Kechuanting-Akupunkt-Klebetherapie lindert Typ-2-Atemwegsentzündungen bei Mäusen mit allergischem Asthma durch Modulation der Anzahl der ILC2s

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erstellung eines Ovalbumin (OVA)-induzierten Mausmodells für allergisches Asthma (AA) zur Untersuchung der therapeutischen Wirkmechanismen der Kechuanting-Akupunktur-Pflastertherapie (KAST) auf die Typ-2-Atemwegsinfektion durch Modulation pulmonaler Gruppe-2-angeborener lymphoider Zellen (ILC2s) über den Calcitonin-Gen-verwandten Peptid (CGRP)/Rezeptor-aktivitätsmodifizierendes Protein 1 (RAMP1)-Signalweg.

Zusammenfassung

Die Akupunkturpunkt-Applikationstherapie an Kechuanting (KAST) hat sich als wirksam bei der Verbesserung der Atemwegsentzündung bei Patienten mit allergischem Asthma (AA) erwiesen; ihre zugrundeliegenden Wirkmechanismen sind jedoch noch unklar. Ziel dieser Studie war es, die therapeutischen Mechanismen von KAST in einem Mausmodell für AA aus neuro-immunologischer Perspektive zu untersuchen. Ein durch Ovalbumin (OVA) induziertes Mausmodell für allergisches Asthma wurde etabliert, und die Mäuse wurden mit KAST behandelt. Die Wirkungen von KAST auf pulmonale Gruppe-2-angeborene lymphoide Zellen (ILC2s) und Typ-2-Atemwegsentzündungen wurden mittels Durchflusszytometrie, Hämatoxylin-Eosin-(HE)-Färbung und Immunhistochemie evaluiert. Western-Blotting (WB) und ELISA dienten zur Bestimmung der Proteinspiegel von Calcitonin-Gen-verwandtem Peptid (CGRP) in Lungengewebe. Die intranasale Verabreichung von CGRP oder des CGRP-Rezeptorinhibitors BIBN-4096 erfolgte bei Mäusen mit allergischem Asthma, um die regulierende Rolle des CGRP/Rezeptor-Aktivitäts-modifizierenden Protein-1-(RAMP1)-Signalwegs auf ILC2s und Typ-2-Atemwegsentzündungen zu untersuchen. KAST verringerte die Anzahl der ILC2s und linderte die Typ-2-Atemwegsentzündung, begleitet von einer verminderten CGRP-Expression im Lungengewebe. Die intranasale Gabe von CGRP erhöhte die Anzahl der RAMP1⁺ILC2s und der gesamten ILC2s in der Lunge und verschlimmerte die Typ-2-Atemwegsentzündung. Umgekehrt führte die intranasale Verabreichung von BIBN-4096 zu einer Verringerung der pulmonalen ILC2s und milderte die Typ-2-Atemwegsentzündung. KAST reduziert die Atemwegsentzündung bei allergischem Asthma, was eng mit der Herunterregulation des CGRP/RAMP1-Signalwegs und der daraus resultierenden Unterdrückung pulmonaler ILC2s assoziiert ist, wie durch pharmakologische Hemmung bestätigt wurde.

Einleitung

Allergisches Asthma (AA) ist das häufigste Asthmaphänotyp, das in China 60–80 % aller Asthmabedingungen ausmacht¹. Es zeichnet sich durch eine hohe Prävalenz und eine suboptimale Krankheitskontrolle aus, die die Lebensqualität der Patienten stark beeinträchtigt und erhebliche wirtschaftliche Belastungen verursacht^2,3,4,5. Obwohl inhalative Kortikosteroide (ICS) weiterhin die Grundlage der klinischen Therapie darstellen⁶, zeigen einige Patienten eine begrenzte Ansprechrate, und die langfristige Anwendung ist häufig mit Nebenwirkungen verbunden und kann den Krankheitsverlauf nicht aufhalten⁷. Daher bleibt die Entwicklung sicherer und wirksamer neuer therapeutischer Strategien sowohl im klinischen als auch im Forschungsbereich eine Priorität. Die Akupunkturpunkt-Applikationstherapie Kechuanting (KAST), eine äußerlich angewendete Traditionelle Chinesische Arzneimethode, führt Wirkstoffe transdermal zu, wodurch möglicherweise der hepatische First-Pass-Effekt vermieden und systemische Nebenreaktionen minimiert werden^8,9. Klinische Studien haben gezeigt, dass KAST Asthmasymptome lindern, einen Teil der Lungenfunktion wiederherstellen und die Lebensqualität der Patienten verbessern kann^10,11,12. Gleichzeitig deuten Serum-Metabolomik-, Netzwerkpharmakologie- und Tierversuche mit Asthmamodellen darauf hin, dass KAST die Atemwegsentzündung abschwächt, indem es die Spiegel entzündungsfördernder Mediatoren im Serum und in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) senkt, einschließlich der Herabregulation der Expression von IgE, IL-4 und IL-13^9,13,14. Insgesamt liefern diese Befunde unterstützende Hinweise auf die therapeutische Wirksamkeit von KAST bei Asthma. Die genauen Wirkmechanismen sind jedoch weiterhin unklar.

Ein zentraler pathologischer Mechanismus, der das Wiederauftreten von AA vorantreibt, ist die Typ-2-Atemwegs­entzündung, an der Gruppe-2-innate Lymphozyten (ILC2s) eine Schlüsselrolle spielen¹⁵. Nach allergener Stimulation sezernieren ILC2s Zytokine wie IL-5 und IL-13 und treiben dadurch die Atemwegs­entzündung voran^16,17. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Eliminierung von ILC2s die Atemwegs­entzündung bei asthmatischen Mäusen signifikant abschwächt und somit ihre zentrale Bedeutung für den Krankheitsverlauf unterstreicht¹⁸. Bemerkenswerterweise werden Aktivierung und Funktion von ILC2s durch mehrere Mechanismen streng reguliert, wobei neuroimmunologische Interaktionen in den letzten Jahren zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen haben. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass das Calcitonin-Gen-verwandte Peptid (CGRP) an das Rezeptor-aktivitätsmodifizierende Protein 1 (RAMP1) auf der Oberfläche von ILC2s binden kann, wodurch deren Aktivierung und anschließende Freisetzung von Typ-2-Zytokinen induziert wird, was die Atemwegs­entzündung bei AA verschärft^19,20,21. In der vorliegenden Studie identifizierte unser Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierungsverfahren (RNA-seq) CGRP als entscheidend reaktives Neuropeptid, das stark durch die KAST-Intervention moduliert wird. Daher konzentrierten wir uns auf den CGRP/RAMP1-Signalweg und verwendeten KAST als Intervention bei AA-Mäusen, um dessen potenzielle Wirkmechanismen bei der Modulation der ILC2-Aktivität und der Abschwächung der Typ-2-Atemwegs­entzündung zu untersuchen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für die Zucht und Verwendung von Laborversuchstieren, herausgegeben von den Nationalen Akademien der Wissenschaften, durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Tierversuchsethik-Komitee des dem Krankenhaus der Nanjing-Universität für Chinesische Medizin angeschlossenen Krankenhauses genehmigt (Genehmigungsnummer: 2023DW-059-01). Eine umfassende Liste aller in dieser Studie verwendeten Materialien, Reagenzien, Werkzeuge und Software ist in der Tabelle der Materialien detailliert aufgeführt.

Experimentelle Tiere und Gruppierung

Gesunde weibliche BALB/c-Mäuse (SPF-Grad, 8–10 Wochen alt) wurden vom Versuchstierzuchtzentrum der Nanjing University of Chinese Medicine (Genehmigungsnummer: SYXK (Su) 2018-0049) bezogen. Die Tiere wurden unter Standardbedingungen mit einem 12-Stunden-Licht-/Dunkel-Wechsel bei 24–26 °C gehalten. Steriles Futter und Wasser wurden ad libitum angeboten, die Einstreu wurde regelmäßig gewechselt und die Käfige routinemäßig gereinigt. Nach einer Anpassungsphase von 7 Tagen wurden die Mäuse zufällig in sechs Gruppen eingeteilt (n = 7/Gruppe): Normale Gruppe, Modellgruppe, CGRP-Gruppe, BIBN-4096-Gruppe, KAST-Gruppe und KAST + CGRP-Gruppe. Die Zuordnung der Tiere zu den Gruppen erfolgte mithilfe einer computergenerierten Zufallszahlentabelle. Die Gruppeneinteilung blieb den Untersuchern bis zur Zuweisung der Interventionen verborgen. Zur Optimierung der Gewebenutzung wurden Lungenproben der randomisierten Kohorte (n = 7 pro Gruppe) systematisch verschiedenen Aufarbeitungswegen zugeordnet, wobei die jeweils tatsächlich analysierten Stichprobengrößen (n = 5, 4 oder 3) für spezifische histologische und molekulare Analysen in den entsprechenden Abbildungslegenden explizit angegeben sind. Keine Daten wurden von der Analyse ausgeschlossen.

