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Forschungsartikel
Diese Studie integriert Netzwerkpharmakologie, molekulares Docking und Molekulardynamik (MD)-Simulation, um zentrale aktive Komponenten und therapeutische Ziele von Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD) bei Autismus-Spektrum-Störung (ASS) aufzuklären, identifiziert wichtige Bindungsreste mittels Alanin-Scanning und validiert Effekte in einem valproinsäureinduzierten ASD-Rattenmodell.
Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) ist eine komplexe neuroentwicklungsbedingte Störung, deren Pathogenese eng mit chronischer Neuroinflammation verbunden ist. Als klassische Formel der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) wird Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD) wegen seiner berichteten neuroprotektiven Wirkung bei neuroentwicklungsbedingten und Gedächtnisstörungen verwendet, aber sein spezifischer molekularer Mechanismus bei ASD bleibt unklar. Diese Studie integriert Netzwerkpharmakologie, molekulare Andockungsanalyse und MD-Simulation, um systematisch die zentralen aktiven Komponenten und potenzielle therapeutische Ziele von KSZZD für ASD sowohl auf systemischer als auch auf atomarer Ebene zu erläutern. Anschließend werden wichtige Bindungsreste mittels Alanin-flexibles Scannen identifiziert, und die biologischen Effekte werden mit einem valproinsäureinduzierten (VPA)-induzierten ASD-Rattenmodell bewertet. Die Analyse der Netzwerkpharmakologie zeigte, dass Quercetin, ein Schlüsselbestandteil bei KSZZD, teilweise durch die Regulierung des TNF-α-vermittelten entzündlichen Signalwegs wirken kann. Molekulare Andockungsergebnisse zeigten, dass die Bindungsenergien der Kernkomponenten von KSZZD an ihre Ziele alle unter -5,0 kcal/mol lagen, wobei Quercetin die stärkste Bindungsaffinität zu TNF (-8,52 kcal/mol) aufwies. Die MD-Simulation deutete darauf hin, dass Quercetin eine stabile Bindung an die aktive Tasse von TNF-α aufrechterhalten könnte, und Alanin-Scans identifizierten GLU104 und GLN102 als wichtige Aminosäurereste zur Aufrechterhaltung der strukturellen Stabilität des Komplexes. In-vivo-Experimente zeigten, dass die Quercetin-Intervention das lokomotorische und explorative Verhalten bei VPA-induzierten ASS-Ratten signifikant verbesserte und die TNF-α-Expression im Serum und im Gehirngewebe effektiv reduzierte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Quercetin zumindest teilweise durch Hemmung des TNF-α-Signalwegs zu den vorhergesagten Effekten von KSZZD beitragen könnte.
Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) ist eine komplexe neuroentwicklungsbedingte Störung, die durch eingeschränkte soziale Kommunikation, eingeschränkte Interessen und wiederholte stereotype Verhaltensweisen gekennzeichnetist. Der pathologische Mechanismus der ASD ist hochkomplex und beinhaltet das Zusammenspiel genetischer Variationen, epigenetischer Regulation und Umweltfaktoren, was letztlich zu einer beeinträchtigten synaptischen Plastizität und abnormaler neuronaler Schaltkreisverbindungführt 2,3. Chronische Entzündungen im zentralen Nervensystem (ZNS) spielen eine zentrale Rolle bei der Pathogenese von ASS, und Interventionen gegen Neuroinflammation haben sich als vielversprechende therapeutische Strategien erwiesen.
Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD), eine klassische TCM-Formel, wurde erstmals in Essential Prescriptions Worth a Thousand Gold for Emergencies aufgenommen. Sie besteht aus vier Heilkräutern: Schildkrötenpanzer, Os Draconis, Polygalae Radix und Acori Tatarinowii Rhizoma. KSZZD wird traditionell verwendet, um Herz und Niere zu stärken, den Geist zu beruhigen und den Geist zu stabilisieren. Klinisch wird es häufig zur Behandlung intellektueller Entwicklungsverzögerung und Gedächtnisstörungeneingesetzt 4. Moderne pharmakologische Studien haben nahegelegt, dass KSZZD und seine aktiven Komponenten neuroprotektive, entzündungshemmende und antioxidative Wirkungen haben und Lern-, Gedächtnis- und angstähnliches Verhalten in neuroentwicklungsbedingten Störungsmodellen5 verbessern können. Unsere phytochemische Analyse zeigte, dass Quercetin und andere Flavonoide die wichtigsten aktiven Bestandteile dieser Formel sind, die die Blut-Hirn-Schranke durchdringen und eine signifikante entzündungshemmende Wirkungzeigen können 6. Der Mechanismus, durch den diese aktiven Komponenten die therapeutischen Effekte von KSZZD bei ASD vermitteln, ist jedoch weiterhin wenig verstanden.
