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Forschungsartikel

Kechuanting-Akupunkt-Klebetherapie lindert Typ-2-Atemwegsentzündungen bei Mäusen mit allergischem Asthma durch Modulation der Anzahl der ILC2s

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DOI:

10.3791/71749

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1. September 2026

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1Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of the Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, 3First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, 4Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erstellung eines Ovalbumin (OVA)-induzierten Mausmodells für allergisches Asthma (AA) zur Untersuchung der therapeutischen Wirkmechanismen der Kechuanting-Akupunktur-Pflastertherapie (KAST) auf die Typ-2-Atemwegsinfektion durch Modulation pulmonaler Gruppe-2-angeborener lymphoider Zellen (ILC2s) über den Calcitonin-Gen-verwandten Peptid (CGRP)/Rezeptor-aktivitätsmodifizierendes Protein 1 (RAMP1)-Signalweg.

Zusammenfassung

Die Akupunkturpunkt-Applikationstherapie an Kechuanting (KAST) hat sich als wirksam bei der Verbesserung der Atemwegsentzündung bei Patienten mit allergischem Asthma (AA) erwiesen; ihre zugrundeliegenden Wirkmechanismen sind jedoch noch unklar. Ziel dieser Studie war es, die therapeutischen Mechanismen von KAST in einem Mausmodell für AA aus neuro-immunologischer Perspektive zu untersuchen. Ein durch Ovalbumin (OVA) induziertes Mausmodell für allergisches Asthma wurde etabliert, und die Mäuse wurden mit KAST behandelt. Die Wirkungen von KAST auf pulmonale Gruppe-2-angeborene lymphoide Zellen (ILC2s) und Typ-2-Atemwegsentzündungen wurden mittels Durchflusszytometrie, Hämatoxylin-Eosin-(HE)-Färbung und Immunhistochemie evaluiert. Western-Blotting (WB) und ELISA dienten zur Bestimmung der Proteinspiegel von Calcitonin-Gen-verwandtem Peptid (CGRP) in Lungengewebe. Die intranasale Verabreichung von CGRP oder des CGRP-Rezeptorinhibitors BIBN-4096 erfolgte bei Mäusen mit allergischem Asthma, um die regulierende Rolle des CGRP/Rezeptor-Aktivitäts-modifizierenden Protein-1-(RAMP1)-Signalwegs auf ILC2s und Typ-2-Atemwegsentzündungen zu untersuchen. KAST verringerte die Anzahl der ILC2s und linderte die Typ-2-Atemwegsentzündung, begleitet von einer verminderten CGRP-Expression im Lungengewebe. Die intranasale Gabe von CGRP erhöhte die Anzahl der RAMP1+ILC2s und der gesamten ILC2s in der Lunge und verschlimmerte die Typ-2-Atemwegsentzündung. Umgekehrt führte die intranasale Verabreichung von BIBN-4096 zu einer Verringerung der pulmonalen ILC2s und milderte die Typ-2-Atemwegsentzündung. KAST reduziert die Atemwegsentzündung bei allergischem Asthma, was eng mit der Herunterregulation des CGRP/RAMP1-Signalwegs und der daraus resultierenden Unterdrückung pulmonaler ILC2s assoziiert ist, wie durch pharmakologische Hemmung bestätigt wurde.

Einleitung

Allergisches Asthma (AA) ist das häufigste Asthmaphänotyp, das in China 60–80 % aller Asthmabedingungen ausmacht1. Es zeichnet sich durch eine hohe Prävalenz und eine suboptimale Krankheitskontrolle aus, die die Lebensqualität der Patienten stark beeinträchtigt und erhebliche wirtschaftliche Belastungen verursacht2,3,4,5. Obwohl inhalative Kortikosteroide (ICS) weiterhin die Grundlage der klinischen Therapie darstellen6, zeigen einige Patienten eine begrenzte Ansprechrate, und die langfristige Anwendung ist häufig mit Nebenwirkungen verbunden und kann den Krankheitsverlauf nicht aufhalten7. Daher bleibt die Entwicklung sicherer und wirksamer neuer therapeutischer Strategien sowohl im klinischen als auch im Forschungsbereich eine Priorität. Die Akupunkturpunkt-Applikationstherapie Kechuanting (KAST), eine äußerlich angewendete Traditionelle Chinesische Arzneimethode, führt Wirkstoffe transdermal zu, wodurch möglicherweise der hepatische First-Pass-Effekt vermieden und systemische Nebenreaktionen minimiert werden8,9. Klinische Studien haben gezeigt, dass KAST Asthmasymptome lindern, einen Teil der Lungenfunktion wiederherstellen und die Lebensqualität der Patienten verbessern kann10,11,12. Gleichzeitig deuten Serum-Metabolomik-, Netzwerkpharmakologie- und Tierversuche mit Asthmamodellen darauf hin, dass KAST die Atemwegsentzündung abschwächt, indem es die Spiegel entzündungsfördernder Mediatoren im Serum und in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) senkt, einschließlich der Herabregulation der Expression von IgE, IL-4 und IL-139,13,14. Insgesamt liefern diese Befunde unterstützende Hinweise auf die therapeutische Wirksamkeit von KAST bei Asthma. Die genauen Wirkmechanismen sind jedoch weiterhin unklar.

