Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur verifizierbaren Identifikation von Proteinen, die direkt mit LncRNA interagieren: Von kultivierten Zellen bis zum Maus-Hoden

Zusammenfassung

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur Identifizierung direkter lncRNA-Protein-Interaktionen.

Zusammenfassung

Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) haben sich als wichtige Regulatoren verschiedener biologischer Prozesse etabliert. Die molekularen Mechanismen, die den Funktionen der meisten lncRNAs zugrunde liegen, sind jedoch weiterhin schlecht verstanden. Die Identifizierung interagierender Proteine, insbesondere RNA-bindende Proteine (RBPs), ist eine Schlüsselstrategie zur Aufklärung der Funktion von lncRNA. Unter den verfügbaren Ansätzen wird die umfassende Identifikation von RNA-bindenden Proteinen (ChIRP) in Verbindung mit Massenspektrometrie aufgrund ihres einfachen Sondendesigns und des einfachen Arbeitsablaufs weit verbreitet. Konventionelles ChIRP basiert auf Paraformaldehyd-(PFA)-Vernetzung, die sowohl direkte RNA-Protein-Kontakte als auch indirekte, durch Brückenfaktoren vermittelte Interaktionen erfasst. Im Gegensatz dazu bewahrt UV-Vernetzung in Kombination mit strengen Waschbedingungen bevorzugt direkte RNA-Protein-Interaktionen. Mit dem lncRNA Tug1 als Modell wurden UV-Vernetzung und PFA-Vernetzung im ChIRP-Rahmen in kultivierten Zellen verglichen, was zeigte, dass UV-basiertes ChIRP für direkte lncRNA-Protein-Interaktionen bereichert. Dieser UV-basierte Workflow wurde anschließend auf Maus-Hoden ausgeweitet, bei denen Gewebe vor UV-Vernetzung in Einzelzell-Suspensionen dissoziiert wurden, was die Identifikation von Tug1-bindenden Proteinen im nativen Gewebekontext ermöglichte. Der Vergleich mit Zelllinien-abgeleiteten Interaktomen zeigte sowohl gemeinsame als auch gewebespezifische Akteure. Zwei geteilte direkte Interaktionen wurden unabhängig voneinander durch die verbesserte Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) validiert. Dieser UV-basierte ChIRP-Ansatz wird als cPDiRT bezeichnet (Proteine, die direkt mit einem RNA-Ziel interagieren). Gemeinsam ermöglicht cPDiRT die Identifizierung von lncRNA-bindenden Proteinen sowohl in kultivierten Zellen als auch in nativen Geweben. Die Kombination aus Gewebedissoziation und UV-Vernetzung bietet eine breit anwendbare Strategie zur Untersuchung direkter lncRNA-Protein-Interaktionen in verschiedenen Organsystemen.

Einleitung

Jüngste Hochdurchsatz-Transkriptomstudien haben Tausende von langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) entdeckt, die an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, von der Chromatinorganisation bis zur zellulären Signalübertragung ^1,2. Trotz ihrer weitverbreiteten Expression und funktionellen Bedeutung bleiben die molekularen Mechanismen der meisten lncRNAs schlecht definiert. Ein großes Hindernis ist die Identifikation ihrer physischen Proteinpartner, insbesondere RNA-bindender Proteine (RBPs)^3,4,5.

Aktuelle RNA-zentrierte Methoden basieren hauptsächlich auf chemischer Vernetzung, die sowohl direkte als auch indirekte RNA-Protein-Interaktionen erfasst. Daher eignen sich diese Ansätze eher für globale Interaktom-Kartierung als für die Identifizierung von echten direkten Kontakten⁶. Die umfassende Identifikation RNA-bindender Proteine gefolgt von Massenspektrometrie (ChIRP-MS) ist eine weit verbreitete Technik zur Kartierung von lncRNA-RBP-Interaktionen, da sie aufgrund ihres einfachen Sondendesigns und ihres effizienten Arbeitsablaufs ^7,8 weit verbreitet ist. Konventionelle ChIRP-MS verwendet Paraformaldehyd-(PFA)-Vernetzung, die sowohl direkte RNA-Protein-Kontakte als auch indirekte Assoziationen erfasst, die durch Brückenfaktoren ^9,10 vermittelt werden.

Im Gegensatz dazu bietet UV-Vernetzung bei 254 nm einen entscheidenden Vorteil. Er verknüpft RNA und Proteine kovalent nur, wenn sie sich in nahezu null Entfernungskontakt befinden (typischerweise <1 Å)¹¹. Dieser Prozess wandelt Wasserstoffbrücken in stabile kovalente Bindungen um und ermöglicht strenge Salzgehalts-Waschbedingungen, die nicht-kovalent gebundene indirekte Interaktoren entfernen. Daher bieten UV-basierte Ansätze eine höhere Spezifität für direkte RNA-Protein-Interaktionen als chemische Vernetzungsmethoden^12,13. Dennoch bleiben UV-basierte Ansätze in gewebeabgeleiteten lncRNA-Interaktomstudien wenig genutzt, hauptsächlich aufgrund von Bedenken hinsichtlich der Vernetzungseffizienz und begrenzter UV-Durchdringung.