Mit der rasanten Entwicklung der Computerbiologie haben Techniken wie Netzwerkpharmakologie, molekulares Andocken, molekulardynamische Simulation und Quantenchemie-Berechnung leistungsstarke Werkzeuge bereitgestellt, um die Wechselwirkungen zwischen aktiven Komponenten der traditionellen chinesischen Medizin und Krankheitszielen auf atomarer Ebenezu klären.. Durch die Integration heterogener Datenquellen ermöglicht die Netzwerkpharmakologie den Aufbau eines komplexen, interaktiven "Komponenten-Ziel-Pfad"-Netzwerks aus systembiologischer Perspektive und identifiziert so vorläufig wichtige biologische Knoten für die traditionelle chinesische Medizin bei Krankheiten.
Auf dieser Grundlage kann das molekulare Andocken weiter genutzt werden, um die geometrische Anordnung und Energieanpassung zwischen Komponenten und Zielproteinen zu simulieren und deren Bindungsmodi sowie potenzielle Aktivitäten vorherzusagen. Anschließend wird eine Molekulardynamik (MD)-Simulation durchgeführt, um die strukturelle Fluktuation und Bindungsstabilität des Komplexes unter wässrigen und physiologischen Bedingungen zu untersuchen. In Kombination mit Alanin-Scans wird eine ortsgerichtete Mutagenese-Simulation angewendet, um die für die Aufrechterhaltung der Bindungsaffinität verantwortlichen Kern-Hot-Spot-Reste genau zu lokalisieren und das Beitragsgewicht des Pharmakophors auf Aminosäureniveau zu klären. Schließlich kann eine Verifikation auf Grundlage gut gestalteter pharmakologischer Experimente effektiv den molekularen Mechanismus aufdecken, der den therapeutischen Wirkungen traditioneller chinesischer Medizin auf bestimmte Krankheiten zugrunde liegt.
Dementsprechend zielt diese Studie zunächst darauf ab, die Kernbestandteile und Ziele von KSZZD bei der Behandlung von ASD mittels Netzwerkpharmakologie zu untersuchen. Anschließend werden in Kombination mit molekularem Andocken, molekularer Dynamiksimulation und alaninflexiblem Scannen die "Hot-Spot-Reste" identifiziert, die komplexe Stabilität aufrechterhalten, und das dynamische Wechselwirkungsmuster zwischen Quercetin und TNF-α wird bewertet. Abschließend werden die computergestützten Ergebnisse experimentell in einem VPA-induzierten ASD-Rattenmodell unter Verwendung von Tierverhalten, Hirnhistopathologie und Expression von Entzündungsfaktoren überprüft. Diese Studie zielt darauf ab, mögliche Mechanismen zu erforschen, durch die KSZZD-abgeleitete Komponenten autismus-bezogene Entzündungswege aus einer multiskaligen Perspektive beeinflussen können, um eine Grundlage für weitere Untersuchungen traditioneller chinesischer Medizininterventionen bei neuroentwicklungsbedingten Störungen zu schaffen.
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Analyse der Netzwerkpharmakologie
"Autismus" wurde als Schlüsselwort verwendet, um in der GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org/) nach autismusbezogenen Zielen 12,13,14 zu suchen. Aus den Datenbanken abgerufene Ziele wurden nach der Entfernung der doppelten Einträge zusammengeführt. Bekannte Ziele aktiver Komponenten, die nicht von Datenbankvorhersagen erfasst wurden, wurden auf Basis von Literaturberichtenergänzt 15. Die Krankheitsziele und potenziellen Ziele der Arzneimittelkomponenten wurden einheitlich auf Gensymbole mit Hilfe der UniProt-Proteindatenbank (https://www.uniprot.org/) standardisiert, und diese beiden Zielgruppen wurden kartiert, um die potenziellen therapeutischen Ziele von KSZZD für Autismus16 zu identifizieren.
