Methodenartikel

Standardisiertes mehrfarbiges Flowzytometrieprotokoll zur messbaren Resterkrankungsbeurteilung bei akuter Leukämie

DOI:

10.3791/71756

⸱

7. August 2026

1Department of Clinical Laboratory, The Second People's Hospital of Neijiang

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Workflow zur messbaren Resterkrankungsbewertung bei akuter Leukämie, integriert kontrollierte Probenverarbeitung, harmonisierte Erfassungsparameter, sequentielle Gating-Strategien und nenner-angepasste Interpretation, um die analytische Reproduzierbarkeit in routinemäßigen klinischen Laboren zu verbessern.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Messbare Resterkrankung (MRD) ist ein wichtiger prognostischer Indikator bei der Behandlung akuter Leukämie. Die routinemäßige Multicolor-Flowzytometrie-(MFC)-Bewertung bleibt jedoch anfällig für präanalytische und analytische Variabilität, einschließlich Hämodilution, inkonsistenter Erwerbstiefe und subjektiver Interpretation. Dieser Artikel präsentiert einen standardisierten operativen Arbeitsablauf für die routinemäßige MRD-Untersuchung bei B-zelliger akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) und akuter myeloischer Leukämie (AML). Das Protokoll beinhaltet strenge Kriterien für die Abnahme von Probeproben, integrierte Hämodilutionsbewertung und verwendet eine Massen-Methode der roten Blutkörperchen-Lyse für Knochenmark- und periphere Blutproben. Die analytische Standardisierung wird durch krankheitsspezifische Zweiröhren-Achtfarb-Antikörperpanels, harmonisierte Erfassungsziele, die mindestens 500.000 CD45-positive Ereignisse erfordern, sowie feste sequentielle Garting-Strategien erreicht. Zusätzlich wendet der Workflow denominator-adjustierte Detektionsgrenzen (LOD) und Quantifizierung (LOQ) an, um ein objektives dreistufiges Berichtssystem zu unterstützen. Die Validierung bei 197 klinischen Proben zeigte eine starke Wiederholbarkeit, robuste Verdünnungslinearität und hohe Konkordanz mit gepaarten orthogonalen molekularen Assays. Gemeinsam bietet dieses Protokoll einen praktischen Rahmen für standardisierte MRD-Überwachung. für standardisierte MRD-Überwachung in routinemäßigen klinischen Laboren durch Integration kontrollierter voranalytischer Handhabung und harmonisierter analytischer Parameter.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auch nach Erreichen morphologischer Remission benötigen Patienten mit akuter Leukämie eine kontinuierliche Überwachung auf messbare Resterkrankung (MRD), um das Rückfallrisiko genau einzuschätzen. Konventionelle morphologische und zytopathologische Untersuchungen verfügen nicht über die Sensitivität, die erforderlich ist, um niedrigstufige restleukämische Populationen zu erkennen. Daher ist die MRD-Bewertung zu einem wesentlichen Bestandteil der Krankheitsüberwachung sowohl bei akuter myeloider Leukämie (AML) als auch bei B-zelliger akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) geworden. Jüngste Empfehlungen des European LeukemiaNet betonen, dass eine zuverlässige MRD-Bewertung bei AML auf technischer Standardisierung und Interobserver-Reproduzierbarkeit basiert und nicht auf der einfachen Verfügbarkeit des Assays 1,2. Bei B-ALL bleibt die mehrfarbige Durchflusszytometrie (MFC) besonders wichtig für Patienten ohne stabile molekulare Ziele. Frühere Studien haben gezeigt, dass standardisierte mehrfarbige Flowzytometrische Ansätze mit strukturierten Antikörperpanel-Designs eine reproduzierbare und empfindliche Nachweis der Restkrankheit ermöglichenkönnen. Flusszytometrie wird aufgrund ihrer breiten Anwendbarkeit, schnellen Bearbeitungszeit und Kosteneffizienz weit verbreitet eingesetzt. Die Assay-Leistung bleibt stark abhängig von der standardisierten Probenpräparation, den Erfassungsparametern und der Dateninterpretation4.

