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Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Dieses Protokoll integriert öffentliche transkriptomische Datensätze und die Validierung von Kolonepithelzellen, um S100P als gemeinsamen Biomarker zu identifizieren, der mit entzündlichen Darmerkrankungen, Darmkrebs und Pankreataskaladenokarzinom assoziiert ist.
Entzündliche Darmerkrankungen (IBD) sind mit einem erhöhten Risiko für Darmkrebs (CRC) und Bauchspeicheldrüsenadenokarzinom (PAAD) verbunden, doch die gemeinsamen molekularen Merkmale dieser Erkrankungen sind weiterhin unvollständig verstanden. Diese Studie hatte zum Ziel, gemeinsame Gene und biologische Signalwege zu identifizieren, die mit IBD, CRC und PAAD durch integrierte transkriptomische Analyse und experimentelle Validierung assoziiert sind. Genexpressionsdatensätze für IBD, CRC und PAAD wurden aus den Datenbanken The Cancer Genome Atlas und Gene Expression Omnibus bezogen. Gewichtete Gen-Koexpressionsnetzwerk-Analysen und differenzielle Expressionsanalysen wurden durchgeführt, um krankheitsassoziierte und geteilte Gene zu identifizieren. Genontologie und die Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (Analysen wurden verwendet, um bereicherte biologische Funktionen und Wege zu erforschen. Die Infiltration von Immunzellen wurde mittels Zelltypidentifikation durch Schätzung relativer Teilmengen von RNA-Transkripten bewertet. Eine Analyse der Empfänger-Betriebseigenschaften wurde durchgeführt, um die diagnostische Leistung gemeinsamer Gene zu bewerten. Eine Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse wurde durchgeführt, um die zelluläre Verteilung von S100P zu untersuchen. Zusätzlich wurden die Effekte der S100P-Downregulation in lipopolysaccharid-(LPS)-stimulierten Colonepithelfeln untersucht. Insgesamt wurden 162 krankheitsassoziierte Gene und vier gemeinsame Gene identifiziert. Funktionelle Anreicherungsanalysen zeigten eine signifikante Anreicherung immun- und entzündungsbezogener Signalwege, einschließlich des Interleukin-17-Signalwegs. Die Analyse der Immuninfiltration zeigte ähnliche Trends in mehreren Immunzellpopulationen in IBD, CRC und PAAD. Die Einzelzellanalyse zeigte eine erhöhte S100P-Expression in Epithelzellen aller drei Krankheiten. Die Herunterregulierung von S100P stellte die Proliferationskapazität der LPS-stimulierten Kolonepithelzellen wieder her und reduzierte die entzündliche Zytokinexpression. Die integrierte transkriptomische Analyse identifizierte S100P als Biomarker, der mit IBD, CRC und PAAD assoziiert ist und hob gemeinsame immunbezogene Merkmale über diese Krankheiten hinweg hervor.
Entzündliche Darmerkrankung (IBD) stellt ein Spektrum immunbedingter Erkrankungen dar, die den Magen-Darm-Trakt betreffen, darunter Colitis ulcerosa und Morbus Crohn1. Die Ätiologie von IBD ist hochkomplex und umfasst mukosale Immunabomalien, Dysbiose und genetische Anfälligkeit2. IBD ist ein globales Gesundheitsproblem mit steigenden Inzidenzraten und erheblichen wirtschaftlichen Belastungen, und seine wachsende Verbreitung hat erheblicheAufmerksamkeit erregt. Wichtig ist, dass Patienten mit IBD ein signifikant erhöhtes Risiko haben, an Darmkrebs (CRC)3 und Pankreasadenokarzinom (PAAD)4 zu erkranken. Obwohl dieser Zusammenhang gut dokumentiert ist, ist das genetische Kreuzsprechen zwischen IBD, CRC und PAAD weiterhin unvollständig verstanden.
Frühere Studien deuten stark darauf hin, dass IBD, CRC und PAAD gemeinsame pathogene Prozesse teilen; Allerdings fehlen weiterhin spezifische und empfindliche diagnostische Biomarker, und die gemeinsamen pathogenen Mechanismen sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Glücklicherweise sind mit dem raschen Fortschritt und der weit verbreiteten Verfügbarkeit von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien zahlreiche transkriptomische Datensätze von Patienten mit IBD, CRC und PAAD öffentlich zugänglich geworden, was eine systematische Untersuchung der molekularen Zusammenhänge zwischen diesen Erkrankungenermöglicht.
Diese Studie nutzte Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten von Patienten mit IBD, CRC und PAAD, um krankheitsassoziierte und geteilte Gene mittels gewichteter Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA) und differentieller Expressionsanalyse zu identifizieren. Diese Gene wurden weiter untersucht, um potenzielle gemeinsame Signalwege zwischen IBD, CRC und PAAD zu identifizieren. Zusätzlich haben wir den diagnostischen Wert dieser gemeinsamen Gene bewertet. Eine Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse (scRNA-seq) zeigte, dass das Schlüsselgen S100P überwiegend in Epithelzellen exprimiert wird. Abschließend untersuchten wir die biologische Rolle von S100P bei IBD.
