Reinigungsmittel zu vorgeformten Vesikeln hinzugefügt wurde im Vergleich zur Addition während der Vesikelbildung (Rehydrationsschritt), was zu Fluoreszenzintensitäten von 18,9 ± 3,9 a.u. bzw. 20,6 ± 3,7 a.u. führte (Abbildung 6C, D, links). Bei Hybridsystemen, bei denen nach der Bildung von Vesikeln Reinigungsmittel hinzugefügt wird, spielt die Waschmittelkonzentration eine bemerkenswerte Rolle: Die Erhöhung von Natriumcholat von 0,015 % auf 0,1 % führte zu einem deutlichen Anstieg der Proteinaufnahme (22,1 ± 5,2 a.u. gegenüber 26,2 ± 5,0 a.u., Abbildung 6C, D, rechts). Beim Vergleich von Polymer- und Hybridsystemen wurde eine etwas höhere Membranaufnahme von Bo3-Oxidase allgemein bei hybriden GUVs beobachtet. Dies ist wahrscheinlich auf das Vorhandensein von Packungsdefekten an Polymer-Lipid-Grenzflächen zurückzuführen, die neben detergentisch induzierten Defekten günstige Insertionsstellen für Membranproteine bieten.

Mit einem zweiten Elektroformationsschritt von 2 Stunden betrug der durchschnittliche Durchmesser von Bo-3-Oxidase-funktionalisierten GUVs etwa 14–15 μm (13,5 ± 3,7 μm für Polymer-GUVs und 15,4 ± 6,3 μm für hybride GUVs), obwohl auch deutlich größere Vesikel vorhanden waren (Abbildung 6C, D). Die Verlängerung der Dauer des zweiten Elektroformationsschritts auf 12 Stunden führte zu einer Gesamtzunahme der GUV-Größe^{von 1,27}.

Das Fusions-Elektroformationsprotokoll ermöglicht außerdem die Einkapselung wasserlöslicher Spezies, wie pH-empfindliche Farbstoffe (z. B. Pyranin), indem der Farbstoff während der Elektroformation dem Rehydrationspuffer hinzugefügt wird (Abbildung 7A). Die GUV-Größe nimmt typischerweise ab, wenn Vesikel in Gegenwart wasserlöslicher Farbstoffe gebildet werden. Um diesen Effekt auszugleichen, sollte die Frequenz während der ersten Elektroformationsschritte von 50–500 Hz erhöht werden.