Herstellung der KAST-Formulierung

Die Formulierung wurde von der Apothekenabteilung des Anschlusskrankenhauses der Nanjing-Universität für Chinesische Medizin²² hergestellt. Neun traditionelle chinesische Arzneipflanzen wurden verwendet: Semen Brassicae (2 Teile), Rhizoma Corydalis (2 Teile), mit Essig verarbeitete Radix Kansui (1 Teil), Asarum (1 Teil), Ephedra (1 Teil), Semen Lepidii (1 Teil), Gewürznelke (1 Teil), Zimtrinde (1 Teil) und Gleditsia sinensis (1 Teil). Jede Pflanze wurde zu feinem Pulver gemahlen und durch ein 80-Maschen-Sieb gesiebt. Für jeweils 100 g gemischtes Pulver wurden 70 mL frischer Ingwersaft und 30 mL flüssiges Paraffin hinzugefügt, gründlich vermischt und zu Pflastern von 0,3 g ± 5 % mit einem Durchmesser von 0,5 cm verarbeitet. Insbesondere wurden alle pflanzlichen Inhaltsstoffe und der frische Ingwer durch den leitenden Apotheker Lin-gang Zhao authentifiziert und vor der Verwendung bei 4 °C in einer dunklen, trockenen Umgebung gelagert⁹. Um die Reproduzierbarkeit der Intervention und die Chargenstabilität sicherzustellen, wurde ein strenger Qualitätskontrollstandard auf Grundlage der etablierten UPLC-Q-TOF-MS- und HPLC-Methoden unseres Teams eingeführt, der das gleichbleibende Vorhandensein wesentlicher Wirkstoffmarker wie Sinapin-Thiocyanat²³ bestätigt. Praktisch wurden die 0,5 cm großen Pflaster mit 2,5 cm × 5,5 cm großem medizinischem, atmungsaktivem, hypoallergenem Klebeband befestigt, um eine optimale transdermale Applikation zu gewährleisten.

Erstellung des AA-Mausmodells

Das AA-Modell wurde gemäß einem etablierten Protokoll aus der Literatur unter Verwendung einer OVA-Sensibilisierung und intranasaler Provokation induziert²⁴. Mit Ausnahme der Normalgruppe wurden alle Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 200 µL Salzlösung, die 100 µg OVA und 2 mg Aluminiumhydroxid enthielt, an den Tagen 0 und 12 sensibilisiert. Vom Tag 18 bis 23 wurden die Mäuse täglich einmalig intranasal mit 50 µg OVA in 50 µL Salzlösung provoziert. Vom Tag 24 bis 53 erhielten die Mäuse alle zwei Tage eine intranasale Gabe von OVA. Am Tag 54 wurde nach dem Wägen der Mäuse eine Tötung durch Halswirbelzerreißung durchgeführt und das Gewebe entnommen. Anschließend wurde der Lungenkoeffizient bestimmt, indem das Gesamt-Lungengewicht durch das Körpergewicht dividiert wurde.

Interventionen

Von Tag 40 bis Tag 53 wurden Mäuse der KAST-Gruppe und der KAST + CGRP-Gruppe in einem dorsalen Bereich von 3 cm × 6 cm rasiert. Pflaster wurden über die bilateralen Akupunkturpunkte Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) und Shenshu (BL23) aufgebracht und mit Klebeband für 1,5 Stunden täglich an Ort und Stelle fixiert, und zwar 14 aufeinanderfolgende Tage lang. Mäuse der CGRP- und KAST + CGRP-Gruppen erhielten alle zwei Tage von Tag 40 bis Tag 53 eine intranasale Gabe von 10 µL Calcitonin/CALCA-Lösung (1 pg/µL). Mäuse der BIBN-4096-Gruppe erhielten alle zwei Tage eine intranasale Gabe von 10 µL BIBN-4096-Lösung (0,3 mg/mL, CGRP-Rezeptorantagonist). Die Normal- und Modellgruppen erhielten eine Standardfütterung ohne Intervention. KAST wurde von Tag 40 bis Tag 53 verabreicht, nachdem eine allergische Atemwegsentzündung etabliert war (Beginn am Tag 40, also 22 Tage nach der ersten OVA-Challenge am Tag 18). Daher diente KAST in dieser Studie als therapeutische und nicht als prophylaktische Maßnahme.

Zur Hautvorbereitung wurde die Haarentfernung über der vorgesehenen dorsalen Region mit einem elektrischen Haarschneider durchgeführt. Die Lokalisation der Akupunkturpunkte erfolgte streng nach der Norm „Nomenklatur und Lokalisation von Akupunkturpunkten bei Laboratoriumstieren – Teil 3: Mäuse“ (T/CAAM 0002-2020) der Chinesischen Gesellschaft für Akupunktur und Moxibustion. Die vier bilateralen dorsalen Stellenpaare wurden präzise markiert und wie folgt definiert: Feishu (BL13: zwischen den Rippen unterhalb des Dornfortsatzes der 3. Brustwirbels, 3 mm lateral zur hinteren Mittellinie), Geshu (BL17: unterhalb des Dornfortsatzes des 7. Brustwirbels, 3 mm lateral zur Mittellinie), Pishu (BL20: unterhalb des Dornfortsatzes des 12. Brustwirbels, 3 mm lateral zur Mittellinie) und Shenshu (BL23: unterhalb des Dornfortsatzes des 2. Lendenwirbels, 3 mm lateral zur Mittellinie). Das 3M-Tape wurde fest umwickelt, um eine stabile Haftung sicherzustellen und eine Verschiebung des Pflasters oder sekundäre Hauterosion während der 1,5-stündigen Verweildauer auszuschließen.

Die Dosen von CGRP/CALCA (1 pg/µL, 10 µL pro Maus) und BIBN-4096 (0,3 mg/mL, 10 µL pro Maus) wurden basierend auf veröffentlichten Studien²⁵ ausgewählt. Im Einzelnen wurde für die CGRP-Intervention eine 0,1-%-BSA-Lösung hergestellt, indem 1 mg BSA in 1 mL ddH₂O gelöst und anschließend vortexiert wurde, um eine Endkonzentration von 1 mg/mL zu erreichen. Vor der Rekonstitution wurde das lyophilisierte Calcitonin/CALCA-Proteinpulver 30 s bei 4 °C mit 12.000 × g zentrifugiert. Anschließend wurden 20 µL der hergestellten 0,1-%-BSA-Lösung zugegeben, um eine Stammlösung mit 1 µg/µL zu erhalten. Das Fläschchen wurde vorsichtig mehrfach invertiert (ohne Vortexen), kurz zentrifugiert und einige Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um eine vollständige Rekonstitution des Proteins sicherzustellen. Um die Arbeitslösung mit 1 pg/µL herzustellen, ohne ein unhandlich großes Volumen in einem einzigen Verdünnungsschritt zu erzeugen, wurde eine standardmäßige zweistufige serielle Verdünnung durchgeführt: 1 µL der Stammlösung (1 µg/µL) wurden zunächst in 999 µL sterilem Salin verdünnt, um eine Zwischenlösung mit 1 ng/µL zu erhalten; anschließend wurden 1 µL dieser Zwischenlösung mit weiteren 999 µL sterilen Salins versetzt, um die endgültige Arbeitslösung mit 1 pg/µL zu erreichen. Die Arbeitslösung wurde bei 4 °C aufbewahrt, während verbleibende Aliquots bis zu 2–3 Monate bei -20 °C gelagert wurden. Für die BIBN-4096-Gruppe wurden 1 mg BIBN-4096-Pulver in 333 µL ddH₂O gelöst, um eine Stammlösung mit 3 mg/mL zu erhalten, die in Portionen zu je 50 µL pro Fläschchen abgefüllt und bei -80 °C gelagert wurde. Zur Herstellung der Arbeitslösung mit 0,3 mg/mL wurde jedes 50-µL-Aliquot der Stammlösung gründlich mit 450 µL sterilen Salins vermischt. Von Tag 40 bis Tag 53 wurde jeder Maus alle zwei Tage eine Volumenmenge von 10 µL entweder der CGRP-Lösung (1 pg/µL) oder der BIBN-4096-Lösung (0,3 mg/mL) intranasal verabreicht, wobei die Tiere ohne Anästhesie sanft fixiert wurden.