Basierend auf der Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) wurden die potenziellen bioaktiven Verbindungen in KSZZD und ihre entsprechenden Ziele gemäß den Kriterien der oralen Bioverfügbarkeit (OB ≥ 0,30) und dem Arzneimittelähnlichkeitsindex (DL ≥ 0,18)17 aussortiert. Die SMILES-Identifizéierer der Verbindungen wurden aus der PubChem-Datenbank (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) abgerufen, und Swiss Target Prediction (http://swisstargetprediction.ch/) wurde weiter verwendet, um potenzielle Ziele zu erforschen, die nicht in der TCMSP-Plattform18 enthalten waren. Anschließend wurde die HERB-Datenbank (http://herb.ac.cn) für ergänzende Screenings gemäß der Lipinskis Fünferregel verwendet, mit folgenden Kriterien: Molekulargewicht (MW ≤ 500 Da), Oktanol-Wasser-Partitionskoeffizient (AlogP ≤ 5), Anzahl der Wasserstoffbrückenspender (Hdon ≤ 5), Anzahl der Wasserstoffbrückenakzeptoren (Hacc ≤ 10) und Anzahl der rotierbaren Bindungen (RBN ≤ 10). Anschließend wurde das Ziel-Screening mit der BATMAN-TCM-Datenbank (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/) durchgeführt, wobei folgende Kriterien verwendet wurden: Score-Cut-off (≥0,84), Drogenfähigkeits-Score (≥0,10) und P-Wert (≤0,05). Schließlich wurde die UniProt-Datenbank (https://www.uniprot.org) verwendet, um die ausgewählten Zielnamen in Standard-Gensymbole umzuwandeln.
Die sich überschneidenden Ziele zwischen den Medikamentenzielen und den Autismus-Zielen wurden mit dem Online-Tool Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be) identifiziert. Diese überlappenden Ziele wurden in die STRING-Datenbank (https://string-db.org/) importiert, um ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI)19 zu konstruieren. Die Art wurde auf Homo sapiens gesetzt, und Protein-Protein-Interaktionen mit Konfidenzwerten unter 0,40 wurden herausgefiltert. Das resultierende Netzwerk wurde für die visuelle Analyse16 in die Software Cytoscape 3.10.0 importiert, wobei Medikamente, Verbindungen und Ziele durch rote Diamanten, blaue Kreise und grüne Dreiecke dargestellt wurden und die Kantengewichte die Gradzentralität der Knoten widerspiegelten. Das CytoNCA-Plugin wurde dann verwendet, um Gradzentralitätswerte zu berechnen, die Kernverbindungen zu rangieren und die Hauptkernverbindungen zu identifizieren. Die bioinformatische Anreicherungsanalyse der Zielgene wurde mit der Metascape-Plattform20 durchgeführt, einschließlich GO-Analyse (biologischer Prozess, BP; molekulare Funktion, MF; zelluläre Komponente, CC) und KEGG-Signalweganalyse.
Molekulare Andockung
Die oben identifizierten autismusbezogenen Rezeptorproteine wurden vor dem Andocken vorverarbeitet, indem fehlende Reste repariert, der Protonationszustand optimiert und kristallisierte Wassermoleküle entfernt wurden, um die strukturelle Integrität der Rezeptoren zu erhalten. Die halbflexible Andockmethode im CDOCKER-Modul21 wurde daraufhin eingesetzt. Reste innerhalb von 10 Å des Kokristallligandens wurden als aktive Tasche definiert, und die Bindung zwischen Liganden und Rezeptor wurde in diesem Bereich simuliert.
Die Andockergebnisse wurden unter Verwendung der CDOCKER-Interaktionsenergie als Schlüsselindex bewertet, wobei niedrigere Energiewerte auf eine stabilere vorhergesagte Bindung zwischen Ligand und Rezeptor hindeuten. Die Zuverlässigkeit des Andockmodus wurde durch den Vergleich der räumlichen Bindungskonformation der Kernkomponente mit der des Kokristallligandens in der aktiven Tasche bewertet. Der Komplex mit der optimalen Bindungsenergie und der stärksten Wechselwirkung wurde als Anfangsform für die anschließende molekulardynamische Simulation ausgewählt.