Um direkte lncRNA-Protein-Interaktionen in einem physiologisch relevanten Kontext zu untersuchen, wurde die lncRNA Tug1 als Modellsystem ausgewählt. Tug1 stellt aufgrund seines starken Knockout-Phänotyps und seiner hohen Anreicherung im Hoden einen idealen Maßstab für die Validierung eines gewebekompatiblen Direktinteraktions-Workflows dar. Die genetische Ablation von Tug1 führt zu vollständiger männlicher Sterilität, beeinträchtigter Spermatogenese und abnormer Spermienmorphologie¹⁴. Darüber hinaus unterstützt Tug1 die Funktion der Sertoli-Zellen und die Integrität der Bluttestis-Barriere bei fettreichen Diätmäusen¹⁵. Trotz dieser gut etablierten Phänotypen sind die direkten Proteinpartner, die die Funktion von Tug1 im Hoden vermitteln—einem Organ, das eine große Anzahl von RBPs ausdrückt, die kürzlich experimentell profiliert^{wurden, 16}—unbekannt. Diese Wissenslücke spiegelt weitgehend die Tatsache wider, dass die meisten lncRNA-Protein-Interaktionskartierungsmethoden für kultivierte Zellsysteme entwickelt wurden.

Um diese Einschränkung zu beheben, wurde das ChIRP-Framework modifiziert, indem PFA-Vernetzung durch UV-Vernetzung ersetzt wurde, um Proteine einzufangen, die direkt mit Tug1 interagieren. Kandidaten-Interaktionen wurden unabhängig durch verstärkte Crosslinking-Immunpräzipitation und anschließend durch Deep Sequencing (eCLIP-seq)¹⁷ validiert. Der Arbeitsablauf wurde weiter auf Gewebeanwendungen ausgeweitet, indem frisches Maus-Hodengewebe vor UV-Vernetzung in Einzelzellen dissoziiert wurde. Dieser optimierte Ansatz wurde als cPDiRT bezeichnet (Aufnahme von Proteinen, die direkt mit einem RNA-Ziel interagieren).

Die Anwendung von cPDiRT auf Tug1 im Maustestikel ermöglichte direkte Interaktionskartierung im nativen Gewebekontext. Parallele Experimente in kultivierten Zellen lieferten einen nebeneinanderfolgenden Vergleich von PFA-basierten und UV-basierten Interaktionsprofilen. In Kombination mit unabhängiger eCLIP-Validierung erzeugte dieser Ansatz eine hochsichere Gruppe molekularer Partner, die während der Spermatogenese zur Funktion von Tug1 beitragen könnten. Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Erfassung von Proteinen, die direkt mit einer Ziel-lncRNA sowohl in kultivierten Zellen als auch in nativen Geweben interagieren. Durch die Definition des direkten Interaktoms von Tug1 im Hoden fördert diese Methode mechanistische Studien einer fruchtbarkeitsessentiellen lncRNA und bietet eine generalisierbare Grundlage zur Untersuchung von lncRNA-Protein-Interaktionen in Fortpflanzungs- und anderen komplexen Geweben.

Protokoll

Alle Lösungen wurden mit nukleasefreiem, proteasenfreiem, ultrareinem Wasser und Reagenzien hergestellt. Alle Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Alle Tierversuche wurden vom Tierethikkomitee der Nanjing Medical University genehmigt (Genehmigungsnummer: IACUC-1812003-4) und wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren (National Research Council, 8. Auflage) durchgeführt. Halte männliche C57BL/6 Mäuse (4 Wochen alt) unter einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus mit Ad-Libitum-Zugang zu Futter und Wasser. Minimieren Sie das Tierleiden, indem Sie so wenige Tiere wie möglich verwenden, um statistische Signifikanz zu erreichen. Mäuse werden gemäß genehmigten institutionellen Protokollen durch CO₂-Inhalation und anschließend zervikaler Verrenkung eingeschläfert.