Ein zentraler pathologischer Mechanismus, der das Wiederauftreten von AA vorantreibt, ist die Typ-2-Atemwegs­entzündung, an der Gruppe-2-innate Lymphozyten (ILC2s) eine Schlüsselrolle spielen15. Nach allergener Stimulation sezernieren ILC2s Zytokine wie IL-5 und IL-13 und treiben dadurch die Atemwegs­entzündung voran16,17. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Eliminierung von ILC2s die Atemwegs­entzündung bei asthmatischen Mäusen signifikant abschwächt und somit ihre zentrale Bedeutung für den Krankheitsverlauf unterstreicht18. Bemerkenswerterweise werden Aktivierung und Funktion von ILC2s durch mehrere Mechanismen streng reguliert, wobei neuroimmunologische Interaktionen in den letzten Jahren zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen haben. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass das Calcitonin-Gen-verwandte Peptid (CGRP) an das Rezeptor-aktivitätsmodifizierende Protein 1 (RAMP1) auf der Oberfläche von ILC2s binden kann, wodurch deren Aktivierung und anschließende Freisetzung von Typ-2-Zytokinen induziert wird, was die Atemwegs­entzündung bei AA verschärft19,20,21. In der vorliegenden Studie identifizierte unser Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierungsverfahren (RNA-seq) CGRP als entscheidend reaktives Neuropeptid, das stark durch die KAST-Intervention moduliert wird. Daher konzentrierten wir uns auf den CGRP/RAMP1-Signalweg und verwendeten KAST als Intervention bei AA-Mäusen, um dessen potenzielle Wirkmechanismen bei der Modulation der ILC2-Aktivität und der Abschwächung der Typ-2-Atemwegs­entzündung zu untersuchen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für die Zucht und Verwendung von Laborversuchstieren, herausgegeben von den Nationalen Akademien der Wissenschaften, durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Tierversuchsethik-Komitee des dem Krankenhaus der Nanjing-Universität für Chinesische Medizin angeschlossenen Krankenhauses genehmigt (Genehmigungsnummer: 2023DW-059-01). Eine umfassende Liste aller in dieser Studie verwendeten Materialien, Reagenzien, Werkzeuge und Software ist in der Tabelle der Materialien detailliert aufgeführt.

Experimentelle Tiere und Gruppierung

Gesunde weibliche BALB/c-Mäuse (SPF-Grad, 8–10 Wochen alt) wurden vom Versuchstierzuchtzentrum der Nanjing University of Chinese Medicine (Genehmigungsnummer: SYXK (Su) 2018-0049) bezogen. Die Tiere wurden unter Standardbedingungen mit einem 12-Stunden-Licht-/Dunkel-Wechsel bei 24–26 °C gehalten. Steriles Futter und Wasser wurden ad libitum angeboten, die Einstreu wurde regelmäßig gewechselt und die Käfige routinemäßig gereinigt. Nach einer Anpassungsphase von 7 Tagen wurden die Mäuse zufällig in sechs Gruppen eingeteilt (n = 7/Gruppe): Normale Gruppe, Modellgruppe, CGRP-Gruppe, BIBN-4096-Gruppe, KAST-Gruppe und KAST + CGRP-Gruppe. Die Zuordnung der Tiere zu den Gruppen erfolgte mithilfe einer computergenerierten Zufallszahlentabelle. Die Gruppeneinteilung blieb den Untersuchern bis zur Zuweisung der Interventionen verborgen. Zur Optimierung der Gewebenutzung wurden Lungenproben der randomisierten Kohorte (n = 7 pro Gruppe) systematisch verschiedenen Aufarbeitungswegen zugeordnet, wobei die jeweils tatsächlich analysierten Stichprobengrößen (n = 5, 4 oder 3) für spezifische histologische und molekulare Analysen in den entsprechenden Abbildungslegenden explizit angegeben sind. Keine Daten wurden von der Analyse ausgeschlossen.

Herstellung der KAST-Formulierung

Die Formulierung wurde von der Apothekenabteilung des Anschlusskrankenhauses der Nanjing-Universität für Chinesische Medizin22 hergestellt. Neun traditionelle chinesische Arzneipflanzen wurden verwendet: Semen Brassicae (2 Teile), Rhizoma Corydalis (2 Teile), mit Essig verarbeitete Radix Kansui (1 Teil), Asarum (1 Teil), Ephedra (1 Teil), Semen Lepidii (1 Teil), Gewürznelke (1 Teil), Zimtrinde (1 Teil) und Gleditsia sinensis (1 Teil). Jede Pflanze wurde zu feinem Pulver gemahlen und durch ein 80-Maschen-Sieb gesiebt. Für jeweils 100 g gemischtes Pulver wurden 70 mL frischer Ingwersaft und 30 mL flüssiges Paraffin hinzugefügt, gründlich vermischt und zu Pflastern von 0,3 g ± 5 % mit einem Durchmesser von 0,5 cm verarbeitet. Insbesondere wurden alle pflanzlichen Inhaltsstoffe und der frische Ingwer durch den leitenden Apotheker Lin-gang Zhao authentifiziert und vor der Verwendung bei 4 °C in einer dunklen, trockenen Umgebung gelagert9. Um die Reproduzierbarkeit der Intervention und die Chargenstabilität sicherzustellen, wurde ein strenger Qualitätskontrollstandard auf Grundlage der etablierten UPLC-Q-TOF-MS- und HPLC-Methoden unseres Teams eingeführt, der das gleichbleibende Vorhandensein wesentlicher Wirkstoffmarker wie Sinapin-Thiocyanat23 bestätigt. Praktisch wurden die 0,5 cm großen Pflaster mit 2,5 cm × 5,5 cm großem medizinischem, atmungsaktivem, hypoallergenem Klebeband befestigt, um eine optimale transdermale Applikation zu gewährleisten.