Abschließend hatte diese Studie das Ziel, gemeinsame diagnostische Biomarker und biologische Wege zu identifizieren, die mit IBD, CRC und PAAD assoziiert sind, und so wertvolle klinische Einblicke in die gemeinsame Prävention und Behandlung dieser Krankheiten zu liefern.
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Diese Studie nutzte öffentlich zugängliche, de-identifizierte Datensätze aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA) und dem Gene Expression Omnibus (GEO) sowie etablierte kommerzielle Zelllinien. Es waren keine neu rekrutierten menschlichen Teilnehmer, identifizierbare Patienteninformationen oder von Patienten abgeleitete Stichproben beteiligt. Alle Analysen wurden gemäß den relevanten institutionellen Richtlinien und den Nutzungsbedingungen der öffentlichen Datenbanken durchgeführt. Daher waren für diese Studie keine zusätzliche institutionelle ethische Zulassung und informierte Zustimmung erforderlich.
Datenquelle
RNA-seq-Daten für die IBD-Kohorten (GSE179285; Plattform: GPL6480 und GSE24287; Plattform: GPL6480), CRC-Kohorten (TCGA-CRC; Plattform: Illumina HiSeq 2000 und GSE87211; Plattform: GPL13497) und PAAD-Kohorten (GSE128735; Plattform: GPL20301 und GSE62452; Plattform: GPL6244) wurden von TCGA und dem GEO heruntergeladen. Alle Datensätze wurden am 5. Dezember 2025 abgerufen.
Für jeden Datensatz wurden die Stichproben streng in zwei Untergruppen unterteilt, wobei Krankheitsläsionen/Tumorgewebe als Fallgruppe dienten und entsprechende nicht-läsionierte normale Gewebe als Kontrollgruppe. Konkret enthielt die IBD-Kohorte 297 Proben der Darmschleimhaut von Patienten mit IBD und 56 normale Proben der Darmschleimhaut gesunder Personen; die CRC-Kohorte umfasste 841 primäre kolorektale Tumorgewebe und 211 übereinstimmende benachbarte normale kolorektale Epithelgewebe; und die PAAD-Kohorte bestand aus 114 PAAD-Tumorgeweben und 106 normalen Pankreas-Parenchymalgeweben.
Alle Datensätze innerhalb derselben Krankheitskategorie wurden einheitlich integriert. Die normalizeBetweenArrays-Funktion des Limma-Pakets wurde angewandt, um Quantilnormalisierungen querprobenübergreifend durchzuführen, wodurch Batch-Effekte zwischen den Plattformen effektiv eliminiert und Genexpressionswerte über verschiedene Datensätze hinweg für die anschließende differentielle Expressionsanalyse standardisiert wurden.
Screening von IBD-, CRC- und PAAD-bezogenen Genen sowie gemeinsamen Genen
Zunächst wurden differenziell exprimierte Gene (DEGs) aus den IBD-, CRC- und PAAD-Kohorten mit dem Limma-Paket gescreent, und die ursprünglichen P-Werte wurden mit der Benjamini-Hochberg-False Discovery Rate (FDR)-Methode korrigiert. In den IBD-, CRC- und PAAD-Kohorten wurden die Screening-Kriterien auf |logFC| festgelegt. > 0,4 und P < 0,05. Zusätzlich wurde WGCNA auf allen Genen durchgeführt, mit einem Mindestmodul-Gen-Schwellenwert von 100 (weiche Schwellenleistung = 0,90; Netzwerktyp = signed). Folglich wurden gemeinsame DEGs und Modulgene in den drei Kohorten identifiziert. Gene, die mit beiden Methoden konsistent identifiziert wurden, wurden als gemeinsame Gene definiert, während die übrigen Gene als verwandte Gene kategorisiert wurden.
PPI- und funktionelle Anreicherungsanalyse
Diese Analysen wurden an den krankheitsassoziierten Genen durchgeführt. Die Analyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI) wurde mit der STRING-Datenbank durchgeführt (Interaktionswert > 0,40). Die funktionelle Anreicherungsanalyse umfasste Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Analysen, die mit clusterProfiler, Enrichplot und org durchgeführt wurden. Hs.eg.db Pakete (P < 0,05 und FDR-bereinigter q-Wert [Benjamini–Hochberg-Methode] < 0,05).