1. Puffer bereiten

1. Bereite einen Zelllysepuffer vor.
   1. Bereiten Sie einen Zelllysepuffer vor, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM EDTA und 1 % SDS enthält.
   2. Fügen Sie unmittelbar vor der Anwendung 1 mM PMSF, einen Protasehemmer-Cocktail und einen spezialisierten RNase-Inhibitor hinzu.
      VORSICHT: SDS ist ein Haut- und Augenreizstoff. Vermeiden Sie das Einatmen von Staub oder Aerosolen. PMSF ist hochgiftig, wirkt als Cholinesterasehemmer und ist in wässriger Lösung instabil. Bereite PMSF sofort vor der Anwendung vor. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrillen beim Umgang mit diesen Reagenzien. Behandle PMSF in einer chemischen Abzugshaube.
2. Bereite einen Hybridisierungspuffer vor
   1. Bereiten Sie einen Hybridisierungspuffer vor, der 750 mM NaCl, 1 % SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA und 15 % Formamid enthält.
   2. Fügen Sie unmittelbar vor der Anwendung 1 mM PMSF, einen Protasehemmer-Cocktail und einen spezialisierten RNase-Inhibitor hinzu.
      HINWEIS: Formamid bei 4 °C lagern, geschützt vor Licht.
      VORSICHT: Formamid ist ein Teratogen- und Fortpflanzungsrisiko. Behandle Formamid in einer chemischen Abzugshaube, während du Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille trägst. Vermeiden Sie Einatmen und Hautkontakt.
3. Waschpuffer bereiten
   1. Bereiten Sie einen Waschpuffer vor, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 % NP-40, 0,1 % SDS und 0,5 % Natriumdeoxycholat enthält.
   2. Schützen Sie den Waschpuffer während der Lagerung vor Licht.
4. Bereite einen Proteinase-K-(PK)-Puffer vor
   1. Bereiten Sie einen PK-Puffer vor, der 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA und 0,5 % SDS enthält.
   2. Fügen Sie Proteinase K unmittelbar vor der Anwendung zu einer Endkonzentration von 5 % hinzu.

2. Sonden entwerfen und vorbereiten

1. Antisense-Sonden entwerfen
   1. Entwickle Antisense-Oligonukleotid-Sonden mit dem Online-Probe-Designer, der bei singlemoleculefish.com¹⁸ verfügbar ist.
2. Erhalten Sie biotinylierte Sonden
   1. Bestellen Sie Antisense-DNA-Sonden, die eine 3'-BiotinTEG-Modifikation enthalten.
3. Bereite den Sondenpool vor
   1. Verdünnen Sie jede Sonde einzeln auf 100 μM.
   2. Mische gleiche Volumina aller Sonden, um einen Probe-Pool zu erzeugen. Halten Sie eine endgültige kombinierte Oligonukleotidkonzentration von 100 μM.
   3. Lagern Sie das Sondenbecken bei -20 °C.
      HINWEIS: Empfohlene Designparameter der Sonde sind wie folgt: (i) eine Sonde pro 100 bp Ziel-RNA, (ii) Ziel-GC-Gehalt von 45 %, (iii) Sondenlänge von 20 nt und (iv) Abstand von 60–80 nt zwischen den Sonden.
      HINWEIS: Wenn die RNA die vom Sondendesigner akzeptierte Größengrenze überschreitet, wird die Sequenz vor dem Design in kleinere Segmente unterteilt. Ausschließen Sie repetitive Regionen und Regionen mit umfangreicher Sequenzhomologie.