Erstellung des AA-Mausmodells

Das AA-Modell wurde gemäß einem etablierten Protokoll aus der Literatur unter Verwendung einer OVA-Sensibilisierung und intranasaler Provokation induziert24. Mit Ausnahme der Normalgruppe wurden alle Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 200 µL Salzlösung, die 100 µg OVA und 2 mg Aluminiumhydroxid enthielt, an den Tagen 0 und 12 sensibilisiert. Vom Tag 18 bis 23 wurden die Mäuse täglich einmalig intranasal mit 50 µg OVA in 50 µL Salzlösung provoziert. Vom Tag 24 bis 53 erhielten die Mäuse alle zwei Tage eine intranasale Gabe von OVA. Am Tag 54 wurde nach dem Wägen der Mäuse eine Tötung durch Halswirbelzerreißung durchgeführt und das Gewebe entnommen. Anschließend wurde der Lungenkoeffizient bestimmt, indem das Gesamt-Lungengewicht durch das Körpergewicht dividiert wurde.

Interventionen

Von Tag 40 bis Tag 53 wurden Mäuse der KAST-Gruppe und der KAST + CGRP-Gruppe in einem dorsalen Bereich von 3 cm × 6 cm rasiert. Pflaster wurden über die bilateralen Akupunkturpunkte Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) und Shenshu (BL23) aufgebracht und mit Klebeband für 1,5 Stunden täglich an Ort und Stelle fixiert, und zwar 14 aufeinanderfolgende Tage lang. Mäuse der CGRP- und KAST + CGRP-Gruppen erhielten alle zwei Tage von Tag 40 bis Tag 53 eine intranasale Gabe von 10 µL Calcitonin/CALCA-Lösung (1 pg/µL). Mäuse der BIBN-4096-Gruppe erhielten alle zwei Tage eine intranasale Gabe von 10 µL BIBN-4096-Lösung (0,3 mg/mL, CGRP-Rezeptorantagonist). Die Normal- und Modellgruppen erhielten eine Standardfütterung ohne Intervention. KAST wurde von Tag 40 bis Tag 53 verabreicht, nachdem eine allergische Atemwegsentzündung etabliert war (Beginn am Tag 40, also 22 Tage nach der ersten OVA-Challenge am Tag 18). Daher diente KAST in dieser Studie als therapeutische und nicht als prophylaktische Maßnahme.

Zur Hautvorbereitung wurde die Haarentfernung über der vorgesehenen dorsalen Region mit einem elektrischen Haarschneider durchgeführt. Die Lokalisation der Akupunkturpunkte erfolgte streng nach der Norm „Nomenklatur und Lokalisation von Akupunkturpunkten bei Laboratoriumstieren – Teil 3: Mäuse“ (T/CAAM 0002-2020) der Chinesischen Gesellschaft für Akupunktur und Moxibustion. Die vier bilateralen dorsalen Stellenpaare wurden präzise markiert und wie folgt definiert: Feishu (BL13: zwischen den Rippen unterhalb des Dornfortsatzes der 3. Brustwirbels, 3 mm lateral zur hinteren Mittellinie), Geshu (BL17: unterhalb des Dornfortsatzes des 7. Brustwirbels, 3 mm lateral zur Mittellinie), Pishu (BL20: unterhalb des Dornfortsatzes des 12. Brustwirbels, 3 mm lateral zur Mittellinie) und Shenshu (BL23: unterhalb des Dornfortsatzes des 2. Lendenwirbels, 3 mm lateral zur Mittellinie). Das 3M-Tape wurde fest umwickelt, um eine stabile Haftung sicherzustellen und eine Verschiebung des Pflasters oder sekundäre Hauterosion während der 1,5-stündigen Verweildauer auszuschließen.

Die Dosen von CGRP/CALCA (1 pg/µL, 10 µL pro Maus) und BIBN-4096 (0,3 mg/mL, 10 µL pro Maus) wurden basierend auf veröffentlichten Studien25 ausgewählt. Im Einzelnen wurde für die CGRP-Intervention eine 0,1-%-BSA-Lösung hergestellt, indem 1 mg BSA in 1 mL ddH2O gelöst und anschließend vortexiert wurde, um eine Endkonzentration von 1 mg/mL zu erreichen. Vor der Rekonstitution wurde das lyophilisierte Calcitonin/CALCA-Proteinpulver 30 s bei 4 °C mit 12.000 × g zentrifugiert. Anschließend wurden 20 µL der hergestellten 0,1-%-BSA-Lösung zugegeben, um eine Stammlösung mit 1 µg/µL zu erhalten. Das Fläschchen wurde vorsichtig mehrfach invertiert (ohne Vortexen), kurz zentrifugiert und einige Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um eine vollständige Rekonstitution des Proteins sicherzustellen. Um die Arbeitslösung mit 1 pg/µL herzustellen, ohne ein unhandlich großes Volumen in einem einzigen Verdünnungsschritt zu erzeugen, wurde eine standardmäßige zweistufige serielle Verdünnung durchgeführt: 1 µL der Stammlösung (1 µg/µL) wurden zunächst in 999 µL sterilem Salin verdünnt, um eine Zwischenlösung mit 1 ng/µL zu erhalten; anschließend wurden 1 µL dieser Zwischenlösung mit weiteren 999 µL sterilen Salins versetzt, um die endgültige Arbeitslösung mit 1 pg/µL zu erreichen. Die Arbeitslösung wurde bei 4 °C aufbewahrt, während verbleibende Aliquots bis zu 2–3 Monate bei -20 °C gelagert wurden. Für die BIBN-4096-Gruppe wurden 1 mg BIBN-4096-Pulver in 333 µL ddH2O gelöst, um eine Stammlösung mit 3 mg/mL zu erhalten, die in Portionen zu je 50 µL pro Fläschchen abgefüllt und bei -80 °C gelagert wurde. Zur Herstellung der Arbeitslösung mit 0,3 mg/mL wurde jedes 50-µL-Aliquot der Stammlösung gründlich mit 450 µL sterilen Salins vermischt. Von Tag 40 bis Tag 53 wurde jeder Maus alle zwei Tage eine Volumenmenge von 10 µL entweder der CGRP-Lösung (1 pg/µL) oder der BIBN-4096-Lösung (0,3 mg/mL) intranasal verabreicht, wobei die Tiere ohne Anästhesie sanft fixiert wurden.