Profilierung der Immunmikroumgebung
CIBERSORT ist ein zuverlässiger Algorithmus zur Schätzung der Infiltrationsniveaus von Immunzellen anhand von Genexpressionsdaten mittels der Standard-LM22-Signaturmatrix7. In dieser Studie wurde der CIBERSORT-Algorithmus verwendet, um das Ausmaß der Immunzellinfiltration in Proben aus den Kohorten von IBD, CRC und PAAD zu schätzen, um die gemeinsamen Eigenschaften der Immunmikroumgebung zwischen den drei Krankheiten zu untersuchen. Die Analyse wurde mit 1.000 Permutationen durchgeführt, um für jede Probe P-Werte zu berechnen, und die Quantilnormalisierung (QN = TRUE) wurde auf die Mischungsausdrucksdatei angewendet. Für spätere Analysen wurden nur Proben mit einem CIBERSORT-P-Wert < 0,05 erhalten, um die Zuverlässigkeit der Dekonvolutionsergebnisse sicherzustellen.
Bewertung des diagnostischen Wertes gemeinsamer Gene
Der Diagnosewert der gemeinsamen Gene in den Kohorten IBD, CRC und PAAD wurde mittels Empfänger-Funktionsmerkmale-(ROC)-Analyse mit dem pROC-Paket in R bewertet. Der optimale Kompromiss zwischen Sensitivität und Spezifität wurde mithilfe von ROC-Kurven visualisiert.
qRT-PCR, Zelltransfektion und Koloniebildungstest
qRT-PCR und Zelltransfektion wurden laut früheren Studien 8,9,10 durchgeführt. Die transiente Transfektion wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit jetPRIME-Transfektionsreagenz (Polyplus, China) durchgeführt. Die Zellen wurden 6 Stunden lang mit der Transfektionsmischung inkubiert, danach wurde das Medium durch vollständiges DMEM ersetzt. Nachfolgende Experimente wurden 48 Stunden nach der Transfektion durchgeführt.
Kurz gesagt wurde die gesamte zelluläre RNA mit TRIzol-Reagenz extrahiert. RNA wurde rückwärts in cDNA mit PrimeScript RT Master Mix transkribiert. Quantitative PCR wurde mit TB Green qPCR durchgeführt. β-Aktin wurde als internes Referenzgen für die Expressionsnormalisierung verwendet. Biologische Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Primer-Sequenzen und die siS100P-Sequenz finden sich in einer früheren Studie 11.
NCM460, FHC, HCT116, SW116, PANC1 und BXPC2 Zellen wurden wie in der Materialtabelle aufgeführt erworben. Alle Zelllinien wurden einer Zellidentifikation und Mycoplasma-Tests unterzogen.
Während der Experimente wurden alle Zellen über 3–5 Generationen hinweg durchführt. Alle Zellen wurden in vollständigem DMEM kultiviert, das 10 % fetales Rinderserum und 1 % Penicillin–Streptomycin enthielt.
Der Assay zur Koloniebildung wurde wie in einer früheren Studie12 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden 1.000 Zellen in jede Bohrung einer 6-Loch-Platte eingesät und zehn Tage lang kultiviert, bevor das Experiment beendet wurde. Die Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt, und die Kolonien wurden mit ImageJ gezählt.
Analyse gemeinsamer Gene auf Basis von scRNA-seq-Daten
scRNA-seq-Daten aus dem IBD-Datensatz (GSE214695), CRC-Datensatz (GSE166555) und PAAD-Datensatz (GSE154778) wurden wie in früheren Studien 8,13 vorverarbeitet. Rohzählmatrizen wurden durch mittlere Expression für doppelte Gensymbole unter Verwendung von limma::avereps kollabiert. Die anfängliche Filterung behielt Gene, die in mindestens drei Zellen und Zellen mit mindestens 50 einzigartigen Transkripten nachgewiesen wurden. Zellen mit einer mitochondrialen Transkriptfraktion >5 % oder weniger als 50 nachgewiesene Gene wurden entfernt. Die Log-Normalisierung wurde mit einem Skalenfaktor von 10.000 durchgeführt, gefolgt von einer varianzstabilisierenden Transformation, um die 1.500 wichtigsten hochvariablen Gene zu identifizieren, die vor der Hauptkomponentenanalyse (PCA) Z-Score-Standardisierung waren. Cluster-definierende Markergene wurden mit log2 (Fold-Veränderung) > 0,5, einer Detektionsfraktion ≥0,25 in Zielclustern und einem angepassten P-Wert <0,05 gefiltert.
Kurz gesagt wurde die Datenvorverarbeitung mit dem Seurat-Paket durchgeführt, und die Zelltypannotation erfolgte mit dem SingleR-Paket (Version 2.6.0). Das Zellclustering wurde in Seurat unter Verwendung der k-nächstgelegenen Nachbargraphenkonstruktion und der t-SNE-Einbettung basierend auf den PCA-Dimensionen 1–20 durchgeführt. Die Verteilung und Expression der gemeinsamen Gene über verschiedene Zelltypen hinweg wurden anschließend untersucht.