Eine der größten technischen Herausforderungen bei der durchflusszytometrischen MRD-Bewertung ist die Erkennung seltener Ereignisse, die stark von der Erfassungstiefe und der Gesamtzahl der Ereignisse beeinflusst wird. Identische Antikörperpanels können unterschiedliche analytische Sensitivitäten erzeugen, wenn Proben mit inkonsistenten Nennergrößen5 entnommen werden. Die Standardisierung geht daher über die Antikörperauswahl hinaus und erfordert harmonisierte Probeverarbeitung, Massenlyse roter Blutkörperchen, Instrumentenkompensation, Erfassungsziele und Gating-Strategien. Bei Knochenmarkproben stellt Hämodilution auch eine bedeutende präanalytische Variable dar, da eine periphere Blutkontamination die scheinbare restliche leukämische Belastungkünstlich reduzieren kann 6,7. Darüber hinaus erfordert die Interpretation niedrigfrequenter Ereignisse klar definierte Berichtsschwellen, die auf der provenspezifischen Aufnahmetiefe basieren. Neuere Studien haben die Bedeutung von nenner-adjustierten Detektionsgrenzen (LOD) und Quantifizierung (LOQ) für die Verbesserung der Konsistenz der flowzytometrischen MRD-Interpretation8 betont.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten Arbeitsablauf für routinemäßige MFC-basierte MRD-Bewertung in B-ALL und AML bereitzustellen. Das Protokoll integriert Probenakzeptanzkriterien, Hämodilutionsbewertung, krankheitsspezifische Antikörperpanel-Design, Bulk-Lysis-Probenvorbereitung, harmonisierte Erfassungsziele, feste sequentielle Gating-Strategien und nenner-angepasste Berichtskriterien in einem einzigen operativen Rahmen 9,10. Durch die Kombination standardisierter voranalytischer und analytischer Verfahren bietet diese Methode einen praktischen und reproduzierbaren Ansatz für die routinemäßige klinische Laborumsetzung der MRD-Überwachung. Abbildung 1 illustriert den insgesamt standardisierten präanalytischen und analytischen Workflow, der in dieser Studie implementiert wurde. Tabelle 1 fasst die Kohorten- und Probenmerkmale der Patienten mit B-zelliger akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) und akuter myeloider Leukämie (AML) zusammen, die während des Validierungszeitraums über vordefinierte Überwachungsfenster (Ende der Induktion, Konsolidierung und Pre-HSCT) aufgenommen wurden.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Standardisierter Arbeitsablauf für routinemäßige mehrfarbige Flow-Cytometrie-MRD-Bewertung. (A) Voranalytischer Workflow, der Probenscreening und Qualitätsbewertung über vordefinierte Überwachungsintervalle hinweg zeigt. (B) Analytischer Workflow von Massenlyse roter Blutkörperchen und Antikörperfärbung bis hin zu sequentiellem Gating und Nenner-angepasster Interpretation und endgültiger MRD-Berichterstattung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Konsolidierte Patientendemografie, klinische Probenmerkmale und routinemäßige Erfassungskennzahlen. Diese einzelne überarbeitete Tabelle fasst die klinischen Ausgangsmerkmale der aufgenommenen Kohorte zusammen, bestehend aus B-zelligen Fällen von akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) und akuter myeloischer Leukämie (AML) und kombiniert Patienten-Demografie mit Merkmalen auf Probenebene, Behandlungsüberwachungsintervallen, Lebensfähigkeit, Hämodilutionswerten, Akquisitionstiefen und nenner-adjustierten messbaren Resterkrankungsklassifikationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren mit menschlichen Proben wurden gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Ethikausschuss des Zweiten Volkskrankenhauses von Neijiang genehmigt (Genehmigungsnummer PXTS887192). Die Studie verwendete deidentifizierte klinische Restproben, die nach routinemäßigen diagnostischen Tests entnommen wurden. Die informierte Einwilligung wurde aufgehoben, da die Studie die Patientenversorgung, die Behandlungszuweisung oder die Probeentnahmeverfahren nicht beeinflusste. Die im Protokoll verwendeten Chemikalien, Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Probenentnahme und voranalytische Bewertung