3. Durchführung von Zellentnahme, Gewebedissoziation und UV-Vernetzung

1. Bereite UV-freie Steuerungen vor
   1. Bereiten Sie Kontrollproben parallel zu experimentellen Proben vor.
   2. Den UV-Quervernetzungsschritt in den Kontrollproben weglassen.
   3. Alle folgenden Verfahren, einschließlich Sonikation, RNA-Protein-Pulldown, RNA-Extraktion und Proteinextraktion, werden für beide Gruppen identisch durchgeführt.
      HINWEIS: Verwenden Sie die No-UV-Kontroll, um UV-abhängige RNA-Protein-Interaktionen von unspezifischer Hintergrundbindung zu unterscheiden.
2. Zellen entnehmen und UV-Vernetzung durchführen
   1. Waschkulturierte Zellen
      1. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um das Restkulturmedium zu entfernen.
   2. Crosslink-Zellen
      1. Verteilt 3 ml PBS gleichmäßig auf eine 15 cm große Kulturschale.
      2. Bestrahlen Sie Zellen in einem 254 nm UV-Quervernetzer mit einer Dosis von 4000 mJ/cm^².
   3. Sammeln Sie vernetzte Zellen
      1. Sammeln Sie Zellen in PBS nach Crosslinking.
      2. Zentrifugiere die Federung und entsorge das Überstandsmittel.
      3. Wiegen Sie das Pellet und bestätigen Sie eine Mindestportion von 500 mg pro Probe.
3. Trenne das Hodengewebe und führe UV-Vernetzung durch
   1. Bereite die Hoden vor
      1. Entkapseln der Hoden.
      2. Wasche das Taschentuch zweimal mit DMEM.
   2. Kollagenase-Verdauung durchführen
      1. Gewebe in DMEM mit 1 mg/mL Kollagenase IV bei 37 °C für 5–15 Minuten inkubieren.
      2. Setzen Sie die Verdauung fort, bis Samentubuli freigesetzt werden.
         HINWEIS: Verdauen Sie nicht länger als 15 Minuten.
   3. Waschen Sie die samenhaltigen Tubuli
      1. Zentrifugiere die Suspension bei 1000 × g für 1 Minute bei 4 °C.
      2. Entferne das Überwasser.
      3. Waschen Sie das Pellet mit 5–10 ml DMEM.
      4. Zentrifugiere erneut unter denselben Bedingungen.
   4. Führen Sie eine Trypsinverdauung durch
      1. Das Pellet in 0,25 % Trypsin mit 1 mg/ml DNase I resuspendieren.
      2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 5–15 Minuten.
         HINWEIS: Verdauen Sie nicht länger als 15 Minuten.
   5. Enzymatische Verdauung stoppen
      1. Fügen Sie ein gleiches Volumen DMEM hinzu, ergänzt durch 10 % FBS.
   6. Erzeugen Sie eine Einzelzell-Suspension
      1. Filtern Sie die Federung durch ein 70-μm-Zellsieb.
   7. Waschzellen
      1. Zentrifugiere Zellen bei 2000 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
      2. Entsorge das Supernatant.
      3. Waschen Sie das Pellet mit 5–10 mL PBS.
      4. Zentrifugiere erneut unter denselben Bedingungen.
   8. Vernetzte Hodenzellen
      1. Die Einzelzellen-Suspension in PBS wieder suspendieren.
      2. Verteilt die Suspension gleichmäßig auf eine 15 cm große Kulturschale.
      3. Bestrahlen Sie Zellen in einem 254 nm UV-Quervernetzer mit einer Dosis von 4000 mJ/cm^².
   9. Sammeln Sie vernetzte Zellen
      1. Für UV-freie Steuerungen sollten Sie auf Bestrahlung verzichten.
      2. Sammeln Sie Zellen in PBS.
      3. Zentrifugiere die Federung und entsorge das Überstandsmittel.
      4. Wiegen Sie das Pellet und bestätigen Sie eine Mindestportion von 500 mg pro Probe.
         HINWEIS: Die Anzahl der Mäuse, die benötigt werden, um etwa 500 mg Zellpellet zu erhalten, hängt vom Alter und der Gewebeausbeute ab. In dieser Studie wurden etwa 10–12 vier Wochen alte Mäuse verwendet.

4. Sonikation durchführen

1. Bereite Lysate vor.
   1. Zellpellets im Zelllysepuffer mit einem Verhältnis von 100 mg Pellet pro 1 mL Puffer wieder suspendieren.
   2. Gründlich mischen, um eine homogene Suspension zu erhalten.
2. Sonikatproben
   1. Sonikalysate mit einem Wasserbad-Sonikator oder einem fokussierten Ultraschallgerät.
   2. Setzen Sie die Sonikation fort, bis das Lysat visuell klar ist.
      HINWEIS: DNA-Fragmentierung durch Agarosegel-Elektrophorese überprüfen. Setzen Sie die Sonikation fort, bis die meisten DNA-Fragmente zwischen 1 kb und 2 kb liegen.

