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L5-Lumbale Laminektomie bei gealterten C57BL/6J-Mäusen zur Modellierung der postoperativen kognitiven Dysfunktion

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DOI:

10.3791/71733

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22. September 2026

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1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte L5-lumbale Laminektomie an alten C57BL/6J-Mäusen, um ein Modell für postoperative kognitive Dysfunktion zu etablieren und gleichzeitig motorische Beeinträchtigungen zu minimieren, wodurch Verhaltens-, histologische und mechanistische Untersuchungen perioperativer neurokognitiver Störungen unterstützt werden.

Zusammenfassung

Die postoperative kognitive Dysfunktion (POCD) ist eine häufige neurologische Komplikation nach chirurgischen Eingriffen und Narkose, insbesondere bei älteren Erwachsenen, und ist mit einer verzögerten Genesung, verlängerter Krankenhausaufenthaltsdauer und verminderten Lebensqualität assoziiert. Orthopädische und Wirbelsäuleneingriffe sind mit einem relativ hohen Risiko für POCD verbunden; präklinische Modelle, die die perioperativen Merkmale eines Wirbelsäuleneingriffs genau widerspiegeln, sind jedoch weiterhin begrenzt. Häufig verwendete Modelle, wie beispielsweise Laparotomie und Schienbeinfraktur, können eine anhaltende motorische Beeinträchtigung und eine verlängerte periphere Entzündung hervorrufen, was die Interpretation kognitiver Verhaltensergebnisse erschweren kann. In der vorliegenden Arbeit wird ein standardisiertes, kostengünstiges Protokoll zur Modellierung der POCD mittels L5-Lendenlaminektomie unter Sevofluran-Narkose bei 18 Monate alten männlichen C57BL/6J-Mäusen beschrieben. Der Eingriff wird mit herkömmlichen chirurgischen Instrumenten durchgeführt und erzeugt eine kontrollierte chirurgische Verletzung, wobei anhaltende motorische Defizite minimiert werden. Die kognitive Funktion wird mittels Erkennungstest für neues Objekt, Y-Maze mit neuem Arm und Barnes-Maze evaluiert, während hippocampale neuronale Schädigungen und neuroinflammatorische Veränderungen durch Nissl-Färbung bzw. Iba1-Immunfluoreszenz nachgewiesen werden. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine erhaltene motorische Aktivität, beeinträchtigte kognitive Leistung, verminderte neuronale Integrität im Hippocampus und verstärkte hippocampale Neuroinflammation nach dem Eingriff. Dieses standardisierte und zugängliche Modell bietet eine klinisch relevante Grundlage zur Untersuchung der Mechanismen, die der kognitiven Dysfunktion im Zusammenhang mit Wirbelsäulenchirurgie zugrunde liegen, sowie zur Bewertung potenzieller neuroprotektiver perioperativer Interventionen.

Einleitung

Die postoperative kognitive Dysfunktion (POCD) ist definiert als ein Rückgang der Lern- und Gedächtnisleistung, der Aufmerksamkeit, der Verarbeitungsgeschwindigkeit und der exekutiven Funktionen nach Anästhesie und Operation1, wobei vor allem ältere Patienten betroffen sind; die berichtete Inzidenz variiert je nach Operationskontext und Patientenkollektiv2,3. Die POCD tritt häufig bei älteren Erwachsenen auf, die sich einer elektiven orthopädischen Operation unterziehen4. Klinisch kann die POCD wochen- bis monatelang nach der Operation anhalten und ist mit verlängerter Krankenhausbehandlung und erhöhter Letalität assoziiert5,6,7. Angesichts der fortschreitenden Alterung der Bevölkerung und der weltweit steigenden Zahl an Operationen ist die POCD zu einem wichtigen Problem der öffentlichen Gesundheit und der perioperativen Versorgung geworden.

Pathophysiologisch wird die postoperative kognitive Dysfunktion (POCD) als multifaktorielles Syndrom betrachtet, das durch chirurgisches Trauma und Exposition gegenüber Anästhetika ausgelöst wird, wobei Neuroinflammation, oxidativer Stress, Dysregulation der Autophagie und synaptische Dysfunktion zu den vorgeschlagenen Mechanismen neuronaler Funktionsstörungen in kognitiv relevanten Hirnarealen wie dem Hippocampus gehören8. Um diese Mechanismen zu untersuchen und potenzielle therapeutische Ansätze zu bewerten, wurden verschiedene präklinische POCD-Paradigmen entwickelt. Dazu zählen Modelle mit alleiniger Anästhesie, Modelle basierend auf Bauchoperationen sowie orthopädische Verletzungsmodelle wie die Tibiafraktur9. Obwohl diese Modelle das Forschungsfeld vorangebracht haben, bilden sie möglicherweise nicht alle perioperativen Merkmale, die für Eingriffe an der Wirbelsäule relevant sind, vollständig ab. Zudem können einige Modelle Störfaktoren wie anhaltende motorische Defizite und verlängerte Gewebeentzündungen einführen, die die kognitiven Messergebnisse sowie die Interpretation der zugrundeliegenden Mechanismen erschweren.

Unter den verfügbaren chirurgischen Strategien wählten wir ein Modell der L5-Lendenlaminektomie, um frühe postoperative kognitive Beeinträchtigungen in einem standardisierten und wirbelsäulenspezifischen chirurgischen Kontext zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht eine kontrollierte, lokal begrenzte chirurgische Noxe unter inhalativer Anästhesie und erlaubt die Untersuchung postoperativer neuroinflammatorischer Reaktionen und kognitiver Dysfunktionen, ohne offensichtliche motorische Beeinträchtigungen hervorzurufen. Durch die Optimierung zentraler operativer Schritte bietet dieses Protokoll eine standardisierte, praktikable und kosteneffiziente Methode zur Erforschung kognitiver Störungen im Zusammenhang mit Wirbelsäulenchirurgie sowie zur Bewertung perioperativer neuroprotektiver Strategien.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt und von dem Ausschuss für Tierversuche der Zhejiang-Universität genehmigt (Genehmigungsnummer für die Tierversuche: ZJU20260153).