Ergebnisparameter und Nachweismethoden

Verhaltenstest

Am Tag 53, nach der letzten intranasalen Applikation, wurden die Häufigkeiten von Nasenreiben und Niesepisoden mithilfe eines digitalen Videosystems über einen Zeitraum von 10 min beobachtet und aufgezeichnet. Die Häufigkeiten der Verhaltensweisen in den Videos wurden von zwei Forschern unabhängig voneinander und in doppelt verblindeter Weise gezählt. Bei signifikanten Abweichungen zwischen den Zählungen bewertete ein dritter Forscher das Video erneut, und die Daten mit der höchsten Übereinstimmung wurden letztendlich für die statistische Analyse ausgewählt.

Provokationstest der Bronchien

Innerhalb von 24 Stunden nach der letzten Provokation wurde die Atemwegsreaktivität mittels nebulisierter Azetylcholin (ACh) in Konzentrationen von 0, 5, 10, 20 und 40 mg/mL (300 µL pro Konzentration, 1 Minute nebulisiert) bewertet. Die Enhanced Pause (Penh)-Werte, ein dimensionsloser Index, der empirisch die Atemwegsverengung anzeigt und die Atemwegshyperreagibilität (AHR) beurteilt, wurden 5 Minuten nach jeder Nebulisation mittels nichtinvasiver Ganzkörper-Plethysmographie aufgezeichnet. Die Mäuse wurden vor der Aufzeichnung 10 Minuten lang an die Kammer angepasst. Penh wurde automatisch mit der integrierten Software für manuelle Datenspeicherung/Streaming gemäß einer empirischen Formel berechnet, die die Verhältnisse von Expirations- und Inspirationszeit sowie Spitzendurchflüssen berücksichtigt.

Histopathologie (HE-Färbung)

Lungenproben, die in 4 % Paraformaldehyd fixiert wurden, wurden über eine abgestufte Alkoholreihe dehydriert, in Xylol geklärt und mithilfe eines automatisierten Geräts in Paraffinblöcke eingebettet. Die Blöcke wurden in einer Dicke von 4 µm geschnitten, in einem 42 °C warmen Wasserbad aufgeschwemmt und auf Objektträger aufgebracht. Die Objektträger wurden 2 h bei 80 °C erhitzt, über Nacht getrocknet und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Zum Färben wurden die Schnitte in Xylol (I und II, je 20 min) entparaffiniert, über eine abgestufte Ethanolreihe (100 % I/II und 75 %, je 5 min) rehydriert und mit Leitungswasser gespült. Die Objektträger wurden 3–5 min mit Hämatoxylin gefärbt, mit 1 % saurem Alkohol differenziert und in einer Blaufärbung blau entwickelt. Nach dem Waschen wurden die Schnitte über 85 % und 95 % Ethanol (je 5 min) dehydriert und 5 min mit Eosin kontragefärbt. Abschließend wurden die Objektträger in absolutem Ethanol (I, II und III, je 5 min) dehydriert, in Xylol (I und II, je 5 min) geklärt, mit neutralem Balsam zugedeckt und luftgetrocknet. Aufnahmen wurden aus zufälligen Gesichtsfeldern bei 200×-Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop und dem CaseViewer-System angefertigt. Lungenentzündung und epitheliale Verdickung wurden verblindet nach einem 0–4-Skala bewertet: 0, keine Entzündung; 1, gelegentliche entzündliche Zellen; 2, wenige (<3) entzündliche Herde; 3, mehrere (≥3) entzündliche Herde; 4, diffuse Infiltration im gesamten Lungengewebe. Die epitheliale Verdickung wurde wie folgt bewertet: 0, normal; 1, sichtbare Verdickung; 2, teilweise Verdickung der Atemwege; 3, nahezu vollständige Obstruktion; 4, fehlende normale Struktur. Für jede experimentelle Gruppe wurden insgesamt 20 zufällige mikroskopische Gesichtsfelder aufgenommen und ausgewertet, um die rohen histopathologischen Werte zu erhalten. Die Daten aus jeweils vier Gesichtsfeldern wurden gemittelt, um einen einzelnen unabhängigen Datenpunkt zu erhalten, was zu einer endgültigen Stichprobengröße von n = 5 unabhängigen Wiederholungen pro Gruppe für die statistische Analyse führte. Die Bewertung erfolgte verblindet.

RNA-Sequenzierung

Gesamt-RNA wurde aus murinen Lungengeweben mit dem TRIzol-Reagenz gemäß der Herstellerprotokoll extrahiert. Die RNA-Reinheit, -konzentration und -integrität wurden mittels eines Spektrophotometers und einer mikrofluidikbasierten Plattform bewertet. Transkriptom-Bibliotheken wurden unter Verwendung eines kommerziellen Bibliothekspräparationskits erstellt und auf einer Hochdurchsatz-Sequenzierplattform sequenziert, um 150 bp lange paired-end Reads zu generieren. Die Rohdaten wurden mittels geeigneter Filterungssoftware qualitätsgeprüft, um bereinigte Reads zu erhalten, die mit einem spleißsensitiven Alignierungswerkzeug an das Referenzgenom angeordnet wurden. Genexpressionsniveaus wurden als FPKM berechnet, und die Read-Anzahlen wurden mithilfe eines Read-Zählprogramms zusammengestellt. Die differentielle Expressionsanalyse wurde mit einem spezialisierten statistischen Paket durchgeführt, wobei die Schwellenwerte bei |log2 Fold Change| ≥ 1 und adjustiertem p < 0,05 festgelegt wurden.

ELISA

Frisches murines Lungengewebe wurde genau gewogen und in PBS-Puffer bei einem strengen Verhältnis von 20 mg Gewebe zu 200 µL Puffer homogenisiert. Die Homogenate wurden etwa 10 min bei 4 °C mit 13.400 × g zentrifugiert, um die proteinhaltigen Überstände zu gewinnen. Zur Normierung wurde der rohe Proteingehalt der Überstände mittels der BCA-Methode kalibriert. Der ELISA wurde in technischen Triplikaten unter Verwendung kommerzieller Kits gemäß Herstellervorschrift durchgeführt. Kurz gesagt, wurden 50 µL Standardverdünnungen oder 50 µL vorverdünnter Proben (10 µL Proteinprobe gemischt mit 40 µL Probenpuffer, was einer 5-fachen Endverdünnung entspricht) in die mit Antikörper beschichteten 96-Loch-Platten pipettiert. Die Platten wurden verschlossen und 30 min bei 37 °C inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit 1:30 verdünntem Waschpuffer wurden 50 µL des enzymgekoppelten Konjugatreagenz in jedes Loch (außer in die Leerwerte) gegeben und das Gemisch 30 min bei 37 °C inkubiert. Nach weiteren fünf Waschschritten wurden je 50 µL Chromogenlösung A und 50 µL Chromogenlösung B in jedes Loch zugegeben, und die Platte wurde 10 min im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µL Stop-Lösung beendet, wodurch sich die Farbe von blau nach gelb veränderte. Die Absorption (OD-Wert) jedes Lochs wurde innerhalb von 15 min bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Standardkurven wurden unter Verwendung eines vierparametrigen logistischen oder linearen Regressionsmodells erstellt (R² > 0,99 sicherstellend), anhand derer die Konzentrationen des Zielproteins in den Lungengewebe-Homogenaten berechnet wurden.