Molekulardynamik-Simulation
Basierend auf den Befunden des molekularen Andockens wurde eine Molekulardynamik-Simulation durchgeführt, um den Bindungsmechanismus zwischen dem Quercetin-Komplex und TNF-α zu untersuchen. Dieser Ansatz simuliert molekulare Bewegungen und Wechselwirkungen auf atomarer Ebene und analysiert dynamische Veränderungen in Proteinen, Liganden und der umgebenden Umgebung, wodurch er Informationen über molekulare Konformationsänderungen, Bindungsstabilität und Protein-Liganden-Dynamik liefert. Der Rezeptor-Liganden-Komplex wurde mit dem TIP3P-Wassermodell solviert, mit einem Pufferabstand von mindestens 12 Å zwischen dem Komplex und der Systemgrenze, um eine vollständige Solsolvation zu gewährleisten und Randeffekte zu reduzieren. Die Ionenkonzentration wurde auf 0,154 m eingestellt, und Na⁺- und Cl⁻-Ionen wurden hinzugefügt, um die Systemladung zu neutralisieren. Zur Verbesserung der Simulationsgenauigkeit wurde das Amber14SB-Proteinkraftfeld22 verwendet, das ungebundene intermolekulare Wechselwirkungen und Bindungsmodi effektiv beschreibt und besonders für Protein-Liganden-Komplex-Studiengeeignet ist 23.
Zur anfänglichen Energieminimierung wurde die steilste Abstiegsmethode über 5000 Schritte durchgeführt, um unangemessene Kontakte und hochenergetische Konformationen zu entfernen, wobei eine Konvergenzschwelle von 10 kJ/mol/nm verwendet wurde, um die Entspannung der Kraftfeldparameter sicherzustellen. Die konjugierte Gradientenmethode wurde dann über 2.000 Schritte durchgeführt, um den thermodynamischen Zustand weiter zu optimieren und die Systemstabilität24 sicherzustellen.
Während des Gleichgewichts wurde die NVT-Ensemble-Simulation zunächst für 100 ps mit einem 2-fs-Zeitschritt durchgeführt. Das System wurde schrittweise auf 300 K erhitzt, um den Einfluss der ursprünglichen Struktur zu verringern und ein thermodynamisches Gleichgewicht zu erreichen. Das Ensemble wurde daraufhin auf NPT umgestellt, und eine zusätzliche 100-ps-Gleichstellung wurde bei konstantem Druck von 1 bar durchgeführt, um Dichte und Druck zu stabilisieren. Diese Stufe wurde verwendet, um das System vor Produktionssimulation25 in einen stabilen thermodynamischen Zustand zu versetzen. Die formale Molekulardynamik-Simulation wurde für 20 ns durchgeführt, wobei die Temperatur bei 300 K, der Druck 1 bar und ein Zeitabschnitt von 2 fs gehalten wurde. Die Flugbahn wurde alle 10 PS gespeichert. Um die Stabilität und Genauigkeit der Simulation sicherzustellen, wurden physikalische Parameter wie Temperatur, Druck und Volumen regelmäßig überwacht, um sicherzustellen, dass sie innerhalb der erwarteten Bereiche blieben.
Alanin-flexibles Scannen
Basierend auf der stabilen Konformation, die aus der molekularen Dynamiksimulation gewonnen wurde, wurde Alanin-Scanning an allen Aminosäureresten innerhalb eines Radius von 3 Å um die Ligandenbindungsgrenze durchgeführt. Bei diesem Verfahren werden Zielreste systematisch durch Alanin ersetzt, wodurch die Seitenkette abgeschnitten wird, während die Hauptketten-Konformation erhalten bleibt und durch die Seitenkette vermittelte spezifische Wechselwirkungen entfernt werden. Das Beitragsgewicht jedes Restes zur Bindungsaffinität wurde quantifiziert, indem die Änderung der freien Bindungsenergie zwischen dem Wildtyp- und dem Mutantenkomplex berechnet wurde. Im Gegensatz zu traditionellen statischen Modellen führte diese Studie einen Sidechain-flexiblen Relaxationsmechanismus ein, der es der Umgebung um die Mutationsstelle ermöglichte, strukturell zu entspannen und die dynamische Reaktion der Bindungsgrenze realistischer zu simulieren. Diese Analyse zielte darauf ab, Kandidaten-Hotspot-Reste zu identifizieren, die komplexe Stabilität aufrechterhalten und einen energetischen Fingerabdruck für die Optimierung der Leadverbindungen mit Blick auf autismusbezogene Proteine liefern.
Tierversuche
Versuchstiere
Gesunde SPF-Grade Sprague-Dawley (SD) Ratten (drei Männchen und drei Weibchen, 3 Monate alt), die unter identischen Bedingungen geboren und aufgezogen wurden, wurden ausgewählt. Die Raumtemperatur wurde bei 18–22 °C kontrolliert, die relative Luftfeuchtigkeit bei 60 % bis 70 % gehalten und der Lichtzyklus betrug 12 H: 12 H (hell: dunkel). Alle tierversuchsbezogenen Operationen wurden vom Ethics Committee für experimentelle Tiere des First People's Hospital of Zunyi genehmigt (Genehmigungsnummer: LunShen (2025)-2-362).