1. Präoperative Vorbereitung

  1. Experimentelle Tiere, Gruppeneinteilung, Analgesie und Verblindung
    1. Verwenden Sie 18 Monate alte männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 30–34 g. Haltung der Mäuse unter einem 12-Stunden-Licht-/Dunkelzyklus mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
    2. Lassen Sie die Mäuse sich mindestens 7 Tage vor der Operation an die Haltungsbedingungen akklimatisieren. Weisen Sie die Mäuse nach der Akklimatisierung zufällig der L5-Laminektomie-Gruppe oder der Kontrollgruppe zu.
    3. Weisen Sie jeder Maus eine codierte Identifikationsnummer vor den experimentellen Verfahren zu. Bewahren Sie den Gruppencodierungsschlüssel auf, sodass die Verhaltensbewertungen verblindet bezüglich der Behandlung durchgeführt werden können.
    4. Unterziehen Sie die Mäuse der L5-Laminektomie-Gruppe einer Narkose mit Sevofluran, gefolgt von einer L5-lumbalen Laminektomie. Exponieren Sie die Mäuse der Kontrollgruppe weder gegenüber Sevofluran-Narkose, Vorbereitung der Operationsstelle noch einem chirurgischen Eingriff.
    5. Verabreichen Sie Meloxicam subkutan in einer Dosis von 2 mg/kg an die Mäuse beider Gruppen. Verabreichen Sie die erste Dosis nach der Narkoseeinleitung in der L5-Laminektomie-Gruppe und zum Zeitpunkt, der dem Ende der Operation in der Kontrollgruppe entspricht.
    6. Verabreichen Sie nachfolgende Dosen von Meloxicam subkutan in einer Dosis von 2 mg/kg alle 24 h über einen Zeitraum von 48 h an die Mäuse beider Gruppen. Haltung, Handhabung und Überwachung beider Gruppen erfolgen unter identischen Bedingungen während des gesamten Versuchszeitraums.
    7. Führen Sie alle Verhaltensbewertungen gemäß dem gleichen experimentellen Zeitplan für beide Gruppen durch. Stellen Sie sicher, dass der Untersucher, der die Verhaltensbewertungen durchführt, bezüglich der Gruppeneinteilung verblindet bleibt.
  2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und desinfizieren Sie den Operationsarbeitsplatz. Heizen Sie eine Wärmematte vor, um die Körpertemperatur während der Narkose zu erhalten. Bereiten Sie Meloxicam für die perioperative Verabreichung vor.
  3. Schalten Sie das Gasnarkosegerät ein und stellen Sie die Maus in eine Induktionskammer. Induzieren Sie eine Vollnarkose mit 3–5 % Sevofluran über 3–5 min bei einem Sauerstofffluss von 1 L/min.
  4. Überführen Sie die narkotisierte Maus auf die Operationsplattform. Erhalten Sie die Narkose mit 1,5–3 % Sevofluran, das über eine Narkosemaske bei einem Sauerstofffluss von 0,5–0,8 L/min appliziert wird. Verabreichen Sie Meloxicam subkutan in einer Dosis von 2 mg/kg. Die gesamte Narkosedauer, gemessen ab Beginn der Sevofluran-Induktion, beträgt etwa 4 h. Passen Sie die Sevofluran-Konzentration nach Bedarf an, um eine stabile chirurgische Narkosetiefe aufrechtzuerhalten.
  5. Positionieren Sie die Maus in Bauchlage mit der Lendenwirbelsäule nach oben. Sichern Sie die Vordergliedmaßen vorsichtig mit Klebeband, um das Tier zu stabilisieren und freien Zugang zum chirurgischen Feld an L5 zu gewährleisten.
  6. Überprüfen Sie eine ausreichende Narkosetiefe durch Kontrolle des Fehlens des Fußreflexes. Tragen Sie ein Augensalbe auf, um eine Hornhauttrockenheit zu verhindern.
  7. Entfernen Sie das Fell aus dem mittigen lumbalen Bereich (ungefähr L3–S1) mithilfe eines Kleintierhaarschneiders. Desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 75 %igem Ethanol, danach mit Povidon-Jod, und wiederholen Sie den Vorgang 2–3-mal, um aseptische Bedingungen sicherzustellen.

2. L5-Lendenlaminektomie-Chirurgie

HINWEIS: In dem vorliegenden Protokoll wurden alle chirurgischen Schritte unter direkter Sichtkontrolle ohne Stereomikroskop oder Vergrößerungsokulare durchgeführt.