5. RNA-Protein-Pulldown durchführen

1. Eingabeproben sammeln
   1. Entfernen Sie Aliquoten von Lysat für Eingabekontrollen.
   2. Reservieren Sie etwa 10 μL für RNA-Analyse und 10 μL für die Proteinanalyse.
   3. Halten Sie die Eingangsproben während der Hybridisierung und Waschprozedur bei 37 °C.
2. Preclear-Lysate
   1. Fügen Sie jeder Probe 30 μL vorgewaschene magnetische Perlen hinzu.
   2. Proben bei 37 °C 30 Minuten inkubieren und sanft in einem Hybridisierungsofen mischen.
      HINWEIS: Wasche magnetische Perlen vor der Benutzung. Stellen Sie Perlenaliquoten für 1 Minute oder bis die Lösung klar ist, auf einen Magnethalter. Entferne die Aufbewahrungslösung komplett. Waschen Sie Perlen zweimal mit 500 μL Zelllysepuffer.
3. Entferne Preclearing-Perlen
   1. Stellen Sie Proben auf einen magnetischen Ständer.
   2. Übertragen Sie das Überdeckmittel in ein frisches Rohr.
   3. Wiederholen Sie die Übertragung einmal, um die Restperlen vollständig zu entfernen.
4. Hybridisieren von Sonden
   1. Fügen Sie jeder Probe zwei Bände des Hybridisierungspuffers hinzu.
   2. Fügen Sie Sonden im Verhältnis von 1 μL von 100 μM Probe-Stock pro 1 ml Lysat hinzu (Ergänzende Tabelle 1).
5. Inkubationshybridisierungsreaktionen
   1. Proben werden bei 37 °C mit Rundumdrehung 12–16 Stunden in einem Hybridisationsofen inkubiert.
6. Bereite Fangperlen vor.
   1. Waschen Sie 100 μL magnetische Perlen unmittelbar vor dem Ende der Hybridisierung dreimal mit einem Zelllysepuffer.
   2. Entferne nach der Endwäsche alle Restpuffer.
7. Erfassungssondengebundene Komplexe
   1. Kurz Zentrifugen-Hybridisierungsreaktionen.
   2. Lassen Sie die gewaschenen Perlen in 1 ml hybridisierter Probe wieder suspendieren.
8. Binde Komplexe an Perlen
   1. Bringen Sie die Perlenfederung wieder in das Originalrohr zurück.
   2. Bei 37 °C bebrüten und 30–40 Minuten mischen.
9. Perlen wiederherstellen
   1. Kurz Zentrifugenproben.
   2. Stellen Sie Schläuche für 1–2 Minuten oder bis die Lösung klar ist, auf einen magnetischen Halter.
   3. Entsorge das Supernatant.
   4. Entfernen Sie die Restflüssigkeit mit einer Pipettenspitze.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, das magnetische Perlenpellet während der Flüssigkeitsentfernung zu stören.
10. Wash eroberte Komplexe
    1. Gib 1 ml Waschpuffer hinzu.
    2. Waschen Sie die Perlen bei 37 °C und mischen Sie kontinuierlich 5 Minuten.
    3. Wiederhole das Waschverfahren fünfmal.
       HINWEIS: Der Waschpuffer enthält 1 M NaCl, das nicht-kovalente Protein-Protein- und Protein-RNA-Interaktionen stört und gleichzeitig kovalente UV-induzierte Querbindungen bewahrt. Diese strengen Bedingungen entfernen indirekte Interaktoren und unspezifischen Hintergrund und bereichern so direkte Proteinpartner¹⁹.
11. Reservematerial für RNA-Analyse
    1. Übertragen Sie 1 % bis 10 % der gewaschenen Perlen in ein frisches Röhrchen zur RNA-Analyse.
    2. Verwenden Sie die restlichen Perlen sofort zur Proteinextraktion oder lagern Sie sie bei -80 °C.
       HINWEIS: Pausieren Sie das Protokoll hier, falls nötig. Bewahren Sie die Perlenproben bei -80 °C auf, bis die Proteinextraktion erfolgt.
12. Elute-Proteine
    1. Füge den Perlen einen SDS-Sample-Puffer hinzu.
    2. Proben bei 95 °C für 30 Minuten kochen, um Proteine zu elutieren und Crosslinks umzukehren.
    3. Fahren Sie mit der Massenspektrometrieanalyse fort.

6. RNA extrahieren

1. Verdauungsproteine
   1. Resuspendiere perlengebundene RNA-Proben in 100 μL PK-Puffer.
   2. Stellen Sie die RNA-Eingabeproben mit einem PK-Puffer auf ein Endvolumen von 100 μL an.
2. Inkubieren mit Proteinase K
   1. Proben bei 50 °C für 45 Minuten mit kontinuierlichem Mischen inkubieren.
3. Inaktiviere Proteinase K
   1. Erhitze die Proben bei 95 °C für 10 Minuten.
4. Fügen Sie Trizol-Reagenz hinzu
   1. Fügen Sie jeder Probe 500 μL Trizol-Reagenz hinzu.
   2. Vortex gründlich.
   3. Inkubiere 5 Minuten bei Zimmertemperatur.
      VORSICHT: Das Trizol-Reagens enthält Phenol und Guanidinthiocyanat. Behandle das Reagenz in einer chemischen Abgashaube, während du Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille trägst. Vermeiden Sie Einatmen und Hautkontakt. Wenn Hautkontakt auftritt, waschen Sie sofort mit Seife und Wasser.
5. Phasentrennung durchführen
   1. Fügen Sie jeder Probe 100 μL Chloroform hinzu.
   2. Vortex gründlich.
   3. Inkubiere 5 Minuten bei Zimmertemperatur.
6. Recover die wässrige Phase
   1. Zentrifugiere Proben bei 4 °C für 15 Minuten.
   2. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Rohr.
7. RNA an Reinigungssäulen binden
   1. Fügen Sie der wässrigen Phase ein gleiches Volumen 100 % Ethanol hinzu.
   2. Gründlich mischen.
   3. Proben auf RNA-Reinigungssäulen laden.
8. RNA reinigen
   1. Führen Sie die RNA-Reinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
   2. Elutierte RNA in 30 μL nukleasefreiem Wasser.
9. RNA-Anreicherung mit qRT-PCR überprüfen
   1. Verwenden Sie pro Reaktion 1 μL eluierte RNA für quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR).
   2. Bewertung der Ziel-RNA-Anreicherung im Vergleich zu Kontrollen.