Die Verkapselung eines ratiometrischen, pH-empfindlichen Farbstoffs wie Pyranin ermöglicht die Überwachung der Protonenpumpung durch einzelne Vesikel und gibt Einblicke in die Ausrichtung der Protonenpumpen. Bei der Versauerung des Vesikellumens nimmt das Fluoreszenzverhältnis von Pyranin, das bei 448 nm und 405 nm angeregt wird, ab. Dieses Verhältnis spiegelt den Protonationszustand von Pyranin wider und korreliert somit mit dem pH-Wert. Ratiometrische Messungen sind vorteilhaft, da sie weitgehend unempfindlich gegenüber Schwankungen in der Farbstoffkapselungseffizienz und der Photobleachung sind. Ein Beispiel für Protonenpumpaktivität ist in Abbildung 7B dargestellt, wo ein Rückgang des intravesikulären Pyranin-Fluoreszenzverhältnisses (I₄₄₈/I₄₀₅) in hybriden GUVs mit rekonstituierter Bo3-Oxidase nach der Zugabe des Elektronendonators DTT und des Elektronenmediators Q₁ beobachtet wird. Das Fluoreszenzverhältnis beginnt etwa 1 Minute nach der Aktivierung stark zu sinken und sinkt etwa 1 Minute lang schnell, bevor es in den nächsten ~18 Minuten langsamer wird. Dieses Verhalten deutet darauf hin, dass die Mehrheit der Bo3-Oxidase-Moleküle so ausgerichtet ist, dass das Protonenpumpen ins Innere der GUVs hinweg stattfindet. Proteinfreie GUVs, die identischen Bedingungen unterzogen wurden, zeigten einen geringeren Rückgang des Fluoreszenzverhältnisses, was als negative Kontrolle diente und bestätigte, dass der größere Rückgang bei Bo-3-GUVs speziell durch die Pumpaktivität von Bo-3-Oxidase-Protonen und nicht durch unspezifische Effekte von DTT und Q1_{auf das} Pyranin-Fluoreszenzverhältnis resultiert.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Herstellung großer unilamellärer Vesikel (LUV), Rekonstitution des Membranprotein-Cytochrom-Bo-3-Oxidase in LUVs und Bildung von bo-3-Oxidase-funktionalisierten riesigen unilamellären Vesikeln (GUV) durch den Fusions-Elektroformationsansatz. LUVs werden durch dünnschichtige Rehydrierung, Gefrier-Tau-Zyklen und Extrusion durch eine 100 nm porengroße Membran hergestellt. Die Rekonstitution von Cytochrom-Bo3-Oxidase erfolgt in Anwesenheit von Waschmittel, das anschließend mit Bio-Beads entfernt wird. bo-3-GUVs entstehen durch das Abbringen von bo 3-LUVs auf Indiumzinnoxid (ITO)-beschichtete Glasobjektträger, gefolgt von partieller Dehydrierung und Rehydratation in Anwesenheit eines elektrischen Stroms. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Bildung eines verschmolzenen großen unilamellaren Vesikels (LUV)-Films durch Dehydration. Sieben 2-μL-Tröpfchen gemischter Proteo-LUVs und LUVs wurden auf mit Indiumzinnoxid (ITO) beschichtete Glasobjekte abgeschieden: (A) unmittelbar nach der Abscheidung und (B) nach partieller Dehydratisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3. Fluoreszierende Markierung von Cytochrom-bo3-Oxidase. (A) Chromatogramm (Elutionsprofil) von bo₃ Oxidase-ATTO 643, gereinigt auf einer Superdex-Säule 200 10/300 GL. Die in Grau hervorgehobenen Brüche wurden gesammelt und anschließend konzentriert. (B) Absorptionsspektren von konzentriertem Bo3-Oxidase-ATTO 643, mit Spitzen bei 280 nm (Protein), 400 nm (Soret-Band der Häm-Kofaktoren in Bo3-Oxidase) und 643 nm (Farbstoff). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4. Größenverteilungen großer unilamellärer Vesikel (LUVs) vor und nach der Proteinrekonstitution: (A) Poly(Dimethylsiloxan)-Graft-Poly (Ethylenoxid) (PDMS-g-PEO) Polymer und (B) PDMS-g-PEO/Sojaphosphatidylcholin-(PC) Hybridvesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5. Sauerstoffverbrauch durch bo-3-Oxidase, rekonstituiert in großen unilamellären Vesikeln (LUVs). (A) Repräsentative Spur der Sauerstoffkonzentration über die Zeit nach Aktivierung der rekonstituierten Cytochrom-bo3-Oxidase durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT) und Ubichinon-1 (Q₁). Die grüne Spur entspricht proteinrekonstituierten LUVs, die graue Spur der negativen Kontrolle (proteinfreie LUVs). (B) Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) von Bo-3-Oxidase, rekonstituiert in Poly(Dimethylsiloxan)-Graft-Poly(Ethylenoxid) (PDMS-g-PEO) und PDMS-g-PEO/Sojaphosphatidylcholin (PC) LUVs. Balken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von drei unabhängigen Messungen (n = 3) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6. Einfügung von fluoreszenzmarkierter Bo3-Oxidase in riesige unilamellare Vesikel (GUV). Repräsentative Mikrographen von (A) Poly(Dimethylsiloxan)-Graft-Poly(Ethylenoxid) (PDMS-g-PEO) und (B) PDMS-g-PEO/Sojaphosphatidylcholin (PC) GUVs (Membranen, die mit Phosphatidylethanolamin-Rhodamin (PE-Rho) beschriftet sind, enthalten rekonstituiertes Cytochrom bo₃ Oxidase-ATTO 643 (magenta). Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von Bo3-Oxidase-ATTO 643 als Funktion der GUV-Größe (N = 100) für verschiedene Rekonstitutionsbedingungen: (C) Zugabe von 0,2 % Natriumcholat (SC) zu vorgeformten Polymer-großen unilamellären Vesikeln (LUVs) und 0,015 % SC zu vorgeformten hybriden LUVs; (D) Polymer-LUVs, die in Anwesenheit von 0,1 % SC gebildet wurden, und Hybrid-LUVs, die nach der Bildung mit 0,1 % SC behandelt wurden. Die Werte repräsentieren die Fluoreszenzintensität einzelner GUVs (N = 100 pro Zustand). Im Text werden mittlere ± Standardabweichungswerte (SD) angegeben. Vergleiche sind beschreibend; Es wurden keine formalen statistischen Tests durchgeführt. A.U. (beliebige Einheiten). Maßstabsleiste = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7. Protonenpumpung durch Bo3-Oxidase, rekonstituiert in riesigen unilamellären Vesikeln (GUV). (A) Repräsentative Fluoreszenzmikroskopographie von Poly(Dimethylsiloxan)-Graft-Poly (Ethylenoxid) (PDMS-g-PEO)/Sojaphosphatidylcholin (PC) GUVs, mit Membranen, die mit 0,05 mol% Phosphatidylethanolamin-Rhodamin (PE-Rho, rot) gekennzeichnet sind, enthalten rekonstituierte Cytochrom-Bo3-Oxidase und gekapseltes pH-empfindliches Farbstoff, Pyranin (Anregung bei 405 und 448 nm; blaue und grüne Kanäle), abgesetzt in einem Glasbehälter. (B) Veränderung des intravesikulären Pyranin-Fluoreszenzverhältnisses bei Aktivierung mit Dithiathreitol (DTT) und Ubichinon-1 (Q₁) in PDMS-g-PEO/Soja-PC-GUVs mit rekonstituierter Bo3-Oxidase. Die grüne Spur entspricht protein-rekonstituierten GUVs, die graue Spur der negativen Kontrolle (proteinfreie GUVs). Die Spur stellt den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar (n = 3 Vesikel). Maßstabsleiste = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