Durchflusszytometrie

Lungengewebe wurden entnommen, zerkleinert und in 5 mL RPMI-1640 mit 10 % FBS, 50 µL Liberase TM und 5 µL DNase I bei 37 °C für 45 min unter Schütteln bei 80 U/min verdaut. Die verdauten Suspension wurde durch einen 400-Maschen-Zellsieb filtriert und bei 4 °C 10 min bei 300 × g zentrifugiert. Der Pellet wurde 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln in 2 mL Erythrozytenlysepuffer resuspendiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen resuspendiert und mit Ghost Dye Red 780 (1,25 µL pro Probe) 20 min bei 4 °C im Dunkeln zur Ausschluss von toten Zellen gefärbt. Nach einer weiteren Wäsche wurden die Zellen mit 10 µL FcR-Blockierreagenz 10 min bei 4 °C blockiert. Anschließend wurden die Zellen an der Oberfläche 30 min bei 4 °C mit den folgenden fluorochrom-markierten Antikörpern gefärbt: FITC anti-maus CD45 (0,5 µL), PE anti-maus/mensch KLRG1 (1,25 µL), BB700 rat anti-maus CD90.2 (0,5 µL) und eine biotinylierte Linienmischung, bestehend aus anti-maus CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (jeweils 0,5 µL) sowie anti-maus CD19 (2 µL). Nach dem Waschen wurden die Zellen 30 min bei 4 °C mit Brilliant Violet 605 Streptavidin (2 µL) inkubiert. Die Daten wurden auf einer BD-Durchflusszytometrieplattform erfasst und mit der FlowJo-Software analysiert. Die Kompensation von Fluoreszenzüberlappungen wurde automatisch durch die kalibrierte Erfassungssoftware des Geräts überwacht und angepasst. Die hierarchische Torgate-Strategie zur Identifizierung pulmonaler ILC2s wurde nacheinander wie folgt durchgeführt: Zunächst wurden Gesamtlymphozyten anhand der Morphologie im Vorwärts-/Seitwärtsstreulicht (FSC-A/SSC-A) isoliert, gefolgt von der Unterscheidung von Doppelzellen mittels Singulett-Gating (FSC-H/FSC-A). Lebende Zellen wurden anschließend durch Ausschluss toter Zellen (Ghost Dye^-) identifiziert, und dann wurden schrittweise Standardtore angewendet, um die Populationen CD45⁺ und Lineage^- auszuwählen. Innerhalb des lebenden CD45⁺ Lineage^--Tors wurden pulmonale ILC2s explizit definiert und quantifiziert, basierend auf den nachfolgenden positiven, sequenziellen Kaskadentoren für CD90.2⁺ und KLRG1⁺-Cluster.

Immunfluoreszenz (IF)

Gefrorene Lungen­schnitte wurden 15–30 min bei Raumtemperatur aufgetaut und anschließend dreimal je 6 min mit PBST (PBS mit 0,05 % Tween-20) gewaschen, um die OCT-Substanz zu entfernen. Nach dem Entfernen überschüssiger Flüssigkeit wurde mittels einer Immunhistochemie-Schreibfeder eine hydrophobe Barriere um das Gewebe gezogen. Die Schnitte wurden in einem Blockier- und Permeabilisierungs-Puffer, der 0,3 % Triton X-100 und 5 % Ziegenserum enthielt, inkubiert. 37 °C für 100 min, gefolgt von einer Übernacht-Inkubation (16–20 h) bei 4 °C mit dem primären Antikörper. Am nächsten Tag wurden die Schnitte 30 Minuten bei Raumtemperatur equilibriert, dreimal mit PBST gewaschen und anschließend mit einem artspezifischen, fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper inkubiert 37 °C im Dunkeln für 60–90 min. Nach drei zusätzlichen Waschungen mit PBST wurden die Kerne mit DAPI (1:1 oder 2:1 in PBS verdünnt) für 8 min bei Raumtemperatur im Dunkeln gegengefärbt. Nach einer abschließenden Waschrunde mit PBST (3 × 6 min) wurden die Schnitte mit einem Anti-Fade-Einbettmedium auf Objektträger aufgebracht, versiegelt, um Blasenbildung zu verhindern, und im Dunkeln gelagert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop bei 400× Vergrößerung. Die Anzahl positiver Zellen pro Feld wurde manuell mit der Leica LAS X-Software gezählt. Für jede experimentelle Gruppe wurden insgesamt 15 zufällige mikroskopische Felder abgebildet, um die Rohzellzahlen zu erhalten. Die Daten aus jeweils drei Feldern wurden gemittelt, um einen einzelnen unabhängigen Datenpunkt zu erhalten, was zu einer endgültigen Stichprobengröße von n = 5 unabhängigen Wiederholungen pro Gruppe für die statistische Analyse führte. Die Zählung erfolgte verblindet.

Immunhistochemie (IHC)

Paraffinschnitte wurden in drei Portionen Xylol (jeweils 15 min) entparaffiniert, durch eine abgestufte Ethanolreihe (100 % zweimal, 85 % und 75 %; jeweils 5 min) rehydriert und mit destilliertem Wasser gespült. Die Antigen-Retrieval-Behandlung erfolgte in Zitratpuffer (pH 6,0) mithilfe eines Schnellkochtopfs (3 min bei hohem Druck nach dem Sieden), gefolgt von einer Abkühlphase und drei Waschschritten mit PBS (pH 7,4) zu je 5 min. Die endogene Peroxidase wurde mit 3 % H₂O₂ für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln blockiert. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit einem hydrophoben Stift umrandet und mit 3 % Ziegen-Serum für 30 min blockiert. Anschließend wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern in PBS verdünnt inkubiert: anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300) oder anti-IL-13 (1:150). Am folgenden Tag wurden die Schnitte gewaschen und für 50 min bei Raumtemperatur mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern (Anti-Maus für IL-4; Anti-Kaninchen für IL-5 und IL-13) inkubiert. Die Signale wurden mithilfe einer frisch zubereiteten DAB-Lösung unter mikroskopischer Kontrolle sichtbar gemacht und mit Leitungswasser gestoppt. Schließlich wurden die Schnitte mit Hämatoxylin kontragefärbt, differenziert, gebläut, durch abgestufte Alkohole und Xylol dehydriert und mit neutralem Balsam eingedeckt, um sie mikroskopisch zu untersuchen. Die mittlere optische Dichte (IOD/Area) wurde mit einer Bildanalyse-Softwareplattform bei 200×-Vergrößerung quantifiziert. Für jede experimentelle Gruppe wurden insgesamt 15 zufällig ausgewählte mikroskopische Felder aufgenommen, um die Rohwerte zu erhalten. Die Daten aus jeweils drei Feldern wurden gemittelt, um einen einzelnen unabhängigen Datenpunkt zu erhalten, was zu einer endgültigen Stichprobengröße von n = 5 unabhängigen Wiederholungen pro Gruppe für die statistische Analyse führte. Die Bewertung erfolgte durch zwei verblindete Beobachter.

Immunoblot (WB)

Zur Probenvorbereitung wurden murine Lungenproben (ca. 30 mg) fein zerkleinert und in 300 µL präkonditioniertem RIPA-Lysepuffer, der mit 1 % Protease-/Phosphatase-Inhibitor-Cocktail versetzt war, homogenisiert. Die Homogenisierung erfolgte mittels eines Gewebehomogenisators bei 60 Hz über vier Zyklen (60 s pro Zyklus). Die Lysate wurden anschließend etwa 15 min bei 4 °C mit 13.400 × g zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. Die Gesamtproteinkonzentrationen wurden mithilfe eines standardisierten BCA-Protein-Assay-Kits bestimmt. Die Proben wurden daraufhin normalisiert, mit 5× Lade-Puffer im Volumenverhältnis 4:1 versetzt und 7 min bei 95 °C denaturiert. Für die SDS-PAGE wurden Proteinproben (20 µg pro Lane) zusammen mit einem vorgefärbten Protein-Molekulargewichtsmarker aufgetragen, zunächst 20 min bei konstanter Spannung von 80 V und anschließend 70 min bei 120 V aufgetrennt. Die Proteine wurden nass in ein 0,22 µm PVDF-Membran unter konstantem Strom von 300 mA über 120 min in einem Eisbad transferiert. Die Membranen wurden mit 5 % BSA in TBST für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und anschließend über Nacht (bis zu 18 h) bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen CGRP (1:500) und GAPDH (1:2000) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit TBST (jeweils 10 min) wurden die Membranen mit mit HRP konjugierten sekundären Antikörpern (1:10.000) für 1–2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Waschen wurden die Proteinbanden mittels eines verbesserten chemilumineszenten (ECL) Substrats im VILBER Fusion FX-Bildgebungssystem sichtbar gemacht. Die Bandenintensitäten wurden mit ImageJ 1.8 quantifiziert, und die Expression des Zielproteins wurde auf die GAPDH-Innenkontrolle normalisiert.