7. LC-MS/MS-Analyse durchführen

1. Proteine getrennt nach SDS-PAGE
   1. Proteine, die in Schritt 5.12 gewonnen wurden, mit 4× LDS-Probenpuffer mischen.
   2. Trenne Proteine auf einem 4%–12%-Bis-Tris-Gel.
   3. Färbe das Gel mit einem Silberfärbungsset.
   4. Eliminiere die gesamte Proteinbahn als ein einziges Band.
2. Verbrauchsgelstücke
   1. Entfernen Sie das Proteinband mit einem sauberen Skalpell.
   2. Minimiere die Menge an überschüssigem Gel.
   3. Schneiden Sie das Gel in etwa 1 mm^{und 3} Stücke.
   4. Übertrage Gelstücke in ein 0,5-mL-Rohr.
3. Entstain-Gel-Stücke
   1. Gib 100 μL Entfärbungslösung hinzu.
   2. Vortex für 10 Minuten.
   3. Zentrifugiere bei 14.000 × g für 1 Minute.
   4. Entferne das Überwasser.
   5. Wiederholen Sie das Verfärbungsverfahren, bis die Gelstücke durchsichtig sind.
4. Proteine reduzieren
   1. Fügen Sie 100 μL Reduktionslösung hinzu.
   2. Inkubiere bei 56 °C für 30 Minuten.
   3. Proben auf Zimmertemperatur abkühlen.
   4. Zentrifugiere kurz und entferne das Supernatant.
5. Alkylatproteine
   1. Fügen Sie 100 μL Alkylationslösung hinzu.
   2. Inkubiere bei Zimmertemperatur 20 Minuten im Dunkeln.
   3. Entferne das Überwasser.
   4. Wasche Gelstücke mit 100 μL Verdauungspuffer für 5 Minuten.
6. Verdauungsproteine
   1. Fügen Sie genügend Trypsinlösung hinzu, um die Gelstücke vollständig zu bedecken.
   2. Inkubieren bei 37 °C für 16–18 Stunden.
7. Extraktpeptide
   1. Fügen Sie 30 μL Extraktionslösung hinzu.
   2. Sonicate 15 Minuten oder Vortex 30 Min.
   3. Zentrifugiere bei 14.000 × g für 1 Minute.
   4. Übertragen Sie das Überdeckmittel in ein frisches Rohr.
   5. Wiederhole das Extraktionsverfahren zweimal.
   6. Sammelt alle Extrakte.
   7. Trocken gepoolte Extrakte in einem Vakuumkonzentrator für etwa 1 Stunde.
8. Peptide mit einem StageTip reinigen
   1. Trocknete Peptide in 20 μL 0,1% Ameisensäure (FA) resuspendieren.
   2. Laden Sie Samples auf einen C18 StageTip.
   3. Zentrifugiere bei 1.000 × g für 2 Minuten.
   4. Waschen Sie den StageTip mit 20 μL 0,1 % FA.
   5. Elutieren Sie Peptide mit 20 μL 60 % Acetonitril/0,1 % FA in ein LC-MS-Fläschchen.
   6. Trockne das Eluate.
   7. Resuspendiere Peptide in 10 μL mit 0,1 % FA.
      HINWEIS: Pausieren Sie das Protokoll hier, falls nötig. Lagere gereinigte Peptide bei -80 °C vor der LC-MS/MS-Analyse.
9. LC-MS/MS-Daten erfassen
   1. Rekonstituiert die Peptide in 0,1 % Ameisensäure.
   2. Isoliere Peptide auf einer 75 μm × 250 mm C18 Analysesäule bei einer Durchflussrate von 300 nL/min.
   3. Verwenden Sie den folgenden Lösungsmittel-B-Gradienten (0,1 % Ameisensäure in Acetonitril):
      2%–25% B über 0–40 Minuten
      25%–40% B über 40–48 Minuten
      40%–99% B über 50–57 Minuten
      Halte 3 Minuten bei 99% B
   4. Betreiben Sie das Massenspektrometer im datenabhängigen Erfassungsmodus.
   5. Vollscan-MS-Spektren über einen m/z-Bereich von 350–1200 mit einer Auflösung von 70.000 zu erfassen.
   6. Nehmen Sie fünfzehn aufeinanderfolgende Hochenergie-Kollisionsdissoziationen (HCD) MS/MS-Scans mit einer Auflösung von 17.500 auf.
   7. Nehmen Sie pro Scan einen Mikroskop auf.
   8. Setze den dynamischen Ausschluss auf 30 S.
10. Prozess-Massenspektrometriedaten
    1. Verarbeiten Sie Rohdaten mit MaxQuant (v2.1.0.0).
    2. Suche Spektren gegen Mausproteinsequenzen, die von UniProt heruntergeladen wurden.
    3. Spezifizieren Sie Trypsin als Verdauungsenzym.
    4. Erlauben Sie maximal zwei verpasste Dekolletés.
    5. Spezifizieren Sie die Methioninoxidation als variable Modifikation.
    6. Spezifizieren Sie die Cysteincarbamidomethylierung als feste Modifikation.
    7. Stellen Sie die Massentoleranzen für Vorläufer und Fragmente auf 15 ppm bzw. 20 ppm ein.
    8. Kontrollieren Sie die Falschentdeckungsrate bei 1 % sowohl auf Peptid- als auch auf Proteinniveau.
    9. Schätzung der Proteinhäufigkeit mit iBAQ-basierter label-freier Quantifizierung.