  1. Sammeln Sie Knochenmarkaspirate als bevorzugten Probentyp für die Bewertung der messbaren Resterkrankung (MRD). Verwenden Sie periphere Blutproben nur, wenn die Knochenmarkaspiration klinisch kontraindiziert ist oder bei ausgewählten Überwachungs- und Vergleichsanalysen.
  2. Sammeln Sie das Knochenmarkexemplar während des ersten Aspirations, wann immer möglich. Vermeiden Sie nachfolgende Aspirationsabzüge, um eine periphere Blutkontamination und die Untereinschätzung niedriger Resterkrankungen zu minimieren.
  3. Proben werden unmittelbar nach der Entnahme in Dikaliumethylendiamintetraessigsäure (K2-EDTA) oder Natriumheparin-Antikoagulanzröhrchen übertragen. Lagere und transportiere die Exemplare bei Raumtemperatur (18–25 °C) und schütze sie vor direktem Sonnenlicht.
    VORSICHT: Stellen Sie die Proben nicht in den Kühlschrank.
  4. Bearbeiten Sie alle Proben innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme. Für Stabilitätsstudien werden Aliquots für die Wiederholungsanalyse bei 24 und 48 Stunden aufbewahrt, während die Lagerbedingungen bei Raumtemperatur erhalten bleiben.
  5. Verifizieren Sie die Patientenkennung, den Antikoagulanstyp, die Integrität der Probe und die Entnahmezeit beim Empfang der Probe. Abstoßproben mit umfangreicher Gerinnung, schwerer Hämolyse oder ausgeprägter Zelldegeneration
  6. Untersuchen Sie Knochenmarkproben auf Hämodilution vor der endgültigen Interpretation. Berechnen Sie einen semi-quantitativen Hämodilutionswert von 0,00 bis 1,00, um die periphere Blutkontamination zu schätzen.
  7. Bestimmen Sie diesen Wert, indem Sie den Anteil der reifen Lymphozyten durch die Summe von CD34-positiven Vorläufern, unreifen Granulozyten und reifen Lymphozyten teilen, wobei ein höherer Quotient auf einen stärkeren Verdünnungseffekt hinweist.
    HINWEIS: Berechnen Sie die Punktzahl mit folgender Formel:
      figure-protocol-1
    wobei ein höherer Wert auf eine größere periphere Blutkontamination hinweist.
  8. Klassifizieren Sie Hämodilutionswerte wie folgt: <0,20, akzeptabel; 0,20–0,39, leicht gehämodilutiert; und ≥0,40, stark verdünnt.
    HINWEIS: Weisen Sie nicht eindeutig MRD-negativen Interpretationen auf deutlich gehämodilutierte Exemplare zu, es sei denn, eine ausreichende Nennergröße und eine erhaltene Markvorläuferarchitektur sind bestätigt.

2. Vorbereitung des krankheitsspezifischen Antikörperpanels

  1. Bereiten Sie standardisierte, krankheitsspezifische Zweiröhren-Achtfarb-Antikörperpanels für B-ALL- und AML-Analysen vor. Erreichen Sie die Standardisierung des Panels durch strikte Einhaltung fester Rückgratmarker über alle Röhren hinweg für stabile Populationsaufnahme.
  2. Verwenden Sie konsistente Fluorochromkonjugate für entsprechende Linienantigene und halten Sie sich strikt an die vom Hersteller empfohlenen Titrationsvolumen, um die Fluoreszenzvariabilität von Lot zu Lot zu minimieren.
  3. Siehe Ergänzende Tabelle 1 für Markerkombinationen, Fluorochromzuweisungen, Antikörperklone, Färbungsvolumen und Aufnahmeparameter.
  4. Für die B-ALL-Bewertung verwenden Sie CD19, CD45, CD34, CD10 und CD20 als Rückgratmarker in beiden Tuben, um Vorläuferpopulationen und Reifungsmuster zu definieren. Fügen Sie CD38, CD58 und CD81 in Röhre 1 hinzu.
  5. Fügen Sie CD66c, CD123 und entweder CD73 oder CD304 gemäß dem diagnostischen, leukämieassoziierten Immunophenotyp, der bei der Ausgangsbewertung festgelegt wurde, Tube 2 hinzu.
  6. Für die AML-Bewertung verwenden Sie CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 und HLA-DR als Rückgratmarker in beiden Röhren, um Blast- und unreife myeloide Populationen zu definieren.
  7. CD7 und CD56 in Röhre 1 hinzufügen, um die antigenkreuze Expression zu bewerten. CD11b und CD15 in Tube 2 geben, um Myeloid-Reifungsauffälligkeiten zu untersuchen.