  1. Legen Sie die anästhetisierte Maus in Bauchlage auf eine vorgewärmte Operationsplattform. Sichern Sie die Vordergliedmaßen mit Klebeband, um den Körper zu stabilisieren und die Lendenregion vollständig freizulegen (Abbildung 1).
  2. Identifizieren Sie die Wirbelebene L5 anhand von Oberflächenmerkmalen. Palpieren Sie die beidseitigen Darmbeinkämme und ziehen Sie eine imaginäre Querlinie durch ihre höchsten Punkte.
  3. Verwenden Sie die Querlinie als ungefähres Orientierungsmal für den L5–L6-Zwischenwirbelraum. Zentrieren Sie den geplanten Hautschnitt leicht kranial zu dieser Linie, um die L5-Lamina anzusteuern.
  4. Desinfizieren Sie die Operationsstelle. Führen Sie einen medianen, längsverlaufenden Hautschnitt von etwa 1,5–2,0 cm Länge über der vorbestimmten L5-Ebene durch, um die Region L4–L6 freizulegen.
  5. Retrahieren Sie die Hautränder mit sterilen Pinzetten. Legen Sie die dorsale Faszie frei und identifizieren Sie die mediane Fasziennaht.
  6. Bestätigen Sie die Wirbelebene nach Freilegung der Wirbelsäule. Identifizieren Sie den lumbosakralen Übergang und den kaudalsten Lendenwirbel.
  7. Identifizieren Sie L5 als den Wirbel unmittelbar kranial von L6, da C57BL/6-Mäuse typischerweise sechs Lendenwirbel besitzen. Bestätigen Sie die Ebene durch Zählen von zwei Wirbeln kranial vom lumbosakralen Übergang.
  8. Erstellen Sie eine kleine Öffnung entlang der medianen Fasziennaht. Retrahieren Sie die paraspinalen Muskeln beidseitig unter direkter Sicht.
  9. Lösen Sie die Muskulatur neben dem L5-Dornfortsatz , um die darunterliegende Lamina freizulegen. Erweitern Sie die Freilegung kranial bis zum L4-Dornfortsatz und kaudal bis zum L6-Dornfortsatz, bis alle drei Dornfortsätze deutlich sichtbar sind.
  10. Führen Sie überwiegend stumpfe, knochennahe Präparation mit Wattestäbchen oder feinen Pinzetten durch. Setzen Sie scharfe Präparation nur dann ein, wenn nötig, um fasziale Adhäsionen zu lösen, und minimieren Sie Blutungen.
  11. Halten Sie die laterale Retraktion mit Wattestäbchen aufrecht, um die L5-Lamina und den L5–L6-Zwischenlamellenraum vollständig freizulegen. Bestätigen Sie die Wirbelebene erneut, bevor Sie fortfahren.
  12. Fassen Sie den L5-Dornfortsatz vorsichtig mit einer Pinzette und heben Sie den Dornfortsatz und den angrenzenden Lendenwirbelbereich auf einen Winkel von etwa 30° relativ zur Operationsplattform an, um den L5–L6-Zwischenlamellenraum zu erweitern.
  13. Führen Sie die geschlossenen Spitzen der Augenchirurgieschere unter direkter Sicht in den L5–L6-Zwischenlamellenraum ein. Führen Sie die Schere entlang einer flachen Ebene unmittelbar unterhalb des kaudalen Randes der L5-Lamina fort.
  14. Öffnen Sie die Schere leicht, um die erste knöcherne Öffnung zu schaffen. Vergrößern Sie das Laminektomiefenster, indem Sie kleine Knochenfragmente nacheinander entlang der Lamellenränder entfernen. Beschränken Sie den Knochenabtrag auf die dorsale L5-Lamina und vermeiden Sie, das knöcherne Fenster lateral in die beidseitigen Gelenkfortsatzgelenke auszudehnen.
  15. Vermeiden Sie übermäßige Einfügetiefe und übermäßige Schneidkraft, um eine Dura-Verletzung zu verhindern.
  16. Setzen Sie das Entfernen der Lamina schrittweise fort, bis die Dura mater durch das knöcherne Fenster deutlich sichtbar ist.
  17. Untersuchen Sie das Operationsfeld sorgfältig. Stellen Sie sicher, dass keine aktive Blutung vorliegt, und überprüfen Sie, ob die Dura mater intakt bleibt.
  18. Spülen Sie die Operationsstelle mit warmer, steriler Kochsalzlösung aus. Erzielen Sie eine Blutstillung durch sanfte Kompression.
  19. Schließen Sie die Wunde schichtweise. Verschließen Sie die Haut mit 6-0-Nylon-Nähten und desinfizieren Sie die Schnittstelle.
  20. Nach Wundverschluss setzen Sie die Sevofluran-Anästhesie fort, bis die gesamte Anästhesiedauer etwa 4 h beträgt. Danach stellen Sie die Sevofluran-Gabe ein und beginnen mit der postoperativen Versorgung.

3. Nach der Operation durchgeführte Versorgung

  1. Zum Zeitpunkt, der dem Ende der Operation in der Laminektomie-Gruppe entspricht, Meloxicam subkutan in einer Dosis von 2 mg/kg den Mäusen der Kontrollgruppe verabreichen. Jede Maus der Laminektomie-Gruppe auf eine temperaturgesteuerte Heizplatte legen und die Körpertemperatur aufrechterhalten, bis die Maus das Bewusstsein wiedererlangt und stabile spontane Atmung sowie motorische Aktivität zeigt.
  2. Jede Maus der Laminektomie-Gruppe nach vollständiger Erholung von der Anästhesie in ihren Heimkäfig zurückbringen. Danach das Tier beobachten, bis eine normale Fortbewegung festgestellt wird. Anschließende Gaben von Meloxicam subkutan in einer Dosis von 2 mg/kg alle 24 Stunden über einen Zeitraum von 48 Stunden beiden Gruppen verabreichen.
  3. Die chirurgische Inzision und die Nahtintegrität täglich bis zum dritten postoperativen Tag untersuchen. Bei Bedarf die Maus erneut anästhesieren und gelockerte oder gerissene Nähte ersetzen.
  4. Die Inzision täglich auf Schwellung, Blutung, Sekretion oder Anzeichen einer lokalen Entzündung untersuchen.
  5. Körpergewicht, Pflegeverhalten, spontane Aktivität sowie Nahrung- und Wasseraufnahme während des gesamten postoperativen Zeitraums überwachen.
  6. Jede Maus vor dem geplanten experimentellen Ende human euthanisieren, wenn eines der folgenden vorab definierten humanen Endpunktkriterien erfüllt ist: ein Gewichtsverlust von ≥20 % des präoperativen Körpergewichts; vollständige Anorexie über 24 Stunden oder Nahrungsaufnahme unter 50 % der normalen Menge an drei aufeinanderfolgenden Tagen; Unfähigkeit oder deutliche Zurückhaltung beim Aufstehen oder beim Zugang zu Nahrung oder Wasser, die 24 Stunden nach der Erholung von der Anästhesie anhält; oder ein sterbender Zustand, gekennzeichnet durch deutliche Depression in Kombination mit einer Körpertemperatur unter 37 °C.