	Komponente	Bestand	Betrag	Endgültige Membranzusammensetzung
Polymersome	PDMS-g-PEO in Chloroform: Methanol (2:1, V/V)	10 mg/mL	499,9 μL	99,95 Mol %
	PE-Rhodamin in Chloroform	1 mg/mL	1,1 μL	0,05 mol%
Hybridvesikel	PDMS-g-PEO in Chloroform: Methanol (2:1, V/V)	10 mg/mL	450,1 μL	70 mol%
	Soja-PC (95 %) in Chloroform	10 mg/mL	49,8 μL	29,95 Mol %
	PE-Rhodamin in Chloroform	1 mg/mL	1,4 μL	0,05 mol%

Tabelle 1: Lagerlösungen und Volumina, die zur Dünnschichtpräparation für die Bildung großer unilamellärer Vesikeln (LUV) verwendet werden. Die Lagerkonzentrationen werden in mg/ml angegeben. Die Volumina werden für eine Gesamtfilmkonzentration von 5 mg/mL Amphiphilen berechnet. Die endgültige Membranzusammensetzung wird in mol% angegeben. PDMS-g-PEO: Poly(Dimethylsiloxan)-Graft-Poly (Ethylenoxid); PE-Rhodamin: Phosphatidylethanolamin-Rhodamin; Soja PC: Sojaphosphatidylcholin; V/V: Lautstärke/Lautstärke.

	Wiederherstellungszustand	Durchmesser (nm)	PDI
Polymersome	Vor der Wiederaufstellung	84,34 ± 0,22	0.084
	Nach der Wiederaufstellung	100,73 ± 0,81	0.109
Hybride	Vor der Wiederaufstellung	89,21 ± 0,77	0.129
	Nach der Wiederaufstellung	85,01 ± 0,42	0.17

Tabelle 2: Durchschnittliche Vesikelgröße und Polydispersitätsindex (PDI) von Polymersomen (Poly(Dimethylsiloxan)-Graft-Poly (Ethylenoxid), PDMS-g-PEO) und Hybridvesikeln (PDMS-g-PEO/Sojaphosphatidylcholin (PC)) vor und nach der Rekonstitution. Die Daten stellen den Mittelwert von drei unabhängigen Messungen dar.

Diskussion

Polymersomen und Polymer/Lipid-Hybridvesikel weisen eine verbesserte chemische und mechanische Stabilität im Vergleich zu herkömmlichen Lipidvesikeln auf, was sie für Anwendungen von der Arzneimittelabgabe und Biosensing bis hin zu Nano- und Mikroreaktoren sowie künstlichen Zellen äußerst attraktiv macht. Ihre charakteristische Membranarchitektur und biophysikalischen Eigenschaften verhindern jedoch oft die direkte Übertragung von für Lipidvesikeln optimierten Protokollen auf polymerbasierte Systeme 15,20,30. Das hier vorgestellte Protokoll adressiert diese Unterschiede und bietet einen optimierten Arbeitsablauf für die Membranprotein-Rekonstitution in PDMS-g-PEO-basierte Polymer- und Hybrid-LUVs, gefolgt von einer Skalierung zu GUVs mittels Fusionselektroformation.