Ergebnisparameter und Nachweismethoden

Verhaltenstest

Am Tag 53, nach der letzten intranasalen Applikation, wurden die Häufigkeiten von Nasenreiben und Niesepisoden mithilfe eines digitalen Videosystems über einen Zeitraum von 10 min beobachtet und aufgezeichnet. Die Häufigkeiten der Verhaltensweisen in den Videos wurden von zwei Forschern unabhängig voneinander und in doppelt verblindeter Weise gezählt. Bei signifikanten Abweichungen zwischen den Zählungen bewertete ein dritter Forscher das Video erneut, und die Daten mit der höchsten Übereinstimmung wurden letztendlich für die statistische Analyse ausgewählt.

Provokationstest der Bronchien

Innerhalb von 24 Stunden nach der letzten Provokation wurde die Atemwegsreaktivität mittels nebulisierter Azetylcholin (ACh) in Konzentrationen von 0, 5, 10, 20 und 40 mg/mL (300 µL pro Konzentration, 1 Minute nebulisiert) bewertet. Die Enhanced Pause (Penh)-Werte, ein dimensionsloser Index, der empirisch die Atemwegsverengung anzeigt und die Atemwegshyperreagibilität (AHR) beurteilt, wurden 5 Minuten nach jeder Nebulisation mittels nichtinvasiver Ganzkörper-Plethysmographie aufgezeichnet. Die Mäuse wurden vor der Aufzeichnung 10 Minuten lang an die Kammer angepasst. Penh wurde automatisch mit der integrierten Software für manuelle Datenspeicherung/Streaming gemäß einer empirischen Formel berechnet, die die Verhältnisse von Expirations- und Inspirationszeit sowie Spitzendurchflüssen berücksichtigt.

Histopathologie (HE-Färbung)

Lungenproben, die in 4 % Paraformaldehyd fixiert wurden, wurden über eine abgestufte Alkoholreihe dehydriert, in Xylol geklärt und mithilfe eines automatisierten Geräts in Paraffinblöcke eingebettet. Die Blöcke wurden in einer Dicke von 4 µm geschnitten, in einem 42 °C warmen Wasserbad aufgeschwemmt und auf Objektträger aufgebracht. Die Objektträger wurden 2 h bei 80 °C erhitzt, über Nacht getrocknet und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Zum Färben wurden die Schnitte in Xylol (I und II, je 20 min) entparaffiniert, über eine abgestufte Ethanolreihe (100 % I/II und 75 %, je 5 min) rehydriert und mit Leitungswasser gespült. Die Objektträger wurden 3–5 min mit Hämatoxylin gefärbt, mit 1 % saurem Alkohol differenziert und in einer Blaufärbung blau entwickelt. Nach dem Waschen wurden die Schnitte über 85 % und 95 % Ethanol (je 5 min) dehydriert und 5 min mit Eosin kontragefärbt. Abschließend wurden die Objektträger in absolutem Ethanol (I, II und III, je 5 min) dehydriert, in Xylol (I und II, je 5 min) geklärt, mit neutralem Balsam zugedeckt und luftgetrocknet. Aufnahmen wurden aus zufälligen Gesichtsfeldern bei 200×-Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop und dem CaseViewer-System angefertigt. Lungenentzündung und epitheliale Verdickung wurden verblindet nach einem 0–4-Skala bewertet: 0, keine Entzündung; 1, gelegentliche entzündliche Zellen; 2, wenige (<3) entzündliche Herde; 3, mehrere (≥3) entzündliche Herde; 4, diffuse Infiltration im gesamten Lungengewebe. Die epitheliale Verdickung wurde wie folgt bewertet: 0, normal; 1, sichtbare Verdickung; 2, teilweise Verdickung der Atemwege; 3, nahezu vollständige Obstruktion; 4, fehlende normale Struktur. Für jede experimentelle Gruppe wurden insgesamt 20 zufällige mikroskopische Gesichtsfelder aufgenommen und ausgewertet, um die rohen histopathologischen Werte zu erhalten. Die Daten aus jeweils vier Gesichtsfeldern wurden gemittelt, um einen einzelnen unabhängigen Datenpunkt zu erhalten, was zu einer endgültigen Stichprobengröße von n = 5 unabhängigen Wiederholungen pro Gruppe für die statistische Analyse führte. Die Bewertung erfolgte verblindet.

RNA-Sequenzierung

Gesamt-RNA wurde aus murinen Lungengeweben mit dem TRIzol-Reagenz gemäß der Herstellerprotokoll extrahiert. Die RNA-Reinheit, -konzentration und -integrität wurden mittels eines Spektrophotometers und einer mikrofluidikbasierten Plattform bewertet. Transkriptom-Bibliotheken wurden unter Verwendung eines kommerziellen Bibliothekspräparationskits erstellt und auf einer Hochdurchsatz-Sequenzierplattform sequenziert, um 150 bp lange paired-end Reads zu generieren. Die Rohdaten wurden mittels geeigneter Filterungssoftware qualitätsgeprüft, um bereinigte Reads zu erhalten, die mit einem spleißsensitiven Alignierungswerkzeug an das Referenzgenom angeordnet wurden. Genexpressionsniveaus wurden als FPKM berechnet, und die Read-Anzahlen wurden mithilfe eines Read-Zählprogramms zusammengestellt. Die differentielle Expressionsanalyse wurde mit einem spezialisierten statistischen Paket durchgeführt, wobei die Schwellenwerte bei |log2 Fold Change| ≥ 1 und adjustiertem p < 0,05 festgelegt wurden.