Statistische Analyse

Alle experimentellen Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die Datenanalyse und statistische Aufbereitung erfolgte mit einer spezialisierten statistischen Softwareplattform. Vor dem Vergleich zwischen Gruppen wurden die Datensätze systematisch auf Normalverteilung geprüft. Bei normalverteilten Daten mit homogener Varianz wurde eine einfache ein- oder zweifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von post-hoc-Tests nach Tukey, Šídák, Holm-Šídák oder dem Fisher’schen LSD-Test für multiple paarweise Vergleiche. Beim Vergleich mehrerer Gruppen mit einer einzigen Kontrollgruppe wurde der Dunnett-Test angewendet. Bei Datensätzen mit heterogener Varianz kam die Brown-Forsythe-ANOVA zum Einsatz, gefolgt vom Dunnett’schen T3-Test. Für Datensätze, die nicht der Normalverteilung folgten, wurde der nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test verwendet, gefolgt vom Dunn-Test für multiple Vergleiche. Ein P-Wert < 0,05 wurde als Hinweis auf statistisch signifikante Unterschiede gewertet. Unterschiedliche Signifikanzniveaus werden dynamisch gekennzeichnet als *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und ****p < 0,0001. Alle Bewertungen der experimentellen Ergebnisse, einschließlich histologischer Score-Erhebung, Durchflusszytometrie-Analyse und Bildquantifizierung, wurden streng verblindet durchgeführt.

Ergebnisse

KAST reduziert pulmonale ILC2-Zellen und lindert Typ-2-Atemwegsentzündungen

Um die therapeutischen Wirkungen von KAST zu untersuchen, wurde ein OVA-induziertes AA-Mausmodell etabliert und mit Pflastern behandelt, die an den Akupunkturpunkten Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) und Shenshu (BL23) appliziert wurden (Abbildung 1A). Nach der Erzeugung des Modells zeigten die AA-Mäuse eine verminderte Körpermasse, wohingegen die KAST-Mäuse im Vergleich zur Modellgruppe eine signifikant erhöhte Körpermasse aufwiesen (Abbildung 1B). Der Lungenkoeffizient, ein Indikator für pulmonale Entzündung, war bei den AA-Mäusen erhöht, nahm jedoch nach KAST-Behandlung deutlich ab (Abbildung 1C). Verhaltensanalysen zeigten bei den AA-Mäusen verstärktes Kratzen an der Nase und häufigeres Niesen, was durch KAST signifikant gemindert wurde (Abbildung 1D–E). Die Ganzkörperplethysmographie zeigte, dass die Penh-Werte, ein Hinweis auf Hyperreagibilität der Atemwege, bei den AA-Mäusen erhöht waren, nach der Behandlung jedoch sanken, was auf eine Verbesserung der Lungenfunktion hindeutet (Abbildung 1F). Die histopathologische Analyse mittels HE-Färbung ergab eine peribronchiale und perialveoläre Infiltration entzündlicher Zellen in der Modellgruppe im Vergleich zu normalen Kontrollen. Im Gegensatz dazu war die entzündliche Infiltration in der KAST-Gruppe vermindert (Abbildung 2A–B). Die Immunhistochemie zeigte, dass IL-4, IL-5 und IL-13 hauptsächlich im Zytoplasma infiltrierender entzündlicher Zellen und einiger Epithelzellen lokalisiert waren, mit möglicher Akkumulation in interstitiellen Bereichen. Im Vergleich zu den normalen Kontrollen wiesen die Modellgruppe deutlich erhöhte positive Signale und mittlere optische Dichtewerte auf, die in der KAST-Gruppe signifikant reduziert waren (Abbildung 2C–H). Die Durchflusszytometrie zeigte weiterhin, dass die Anzahl der ILC2-Zellen in den Lungen der AA-Mäuse im Vergleich zu den normalen Kontrollen signifikant erhöht war, während KAST die ILC2-Zahlen deutlich verringerte (Abbildung 2I–J).

KAST lindert die Typ-2-Atemwegsentzündung durch Hemmung der CGRP/RAMP1-Achse

Die Hyperaktivierung von ILC2 wird durch mehrere Faktoren reguliert. Die RNA-Seq-Analyse zeigte, dass die Expression von CGRP in AA-Mäusen signifikant hochreguliert war, während KAST die pulmonalen CGRP-Spiegel deutlich herabsetzte (Abbildung 3A). Western Blot und ELISA bestätigten erhöhte CGRP-Proteinspiegel in der Modelgruppe im Vergleich zu Kontrollen, die durch KAST reduziert wurden (Abbildung 3B–D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass KAST die CGRP-Expression in den Lungen von AA-Mäusen abschwächt und dadurch die Immunantwort der ILC2-Zellen moduliert. Insgesamt legen diese Veränderungen in der Hochdurchsatzsequenzierung und der Proteinscreening-Analyse eine starke Assoziation zwischen der therapeutischen Intervention mit KAST und der Herabregulierung der pulmonalen CGRP-Spiegel in AA-Mäusen nahe.

Um die Rolle von CGRP weiter zu untersuchen, wurden AA-Mäuse mit exogenem CGRP, dem CGRP-Rezeptorantagonisten BIBN-4096 oder KAST in Kombination mit CGRP behandelt. Die ELISA-Ergebnisse zeigten signifikant verringerte CGRP-Proteinspiegel in den KAST- und BIBN-4096-Gruppen, erhöhte Spiegel in der CGRP-Gruppe sowie höhere Spiegel in der KAST + CGRP-Gruppe im Vergleich zu KAST allein (Abbildung 4A). Die Durchflusszytometrie ergab, dass die Anzahl der ILC2-Zellen in den KAST- und BIBN-4096-Gruppen vermindert war, jedoch in den CGRP- und KAST + CGRP-Gruppen im Vergleich zur Modellgruppe erhöht war (Abbildung 4B–C). Die HE-Färbung zeigte eine verminderte Infiltration entzündlicher Zellen um die Atemwege und Alveolen in den KAST- und BIBN-4096-Gruppen, während die Infiltration in den CGRP- und KAST + CGRP-Gruppen verstärkt war (Abbildung 4D–E). ELISA bestätigte zudem eine Abnahme der IL-4-, IL-5- und IL-13-Spiegel in den KAST- und BIBN-4096-Gruppen, jedoch einen Anstieg in den CGRP- und KAST + CGRP-Gruppen (Abbildung 4F–H).

Die Anzahl der pulmonalen RAMP1⁺ILC2s in den verschiedenen Gruppen wurde mittels mehrfarbiger Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe die Anzahl der gesamten RAMP1⁺ILC2s im Lungengewebe der Modellgruppe signifikant erhöht war. Im Vergleich zur Modellgruppe stieg die Anzahl der pulmonalen RAMP1⁺ILC2s in der CGRP-Gruppe weiter signifikant an, während sie sowohl in der BIBN-4096-Gruppe als auch in der KAST-Gruppe deutlich vermindert war. Bemerkenswerterweise zeigte die KAST + CGRP-Gruppe im Vergleich zur KAST-Gruppe eine signifikante Erhöhung der Anzahl pulmonaler RAMP1⁺ILC2s, was darauf hindeutet, dass eine exogene CGRP-Zugabe die hemmende Wirkung von KAST auf die Populationen der gesamten RAMP1⁺ILC2s erfolgreich umkehrte (Abbildung 5A–B).

VERFÜGBARKEIT VON DATEN:

Die vollständigen Rohdatensätze, die in der vorliegenden Studie generiert und analysiert wurden, wurden in einem öffentlich zugänglichen Repository hinterlegt. Diese umfassenden Materialien enthalten insbesondere alle vollständigen, ursprünglichen Membran-Scans für Western Blot (WB)-Analysen, alle vollständigen, rohen, hochauflösenden Mikroskopieaufnahmen für histologische (HE und IHC) und Immunfluoreszenz-(IF)-Analysen sowie individuelle Wiederholungsdatensätze und Excel-Tabellen zur Quantifizierung. Alle Rohdaten sind unter der folgenden dauerhaften DOI frei zugänglich: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. Die Reihenfolge der Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie ist in Abbildung 1, Zusatzmaterial dargestellt. Zwei vollständige Blot-Bilder wurden als Abbildungen 2–3, Zusatzmaterial eingereicht, und die quantitativen Daten liegen in Tabelle 1, Zusatzmaterial vor.