Tierpaarung, Schwangerschaftsidentifikation und Gruppierung
Alle Ratten wurden nach dem Kauf eine Woche lang adaptiv in einer SPF-Umgebung gefüttert. Eine weibliche und eine männliche Ratte wurden jeden Nachmittag um 18:00 Uhr zusammen eingesperrt. Die Vaginalplug-Untersuchung wurde am nächsten Morgen um 8:00 Uhr durchgeführt (12 Stunden nach dem Kauge). Das Vorhandensein eines vaginalen Plugs galt als erfolgreiche Paarung und wurde am selben Tag als Gestationstag 0,5 (GD0,5) festgelegt. Trächtige Ratten wurden einzeln in getrennten Käfigen gehalten. Das Körpergewicht trächtiger Ratten wurde täglich gemessen und aufgezeichnet. Das Körpergewicht trächtiger Ratten stieg kontinuierlich an, mit einer durchschnittlichen täglichen Zunahme von 2–5 g, und das Gesamtgewicht konnte vor der Geburt um etwa 30 % steigen. Nach etwa 10 Tagen Schwangerschaft war eine typische birnenförmige asymmetrische Bauchwölbung sichtbar, und harte Fötenmassen konnten durch Palpation spürbar werden, was sich vom gleichmäßigen und weichen Bauchumfang durch Fettleibigkeit unterschied.
Modellaufbau und Steuerungsgruppensetzung:
In der Modellgruppe wurden zwei trächtige Ratten zufällig ausgewählt und intraperitoneal mit VPA-Lösung (600 mg/kg) am Gestationstag 12,5 injiziert (GD12,5). VPA wurde per einzelner intraperitonealer Injektion in einer Dosis von 600 mg/kg am Gestationstag 12,5 verabreicht. Dieses Regime wurde auf Grundlage der grundlegenden Arbeiten von Schneider und Przewłocki26 ausgewählt, die zeigten, dass die VPA-Exposition zu diesem spezifischen Gestationszeitpunkt sowohl die neuroanatomischen als auch die Verhaltensmerkmale des menschlichen ASS wiederholt. Dieses Protokoll ist seitdem zum Standardmodell geworden und wurde in jüngsten pharmakologischen Studien mit identischen Parametern27 konsequent validiert. Für die Leerkontrollgruppe wurde eine trächtige Ratte ausgewählt und intraperitoneal mit einem gleichen Volumen von 0,9 % normaler Kochsalzlösung zur gleichen Zeit injiziert. Trächtige Ratten brachten natürlich zur Welt, und der Geburtstag der Nachkommen wurde als postnataler Tag 0 (PND0) vermerkt. Alle Nachkommen wurden auf PND21 entwöhnt und getrennt nach Geschlecht untergebracht.
Nachwuchsgruppierung und Intervention
Bei PND28 wurden 12 männliche Welpen zufällig aus den Nachkommen von VPA-exponierten trächtigen Ratten ausgewählt (6 in der Modellgruppe und 6 in der Quercetin-Interventionsgruppe), und 6 männliche Welpen wurden zufällig aus den Nachkommen normaler, salzhaltiger trächtiger Ratten ausgewählt (6 in der leeren Gruppe). Es wurde sichergestellt, dass es keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht zwischen den Welpen jeder Gruppe gab. Nachkommen von trächtigen Ratten, die mit normaler Kochsalzlösung behandelt wurden, wurden der Blankgruppe zugeordnet, jene von trächtigen Ratten mit VPA der Modellgruppe, und jene von schwangeren Ratten mit VPA der Quercetin-Interventionsgruppe.