4. Verhaltensmäßige Beurteilung von POCD

  1. Open-Field-Test (Lokomotorische Kontrolle; Tag 3 nach der Operation)
    1. Führen Sie den Open-Field-Test in einer 45 cm × 45 cm großen Arena mit 40 cm hohen Wänden bei einer Beleuchtungsstärke von 20 Lux durch. Positionieren Sie die Videokamera direkt über der Mitte der Arena, sodass der gesamte Testbereich im Sichtfeld liegt.
    2. Platzieren Sie die Maus in der Mitte der Arena und starten Sie unmittelbar nach der Platzierung die Video-Verfolgung. Lassen Sie die Maus 5 Minuten lang frei erkunden. Analysieren Sie die gesamte 5-minütige Sitzung und berechnen Sie die zurückgelegte Gesamtstrecke sowie die mittlere Bewegungsgeschwindigkeit mithilfe des Video-Tracking-Systems.
  2. Ganganalyse
    1. Führen Sie die Ganganalyse am Tag 3 nach der Operation mit einem automatisierten Ganganalysesystem durch.
    2. Platzieren Sie jede Maus an einem Ende des Laufstegs und lassen Sie sie den Laufsteg frei durchlaufen. Zeichnen Sie die Pfotenabdrücke während der Fortbewegung mit der in das Ganganalysesystem integrierten Hochgeschwindigkeitskamera auf.
    3. Aufzeichnung mehrerer Gangversuche pro Maus; sammeln Sie drei gültige Durchläufe mit kontinuierlicher Vorwärtsbewegung über den Laufsteg für die anschließende Analyse.
    4. Analysieren Sie die aufgezeichneten Pfotenabdruckdaten mithilfe der Ganganalyse-Software. Überprüfen Sie die automatisch identifizierten Pfotenabdrücke und korrigieren Sie gegebenenfalls manuell die Klassifizierung der rechten Vorderpfote, linken Vorderpfote, rechten Hinterpfote und linken Hinterpfote, bevor Sie die Gangparameter extrahieren.
    5. Quantifizieren Sie Schrittlänge, Standzeit, Schwunggeschwindigkeit und Abdruckfläche und berechnen Sie für jede Maus den Mittelwert aus den drei gültigen Durchläufen zur statistischen Analyse.
  3. Barnes-Maze (räumliches Lernen und Gedächtnis; Tage 4–6 nach der Operation)
    ​HINWEIS: Führen Sie die Barnes-Maze-Tests einmal täglich über drei aufeinanderfolgende Tage hinweg ab Tag 4 nach der Operation durch. Führen Sie die Tests jeweils im gleichen Tageszeitfenster durch, um zirkadiane Schwankungen zu minimieren.
    1. Platzieren Sie die Fluchtkiste unterhalb des vorgesehenen Ziellochs. Behalten Sie während des gesamten Experiments dieselbe Zielposition bei.
    2. Platzieren Sie die Maus zur Beginn jedes Versuchs in der Mitte des Labyrinths. Erlauben Sie der Maus, bis zu 3 Minuten lang nach der Fluchtkiste zu suchen. Beenden Sie den Versuch, sobald die Maus die Fluchtkiste betritt.
    3. Leiten Sie die Maus sanft zum Zielloch, falls sie innerhalb von 3 Minuten die Fluchtkiste nicht findet. Lassen Sie die Maus kurz in der Fluchtkiste verweilen, um das Lernen der Aufgabe zu verstärken.
    4. Notieren Sie die Fluchtlatenz und die zurückgelegte Distanz mithilfe des Video-Tracking-Systems. Bei Versuchen, bei denen die Maus die Fluchtkiste innerhalb von 3 Minuten nicht erreicht, setzen Sie die Fluchtlatenz auf 180 s fest. Berücksichtigen Sie in der statistischen Analyse ausschließlich die Fluchtlatenz und die zurückgelegte Distanz aus der letzten Sitzung am Tag 3.
  4. Erkennung neuer Objekte (Erkennungsgedächtnis; Tage 3–4 nach der Operation)
    ​HINWEIS: Verwenden Sie dieselbe Arena und dasselbe Video-Tracking-System wie beim Open-Field-Test beschrieben. Nutzen Sie die Open-Field-Sitzung am Tag 3 nach der Operation, um die Mäuse an die Testarena zu gewöhnen, bevor das Training zur Erkennung neuer Objekte beginnt.
    1. Platzieren Sie während der Trainingsphase zwei identische zylindrische Objekte an symmetrischen Positionen in der Arena. Lassen Sie die Maus 5 Minuten lang frei erkunden.
    2. Nach einer Retentionsphase von 1 Stunde ersetzen Sie eines der bekannten zylindrischen Objekte durch ein neues, würfelförmiges Objekt. Balancieren Sie die Position des neuen Objekts über die einzelnen Mäuse hinweg aus, um mögliche Seitenvorlieben zu minimieren. Lassen Sie die Maus 5 Minuten lang erkunden.
    3. Notieren Sie die Erkundungszeit für das bekannte und das neue Objekt mithilfe des Video-Tracking-Systems. Berücksichtigen Sie nur Mäuse mit einer Gesamterkundungszeit von mindestens 3 s bei der Analyse.
    4. Berechnen Sie den Präferenzindex (PI) gemäß:
      figure-protocol-1
      Definieren Sie Tnovel und Tfamiliar als die Zeiten, die während der Testphase mit der Erkundung des neuen bzw. bekannten Objekts verbracht wurden.
  5. Y-Maze mit neuem Arm (räumliches Erkennungsgedächtnis; Tag 5 nach der Operation)
    1. Führen Sie den Test in einem Y-förmigen Labyrinth durch, das aus drei identischen Armen besteht, die jeweils um 120° voneinander getrennt sind. Blockieren Sie zufällig einen Arm mit einer undurchsichtigen Tür und definieren Sie diesen Arm als den neuen Arm.
    2. Wählen Sie zufällig einen der beiden offenen Arme als Startarm. Definieren Sie den verbleibenden offenen Arm als bekannten Arm. Platzieren Sie die Maus am Ende des Startarms und lassen Sie sie die beiden zugänglichen Arme 5 Minuten lang frei erkunden.
    3. Nach einer intertrialschen Pause von 1 Stunde entfernen Sie die undurchsichtige Tür und stellen die Maus erneut ans Ende desselben Startarms zurück.
    4. Lassen Sie die Maus alle drei Arme 5 Minuten lang frei erkunden.
    5. Definieren Sie einen Armeintritt als das Eintreten des verfolgten Körperschwerpunkts in eine vordefinierte Armzone aus der zentralen Zone heraus. Notieren Sie die Anzahl der Eintritte und die in jedem Arm verbrachte Zeit mithilfe des Video-Tracking-Systems.
    6. Berechnen Sie den zeitbasierten Präferenzindex für den neuen Arm gemäß:
      figure-protocol-2
      Definieren Sie Tnovel, Tstart und Tfamiliar als die Zeiten, die in den neuen, Start- und bekannten Arm verbracht wurden.
    7. Berechnen Sie den auf Einträgen basierenden Präferenzindex gemäß:
      figure-protocol-3
      Definieren Sie Enovel als die Anzahl der Eintritte in den neuen Arm und Etotal als die Gesamtanzahl der Eintritte in alle drei Arme während des Testdurchlaufs.