Abbildung 1: Wirkungen von KAST auf Symptome und Lungenfunktion bei AA-Mäusen. (A) Protokoll zur Induktion von allergischem Asthma mittels OVA. (B) Körpergewichtsstatistik der Mäuse in jeder Gruppe, n = 5. (C) Lungenkoeffizient der Mäuse in jeder Gruppe, n = 5. (D) Anzahl der Nasenreibungen innerhalb von 10 min nach der letzten Provokation, n = 5. (E)  Häufigkeit des Niesens innerhalb von 10 min nach der letzten Provokation, n = 5. (F) Penh-Werte der Mäuse in jeder Gruppe nach Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen von Acetylcholin, n = 5. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die statistischen Vergleiche wurden entweder mittels einfaktorieller oder zweifaktorieller ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem post-hoc-Mehrfachvergleichstest, wo zutreffend. n = biologische Wiederholungen. Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Regulation der ILC2-Zahlen und der Typ-2-Luftwegentzündung durch KAST in AA-Mäusen. (A) Morphologische Veränderungen der Lungen, untersucht mittels HE-Färbung. Maßstab = 50 µm. Vergrößerung: 200×. Die Entzündungsscore wurden verblindet bewertet. (B) Statistische Analyse der Entzündungsscores in verschiedenen Gruppen, n = 5. (C–H) Repräsentative IHC-Bilder und mittlere optische Dichtewerte der IL-4- (C, D), IL-5- (E, F) und IL-13-Proteinexpression (G, H) in Lungengewebe verschiedener Gruppen, n = 5. Maßstab = 50 µm. Vergrößerung: 200×. (I) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme, die die endgültige Gating-Strategie für pulmonale ILC2 in den Gruppen Normal, Modell und KAST zeigen. Einzelzellen und lebensfähige Zellen wurden sequenziell als CD45⁺ Lineage^- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19) selektiert, gefolgt von CD90.2⁺, und pulmonale ILC2 wurden letztlich durch die positive Expression von KLRG1⁺ identifiziert. Die Daten wurden auf einer Hochleistungs-Durchflusszytometrie-Plattform erfasst und mit einem speziellen Softwarepaket zur Analyse von Durchflusszytometriedaten ausgewertet. (J) Analyse der ILC2, angegeben als Anteil von CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺-Zellen an den lebenden Zellen, n = 5. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die statistischen Vergleiche wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließenden geeigneten post-hoc-Tests für multiple Vergleiche durchgeführt. n = biologische Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: KAST hemmt die CGRP-Expression in Lungengewebe von AA-Mäusen. (A) Heatmap der Genexpression in verschiedenen Gruppen, n = 4. (B) Repräsentative WB-Bilder der CGRP-Expression (10 kDa) und GAPDH-Expression (37 kDa) in Lungengewebe jeder Gruppe. (C) WB-Analyse der CGRP-Proteinexpression in Lungengewebe, dargestellt als relative CGRP-Expression (CGRP/GAPDH-Verhältnis), n = 3. (D) ELISA-Analyse der CGRP-Proteinexpression in Lungengewebe, n = 4. Die Daten sind als Mittelwert ± SD angegeben. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die statistischen Vergleiche wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließendem post-hoc-Mehrfachvergleichstest durchgeführt. n = biologische Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Wirkung von KAST auf die Anzahl von ILC2-Zellen und die Typ-2-Luftwegentzündung über CGRP in AA-Mäusen. (A) ELISA-Analyse der CGRP-Proteinexpression in Lungengewebe aus verschiedenen Gruppen, n = 4. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von ILC2-Zellen (CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) in jeder Gruppe. (C) Analyse der ILC2-Zellen, ausgedrückt als Prozentsatz von CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺-Zellen unter den lebenden Zellen, n = 5. (D) Morphologische Veränderungen der Lunge, untersucht mittels HE-Färbung. Maßstab = 50 µm. Vergrößerung: 200×. (E) Statistische Analyse der Entzündungswerte in den verschiedenen Gruppen, n = 5. (F–H) ELISA-Analyse der Proteinexpression von IL-4 (F), IL-5 (G) und IL-13 (H) in Lungengewebe aus verschiedenen Gruppen, n = 4. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die statistischen Vergleiche wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließenden geeigneten post-hoc-Tests für multiple Vergleiche durchgeführt. n = biologische Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Wirkung von KAST auf die Anzahl der ILC2-Zellen in Lungengewebe über den CGRP/RAMP1-Signalweg. (A) Zellzahlen von RAMP1⁺ ILC2s (definiert als KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺ triple-positive Zellen) pro 400× Feld in Lungengewebe, n = 5. (B) Repräsentative Fluoreszenzfärbung von Lungengewebe. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt, und die Immunfärbung erfolgte für KLRG1 (lila), GATA3 (rot) und RAMP1 (grün). Maßstabsbalken = 50 µm. Quantifizierung: manuelle Zählung der RAMP1⁺ ILC2s (KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺ Zellen) in verblindeter Weise mithilfe einer spezialisierten Bildanalysenplattform. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die statistischen Vergleiche wurden mittels einfaktorieller ANOVA gefolgt von einem post-hoc-Mehrfachvergleichstest durchgeführt. n = biologische Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 1 (Zusatzmaterial): Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme, die die schrittweise Gating-Strategie zur Isolierung pulmonaler ILC2-Zellen zeigen. Zunächst wurden alle Ereignisse mittels Streuung nach vorne (FSC-A) und seitlicher Streuung (SSC-A) ausgewählt. Doppelzellen wurden über FSC-A gegen FSC-H ausgeschlossen, um Einzelzellen zu erhalten. Lebende Zellen wurden als Ghost Dye Red 780⁻ identifiziert, um tote Zellen auszuschließen. Anschließend wurden Leukozyten als CD45⁺ ausgewählt, gefolgt von der Selektion von linien-negativen (Lin⁻) Zellen. Innerhalb der CD45⁺ Lin⁻-Population wurden die Zellen weiter auf CD90.2⁺ selektiert, und pulmonale ILC2-Zellen wurden letztlich durch die positive Expression von KLRG1 (KLRG1⁺) definiert.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S2: Vertretendes Western-Blot-Bild des internen Referenzproteins GAPDH (37 kDa) aus Maus-Lungengewebe-Proben. Die bandintegrierte optische Dichte wurde mit der ImageJ-Software zur anschließenden Normalisierung quantifiziert.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 3 (Zusatzmaterial): Repräsentatives Western-Blot-Bild des Zielproteins CGRP (10 kDa) aus Maus-Lungengewebe-Proben. Die relative CGRP-Expression wurde berechnet, indem die integrierte optische Dichte der CGRP-Banden durch die entsprechenden integrierten optischen Dichte-Werte von GAPDH dividiert wurde.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Tabelle 1: Rohdatenwerte. Rohdatenwerte, die zur Erstellung der Diagramme verwendet wurden.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Behandlung von AA weist mehrere Einschränkungen auf, darunter Nebenwirkungen im Zusammenhang mit langfristiger Medikamenteneinnahme, unvollständige Symptomkontrolle und häufige Rückfälle. Obwohl die konventionelle pharmakologische Therapie wirksam ist, geht sie oft mit unerwünschten Wirkungen wie Steroidabhängigkeit^26,27 einher. Im Gegensatz dazu bietet KAST eine sichere, kostengünstige und praktische Alternative zur Behandlung von AA. Klinische Belege haben gezeigt, dass KAST Asthmasymptome wirksam lindern kann, indem es die pulmonale Immunfunktion moduliert²⁸. In dieser Studie konnten wir außerdem nachweisen, dass KAST die Typ-2-Atemwegsentzündung bei AA-Mäusen abschwächt, indem es den CGRP/RAMP1-Signalweg hemmt und die Anzahl der ILC2s verringert.