Eine kontinuierliche Intervention wurde über 4 Wochen ab PND28 durchgeführt. Für die Quercetin-Interventionsgruppe wurde die Quercetin-Suspension täglich zu einer festen Zeit intragastrisch verabreicht, in einer Dosis von 100 mg/kg/Tag. Diese Dosierung wurde auf Grundlage folgender integrierter Evidenz ausgewählt: (i) Eine frühere Dosis-Intervallstudie identifizierte 100 mg/kg als optimale Dosis zur Linderung angstähnlicher Verhaltensweisen und zur Reduktion proinflammatorischer Zytokine in einem LPS-induzierten Neuroinflammations-Rattenmodell28; (ii) Quercetin mit 50 mg/kg wurde gezeigt, dass es soziale Interaktionsdefizite und oxidative Hirnschäden bei einem pränatalen VPA-induzierten Autismusrattenmodell29 verhindert; und (iii) wurde kürzlich gezeigt, dass orales Quercetin die TNF-α-Spiegel im Gehirn senkt und autistisch-ähnliche Verhaltensweisen in einem propionsäureinduzierten Autismus-Rattenmodell30 verbessert. Zusammen unterstützen diese unabhängigen Validierungen die Auswahl von 100 mg/kg, um eine robuste Einbindung des TNF-α-vermittelten Entzündungswegs im aktuellen postnatalen VPA-induzierten ASS-Modell sicherzustellen. Für die Blank- und Modellgruppen wurde täglich ein gleiches Volumen von 0,5 % CMC-Na-Kochsalzlösung intragastrisch verabreicht. Alle Tiere hatten während der Interventionsphase freien Zugang zu Futter und Wasser, und ihr Körpergewicht wurde wöchentlich gemessen, um das Verabreichungsvolumen an ihr Körpergewicht anzupassen.
Freifeldtest
Nach 4 Wochen Intervention (ca. PND56) wurde der Openfield-Test durchgeführt, um spontane Aktivität und Angstlevel zu bewerten. Der Open-Field-Test (OFT) ist ein klassisches Verhaltensexperiment zur Bewertung von angstbedingtem Verhalten bei Versuchstieren. Die gemessenen Indikatoren waren die spontane Bewegungsfähigkeit der Ratten in einer offenen Umgebung und die Zeit, die sie im Zentrum des offenen Feldes verbrachten. Das OFT-Gerät für Ratten war 30 cm hoch, 50 cm lang und unten 50 cm breit, mit weißen Innenwänden und künstlich in 16 kleine Gitter unterteilt, darunter 4 Gitter im Innenbereich und 12 Gitter im Außenbereich. Der Versuchsstandort wurde ruhig gehalten, um Schallstimulation zu vermeiden, die die Genauigkeit der experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen könnte. Jede Ratte wurde in die Mitte des Bodens der Box gelegt, und Videoaufnahmen sowie Zeitmessung wurden gleichzeitig durchgeführt. Das Kamerafeld deckte das gesamte offene Feld ab und dokumentierte die spontane Bewegung der Ratten sowie die Anzahl der Übergänge zwischen den Rastern. Jeder Test dauerte 5 Minuten, danach wurde die Videoaufnahme eingestellt. Die Innenwand und der Boden der offenen Box wurden mit 75 % Alkohol abgewischt, um zu verhindern, dass Kot und Körpergeruch eines Tieres die Testergebnisse des nächsten Tieres beeinflussen. Die Operation wurde nach dem Austausch der Ratten wiederholt, bis alle Ratten den Test abgeschlossen hatten.
Pathologische Detektionsmethode
Nach der Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd wurde das Gehirngewebe mit einem vollautomatischen Dehydratator einer Gradientendehydrierung unterzogen: 75 % Ethanol für 2 Stunden, 85 % Ethanol für 1 Stunden, 95 % Ethanol für 1 Stunde und absolutes Ethanol I-IV für jeweils 20 Minuten. Das Gewebe wurde dann 25 Minuten lang mit Reinigungsmittel I und 30 Minuten mit Reinigungsmittel II beseitigt, gefolgt von Paraffin-Einbettung. Abschnitte mit einer Dicke von 5 μm wurden jeweils 30 Minuten mit Entwachslösung I und II entwachst und mit Gradientenethanol rehydriert. Die Schnitte wurden 5–10 Minuten lang mit Hämatoxylin gefärbt, 3 Sekunden lang mit Salzsäurealkohol differenziert und mit alkalischem Wasser gegenfärbt, um blau zu werden. Anschließend wurden sie 3 Minuten lang mit alkohollöslichem Eosin gegenfärbt, mit Gradientenethanol dehydriert, geklärt, mit neutralem Montagemedium gedeckt und unter dem Mikroskop betrachtet.