3. Vorbereitung und Färbung der Massenlyse

  1. Übertragen Sie 2,0 ml gut gemischtes Knochenmark oder peripheres Blut in ein 15 ml Polypropylenrohr. Wenn das Probevolumen begrenzt ist, wird ein Mindesteingangsvolumen von 1,0 mL verwendet.
  2. Fügen Sie der Probe 10 ml vorgewärmten Ammoniumchlorid-Lysepuffer hinzu. Inkubiere die Suspension 10 Minuten bei Zimmertemperatur, um rote Blutkörperchen zu lysieren.
  3. Zentrifugiere die Probe bei 500 × g für 5 Minuten. Entsorgen Sie das Supernatant vorsichtig, ohne das nukleierte Zellpellet zu stören.
  4. Resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), das 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) enthält. Wiederholen Sie den Waschschritt einmal, wenn die restliche Hämoglobinkontamination sichtbar bleibt.
  5. Bestimmen Sie die nukleierte Zellkonzentration mit einem automatisierten Hämatologie-Analysator oder manueller Hämozytometerzählung unter Ausschluss von Trypan-Blau. Betrachten Sie eine minimale nukleäre Zellkonzentration von 5 × 106 Zellen/mL als optimal für die Standardaufnahme.
    HINWEIS: Wenn die zelluläre Ausbeute unter diesen Schwellenwert fällt, konzentriert man die Probe durch eine zusätzliche Zentrifugation bei 500 × g für 5 Minuten und reduziert vorsichtig das Puffervolumen der Resuspension, um die zelluläre Dichte zu maximieren.
  6. Aliquot 5 × 10 bis6 nukleierte Zellen pro Röhre für routinemäßige Färbungen. Erhöhen Sie den Eingang auf maximal 1 × 107 Zellen pro Tube für eine Analyse mit hoher Empfindlichkeit, wenn die Probengewinnung 6,7 erlaubt.
  7. Fügen Sie jedem Tub gemäß der validierten Konfiguration des Färbstoffpanels den individuell titrierten Antikörpercocktail und den in der Materialtabelle angegebenen fixierbaren Viabilitätsfarbstoff hinzu. Das routinemäßig validierte Panel verwendet 5 μL pro fluorochromkonjugiertem Antikörper, es sei denn, die vom Hersteller empfohlene Titration zeigt ein anderes antikörperspezifisches Volumen an.
  8. Stellen Sie sicher, dass das endgültige Färbungsreaktionsvolumen streng bei 100 μL pro Test gehalten wird, um die optimale Antikörper-zu-Antigen-Stöchiometrie zu erhalten. Inkubieren Sie die Exemplare 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  9. Waschen Sie die gefärbten Zellen einmal mit einem Waschpuffer und suspendieren Sie das endgültige Pellet in 500 μL Aufnahmepuffer neu.
  10. Bereiten Sie am selben Tag der Probenentnahme Einzel-gefärbte Kompensationskontrollen mit Kompensationsperlen vor.

4. Instrumentenaufbau und Datenerfassung

  1. Führen Sie die tägliche Qualitätskontrolle des Starts am Durchflusszytometer durch, bevor Sie Patientenproben entnehmen. Verifizieren Sie die Fluidik, die Laserausrichtung, die Detektorleistung und die Fluoreszenzzielwerte mithilfe von Kalibrierungskugeln und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
  2. Bereiten Sie Einzel-gefärbte Kompensationskontrollen mit denselben Fluorochromen vor, die auch in den Antikörperpanels enthalten sind. Passen Sie die Kompensationsmatrix vor der Patientenaufnahme an und bestätigen Sie, dass die Rückgratmarker innerhalb der vordefinierten Fluoreszenzzielbereiche bleiben.
  3. Verwenden Sie dieselbe Erfassungsvorlage, Detektoreinstellungen, Kompensationsstrategie und Gating-Hierarchie für alle während der Validierungsperiode analysierten Proben.
    HINWEIS: Sicherstellen Sie eine ordnungsgemäße Harmonisierung über Instrumente hinweg, indem standardisierte mediane Fluoreszenzintensitätswerte für alle Detektoren mit speziellen Kalibrierungsperlen festgelegt werden, und bestätigen, dass identische Proben vergleichbare Fluoreszenzprofile über verschiedene Plattformen hinweg liefern, bevor klinische Daten erfasst werden.
  4. Erfassen Sie Daten mit niedriger bis mittlerer Flussrate, um Koincident-Ereignisse zu reduzieren und die Genauigkeit der Erkennung seltener Ereignisse zu erhalten. Überwachen Sie die Ereignisrate kontinuierlich während der Erfassung.
  5. Erfassen Sie mindestens 500.000 CD45-positive nukleierte Ereignisse für jedes meldepflichtige MRD-Ergebnis. Wenn Probenqualität und Ereignisstabilität es erlauben, wird die Erwerbung auf 1,0–1,5 Millionen Gesamtereignisse ausgeweitet, insbesondere wenn eine niedrigstufige Resterkrankung vermutet wird.
  6. Erfassen werden pausiert oder abgebrochen, wenn fluidische Instabilität, Probenverstopfungen, abrupte Änderungen der Ereignisrate oder sichtbare Verschlechterung der Streuqualität auftreten. Filtern oder mischen Sie die Probe bei Bedarf erneut und nehmen Sie die Probe erst wieder auf, wenn stabiler Fluss wiederhergestellt ist.