Ein entscheidender Schritt im Protokoll ist die Vorbereitung von LUVs mit einer schmalen und reproduzierbaren Größenverteilung. Wie bei Lipidfilmen fügen sich PDMS-g-PEO-Filme nach Rehydration mit einem wässrigen Puffer selbst zu Vesikeln zusammen. Im Gegensatz zu Lipidsystemen, die häufig eine Mischung aus uni- und multilamellären Vesikeln erzeugen, bildet PDMS-g-PEO bevorzugt unilamellare^{Strukturen 1}, wodurch die Notwendigkeit von Frost-Tau-Zyklen, die typischerweise zur Reduzierung der Multilamellarität in Lipidpräparaten verwendet werden, überflüssig werden. Die Extrusion wird durchgeführt, um die Größenverteilung der Vesikel zu standardisieren. Aufgrund der erhöhten Weichheit der PDMS-g-PEO-Membranen im Vergleich zu Lipiddoppelschichten¹ reichen niedrigere Extrusionsdrücke aus. Während die vom Hersteller empfohlenen 11 Extrusionsdurchgänge im Allgemeinen ausreichen, führt eine erhöhte Anzahl der Durchgänge typischerweise zu einer schmaleren Größenverteilung und verbesserter Reproduzierbarkeit. Eine übermäßige Extrudion kann jedoch Vesikel erzeugen, die etwas kleiner sind als die nominale Porengröße der Membran. Wiederholte Extrusion kann auch den Ertrag der Vesikel aufgrund von Materialverlust verringern; zuvor haben wir festgestellt, dass etwa 31 % des PDMS-g-PEO und 25 % des PDMS-g-PEO/Soy PC-Vesikelmaterials nach 21 Durchgängen durch eine 100-nm-Membran¹ verloren gegangen sind. Daher sollte die Anzahl der Extrusionsdurchgänge optimiert werden, um Größengleichmäßigkeit mit Vesikelintegrität und Ausbeute auszugleichen.

Die durch Waschmittel vermittelte Rekonstitution stellt einen weiteren entscheidenden Erfolgsfaktor dar. Der optimale Reinigungstyp und die optimale Konzentration hängen sowohl vom spezifischen Membranprotein als auch von der Membranzusammensetzung ^3,20 ab. Im Fall reiner Polymermembranen, wenn die Sättigungsbedingungen optimal sind, führt die Einbindung von Reinigungsmittel während der Filmrehydratation zu höheren Einfügungseffizienzen als das Einfügen von vorgefertigten Vesikeln. Steifere Polymermembranen, wie sie aus PBD-b-PEO entstehen, benötigen für die Membranlösung³⁰ deutlich höhere Reinigungskonzentrationen, was die Notwendigkeit einer polymerspezifischen Optimierung unterstreicht. Ein erfolgreicher Einsatz sollte nicht nur durch Aktivitätsmessungen – im Vergleich zu Desperzenmizellen oder Lipidvesikeln – verifiziert werden, sondern auch durch Strukturanalysen wie Kryo-TEM, um Einfließtiefe und Membrananpassung an hydrophobe Fehlanpassung¹ zu beurteilen. Die Proteinorientierung ist ebenso entscheidend, insbesondere für Protonenpumpen, da ein funktionaler Protonengradient erfordert, dass die meisten Pumpen gleichmäßig ausgerichtet sind. Idealerweise sollten Pumpen Protonen nach innen transportieren, um eine Kopplung mit gradientenverbrauchenden Prozessen wie der ATP-Synthese ^3,15 zu ermöglichen. Die Orientierung kann mit Protein-Tags bewertet werden, zum Beispiel durch selektives Abschrecken von Farbstoffen, die an der Außenseite des Vesikels befestigt sind, oder durch das Verschieben von fluoreszierenden Etiketten, die an His-tags²⁰ angebracht sind. Diese Ansätze werden als allgemeine Empfehlungen zur Protokolloptimierung präsentiert und wurden in dieser Studie nicht umgesetzt.