ELISA

Frisches murines Lungengewebe wurde genau gewogen und in PBS-Puffer bei einem strengen Verhältnis von 20 mg Gewebe zu 200 µL Puffer homogenisiert. Die Homogenate wurden etwa 10 min bei 4 °C mit 13.400 × g zentrifugiert, um die proteinhaltigen Überstände zu gewinnen. Zur Normierung wurde der rohe Proteingehalt der Überstände mittels der BCA-Methode kalibriert. Der ELISA wurde in technischen Triplikaten unter Verwendung kommerzieller Kits gemäß Herstellervorschrift durchgeführt. Kurz gesagt, wurden 50 µL Standardverdünnungen oder 50 µL vorverdünnter Proben (10 µL Proteinprobe gemischt mit 40 µL Probenpuffer, was einer 5-fachen Endverdünnung entspricht) in die mit Antikörper beschichteten 96-Loch-Platten pipettiert. Die Platten wurden verschlossen und 30 min bei 37 °C inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit 1:30 verdünntem Waschpuffer wurden 50 µL des enzymgekoppelten Konjugatreagenz in jedes Loch (außer in die Leerwerte) gegeben und das Gemisch 30 min bei 37 °C inkubiert. Nach weiteren fünf Waschschritten wurden je 50 µL Chromogenlösung A und 50 µL Chromogenlösung B in jedes Loch zugegeben, und die Platte wurde 10 min im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µL Stop-Lösung beendet, wodurch sich die Farbe von blau nach gelb veränderte. Die Absorption (OD-Wert) jedes Lochs wurde innerhalb von 15 min bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Standardkurven wurden unter Verwendung eines vierparametrigen logistischen oder linearen Regressionsmodells erstellt (R2 > 0,99 sicherstellend), anhand derer die Konzentrationen des Zielproteins in den Lungengewebe-Homogenaten berechnet wurden.

Durchflusszytometrie

Lungengewebe wurden entnommen, zerkleinert und in 5 mL RPMI-1640 mit 10 % FBS, 50 µL Liberase TM und 5 µL DNase I bei 37 °C für 45 min unter Schütteln bei 80 U/min verdaut. Die verdauten Suspension wurde durch einen 400-Maschen-Zellsieb filtriert und bei 4 °C 10 min bei 300 × g zentrifugiert. Der Pellet wurde 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln in 2 mL Erythrozytenlysepuffer resuspendiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen resuspendiert und mit Ghost Dye Red 780 (1,25 µL pro Probe) 20 min bei 4 °C im Dunkeln zur Ausschluss von toten Zellen gefärbt. Nach einer weiteren Wäsche wurden die Zellen mit 10 µL FcR-Blockierreagenz 10 min bei 4 °C blockiert. Anschließend wurden die Zellen an der Oberfläche 30 min bei 4 °C mit den folgenden fluorochrom-markierten Antikörpern gefärbt: FITC anti-maus CD45 (0,5 µL), PE anti-maus/mensch KLRG1 (1,25 µL), BB700 rat anti-maus CD90.2 (0,5 µL) und eine biotinylierte Linienmischung, bestehend aus anti-maus CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (jeweils 0,5 µL) sowie anti-maus CD19 (2 µL). Nach dem Waschen wurden die Zellen 30 min bei 4 °C mit Brilliant Violet 605 Streptavidin (2 µL) inkubiert. Die Daten wurden auf einer BD-Durchflusszytometrieplattform erfasst und mit der FlowJo-Software analysiert. Die Kompensation von Fluoreszenzüberlappungen wurde automatisch durch die kalibrierte Erfassungssoftware des Geräts überwacht und angepasst. Die hierarchische Torgate-Strategie zur Identifizierung pulmonaler ILC2s wurde nacheinander wie folgt durchgeführt: Zunächst wurden Gesamtlymphozyten anhand der Morphologie im Vorwärts-/Seitwärtsstreulicht (FSC-A/SSC-A) isoliert, gefolgt von der Unterscheidung von Doppelzellen mittels Singulett-Gating (FSC-H/FSC-A). Lebende Zellen wurden anschließend durch Ausschluss toter Zellen (Ghost Dye-) identifiziert, und dann wurden schrittweise Standardtore angewendet, um die Populationen CD45+ und Lineage- auszuwählen. Innerhalb des lebenden CD45+ Lineage--Tors wurden pulmonale ILC2s explizit definiert und quantifiziert, basierend auf den nachfolgenden positiven, sequenziellen Kaskadentoren für CD90.2+ und KLRG1+-Cluster.

Immunfluoreszenz (IF)

Gefrorene Lungen­schnitte wurden 15–30 min bei Raumtemperatur aufgetaut und anschließend dreimal je 6 min mit PBST (PBS mit 0,05 % Tween-20) gewaschen, um die OCT-Substanz zu entfernen. Nach dem Entfernen überschüssiger Flüssigkeit wurde mittels einer Immunhistochemie-Schreibfeder eine hydrophobe Barriere um das Gewebe gezogen. Die Schnitte wurden in einem Blockier- und Permeabilisierungs-Puffer, der 0,3 % Triton X-100 und 5 % Ziegenserum enthielt, inkubiert. 37 °C für 100 min, gefolgt von einer Übernacht-Inkubation (16–20 h) bei 4 °C mit dem primären Antikörper. Am nächsten Tag wurden die Schnitte 30 Minuten bei Raumtemperatur equilibriert, dreimal mit PBST gewaschen und anschließend mit einem artspezifischen, fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper inkubiert 37 °C im Dunkeln für 60–90 min. Nach drei zusätzlichen Waschungen mit PBST wurden die Kerne mit DAPI (1:1 oder 2:1 in PBS verdünnt) für 8 min bei Raumtemperatur im Dunkeln gegengefärbt. Nach einer abschließenden Waschrunde mit PBST (3 × 6 min) wurden die Schnitte mit einem Anti-Fade-Einbettmedium auf Objektträger aufgebracht, versiegelt, um Blasenbildung zu verhindern, und im Dunkeln gelagert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop bei 400× Vergrößerung. Die Anzahl positiver Zellen pro Feld wurde manuell mit der Leica LAS X-Software gezählt. Für jede experimentelle Gruppe wurden insgesamt 15 zufällige mikroskopische Felder abgebildet, um die Rohzellzahlen zu erhalten. Die Daten aus jeweils drei Feldern wurden gemittelt, um einen einzelnen unabhängigen Datenpunkt zu erhalten, was zu einer endgültigen Stichprobengröße von n = 5 unabhängigen Wiederholungen pro Gruppe für die statistische Analyse führte. Die Zählung erfolgte verblindet.