Nachweis von TNF-α-Spiegeln im Serum und im Gehirngewebe
Nach der letzten Verabreichung wurde abdominales Aortenblut von Ratten entnommen und bei 3.000 U/min bei 4 °C für 15 Minuten zentrifugiert, wobei das Serumsupernatant entnommen wurde. Inzwischen wurden hippocampale und kortikale Gewebe seziert und vorgekühltes PBS im Verhältnis 1:9 zur mechanischen Homogenisierung hinzugefügt. Das Homogenat wurde dann mit 12.000 U/min bei 4 °C für 20 Minuten zentrifugiert, um das Supernatant zu sammeln. Die BCA-Methode wurde zur Quantifizierung von Gewebeproteinen verwendet. Nach den Anweisungen des ELISA-Kits wurden die zu testen Proben und biotinylierte Antikörper der Mikroplatte nacheinander hinzugefügt. Nach der Inkubation und Wäsche wurde der Avidinperoxidase-Komplex hinzugefügt und inkubiert. Nach einem weiteren Waschen wurde zur Farbentwicklung Substratlösung hinzugefügt, die Reaktion mit einer Stopplösung beendet und die Absorption mit 450 nm mittels Mikroplattenleser gemessen. Die Konzentrationen von TNF-α im Serum (pg/mL) und im Hirngewebe (pg/mg prot) wurden mit der Standardkurve berechnet.
Statistische Analyse
Die RANDBETWEEN-Funktion in Microsoft Excel wurde verwendet, um die Ratten zu randomisieren und zufällige Zahlen für die Rattenzuteilung zu generieren. Alle experimentellen Daten in dieser Studie wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Vor der statistischen Analyse wurden zunächst der Normalitätstest (Shapiro-Wilk-Test) und der Homogenitäts-Varianz-Test (Levene-Test) an den Daten jeder Gruppe durchgeführt. Für Daten, die der Normalverteilung und der Varianzhomogenität entsprachen, wurde eine Einweg-Varianzanalyse (Einweg-ANOVA) verwendet. Wenn der Unterschied statistisch signifikant war, wurde die LSD-Methode für mehrere Vergleiche weiter verwendet. Ein Wert von *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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Analyse der Ergebnisse der Netzwerkpharmakologie-Studie zu KSZZD bei der Behandlung von Autismus
Insgesamt wurden 15.770 autismusbezogene Ziele aus der GeneCards-Datenbank abgerufen. Ziele mit einem Relevanzwert ≥ 4,21 wurden als potenzielle Ziele für Autismus ausgewählt, was zu 1014 Krankheitszielen führte. Die 827 Ziele von KSZZD wurden mit den 1.014 Autismus-Zielen gekreuzt, und es wurden 125 gemeinsame Ziele erreicht. Die Visualisierung er...
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Eine entscheidende Frage ist, warum Quercetin anstelle anderer Kernkomponenten für die experimentelle Validierung ausgewählt wurde und ob es die ganzheitlichen Effekte von KSZZD repräsentieren kann. Diese Auswahl basierte auf folgenden konvergierenden Beweislinien: (i) In einem pränatalen VPA-induzierten Rattenmodell verhinderte Quercetin signifikant soziale Interaktionsdefizite und oxidative Hirnschäden29; (ii) In einem propionsäureinduzierten Autismusmodell senk...
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Dieses Werk ist Teil von Nr.: Zun Shi Ke He HZ Zi (2024) Nr. 54. Projekttitel: Studie zur therapeutischen Wirkung von Jiawei Kongsheng Zhenzhong Dan auf Autismus basierend auf dem BDNF-ERK-CREB-Signalweg.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5% CMC-Na Normalsalzlösung | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | Fahrzeug für Leer- und Modellgruppen und Quercetin-Suspension. |
| 0,9% Normalsalz | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | Fahrzeug für Leerkontroll-Mutterinjektionen. |
| 4% Paraformaldehyd in PBS | Thermo Scientific Chemicals | J61899.AK | Verwendet zur Fixierung von Hirngewebe. |
| 75% Alkohol | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | Verwendet zur Reinigung des Freifeldapparates zwischen den Tieren. |
| Absolutes Ethanol | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | Verwendet zur Gewebeentwässerung vor der Einbettung. |
| Alkalisches Wasser | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | Verwendet zum Blaufärben von Hämatoxylin-gefärbten Abschnitten. |
| Amber14SB Protein-Kraftfeld | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Protein-Kraftfeld, das für molekulardynamische Simulationen verwendet wird. |
| BATMAN-TCM Datenbank | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Online-Ziel-Screening-Datenbank: http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/ |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Verwendet für die Proteinquantifizierung von Gewebehomogenaten. |
| Bläuemittel | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7301 | Verwendet nach Hämatoxylin-Färbung zum Blaufärben von Zellkernen. |
| CDOCKER-Modul | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Halbflexibles Docking-Modul, das für molekulares Docking verwendet wird. |