8. Durchführung von Genontologie-Anreicherungsanalysen

1. Funktionale Anreicherung analysieren
   1. Führen Sie eine Gene Ontology (GO)-Anreicherungsanalyse mit dem clusterProfiler R-Paket (v4.6.0) durch.
   2. Verwenden Sie die GO-Datenbank (v2024-09-20) als Quelle für die Referenzannotation.
   3. Wenden Sie die Benjamini-Hochberg-Korrektur für mehrere Tests an.
   4. Definieren Sie statistische Signifikanz als einen bereinigten P-Wert (FDR) < 0,05.

9. Durchführung von eCLIP-seq-Validierung

1. Bereite eCLIP-Samples vor
   1. Führen Sie die verstärkte Crosslinking Immunoprezipitation (eCLIP) wie zuvor beschrieben^{durch 17}.
   2. Bereite UV-vernetzte Zellproben für die Immunpräzipitation von PABPC1 und CCT3 vor.
   3. Lyse-Proben mit eCLIP-Lysis-Puffer.
2. Immunpräzipitate RNA-Protein-Komplexe
   1. Gib 10 μg Antikörper zu jeder Probe hinzu.
   2. RNA-Protein-Komplexe auf magnetischen Perlen einfangen.
   3. Sammeln Sie Eingabeproben vor der Immunpräzipitation.
3. RNA-Bibliotheken bereiten
   1. Dephosphorylierte proteingebundene RNAs.
   2. Ligatieren Sie einen 3' RNA-Adapter an die wiedergewonnene RNA.
   3. Waschen Sie immunpräzipitierte und Eingabeproben unter strengen Bedingungen.
   4. Eliutieren Sie Komplexe, indem Sie die Perlen kochen.
   5. Proben werden auf einem 4%–12%-Bis-Tris-Gradienten-Gel aufgelöst.
   6. Übertragen Sie getrennte Komplexe auf eine Nitrocellulosemembran.
4. RNA wiederherstellen
   1. Entfernen Sie eine größenangepasste Membranregion.
   2. Proteine werden mit Harnstoff und Proteinase K verdaulich.
   3. RNA aus der Membran gewinnen.
5. Sequenzierungsbibliotheken erstellen
   1. Reverse-transkribierte RNA in cDNA.
   2. Reinigen Sie cDNA mit einer Exonuklease-I- und Garnelen-alkalischen Phosphatase-Mischung.
   3. Ligatiere einen DNA-Adapter mit T4-RNA-Ligase an das 3'-Ende der cDNA.
   4. Bibliotheken mit einer hochpräzisen DNA-Polymerase zu verstärken.
   5. Separate verstärkte Bibliotheken auf einem 3%-niedrigschmelzenden Agarosegel.
   6. Reinigen Sie größenselektierte Bibliotheken mit einem Gelextraktionskit.
   7. Sequenzbibliotheken auf einer Illumina-Plattform.
6. Analysieren Sie eCLIP-seq-Daten
   1. Sequenzierungsdaten mit der ENCODE eCLIP-Pipeline²⁰ analysieren.
   2. Trimmadapter und 3'-Adapter-Dimer mit Cutadapt (v1.14).
   3. Align liest auf UCSC-Wiederholungselemente mit STAR (v2.7.6a).
   4. Lesungen entfernen, die auf wiederholende Elemente abgebildet werden.
   5. Richten Sie die verbleibenden Reads auf das mm10-Referenzgenom (GENCODE vM23) aus.
   6. Entferne PCR-Duplikate.
   7. Identifizieren Sie angereicherte Bindungsstellen mit CLIPPER.
   8. Definiere signifikante Spitzen als solche mit Faltenanreicherung ≥ 8 und bereinigtem P ≤ 0,001.
   9. Identifizieren Sie reproduzierbare Spitzen unter Verwendung einer irreproduzierbaren Entdeckungsrate-(IDR)-Schwelle von 0,01.

Ergebnisse

Um Tug1-bindende Proteine zu identifizieren, wurde UV-Vernetzung in den ChIRP-Workflow integriert und eine Methode mit der Bezeichnung cPDiRT etabliert (Abbildung 1). Konventionelles ChIRP wurde erstmals in GC2-Zellen durchgeführt, um Tug1-interagierende Proteine zu bereichern (Abbildung 2A, B). Massenspektrometrieanalyse identifizierte mehr als 190 Proteine, die relativ zur negativen Kontrolle...