Immunhistochemie (IHC)

Paraffinschnitte wurden in drei Portionen Xylol (jeweils 15 min) entparaffiniert, durch eine abgestufte Ethanolreihe (100 % zweimal, 85 % und 75 %; jeweils 5 min) rehydriert und mit destilliertem Wasser gespült. Die Antigen-Retrieval-Behandlung erfolgte in Zitratpuffer (pH 6,0) mithilfe eines Schnellkochtopfs (3 min bei hohem Druck nach dem Sieden), gefolgt von einer Abkühlphase und drei Waschschritten mit PBS (pH 7,4) zu je 5 min. Die endogene Peroxidase wurde mit 3 % H2O2 für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln blockiert. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit einem hydrophoben Stift umrandet und mit 3 % Ziegen-Serum für 30 min blockiert. Anschließend wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern in PBS verdünnt inkubiert: anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300) oder anti-IL-13 (1:150). Am folgenden Tag wurden die Schnitte gewaschen und für 50 min bei Raumtemperatur mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern (Anti-Maus für IL-4; Anti-Kaninchen für IL-5 und IL-13) inkubiert. Die Signale wurden mithilfe einer frisch zubereiteten DAB-Lösung unter mikroskopischer Kontrolle sichtbar gemacht und mit Leitungswasser gestoppt. Schließlich wurden die Schnitte mit Hämatoxylin kontragefärbt, differenziert, gebläut, durch abgestufte Alkohole und Xylol dehydriert und mit neutralem Balsam eingedeckt, um sie mikroskopisch zu untersuchen. Die mittlere optische Dichte (IOD/Area) wurde mit einer Bildanalyse-Softwareplattform bei 200×-Vergrößerung quantifiziert. Für jede experimentelle Gruppe wurden insgesamt 15 zufällig ausgewählte mikroskopische Felder aufgenommen, um die Rohwerte zu erhalten. Die Daten aus jeweils drei Feldern wurden gemittelt, um einen einzelnen unabhängigen Datenpunkt zu erhalten, was zu einer endgültigen Stichprobengröße von n = 5 unabhängigen Wiederholungen pro Gruppe für die statistische Analyse führte. Die Bewertung erfolgte durch zwei verblindete Beobachter.

Immunoblot (WB)

Zur Probenvorbereitung wurden murine Lungenproben (ca. 30 mg) fein zerkleinert und in 300 µL präkonditioniertem RIPA-Lysepuffer, der mit 1 % Protease-/Phosphatase-Inhibitor-Cocktail versetzt war, homogenisiert. Die Homogenisierung erfolgte mittels eines Gewebehomogenisators bei 60 Hz über vier Zyklen (60 s pro Zyklus). Die Lysate wurden anschließend etwa 15 min bei 4 °C mit 13.400 × g zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. Die Gesamtproteinkonzentrationen wurden mithilfe eines standardisierten BCA-Protein-Assay-Kits bestimmt. Die Proben wurden daraufhin normalisiert, mit 5× Lade-Puffer im Volumenverhältnis 4:1 versetzt und 7 min bei 95 °C denaturiert. Für die SDS-PAGE wurden Proteinproben (20 µg pro Lane) zusammen mit einem vorgefärbten Protein-Molekulargewichtsmarker aufgetragen, zunächst 20 min bei konstanter Spannung von 80 V und anschließend 70 min bei 120 V aufgetrennt. Die Proteine wurden nass in ein 0,22 µm PVDF-Membran unter konstantem Strom von 300 mA über 120 min in einem Eisbad transferiert. Die Membranen wurden mit 5 % BSA in TBST für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und anschließend über Nacht (bis zu 18 h) bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen CGRP (1:500) und GAPDH (1:2000) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit TBST (jeweils 10 min) wurden die Membranen mit mit HRP konjugierten sekundären Antikörpern (1:10.000) für 1–2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Waschen wurden die Proteinbanden mittels eines verbesserten chemilumineszenten (ECL) Substrats im VILBER Fusion FX-Bildgebungssystem sichtbar gemacht. Die Bandenintensitäten wurden mit ImageJ 1.8 quantifiziert, und die Expression des Zielproteins wurde auf die GAPDH-Innenkontrolle normalisiert.