5. Sequentielle Gating und nenner-angepasste Interpretation

  1. Analysieren Sie die Durchflusszytometriedaten mit validierter Flusszytometrie-Analysesoftware. Verwenden Sie für alle Proben dieselbe sequentielle Gating-Strategie, um die Variabilität zwischen den Betreibern zu verringern.
  2. Herstellen Sie normale und regenerierende Reifungsmuster, indem Sie unabhängig eine Referenzbank mit mindestens 20 normalen oder regenerierenden Knochenmarkproben erwerben und analysieren, die als Ausgangsvorlagen für die Expression dienen.
  3. Ausschließen Sie Trümmer unter Verwendung von Vorwärtsstreu- und Seitenstreuparametern. Isolieren Sie einzelne Zellen, indem Sie Vorwärts-Streuflächen- versus Vorwärts-Streu-Höhen-Gating anwenden.
  4. Nicht-lebensfähige Zellen mit dem in der Material-Tabelle aufgeführten Viabilitätsfarbstoff-Gate ausschließen. Eliminieren Sie diese nicht lebensfähigen Zellen routinemäßig, da sie eine unspezifische Antikörperbindung zeigen und künstlich Hintergrundgeräusche erhöhen oder seltene abweichende Populationen nachahmen können.
    HINWEIS: Für eine optimale nachgelagerte Analyse wird eine Mindestlebensfähigkeit von 75 % gefordert, wobei beachtet wird, dass Exemplare, die unter diesen Wert fallen, eine vorsichtige Interpretation hinsichtlich potenzieller seltener Ereignisse-Artefakte erfordern. Definiere den Leukozytennenner durch Gating auf lebensfähige CD45-positive Ereignisse mit geeigneten Seitenstreueigenschaften.
  5. Für B-ALLE Proben beschränken Sie die Analyse auf das CD19-positive Vorläuferkompartiment. Implementierung eines alternativen Gating-Rahmens für Patienten, die gezielte Anti-CD19-Therapien erhalten.
  6. Die primäre Bewertung wird auf CD22-, CD24- oder CD34-positive Kompartimente verlagert, um die leukämische Population unabhängig von CD19-Expression zu erfassen. Bewertung der Reifungsmuster von CD34, CD10 und CD20 und identifiziere abweichende Populationen anhand der Expressionsmuster CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123 und CD73 oder CD304.
  7. Für AML-Proben definieren Sie den Blast- oder Vorläuferbereich mit CD45, Seitenstreuung, CD34 und CD117-Expression.
  8. Bewertung der aberranten oder asynchronen Expression myeloider und kreuzer Linienmarker, einschließlich CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b und CD15.
  9. Berechnen Sie die probenspezifische Detektionsgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) unter Verwendung der Gesamtzahl der erworbenen lebensfähigen CD45-positiven Ereignisse als Nenner:
     figure-protocol-2
      figure-protocol-3
  10. Klassifizieren Sie die endgültige MRD-Interpretation in eine von drei Kategorien: MRD-positiv, unterhalb des LOD oder analytisch begrenzt.
    1. Das Ergebnis wird als MRD-positiv zugeordnet, wenn ein klarer, zusammenhängender Cluster abweichender Ereignisse den probenspezifischen LOD überschreitet und einen intern konsistenten Immunophenotyp zeigt, der sich von normalen oder regenerierenden hämatopoetischen Populationen unterscheidet.
      HINWEIS: Klassifizieren Sie verstreute, nicht geclusterte Ereignisse nicht als MRD-positiv. Nutzen Sie einen integrierten Analyseansatz, der sowohl den leukämieassoziierten Immunophenotyp (LAIP), der aus der Ausgangsstichprobe verfolgt wurde, als auch unterschiedliche Methoden zur Erkennung von Mustern (DfN) kombiniert.
    2. Weisen Sie das Ergebnis als unterstehende LOD zu, wenn seltene verdächtige Ereignisse vorliegen, aber nicht die meldepflichtige Schwelle für das Exemplar erreichen.
    3. Das Ergebnis wird als analytisch begrenzt zugeordnet, wenn die Nennergröße unzureichend ist, die Hämodilution erheblich ist, die Probequalität schlecht ist oder voranalytische oder analytische Einschränkungen eine sichere negative Interpretation verhindern.
  11. Überprüfen Sie alle MRD-positiven und grenzwertigen Low-Level-Fälle unabhängig von einem zweiten qualifizierten Analysten.
  12. Finalisieren Sie die Interpretation der Flusszytometrie, bevor Sie gepaarte Molekularvergleichsdaten prüfen, einschließlich quantitativer Polymerase-Kettenreaktion oder Next-Gen-Sequenzierungsergebnisse.