Diskussion

cPDiRT wurde als modifiziertes ChIRP-basiertes Protokoll entwickelt, das Paraformaldehyd-(PFA)-Crosslinking durch UV-Crosslinking ersetzt, um gezielt direkte lncRNA-Protein-Interaktionen zu erfassen. Durch die Kombination der enzymatischen Dissoziation von frischem Hodengewebe in Einzelzellen mit UV-Vernetzung wurde die direkte Interaktionskartierung von kultivierten Zelllinien auf native Gewebe ausgeweitet. Parallele Experimente in kultivierten Zellen ermöglichten einen nebeneinanderfol...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25% Trypsin-EDTA-Lösung	Gibco	25200056	zur Gewebedissoziation und Herstellung von Einzelzellsuspensionen
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	zur RNA-Aufreinigung
AffinityScript Reverse Transkriptase	Agilent	600107	für eCLIP-cDNA-Synthese
Anti-CCT3-Antikörper	Abcam	Ab225878	Antikörper für eCLIP
Anti-PABPC1-Antikörper	Abcam	Ab312314	Antikörper für eCLIP
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	zur RNA-Extraktion
Kollagenase Typ IV	Sigma-Aldrich	C5138	zur enzymatischen Dissoziation von Hodengewebe
Dephosphorylierungsreagenzien (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	zur Dephosphorylierung von eCLIP-RNA
DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt	Gibco	11965092	zur Zellkultur und als Puffer für Gewebedissoziation
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetische Perlen	Thermo Fisher Scientific	65001	zur Kapselung von biotinylierten Probe-RNA-Protein-Komplexen
DynaMag-15 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12301D	zur magnetischen Perlenabtrennung
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	zur magnetischen Perlenabtrennung
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	zur Chelatierung von zweiwertigen Kationen in Lysis- und Waschpuffern
Exonuklease I	New England Biolabs	M0293S	zur eCLIP-cDNA-Reinigung
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco	10099141C	zum Stoppen der Trypsinverdauung
Formamid	Thermo Fisher Scientific	AM9342	zur Hybridisierungspufferzubereitung
Hybridisierungsofen	TUOHE	LF-I	zur Hybridisierung von Sonden und zum Waschen der Perlen
Agarose mit niedriger Schmelztemperatur	Sigma-Aldrich	A9414	zur Größenselektion von eCLIP-Bibliotheken
MinElute Gel-Extraktions-Kit	Qiagen	28604	zur Größenselektion von eCLIP-Bibliotheken
miRNeasy Mini-Kit	Qiagen	217004	zur RNA-Reinigung
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	zur Herstellung von Hochsalz-Waschpuffer
Nitrozellulosemembran	GE Healthcare / Amersham	10600002	zur Western Blot Übertragung von eCLIP
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	für Waschpufferdetergentien
Nukleasen- und Protease-freies Wasser	Thermo Fisher Scientific	10977035	zur Herstellung nucleasenfreier Lösungen
NuPAGE 4-12% Bis-Tris-Gel	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	zur Größenselektion von eCLIP
NuPAGE Bis-Tris-Fertiggele	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	zur SDS-PAGE-Proteintrennung
PBS (pH 7,4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	zum Zellwaschen und Resuspendieren
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Serinprotease-Inhibitor für Zelllysepuffer; frisch vor der Verwendung zugegeben
Proteaseinhibitor-Cocktail	Roche	4693132001	Breitspektrum-Proteaseinhibitor für Zelllysepuffer; frisch vor der Verwendung zugegeben
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850	zur Proteinverdauung bei RNA-Extraktion
qRT-PCR-Mastermix	Thermo Fisher Scientific	11704044	zur quantitativen RT-PCR zur Bestätigung der RNA-Anreicherung
RNase/Protease-freie DNase I-Lösung	Thermo Fisher Scientific	EN0521	zur Gewebedissoziation
RNeasy Mini-Kit	Qiagen	74104	zur RNA-Reinigung
SDS-PAGE-Probenfärbemittel	Beyotime	P0286	zur Proteinprobenvorbereitung
Shrimp Alkaline Phosphatase	New England Biolabs	M0371S	zur eCLIP-cDNA-Reinigung
Silberfärbe-Kit	Beyotime	P00175	zur Visualisierung von Proteinen in SDS-PAGE-Gelen
Natriumdeoxycholat	Sigma-Aldrich	D6750	für Waschpufferdetergentien
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	zur Zelllyse und Proteindenaturation
Superase-in RNase-Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	spezialisierter RNase-Inhibitor; frisch vor der Verwendung zugegeben
T4-RNA-Ligase	New England Biolabs	M0204	zur eCLIP-Adapterligierung
Tris–HCl (pH 7,0)	Sigma-Aldrich	T5941	zur Herstellung von Lyse-, Hybridisierungs- und Waschpuffern
TRIzol-Reagenz	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	zur RNA-Extraktion
Ultraschall-Zellbrecher	ATPIO	ATPIO-650D	zur Zelllyse und DNA-Fragmentierung
Ultraviolett-Quervernetzer	Analytik Jena	UVP CL-1000	zur UV-Quervernetzung von RNA-Protein-Interaktionen
Harnstoff	Sigma-Aldrich	U5128	zur eCLIP-Proteindegradation auf der Membran