| Klärungs-/Entwachungsmittel | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | Clear-Rite 3, 6901 | Kann für die Klärung und Entparaffinierung in Histologie-Workflows verwendet werden. |
| CytoNCA-Plugin | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Cytoscape-Plugin, das für die Analyse der Gradzentralität verwendet wird. |
| Cytoscape-Software | Nicht im Manuskript angegeben | Version 3.10.0 | Verwendet für Netzwerkvisualisierung und Protein-Protein-Interaktionsanalyse. |
| Discovery Studio-Software | Nicht im Manuskript angegeben | Versionen 2019 und 2021 | Verwendet für Rezeptorvorverarbeitung, Docking und Alanin-Scanning. |
| Draw Venn Diagram Online-Tool | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Online-Tool für Venn-Diagramme: http://bioinformatics.psb.ugent.be |
| Eosin-Y (alkoholisch) | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7111 | Verwendet für die cytoplasmatische Gegenfärbung bei H&E-Färbung. |
| Vollautomatischer Entwässerer | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | Verwendet zur Gradiententrocknung von fixiertem Hirngewebe. |
| GeneCards Datenbank | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Online-Datenbank zur Abfrage von Autismus-bezogenen Zielen: https://www.genecards.org/ |
| GraphPad Prism Software | Nicht im Manuskript angegeben | Version 9.5 | Verwendet für statistische Analyse und Grafiken. |
| Hämatoxylin-Färbelösung | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7211 | Verwendet für Kernfärbung bei H&E-Färbung. |
| HERB Datenbank | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Online-Datenbank zur ergänzenden Compound-Screening: http://herb.ac.cn |
| Salzsäurealkohol | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | Verwendet für die Differenzierung während der H&E-Färbung. |
| Metascape Plattform | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Online-Plattform für GO- und KEGG-Anreicherungsanalyse. |
| Mikroplatten-Reader | Thermo Scientific | Multiskan FC, 51119000 | Verwendet für Absorbanzmessung bei 450 nm. |
| Mikroskop | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | Verwendet zur Beobachtung von H&E-gefärbten Hirnschnitten. |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | Nicht angegeben | Verwendet zur Randomisierung von Ratten mit der RANDBETWEEN-Funktion. |
| Einbettungsmittel | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 4111 | Verwendet zum Abdecken und dauerhaften Einbetten von gefärbten Abschnitten. |
| Open-Field-Testapparat | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | 50 cm × 50 cm × 30 cm Box, die für Verhaltenstests verwendet wird. |
| Paraffin | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | Verwendet für Paraffin-Einbettung von Hirngewebe. |
| Phosphatpufferlösung (PBS), pH 7,4 | Gibco | 10010023 | Verwendet als vorgekühltes Puffermittel für Gewebehomogenisierung. |
| PLIP-Interaktionsfingerabdruck | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Verwendet für Protein-Ligand-Interaktionsfingerabdruckanalyse. |
| PubChem Datenbank | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Online-Datenbank zur Abfrage von SMILES-Identifiern: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ |
| Quercetin | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | Peroral verabreicht bei 100 mg/kg/Tag. |
| Rat TNF-α ELISA-Kit | Invitrogen | ERA56RB | Geeignet für TNF-α-Nachweis in Serum und Gewebehomogenaten. |
| Kühlzentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 16R, 75004383 | Verwendet für die Zentrifugierung von Serum und Gewebehomogenaten. |
| Schrödinger Suite Software | Schrödinger, LLC | Version 2024 | Verwendet zum Aufbau des molekulardynamischen Simulationssystems. |
| SPF-Grad Sprague-Dawley-Ratten | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht angegeben | 3 männliche und 3 weibliche Ratten, die für die Erstellung eines Tiermodells verwendet werden. |
| SPSS-Software | Nicht im Manuskript angegeben | Version 25.0 | Verwendet für statistische Analyse. |
| SRplot Plattform | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Online-Plattform zur Visualisierung: https://www.bioinformatics.com.cn/ |
| STRING Datenbank | Nicht im Manuskript angegeben | Version 12.0 | Verwendet zum Aufbau des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks: https://string-db.org/ |
| SwissTargetPrediction Plattform | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Online-Plattform zur Zielvorhersage: http://swisstargetprediction.ch/ |
| TCMSP Datenbank | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Online-Plattform zur Bioaktive-Compound-Screening: http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php |
| TIP3P Wassermodell | Nicht im Manuskript angegeben | Nicht anwendbar | Wassermodell, das für molekulardynamische Simulation verwendet wird. |
| UniProt Proteindatenbank |