5. Gewebeaufbereitung, Nissl-Färbung und Immunfluoreszenzfärbung

  1. Gewebeprozessierung
    1. Am vorgesehenen Verschlusspunkt des Experiments das Maus unter Verwendung von 3 % Sevofluran, das mit einer Sauerstoffflussrate von 2 L/min appliziert wird, tief anästhesieren.
    2. Überprüfen Sie eine ausreichende Anästhetietiefe durch das Fehlen des plantaren Withdrawal-Reflexes. Unter Aufrechterhaltung einer tiefen Anästhesie und vor dem kardialen Stillstand führen Sie eine transkardiale Perfusion mit 20 mL gepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch, um intravasales Blut zu entfernen.
    3. Perfundieren Sie die Maus unverzüglich mit 20 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA).
    4. Entnehmen Sie das gesamte Gehirn vorsichtig. Legen Sie das Gehirn für 24 h in 4 % PFA ein. 4 °C für die Nachfixierung.
    5. Überführen Sie das Gehirn in 30%ige Saccharose, bis das Gewebe vollständig gesunken ist.
    6. Das Gehirn in optimalem Schneidetemperatur-(OCT-)Medium einbetten.
    7. Gefrieren Sie das eingebettete Gewebe schnell ein und lagern Sie es bei −80 °C bis zur Kryoschnittherstellung
  2. Nissl-Färbung
    1. Bringen 16 µm Schnellpräparationen auf Raumtemperatur bringen. Die Objektträger 20 Minuten lufttrocknen lassen.
    2. Spülen Sie die Objektträger 2 min mit PBS.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Gewebeschnitte vor der Färbung fest auf den Objektträgern haften bleiben.
    3. Decken Sie die Schnitte vollständig mit der Toluiddarstellungslösung ab. Inkubieren Sie 30 min bei 55 °C.
      HINWEIS: Optimieren Sie die Färbedauer empirisch für 16 µm Abschnitte, um eine Überfärbung zu vermeiden
    4. Spülen Sie die Objektträger kurz mit destilliertem Wasser für 10–30 s.
    5. Differenzieren Sie die Schnitte nacheinander in 95 %, 85 % und 75 %igem Ethanol jeweils 2 Minuten lang.
      HINWEIS: Passen Sie die Differenzierungszeit gegebenenfalls an, um die Färbungsintensität zu optimieren.
    6. Die Objektträger zweimal je 5 Minuten in frischem Xylol spülen.
      HINWEIS: Führen Sie alle Arbeitsschritte mit Xylol in einem Abzug durch.
    7. Die Schnitte mit neutralen Balsam aufnehmen. Vorsichtig ein Deckglas über jeden Schnitt legen.
    8. Bildaufnahme der gefärbten Schnitte mit einem Lichtmikroskop mit 20-facher Objektivvergrößerung× Zielsetzung. Identifizieren Sie die CA1-Region anhand ihrer charakteristischen dichten Pyramidenzellenschicht im koronaren Hippocampus-Schnitt. Analysieren Sie für jede Maus einen koronaren Schnitt und erfassen Sie jeweils zwei nicht überlappende Aufnahmefelder aus der CA1-Region jeder hippocampalen Hemisphäre.
    9. Zählen Sie morphologisch intakte, Nissl-positive Neurone und Nissl-Körper manuell mithilfe des Zellzähl-Plugins in einer Bildanalyse-Software. Intakte Neurone werden anhand eines intakten Soma, eines runden Zellkerns mit sichtbarem Nukleolus und reichlich vorhandener cytoplasmatischer Nissl-Substanz identifiziert; Nissl-Körper erscheinen als intensiv basophile, granuläre oder klumpige Strukturen im neuronalen Zytoplasma.
    10. Mitteln Sie die Werte aus allen analysierten Feldern, um pro Tier einen einzelnen Wert zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass der Beobachter, der die Zählungen durchführt, hinsichtlich der Gruppenzuordnung verblindet bleibt.
  3. Iba1-Immunfluoreszenz-Färbung
    1. Lassen Sie die Gehirnschnitte vor der Färbung auf Raumtemperatur anwärmen.
    2. Tauchen Sie die Objektträger in die Zitrat-Antigen-Retrieval-Lösung ein und führen Sie die Antigen-Retrieval-Behandlung in einem 80 °C Wasserbad für 25 min. Nach der Antigenfreisetzung die Objektträger und die Antigenfreisetzungslösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    3. Spülen Sie die Schnitte dreimal mit gepuffertem Phosphatsalzlösung (PBS) je 3 Minuten lang.
    4. Permeabilisieren Sie die Schnitte 30 min bei Raumtemperatur mit 0,2 % Triton X-100 in PBS, gefolgt von drei Waschungen mit PBS je 3 min.
    5. Blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie die Schnitte 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS inkubieren.
    6. Spülen Sie die Schnitte dreimal mit PBS, jeweils 3 Minuten lang.
    7. Verdünnen Sie den primären Antikörper gegen das ionisierte Calcium-bindende Adaptermolekül 1 (Iba1; 1:100) in der Blockierungslösung (3 % BSA in PBS) und inkubieren Sie die Schnitte über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer
    8. Spülen Sie die Schnitte dreimal mit PBS, jeweils 3 Minuten lang.
    9. Inkubieren Sie die Schnitte mit 488-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) (1:1000) für 90 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    10. Die Schnitte dreimal für jeweils 3 min im Dunkeln mit PBS waschen.
    11. Die Kerne mit DAPI (1:8000) für 5 min im Dunkeln kontrastfärben.
    12. Spülen Sie die Schnitte dreimal für jeweils 3 min im Dunkeln mit PBS.
    13. Die Schnitte mit einem Antifade-Mounting-Medium aufnehmen, Deckgläser auflegen und die Schnitte bis zur Bildgebung vor Licht schützen.
    14. Erwerben Sie Fluoreszenzbilder der hippocampalen CA1-Region mithilfe eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops mit einer 20× Ziel. Verwenden Sie für alle in die quantitativen Vergleiche einbezogenen Schnitte identische Einstellungen für die Bildaufnahme. Analysieren Sie für jedes Maus ein koronales Schnittpräparat und gewinnen Sie zwei nicht überlappende Felder aus der CA1-Region jeder hippocampalen Hemisphäre.
    15. Quantifizieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität von Iba1 in der hippocampalen CA1-Region mit identischen Schwellenwerten für alle Bilder. Mitteln Sie die Werte aller Felder, um einen einzelnen Wert pro Tier zu erhalten.