Statistische Analyse

Alle experimentellen Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die Datenanalyse und statistische Aufbereitung erfolgte mit einer spezialisierten statistischen Softwareplattform. Vor dem Vergleich zwischen Gruppen wurden die Datensätze systematisch auf Normalverteilung geprüft. Bei normalverteilten Daten mit homogener Varianz wurde eine einfache ein- oder zweifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von post-hoc-Tests nach Tukey, Šídák, Holm-Šídák oder dem Fisher’schen LSD-Test für multiple paarweise Vergleiche. Beim Vergleich mehrerer Gruppen mit einer einzigen Kontrollgruppe wurde der Dunnett-Test angewendet. Bei Datensätzen mit heterogener Varianz kam die Brown-Forsythe-ANOVA zum Einsatz, gefolgt vom Dunnett’schen T3-Test. Für Datensätze, die nicht der Normalverteilung folgten, wurde der nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test verwendet, gefolgt vom Dunn-Test für multiple Vergleiche. Ein P-Wert < 0,05 wurde als Hinweis auf statistisch signifikante Unterschiede gewertet. Unterschiedliche Signifikanzniveaus werden dynamisch gekennzeichnet als *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und ****p < 0,0001. Alle Bewertungen der experimentellen Ergebnisse, einschließlich histologischer Score-Erhebung, Durchflusszytometrie-Analyse und Bildquantifizierung, wurden streng verblindet durchgeführt.

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Ergebnisse

KAST reduziert pulmonale ILC2-Zellen und lindert Typ-2-Luftwegentzündungen

Um die therapeutischen Wirkungen von KAST zu untersuchen, wurde ein OVA-induziertes AA-Mausmodell etabliert und mit Pflastern behandelt, die an den Akupunkturpunkten Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) und Shenshu (BL23) appliziert wurden (Abbildung 1A). Nach der Modellierung zeigten die AA-Mäuse eine Abnahme des Körpergewichts, während die KAST-Mäuse im Vergleich zur...