Die angeborene Immunität, insbesondere ILC2-Zellen, spielt eine unverzichtbare Rolle bei der Initiation, Verstärkung und Aufrechterhaltung der Typ-2-Atemwegsentzündung bei AA²⁹. Nach Allergenexposition reagieren ILC2-Zellen rasch auf epitheliale Alarmin-Signale und setzen innerhalb weniger Stunden große Mengen an IL-5 und IL-13 frei, wodurch Typ-2-entzündliche Reaktionen ausgelöst werden^30,31. Darüber hinaus fördern ILC2-Zellen die Differenzierung von Th2-Zellen und die Synthese von IgE, verstärken somit die adaptive Immunantwort und verschlimmern die Atemwegsentzündung³². Untersuchungen haben gezeigt, dass die genetische Eliminierung von ILC2-Zellen die Dauer der Atemwegsentzündung in AA-Modellen signifikant verkürzt, was ihre zentrale Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Typ-2-Entzündung unterstreicht¹⁸. ILC2-Zellen werden durch Zytokine (z. B. IL-25, IL-33, TSLP), entzündliche Mediatoren (z. B. Leukotriene) und Neuropeptide (z. B. CGRP, VIP, NMU) reguliert³³. Unter diesen spielen Neuropeptide eine entscheidende Rolle in der Regulation der angeborenen Immunität. Neuromedin U (NMU) verstärkt direkt die Aktivität von ILC2-Zellen und induziert rasch die Freisetzung von IL-5 und IL-13³⁴. Das vasoaktive intestinale Peptid (VIP) trägt zur Nährstoffaufnahme und zirkadianen Regulation bei, fördert die IL-5-Produktion durch ILC2-Zellen und erhält die Homöostase der Eosinophilen aufrecht³³. CGRP verstärkt die Freisetzung von IL-5 aus ILC2-Zellen deutlich und fördert dadurch die Atemwegsentzündung bei AA. Bemerkenswerterweise wird RAMP1, die Rezeptoruntereinheit für CGRP, auf ILC2-Zellen in viel höheren Mengen exprimiert als Rezeptoren für andere Neuropeptide, was darauf hindeutet, dass CGRP der stärkste Ligand für die Aktivierung von ILC2-Zellen ist³⁵. In dieser Studie identifizierte die Transkriptom-Analyse CGRP als eines der am stärksten differenziell exprimierten Neuropeptide bei AA-Mäusen, und proteinbasierte Assays bestätigten die Hochregulation in Lungengewebe. Die exogene Gabe von CGRP erhöhte die Anzahl der ILC2-Zellen und die Freisetzung von Typ-2-Zytokinen weiter, wodurch die Atemwegsentzündung verschärft wurde.

Mechanistisch bindet CGRP an RAMP1 auf ILC2s, um deren downstream gerichtete Immunantworten zu regulieren. Während einige vorhandene Literaturstellen CGRP als negativen Regulator beschreiben, der die Expansion von ILC2s begrenzt, um vor Hyperinflammation zu schützen^20,21, deuten gegenteilige Befunde darauf hin, dass CGRP mit Alarminen synergistisch wirken kann, um die Gruppe-2-angeborene Immunität in bestimmten pathologischen Mikroumgebungen stark zu aktivieren. Unsere experimentellen Endpunkte orientieren sich spezifisch an dieser letztgenannten Kaskade und zeigen eine durch CGRP vermittelte Hochregulation der pulmonalen ILC2-Infiltration in der OVA-induzierten allergischen Mikroumgebung. Umgekehrt verbessert die Blockade des CGRP-Signalwegs mit dem Rezeptorantagonisten BIBN-4096 die ILC2-vermittelte Atemwegsinfektion signifikant. Anstatt direkte genetische Ablationsbeweise vorzulegen, nutzen unsere Ergebnisse assoziative transkriptomische Variationen und parallele pharmakologische Interventionsversuche (unter Verwendung von exogenem CGRP und dem Antagonisten BIBN-4096), um zu zeigen, dass der therapeutische Schutz durch KAST eng mit der Unterdrückung von CGRP/RAMP1-Signalclustern auf ILC2s korreliert.

Trotz dieser vielversprechenden Ergebnisse müssen mehrere inhärente Einschränkungen berücksichtigt werden. Erstens liefert das OVA-induzierte murine Modell zwar wertvolle mechanistische Erkenntnisse, könnte jedoch aufgrund interspezifischer Unterschiede die komplexe pathophysiologische und immunologische Landschaft des menschlichen allergischen Asthmas nicht vollständig nachbilden. Zweitens erfordert die relativ geringe Stichprobengröße bei bestimmten explorativen Assays die Untersuchung größerer Kohorten, um eine breitere statistische Verallgemeinerung zu ermöglichen. Drittens konzentrierte sich diese Studie vorrangig auf die CGRP/RAMP1/ILC2-Signalachse, was bedeutet, dass andere möglicherweise relevante neuro-immune Wechselwirkungspfade und überlappende Zytokinnetzwerke zukünftig tiefergehend untersucht werden müssen. Besonders hervorzuheben ist eine wesentliche technische Limitation: die fehlende Kontrollgruppe mit einem dedizierten Schein-Akupunkturpunkt, die nicht-medikamentöse Pflaster oder nicht-akupunkturelle Lokalisationen verwendet. Folglich können potenzielle unspezifische Störfaktoren – wie mechanischer Stress durch Rasur, experimentelles Handling und die adhesive Stimulation des Pflasters selbst – nicht vollständig von den spezifischen therapeutischen Eigenschaften der KAST getrennt werden. Um diese Unwägbarkeiten auszuräumen, werden unsere zukünftigen Forschungsansätze streng gestaltete Schein-Kontrollgruppen und Validierungen über mehrere Signalwege hinweg einbeziehen, um die Spezifität und Reproduzierbarkeit dieser Ergebnisse weiter zu festigen. Hinsichtlich der beobachteten Reduktion der CGRP-Proteinspiegel nach BIBN-4096-Behandlung ist entscheidend anzumerken, dass BIBN-4096 zwar primär als kompetitiver Antagonist wirkt, der den RAMP1/CRLR-Rezeptorkomplex und nicht direkt die CGRP-Synthese hemmt, aber dennoch die in vivo-Gabe eine Herunterregulation der lokalen Ligandenakkumulation im Gewebe bewirken kann. Dieses sekundäre Phänomen wird vermutlich durch die Unterbrechung der neuro-immunen positiven Feedbackschleife vermittelt. Durch die Blockade von RAMP1 auf Zielimmunzellen wie ILC2s unterdrückt BIBN-4096 die Freisetzung nachgeschalteter Effektorzytokine, wodurch wiederum die retrograde inflammatorische Aktivierung sensorischer Nervenendigungen und pulmonaler neuroendokriner Zellen (PNECs) verringert wird und somit indirekt die nachgeschaltete CGRP-Synthese und Gewebespeicherung abnimmt.