6. Statistische Analyse

  1. Führen Sie alle statistischen Analysen mit statistischer Analyse-Software durch. Geben Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) an.
  2. Überprüfen Sie die Normalverteilung der Daten mithilfe des Shapiro-Wilk-Tests. Prüfen Sie die Varianzhomogenität mit dem F-Test.
  3. Vergleichen Sie die Kontrollgruppe und die L5-Laminektomiegruppe mittels eines ungepaarten zweiseitigen Student-t-Tests, wenn die Varianzhomogenität gegeben ist. Verwenden Sie den Welch-t-Test, wenn die Varianzhomogenität nicht gegeben ist.
  4. Definieren Sie n als die Anzahl der Tiere, die in jede Analyse einbezogen wurden. Ein P-Wert < 0,05 wird als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Alle Mäuse überlebten bis zum geplanten experimentellen Endpunkt, keines der Tiere erfüllte die vorab definierten Kriterien für einen humanen Endpunkt, und alle wurden in die abschließende Analyse einbezogen. Die motorische Funktion wurde am dritten postoperativen Tag mittels Open-Field- und Gangbildanalyse bewertet. Weder die insgesamt zurückgelegte Distanz noch die durchschnittliche Geschwindigkeit im Open-Field-Test unterschieden sich zwischen den Gruppen, was auf vergleichbare spontane motorische Aktivität hinweist (Abbildung 2A). Auch die Gangbildanalyse zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen bezüglich Schrittlänge, Standzeit, Schwunggeschwindigkeit oder Abdruckfläche (Abbildung 2B). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das L5-Laminektomieverfahren keine offensichtliche motorische Beeinträchtigung verursacht hat, die ausreichen würde, um die später beobachteten Unterschiede in der kognitiv-verhaltensbezogenen Leistung zu erklären.

Die kognitive Leistung wurde mit dem Test zur Erkennung neuartiger Objekte (NOR), dem Y-Maze mit neuem Arm und dem Barnes-Maze bewertet. Im NOR-Test wies die Gruppe nach L5-Laminektomie einen signifikant niedrigeren Präferenzindex für das neue Objekt (PI) im Vergleich zur Kontrollgruppe auf (Abbildung 3A). Im Y-Maze mit neuem Arm zeigte die Gruppe nach L5-Laminektomie signifikant niedrigere PI-Werte sowohl für die im neuen Arm verbrachte Zeit als auch für die Anzahl der Zugänge zum neuen Arm (Abbildung 3B). Im Barnes-Maze zeigte die Gruppe nach L5-Laminektomie am dritten Tag des Tests eine längere Fluchtlatenz und eine größere zurückgelegte Distanz (Abbildung 3C). Insgesamt deuten diese Verhaltensbefunde auf eine beeinträchtigte kognitive Leistung nach L5-Laminektomie hin.

In der hippocampalen CA1-Region zeigte die L5-Laminektomiegruppe signifikant weniger Nissl-positive Neurone und signifikant weniger Nissl-Körperchen als die Kontrollgruppe, was auf eine neuronale Strukturveränderung hinweist (Abbildung 4A, B). Zusätzlich war die mittlere Fluoreszenzintensität von Iba1 in der L5-Laminektomiegruppe signifikant erhöht, was mit einer verstärkten Mikroglia-Aktivierung übereinstimmt (Abbildung 4C, D).