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Diskussion

Die Behandlung von AA weist mehrere Einschränkungen auf, darunter Nebenwirkungen im Zusammenhang mit langfristiger Medikamenteneinnahme, unvollständige Symptomkontrolle und häufige Rückfälle. Obwohl die konventionelle pharmakologische Therapie wirksam ist, geht sie oft mit unerwünschten Wirkungen wie Steroidabhängigkeit26,27 einher. Im Gegensatz dazu bietet KAST eine sichere, kostengünstige und praktische Alternative zur Behandlung von AA. Klinische Belege haben ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82274632), dem Projekt zur Förderung führender Talente der Provinz Jiangsu für die Traditionelle Chinesische Medizin (Nr. SLJ0309), der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (Nr. BK20231381), dem Projekt zur wissenschaftlichen und technologischen Entwicklung der Traditionellen Chinesischen Medizin in der Provinz Jiangsu (Nr. ZT202205) sowie dem Schwerpunktlaboratorium für Akupunktur- und Medizin-Forschung des Bildungsministeriums an der Nanjing University of Chinese Medicine (Nr. AML202304).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3M Medizinisches atmungsaktives Klebeband3M, USA1530CPflasterfixierung
AcetylcholinchloridSigma-Aldrich, USAA6625bronchiale Provokation
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent Technologies, USAG2939BABeurteilung der RNA-Qualität und -Integrität
Alexa Fluor 488 Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)Thermo Fisher Scientific, USA(Sonderbestellung)Immunfluoreszenz (sekundär)
AluminiumhydroxidSigma-Aldrich, USA239186Adjuvans
Anti-CGRP-Antikörper (Kaninchen)Abcam, UKab81887Western Blot / IF
BALB/c-Maus (weiblich, SPF, 8–10 Wochen, 18–22 g)Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd.B202407260106Tiermodell
BB700 Rat Anti-Maus CD90.2 (Klon 53-2.1)BD Biosciences, USA566465Durchflusszytometrie
BD FACSCanto II DurchflusszytometerBD Biosciences, USAFACSCanto IIDurchflusszytometrie
BIBN-4096 (Olcegepant-Hydrochlorid)MedChemExpress LLC, USAHY-10095ACGRP-Rezeptorantagonist
Biotin-Lineage-CocktailBD Biosciences, USA(Angepasst, Klone wie beschrieben)Durchflusszytometrie
Brilliant Violet 605 StreptavidinBD Biosciences, USA563260Durchflusszytometrie
BSA Albumin Fraktion VBioFroxx (neoFroxx GmbH), Deutschland4240GR100Blockierung
Calcitonin/CALCA-ProteinMedChemExpress LLC, USAHY-P77587CGRP-Intervention
CD11c/ITGAX-Antikörper (Kaninchen)Abmart, Shanghai, ChinaMU115408SImmunfluoreszenz
Citrat-Antigen-Retrieval-PufferBoster, ChinaAR0024Immunhistochemie
DAPI-FärbelösungBeyotime, Shanghai, ChinaC1006Kernfärbung
ddH2O (doppelt destilliertes Wasser)Sigma-Aldrich, USA10977015Proteinrekonstitution und Pulverauflösung
DESeq2Bioconductor (R-Paket)Version 1.42.0Software zur differentiellen Expressionsanalyse
DNase IRoche Diagnostics, Deutschland10104159001Verdauung von Lungengewebe
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555)Abcam, UKab150106Immunfluoreszenz (sekundär)
ECL-Substrat (Super Femto)Nanjing Lanken Biotech, China–Chemilumineszenz bei Western Blot
Erweitertes BCA-Protein-Assay-KitBeyotime, Shanghai, ChinaP0010Proteinquantifizierung
Eosin Y-FärbelösungSigma-Aldrich, USAHT110216Histologie (HE-Färbung)
Ethanol (absolut, analysenrein)Sinopharm Chemical Reagent, China10009218Gewebedehydrierung und Histologie
F4/80-Antikörper (Maus, Klon C-7)Santa Cruz Biotechnology, USAsc-377009Immunfluoreszenz
fastpOpen Source (GitHub)Version 0.23.4Software zur Qualitätskontrolle von RNA-seq-Rohdaten
FITC Anti-Maus CD45 (Klon 30-F11)BD Biosciences, USA553080Durchflusszytometrie
FlowJoBD Biosciences, USA10Analysesoftware für Durchflusszytometrie
GAPDH monoklonaler Antikörper (Maus)Proteintech, Wuhan, China60004-1-IgWestern Blot
GATA3-Antikörper (Maus, Klon L50-823)Santa Cruz Biotechnology, USAsc-268Immunfluoreszenz
Ghost Dye Red 780Tonbo Biosciences, USA13-0865-T100Ausschluss toter Zellen
Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (H+L), sekundärer Antikörper, cross-adsorbiertThermo Fisher Scientific, USAA11008Immunfluoreszenz (sekundär)
GraphPad PrismGraphPad Software, USA10.1.2Statistische Analyse
Hämatoxylinlösung (Harris)Sigma-Aldrich, USAHHS16Histologie (HE-Färbung)
HISAT2Johns Hopkins University (Open Source)Version 2.2.1Software zur Referenzgenom-Alignment für RNA-seq
HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)Proteintech, Wuhan, ChinaSA00001-1Western Blot (sekundär)
HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)Proteintech, Wuhan, ChinaSA00001-2Western Blot (sekundär)
HTSeq-countEMBL (Python-Tool)Version 2.0.3Python-Tool zur Zählung von Genom-Reads in RNA-seq
Wasserstoffperoxid (H2O2, 3%ige Lösung)Sigma-Aldrich, USAH1009Blockierung endogener Peroxidase
iFluor™ 488-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-AntikörperHuabio, ChinaHA1121Immunfluoreszenz (sekundär)
IL-4 monoklonaler AntikörperProteintech, Wuhan, China66142-1-IgWestern Blot
IL13-AntikörperAffinity Biosciences, USADF6813Western Blot
IL5-AntikörperAffinity Biosciences, USAAF5123Western Blot
Illumina Novaseq 6000Illumina, USA–RNA-Sequenzierung
ImageJNIH, USA1.8Quantifizierung bei Western Blot
Image-Pro PlusMedia Cybernetics, USAVersion 6.0Quantifizierung der optischen Dichte von Bildern
KAST-KräuterformulierungApotheke, Partnerkrankenhaus der Nanjing-Universität für Chinesische Medizin–Intervention
KLRG1 monoklonaler Antikörper (2F1)Thermo Fisher Scientific, USA58-5893-82Immunfluoreszenz
Leica LAS XLeica Microsystems, Deutschland4.5Quantifizierung von Immunfluoreszenz
Leica STELLARIS 8 DIVE KonfokalmikroskopLeica Microsystems, DeutschlandSTELLARIS 8Immunfluoreszenz-Aufnahme
Liberase TMRoche Diagnostics, Deutschland5401119001Verdauung von Lungengewebe
Marker (prägefärbte Proteinleiter)NCM Biotech, Suzhou, ChinaP9001Western Blot
Maus-CGRP-ELISA-KitAifang Biotechnology, Hunan, ChinaAF2491-AELISA
Maus-IL-13-ELISA-KitAifang Biotechnology, Hunan, ChinaAF-02456M1ELISA
Maus-IL-4-ELISA-KitAifang Biotechnology, Hunan, ChinaAF-02448M1ELISA
Maus-IL-5-ELISA-KitAifang Biotechnology, Hunan, ChinaAF-11729M1ELISA
Neutrales Balsam-EinbettungsmediumSinopharm Chemical Reagent, China10014061Einbettung von histologischen Präparaten
Normales Ziegenserum (zur Blockierung)Abcam, UKab7481Blockierung bei Immunhistochemie/IF
OCT-EinbettungsmittelSakura, USA4583Cryoschnitt-Einbettung
One-Step PAGE Gel Fast Preparation KitVazyme, Nanjing, ChinaE303-01SDS-PAGE-Gel-Herstellung
Ovalbumin (OVA)Sigma-Aldrich, USAA5503Sensibilisierung/Herausforderung
Paraformaldehyd (4% in PBS)Biosharp, ChinaBL539AGewebefixierung
PE Anti-Maus/Mensch KLRG1 (Klon 2F1)BD Biosciences, USA564022Durchflusszytometrie
Phosphatase-Inhibitorcocktail (50×)Beyotime, Shanghai, ChinaP1092Proteinextraktion
Poly-L-Lysin-LösungBoster, ChinaAR0003Beschichtung von histologischen Objektträgern
Proteinase- und Phosphatase-InhibitorNCM Biotech, Suzhou, ChinaP002Proteinextraktion
PVDF-Membran (0,22 μm)Merck Millipore, USAISEQ00010Western Blot
RAMP1 polyklonaler Antikörper (Kaninchen)Proteintech, Wuhan, China10327-1-APImmunfluoreszenz
Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen (RBC)Beyotime, Shanghai, ChinaC3702Probenvorbereitung für Durchflusszytometrie
RIPA-Lysepuffer (stark)Beyotime, Shanghai, ChinaP0013BProteinextraktion
RPMI-1640-MediumThermo Fisher Scientific, USA11875093Basislösung für Gewebezellverdau
SuperKine™ Enhanced Antifade Mounting MediumWuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd.BMU104Einbettung für Immunfluoreszenz
Triton X-100 (Tensid)Sigma-Aldrich, USAT8787Permeabilisierung für Immunfluoreszenz
TRIzol-ReagenzThermo Fisher Scientific, USA15596026RNA-Extraktion
VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep KitVazyme, Nanjing, ChinaNR605-01Konstruktion von RNA-seq-Bibliotheken
Ganzkörper-PlethysmographiesystemGuangyuanda, Beijing, ChinaWBP-4Lungenfunktion (Penh)
Xylol (analysenrein)Sinopharm Chemical Reagent, China10023418Entparaffinierung und Klärung

Referenzen

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