Zusammenfassend zeigen unsere empirischen Befunde, dass KAST die pulmonale angeborene Immunmikroumgebung wirksam durch gezielte Beeinflussung der neuronalen CGRP/RAMP1-Achse umgestaltet. Obwohl wir anerkennen, dass eine direkte klinische Übertragung aufgrund der biologischen Unterschiede zwischen Nagetieren und Menschen vorsichtige Optimierung erfordert, liefern diese Endpunkte eine entscheidende, bisher fehlende mechanistische Grundlage, die die traditionelle Theorie des „Fei Wai He Pi Mao“ (Lunge verbindet sich mit Haut und Haaren) untermauert. Durch die Bereitstellung einer präzisierten neuro-immunologischen Perspektive schafft dieses Protokoll eine zuverlässige wissenschaftliche Basis, um zukünftige prospektive, multizentrische klinische Übertragungen traditioneller Kräuter-Akupunkturpflastertherapien zur Behandlung allergischer Asthmaerkrankungen zu leiten und zu unterstützen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3M Medizinisches atmungsaktives Klebeband	3M, USA	1530C	Pflasterfixierung
Acetylcholinchlorid	Sigma-Aldrich, USA	A6625	bronchiale Provokation
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, USA	G2939BA	Beurteilung der RNA-Qualität und -Integrität
Alexa Fluor 488 Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific, USA	(Sonderbestellung)	Immunfluoreszenz (sekundär)
Aluminiumhydroxid	Sigma-Aldrich, USA	239186	Adjuvans
Anti-CGRP-Antikörper (Kaninchen)	Abcam, UK	ab81887	Western Blot / IF
BALB/c-Maus (weiblich, SPF, 8–10 Wochen, 18–22 g)	Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd.	B202407260106	Tiermodell
BB700 Rat Anti-Maus CD90.2 (Klon 53-2.1)	BD Biosciences, USA	566465	Durchflusszytometrie
BD FACSCanto II Durchflusszytometer	BD Biosciences, USA	FACSCanto II	Durchflusszytometrie
BIBN-4096 (Olcegepant-Hydrochlorid)	MedChemExpress LLC, USA	HY-10095A	CGRP-Rezeptorantagonist
Biotin-Lineage-Cocktail	BD Biosciences, USA	(Angepasst, Klone wie beschrieben)	Durchflusszytometrie
Brilliant Violet 605 Streptavidin	BD Biosciences, USA	563260	Durchflusszytometrie
BSA Albumin Fraktion V	BioFroxx (neoFroxx GmbH), Deutschland	4240GR100	Blockierung
Calcitonin/CALCA-Protein	MedChemExpress LLC, USA	HY-P77587	CGRP-Intervention
CD11c/ITGAX-Antikörper (Kaninchen)	Abmart, Shanghai, China	MU115408S	Immunfluoreszenz
Citrat-Antigen-Retrieval-Puffer	Boster, China	AR0024	Immunhistochemie
DAPI-Färbelösung	Beyotime, Shanghai, China	C1006	Kernfärbung
ddH2O (doppelt destilliertes Wasser)	Sigma-Aldrich, USA	10977015	Proteinrekonstitution und Pulverauflösung
DESeq2	Bioconductor (R-Paket)	Version 1.42.0	Software zur differentiellen Expressionsanalyse
DNase I	Roche Diagnostics, Deutschland	10104159001	Verdauung von Lungengewebe
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam, UK	ab150106	Immunfluoreszenz (sekundär)
ECL-Substrat (Super Femto)	Nanjing Lanken Biotech, China	–	Chemilumineszenz bei Western Blot
Erweitertes BCA-Protein-Assay-Kit	Beyotime, Shanghai, China	P0010	Proteinquantifizierung
Eosin Y-Färbelösung	Sigma-Aldrich, USA	HT110216	Histologie (HE-Färbung)
Ethanol (absolut, analysenrein)	Sinopharm Chemical Reagent, China	10009218	Gewebedehydrierung und Histologie
F4/80-Antikörper (Maus, Klon C-7)	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-377009	Immunfluoreszenz
fastp	Open Source (GitHub)	Version 0.23.4	Software zur Qualitätskontrolle von RNA-seq-Rohdaten
FITC Anti-Maus CD45 (Klon 30-F11)	BD Biosciences, USA	553080	Durchflusszytometrie
FlowJo	BD Biosciences, USA	10	Analysesoftware für Durchflusszytometrie
GAPDH monoklonaler Antikörper (Maus)	Proteintech, Wuhan, China	60004-1-Ig	Western Blot
GATA3-Antikörper (Maus, Klon L50-823)	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-268	Immunfluoreszenz
Ghost Dye Red 780	Tonbo Biosciences, USA	13-0865-T100	Ausschluss toter Zellen
Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (H+L), sekundärer Antikörper, cross-adsorbiert	Thermo Fisher Scientific, USA	A11008	Immunfluoreszenz (sekundär)
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	10.1.2	Statistische Analyse
Hämatoxylinlösung (Harris)	Sigma-Aldrich, USA	HHS16	Histologie (HE-Färbung)
HISAT2	Johns Hopkins University (Open Source)	Version 2.2.1	Software zur Referenzgenom-Alignment für RNA-seq
HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-1	Western Blot (sekundär)
HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-2	Western Blot (sekundär)
HTSeq-count	EMBL (Python-Tool)	Version 2.0.3	Python-Tool zur Zählung von Genom-Reads in RNA-seq
Wasserstoffperoxid (H2O2, 3%ige Lösung)	Sigma-Aldrich, USA	H1009	Blockierung endogener Peroxidase
iFluor™ 488-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper	Huabio, China	HA1121	Immunfluoreszenz (sekundär)
IL-4 monoklonaler Antikörper	Proteintech, Wuhan, China	66142-1-Ig	Western Blot
IL13-Antikörper	Affinity Biosciences, USA	DF6813	Western Blot
IL5-Antikörper	Affinity Biosciences, USA	AF5123	Western Blot
Illumina Novaseq 6000	Illumina, USA	–	RNA-Sequenzierung
ImageJ	NIH, USA	1.8	Quantifizierung bei Western Blot
Image-Pro Plus	Media Cybernetics, USA	Version 6.0	Quantifizierung der optischen Dichte von Bildern
KAST-Kräuterformulierung	Apotheke, Partnerkrankenhaus der Nanjing-Universität für Chinesische Medizin	–	Intervention
KLRG1 monoklonaler Antikörper (2F1)	Thermo Fisher Scientific, USA	58-5893-82	Immunfluoreszenz
Leica LAS X	Leica Microsystems, Deutschland	4.5	Quantifizierung von Immunfluoreszenz
Leica STELLARIS 8 DIVE Konfokalmikroskop	Leica Microsystems, Deutschland	STELLARIS 8	Immunfluoreszenz-Aufnahme
Liberase TM	Roche Diagnostics, Deutschland	5401119001	Verdauung von Lungengewebe
Marker (prägefärbte Proteinleiter)	NCM Biotech, Suzhou, China	P9001	Western Blot
Maus-CGRP-ELISA-Kit	Aifang Biotechnology, Hunan, China	AF2491-A	ELISA
Maus-IL-13-ELISA-Kit	Aifang Biotechnology, Hunan, China	AF-02456M1	ELISA
Maus-IL-4-ELISA-Kit	Aifang Biotechnology, Hunan, China	AF-02448M1	ELISA
Maus-IL-5-ELISA-Kit	Aifang Biotechnology, Hunan, China	AF-11729M1	ELISA
Neutrales Balsam-Einbettungsmedium	Sinopharm Chemical Reagent, China	10014061	Einbettung von histologischen Präparaten
Normales Ziegenserum (zur Blockierung)	Abcam, UK	ab7481	Blockierung bei Immunhistochemie/IF
OCT-Einbettungsmittel	Sakura, USA	4583	Cryoschnitt-Einbettung
One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit	Vazyme, Nanjing, China	E303-01	SDS-PAGE-Gel-Herstellung
Ovalbumin (OVA)	Sigma-Aldrich, USA	A5503	Sensibilisierung/Herausforderung
Paraformaldehyd (4% in PBS)	Biosharp, China	BL539A	Gewebefixierung
PE Anti-Maus/Mensch KLRG1 (Klon 2F1)	BD Biosciences, USA	564022	Durchflusszytometrie
Phosphatase-Inhibitorcocktail (50×)	Beyotime, Shanghai, China	P1092	Proteinextraktion
Poly-L-Lysin-Lösung	Boster, China	AR0003	Beschichtung von histologischen Objektträgern
Proteinase- und Phosphatase-Inhibitor	NCM Biotech, Suzhou, China	P002	Proteinextraktion
PVDF-Membran (0,22 μm)	Merck Millipore, USA	ISEQ00010	Western Blot
RAMP1 polyklonaler Antikörper (Kaninchen)	Proteintech, Wuhan, China	10327-1-AP	Immunfluoreszenz
Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen (RBC)	Beyotime, Shanghai, China	C3702	Probenvorbereitung für Durchflusszytometrie
RIPA-Lysepuffer (stark)	Beyotime, Shanghai, China	P0013B	Proteinextraktion
RPMI-1640-Medium	Thermo Fisher Scientific, USA	11875093	Basislösung für Gewebezellverdau
SuperKine™ Enhanced Antifade Mounting Medium	Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd.	BMU104	Einbettung für Immunfluoreszenz
Triton X-100 (Tensid)	Sigma-Aldrich, USA	T8787	Permeabilisierung für Immunfluoreszenz
TRIzol-Reagenz	Thermo Fisher Scientific, USA	15596026	RNA-Extraktion
VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit	Vazyme, Nanjing, China	NR605-01	Konstruktion von RNA-seq-Bibliotheken
Ganzkörper-Plethysmographiesystem	Guangyuanda, Beijing, China	WBP-4	Lungenfunktion (Penh)
Xylol (analysenrein)	Sinopharm Chemical Reagent, China	10023418	Entparaffinierung und Klärung