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Abbildung 1: Das L5-Lendenlaminektomieverfahren zur Modellierung postoperativer kognitiver Dysfunktion (POCD) bei Mäusen. (A) Darstellung des chirurgischen Zielbereichs an der L5-Lamina sowie des Expositionsgebiets, das sich über die angrenzenden Wirbelebenen (L4–L6) erstreckt. (B) Intraoperative Aufnahmen, die Schlüsselschritte des L5-Lendenlaminektomieverfahrens veranschaulichen. (a) Lendenregion nach Rasur, mit identifizierter Wirbelsäulemitte; Pfeile zeigen die Richtung des geplanten Hautschnitts an. (b) Mittelliniger Hautschnitt über der Lendenwirbelsäule. (c) Schnitt durch die Faszie mit schrittweiser Trennung der paraspinalen Muskulatur, um die Dornfortsätze freizulegen und das Gewebe um den Dornfortsatz und die Lamina des L5-Wirbels weiter zu entfernen, um die L5-Lamina vollständig freizulegen. (d) L5-Laminektomie nach Entfernung der L5-Lamina. Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung einzusehen.

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Abbildung 2: Beurteilung der motorischen Aktivität und des Gangbilds nach L5-Lendenlaminektomie. (A) Open-Field-Test mit Gesamtwegstrecke und durchschnittlicher Geschwindigkeit (n = 10). (B) Ganganalyse mit Schrittlänge, Standzeit, Schwunggeschwindigkeit und Abdruckfläche (n = 6). Die Daten zeigen den Mittelwert ± SD. Die statistische Signifikanz ist mit ns (nicht signifikant) angegeben. Abkürzungen: Control = Kontrollgruppe; Laminectomy = L5-Laminektomiegruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Kognitive Verhaltensbewertungen nach L5-Lendenlaminektomie. (A) Test zur Erkennung neuartiger Objekte (n = 10). (B) Y-Maze-Test mit neuartigem Arm (n = 10). (C) Barnes-Maze-Test (n = 10). Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar. Die statistische Signifikanz ist mit *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001 gekennzeichnet. Abkürzungen: Control = Kontrollgruppe; Laminectomy = L5-Laminektomiegruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Histologische Beurteilung der hippocampalen CA1-Region nach L5-Lendenlaminektomie. (A) Repräsentative Bilder der Nissl-Färbung in der hippocampalen CA1-Region. (B) Quantifizierung der Nissl-positiven Neuronen (links) und Nissl-Körperchen (rechts) (n = 5). (C) Repräsentative Bilder der Iba1-Immunfluoreszenz in der hippocampalen CA1-Region. Maßstab = 100 µm. (D) Quantifizierung der mittleren Iba1-Fluoreszenzintensität (n = 6). Die Daten zeigen den Mittelwert ± SD. Die statistische Signifikanz ist mit **P < 0,01 und ***P < 0,001 gekennzeichnet. Abkürzungen: Control = Kontrollgruppe; Laminectomy = L5-Laminektomiegruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Postoperative kognitive Dysfunktion wurde bei älteren Erwachsenen beschrieben, die eine Wirbelsäulenchirurgie durchlaufen10. Experimentelle Befunde deuten zudem darauf hin, dass das Alter die Anfälligkeit für operationsassoziierte kognitive Beeinträchtigungen und neuroinflammatorische Reaktionen erhöht11,12. Das vorliegende Protokoll kombiniert eine etwa vierstündige Anästhesie mit Sevofluran mit einer L5-Laminektomie bei alten Mäusen, um eine frühe postoperative kognitive Beeinträchtigung zu modellieren. Der methodologische Hauptwert liegt darin, ein praktisches und leicht zugängliches Verfahren bereitzustellen, um Verhaltensänderungen und hippocampale histologische Veränderungen nach einer Wirbelsäulenchirurgie zu untersuchen.

Präklinische Modelle für POCD umfassen Paradigmen mit alleiniger Anästhesieexposition, Bauchchirurgie und orthopädischen Verletzungen13. Alleinige Anästhesieparadigmen ermöglichen die Untersuchung anästhetischer Effekte ohne chirurgisches Trauma14, reproduzieren jedoch nicht die kombinierte Exposition gegenüber Anästhesie und Gewebeschädigung. Modelle mit Bauchoperationen und Schienbeinfrakturen beinhalten chirurgische Verletzungen und wurden zur Erforschung der mit einer Operation assoziierten kognitiven Beeinträchtigung verwendet15,16. Ihre Operationsstellen und Muster der Gewebeschädigung unterscheiden sich jedoch von denen spinaler Eingriffe. Da Art und Intensität des chirurgischen Traumas postoperative kognitive Ergebnisse und zentrale entzündliche Reaktionen beeinflussen können9, sollte der chirurgische Kontext bei der Auswahl eines präklinischen Modells berücksichtigt werden. Das vorliegende Protokoll einer L5-Laminektomie bietet daher ein experimentelles Paradigma im Zusammenhang mit Wirbelsäulenchirurgie, um frühzeitige postoperative kognitive Beeinträchtigungen bei alten Mäusen zu untersuchen.