Die Skalierung von Proteo-LUVs zu Proteo-GUVs mittels Fusionselektroformation erfordert eine sorgfältige Steuerung der Abscheidungs- und Dehydrationsparameter. Die Konzentration der LUVs und die Tropfengröße haben entscheidenden Einfluss auf die endgültige GUV-Ausbeute und Reinheit. Übermäßig hohe LUV-Konzentrationen (≥10 mg/mL) können dazu führen, dass nicht verschmolzene LUVs in der Endprobe verbleiben, während zu niedrige Konzentrationen (<5 mg/mL) die Erträge des GUV aufgrund unzureichender abgeschiedener Materialien verringern. Die Dehydrierung muss teilweise statt vollständig erfolgen – angezeigt durch das Erscheinen eines weißen Rings am Tropfenrand statt eines vollständig weißen Tropfens –, da übermäßige Dehydrierung die Membranproteinaktivität beeinträchtigen oder abschaffen kann, insbesondere bei Protonenpumpen. Kontrollierte Luftfeuchtigkeit und Temperatur sind daher unerlässlich, um die Membranen ausreichend für die Fusion zu destabilisieren und gleichzeitig die Proteinfunktion zu erhalten.

Hohe Proteinmengen können die GUV-Größe verringern, aber dieser Effekt kann durch Verdünnung proteinfunktionalisierter LUVs mit proteinfreien LUVs gemildert werden. Auf diese Weise kann die Proteindichte in GUV-Membranen vor der Ablagerung präzise moduliert werden. Zum Beispiel erzeugt das Mischen hochbelasteter Bo-3-LUVs mit leeren LUVs (bis zu 1:10, v/v) GUVs mit Durchmessern von 5–30 μm und abstimmbarem Proteingehalt, während die Membranverteilung²⁷ gleichmäßig erhalten bleibt. Obwohl diese Strategie zu heterogenen Vesikelpopulationen hinsichtlich der Proteindichte führt, ermöglichen Kalibrierungsverfahren eine quantitative Bewertung der Inkorporationsniveaus^23,31. Wichtig ist, dass der Mischansatz eine höhere Gesamtproteinbelastung ermöglicht, ohne eine übermäßige Verringerung der GUV-Größe²⁷.

Die funktionelle Analyse rekonstituierter Proteine kann durchgeführt werden, indem pH-sensitive Farbstoffe wie Pyranin im Elektroformationspuffer gekapselt werden, um intravesikuläre pH-Veränderungen zu überwachen. Für eine zuverlässige Live-Bildgebung müssen Vesikel absetzen oder immobilisiert werden, um Bewegung zu verhindern, was die Fluoreszenzsignale verwischen und die genaue Quantifizierung der intravesikulären pH-Dynamik erschweren würde. Die Immobilisierung durch Biotin–Streptavidin-Kopplung mit biotinylierten Lipiden und streptavidinbeschichteten Oberflächen³² sorgt für eine stabile Anhaftung, kann jedoch die Membranzusammensetzung oder -spannung verändern. Die Semi-Immobilisierung in mikrofluidischen Fallen bietet eine Alternative, die zusätzliche Membrankomponenten vermeidet und Störungen^{minimiert 1,33}. Obwohl Massenfluoreszenzmessungen nach der Entfernung des äußeren Farbstoffs durch wiederholte Sedimentation und Pufferaustausch möglich sind, kann der residual-membranassoziierte Farbstoff die Anzeige stören; daher wird die konfokale Mikroskopie einzelner GUVs im Allgemeinen bevorzugt.

Im Vergleich zu alternativen Ansätzen, die versuchen, direkte Proteininsertion in vorgefertigte GUVs einzuführen, erlaubt die Fusions-Elektroformationsstrategie eine unabhängige Optimierung der Rekonstitutionsbedingungen auf LUV-Ebene, bevor auf GUVs hochskaliert wird. Dieser modulare Arbeitsablauf verbessert die Reproduzierbarkeit und den funktionellen Ertrag, insbesondere bei Polymer- und Hybridmembranen, die für herkömmliche lipidbasierte Protokolle weniger geeignet sind. Die Methode ist mit einer breiten Palette von Membranproteinen^{kompatibel 1}, einschließlich Multi-Protein-Systemen¹⁵, und ermöglicht die Membranfunktionalisierung und Ko-Kapselung zusätzlicher Komponenten. Als solches bietet es eine vielseitige Plattform für den Bau langlebiger künstlicher Zellen, Mikroreaktoren und Modellsysteme zur Untersuchung von Polymer-Protein-Interaktionen unter kontrollierten Bedingungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ÄKTA pure™ chromatography system	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8 well chambered coverglass	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS ester	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)	pgo	CEC020S
LAS X software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
Oxytherm+P system	Hansatech Instruments	/
Plasma cleaner (benchtop)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μm	Avanti Research	610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)	Grace Bio-Labs	41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)			laboratory-made, cut from silicone sheet
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS spectrophotometer	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)	Cytiva	28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600