Entwicklung des IBD-Modells
Laut früherenStudien 14 wurde Lipopolysaccharid (LPS) verwendet, um Entzündungen in normalen menschlichen Colonepithelzellen (FHC und NCM460) zu induzieren und so ein entzündungsähnliches IBD-Modell zu erzeugen. Biologische Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Zellen wurden routinemäßig in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2 kultiviert. Wenn die Zellkonfluenz etwa 50–70 % erreichte, wurde das Kulturmedium durch frisches, vollständiges Medium ersetzt und die Zellen wurden 12 Stunden lang mit 10 ng/mL LPS behandelt. Ein gleiches Volumen steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurde als Fahrzeugsteuerung verwendet. Das Kulturvolumen betrug 2 ml pro Bohrloch in 6-Bohrlochplatten. Nach der Behandlung wurde das Medium entfernt, die Zellen zweimal mit vorgekühltem sterilem PBS gewaschen und die Zellen für weitere Analysen gesammelt.
Statistische Analyse
Alle bioinformatischen Analysen wurden mit R-Software (Version 4.1.2) durchgeführt. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit dem Student's t-Test durchgeführt, während Vergleiche zwischen mehreren Gruppen mit einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt wurden. Die Korrelationsanalyse wurde mit der Spearman-Methode durchgeführt. Alle zellulären Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt, und die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Ein P-Wert oder FDR < 0,05 galt als statistisch signifikant. NS, nicht signifikant; P < 0,05 (*), P < 0,01 (**) und P < 0,001 (***).
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DEGs in IBD, CRC und PAAD
Zunächst wurden die IBD-Kohorten (GSE179285 und GSE24287), CRC-Kohorten (TCGA-CRC und GSE87211) und PAAD-Kohorten (GSE128735 und GSE62452) integriert, und die Integration wurde mittels PCA- und Genexpressionsdichtediagrammen ausgewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass Batch-Effekte zwischen den verschiedenen Datensätzen nach der Integration effektiv eliminiert wurden (Abbildung 1A–F).
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Frühere Studien haben den Zusammenhang von IBD, einer immunbedingten gastrointestinalen Erkrankung, mit mehreren Erkrankungen hervorgehoben, darunter neurodegenerative Erkrankungen17, MultipleSklerose 18, amyotrophe Lateralsklerose19, Endometriose20, rheumatoide Arthritis2, Hodgkin-Lymphom21, CRC22 und PAAD
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Interessenkonflikt:
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Die Autoren erkennen die finanzielle Unterstützung aus dem Nationalen Schlüssel-F&E-Plan Chinas an (Grant Nr. 2023YFB3210400).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BXPC2 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| CIBERSORT | N/A | N/A | Immune cell infiltration analysis |
| clusterProfiler package | Bioconductor | v4.8.0 | Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | Cell culture supplement |
| FHC cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| GEO dataset (GSE128735) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE154778) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE166555) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for colorectal cancer |
| GEO dataset (GSE179285) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE214695) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE24287) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE62452) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE87211) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for colorectal cancer |
| ggplot2 package | CRAN | v3.4.2 | Data visualization |
| HCT116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | v1.8.0 | Colony counting |
| jetPRIME Transfection Reagent | Polyplus | 101000046 | Cell transfection |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Beyotime Co., Ltd | S1735 | Induction of an inflammation-mimicking IBD cell model |
| limma package | Bioconductor | v3.54.0 | Differential expression analysis |
| NCM460 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| org.Hs.eg.db package | Bioconductor | v3.23.1 | Gene annotation for enrichment analysis |
| PANC1 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| Penicillin–streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic supplement for cell culture |
| pheatmap package | CRAN | v1.0.12 | Heatmap visualization |
| pROC package | CRAN | v1.19.0.1 | Receiver operating characteristic (ROC) analysis |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | RR036A | Reverse transcription of RNA into cDNA |
| Primer sets for qRT-PCR | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Primer sequences reported in Reference 11 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.1.2 | Statistical and bioinformatics analyses |
| Seurat package | CRAN | v4.0 | Single-cell RNA sequencing data preprocessing and analysis |
| siS100P | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Small interfering RNA targeting S100P |
| SingleR package | Bioconductor | v2.6.0 | Cell type annotation for single-cell RNA sequencing |
| STRING database | STRING Consortium | N/A | Protein-protein interaction analysis |
| SW1116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| TB Green qPCR Mix | Takara Bio | RR430B | Quantitative real-time PCR |
| TCGA-CRC dataset | The Cancer Genome Atlas (TCGA) | N/A | Public colorectal cancer transcriptomic dataset |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA extraction |
| WGCNA package | CRAN | v1.73 | Weighted gene co-expression network analysis |
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