Die entscheidende technische Herausforderung bei diesem Protokoll besteht darin, genügend Knochen von der L5-Lamina zu entfernen, um die Dura klar freizulegen, ohne dabei die Dura zu verletzen. Bei einer Laminektomie unter direkter Sicht ist eine sorgfältige Kontrolle der Instrumententiefe, der Schneidkraft und des Einfügewinkels der Augenscheren erforderlich. Der Knochen sollte schrittweise durch kleine, kontrollierte Schnitte entlang der Ränder der Lamina entfernt werden. Durch das Greifen des L5-Dornfortsatzes mit einer Pinzette und das Anheben des operativen Lendenwirbelsegments auf einen Winkel von etwa 30° gegenüber der Operationsplattform wird der interlaminare Raum zwischen L5 und L6 vergrößert. Diese Maßnahme ermöglicht ein flaches Einführen der Scherenspitzen unter die knöcherne Kante und verringert das Risiko eines Kontakts mit der Dura. Unvollständige Knochenentfernung kann die chirurgische Exposition einschränken, während übermäßiges Schneiden oder eine zu große Einfügetiefe eine Verletzung der Dura verursachen kann. Unkontrollierte Blutungen können das Operationsfeld verschleiern, die postoperative Erholung beeinträchtigen und die Variabilität der Verhaltensergebnisse erhöhen. Wenn der interlaminare Raum für ein sicheres Einführen der Scherenspitzen nicht ausreicht, sollte die Position und der Anhebewinkel des operativen Lendenwirbelsegments neu justiert werden, anstatt die Einfügetiefe zu erhöhen. Wenn Blutungen das Operationsfeld verschleiern, sollte die Knochenentfernung unterbrochen werden, bis eine ausreichende Sicht wiederhergestellt ist, woraufhin verbleibender Knochen schrittweise entfernt werden sollte.

Die Trennung der paraspinalen Muskulatur und die L5-Laminektomie können zu vorübergehenden postoperativen Schmerzen führen, und eine mechanische Hypersensitivität wurde nach experimenteller Laminektomie bei Mäusen dokumentiert17. Meloxicam wurde gemäß einem vordefinierten analgetischen Regime verabreicht. Berichten zufolge halten schmerzbedingte Gesichtsausdrücke bei Mäusen etwa 36–48 Stunden an18. Das 48-stündige Analgetikaregime sollte diesen frühen postoperativen Zeitraum abdecken, und die kognitiv-verhaltensbezogene Testung wurde am dritten postoperativen Tag nach Abschluss des analgetischen Regimes begonnen, um den möglichen Einfluss unmittelbarer postoperativer Schmerzen zu verringern. Der Open-Field-Test wurde in experimentellen Studien zu postoperativer kognitiver Dysfunktion (POCD) verwendet, um die spontane motorische Aktivität zu bewerten und festzustellen, ob eine verminderte Bewegungsaktivität die kognitiv-verhaltensbezogenen Leistungen beeinträchtigen könnte19,20. Daher wurden der Open-Field-Test und die Gangbildanalyse am dritten postoperativen Tag vor der kognitiven Beurteilung durchgeführt. Es wurden keine signifikanten Gruppenunterschiede in der motorischen Aktivität im Open-Field-Test oder bei den Gangparametern beobachtet, was darauf hindeutet, dass die anschließend festgestellten kognitiv-verhaltensbezogenen Unterschiede wahrscheinlich nicht primär auf offensichtliche motorische Beeinträchtigungen zurückzuführen waren. Da jedoch spontane postoperative Schmerzen und Wundbeschwerden nicht direkt erfasst wurden, können deren verbleibende Auswirkungen auf die verhaltensbezogenen Leistungen nicht vollständig ausgeschlossen werden. Zukünftige Studien könnten direkte Bewertungen spontaner postoperativer Schmerzen einbeziehen.

Insgesamt bietet dieses Protokoll einen praktischen experimentellen Ansatz zur Untersuchung der frühen postoperativen kognitiven Beeinträchtigung bei alten Mäusen nach einer L5-Laminektomie. Es kann verwendet werden, um die Verhaltensausgänge und die zugrundeliegenden Mechanismen der mit einer Wirbelsäulenchirurgie assoziierten kognitiven Beeinträchtigung zu erforschen sowie Interventionen zu bewerten, die darauf abzielen, die postoperative kognitive Beeinträchtigung zu verhindern oder zu verringern. Eine Validierung in größeren Kohorten und an unabhängigen Laboratorien würde die Stabilität und Reproduzierbarkeit des Modells weiter untermauern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Wettbewerbsinteresse besteht.

Danksagungen

Wir danken Sanhua Fang von der zentralen Technologieplattform der medizinischen Fakultät der Zhejiang-Universität, Yanhong Chen und Xuliang Zhang vom Tierzentrum der Zhejiang-Universität für ihre technische Unterstützung. Diese Studie wurde durch die folgenden Fördermittel finanziert: Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (Nr. 82575196, 82074535 und U23A20508).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57BL/6J männliche MäuseSuzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-0005Tiermodell
ANY-maze Video-Tracking-SoftwareStoelting Co., USA6000Verhaltensmäßige Video-Verfolgung und Analyse
Erythromycin-AugensalbeBeijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H11021270Verhinderung von trockenen Augen
Feine PinzetteNANAHaut abklemmen
HeizplatteNANATemperaturgesteuert
Iba1/AIF-1 (E4O4W) Kaninchen-monoklonaler AntikörperCell Signaling Technology17198Iba1-Immunfluoreszenz-Färbung
InhalationsanästhesiegerätRWD Life Science Co., Ltd.R581SAnästhesie
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY2025112704Ganganalyse
Mikro-Ophtalmologische SchereNANAKnochenentfernung
Nissl-FärbungslösungHaoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033Nissl-Färbung
SchereShang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY00030Hautschnitt
SevofluranShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.25062331Anästhesie
Einweg-OperationsabdeckungJiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.20212140221Unterlage für chirurgische Eingriffe
Trimgeräte für KleintiereYiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-03310Haarentfernung
Chirurgische Nahtnadeln mit FadenShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603Haut nähen
Veet HaarentfernungscremeRECKITT BENCKISER (India) LtdNAHaarentfernung

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Wirbelsäulenchirurgie-ModellSevofluran-AnästhesieTest der kognitiven Funktionhippokampale neuronale Schädigungneuroinflammatorische VeränderungenNissl-FärbungIba1-Immunfluoreszenz

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