6. Analytische Validierungsmethodik

  1. Bewerten Sie die analytische Wiederholbarkeit, indem Sie doppelte Aliquots aus derselben Post-Lyse-Zellsuspension herstellen. Erfassen und analysieren Sie mindestens 30 gepaarte Exemplare unabhängig voneinander.
  2. Bewerten Sie die Verdünnungslinearität, indem Sie serielle Verdünnungen über sechs Niveaus innerhalb des erwarteten niedrigen Belastungsbereichs vorbereiten. Vergleichen Sie die beobachteten MRD-Werte mit den erwarteten MRD-Werten über die Verdünnungsreihe hinweg.
  3. Bewertung der Reproduzierbarkeit zwischen Operatoren und Instrumenten durch Analyse von Referenzproben über mehrere qualifizierte Operatoren und harmonisierte Durchflusszytometer.
  4. Transformieren Sie Flusszytometrische und gepaarte molekulare MRD-Prozentsätze mittels log10-Transformation vor statistischem Vergleich. Quantitative Übereinstimmung mit Korrelationsanalyse und Bland-Altman-Analyse bewerten.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkmale des routinemäßigen Implementierungsdatensatzes

Während des Studienzeitraums bestanden 197 aufeinanderfolgende Proben das Eignungsscreening und die präanalytische Qualitätsbewertung und nahmen den meldepflichtigen Workflow ein. Die Studienkohorte umfasste 98 Patienten, 62 (63,3 %) mit B-zelliger akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) und 36 (36,7 %) mit akuter myeloider Leukämie (AML). Die Kohorte bestand aus 64 Männern (65,3 %) und 34 Frauen (34,7 %), mit einem Medianalter von 32 Jahren (Interquartilbereich [IQR], 13–49 Jahre; Bereich 2–73 Jahre). Der mediane Ausgangs-Blast-Prozentsatz betrug 67,2 % (IQR, 56,9 % – 80,2 %).

Die meisten analysierten Proben waren Knochenmarkaspirate (174/197, 88,3 %), während periphere Blutproben 23 von 197 (11,7 %) ausmachten. Laut den vordefinierten Überwachungsintervallen wurden am Ende der Induktionstherapie 86 Proben (43,7 %) entnommen, 65 (33,0 %) während der Konsolidierungstherapie und 46 (23,4 %) vor der hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) (Tabelle 1).

Die mittlere Probenlebensfähigkeit betrug 88,3 % (IQR, 84,4 % – 92,6 %). Der Erfassungsworkflow ergab vor der Datenbereinigung einen Median von insgesamt 1.116.901 Ereignissen (IQR, 908.521–1.258.946). Nach dem sequentiellen analytischen Ausschluss von Trümmer, koinzidierten Doublets und nicht lebensfähigen Zellen erreichte die Gating-Strategie einen Median von 907.325 lebensfähigen einzelnen CD45-positiven Zielereignissen (IQR, 690.112–1.095.836) mit einer mittleren Erwerbszeit von 11,9 Minuten. Der mittlere Hämodilutionswert lag bei 0,20 (IQR, 0,14–0,28). Nach der nenneradjustierten Interpretation wurden 41 Proben (20,8 %) als MRD-positiv klassifiziert und 156 Proben (79,2 %) unterhalb des probenspezifischen Nachweislimits (LOD) (Tabelle 1).

Analytische Validierung: Wiederholbarkeit, Linearität und Stabilität

Die analytische Leistung des standardisierten Arbeitsablaufs wurde durch Wiederholbarkeit, Verdünnungslinearität und kurzfristige Stabilitätsstudien bewertet (Abbildung 2). Duplikat-Aliquots, die aus denselben bulklysierten Proben hergestellt wurden, zeigten eine starke Wiederholbarkeit, mit einem mittleren doppelten Variationskoeffizienten (CV) von 0,101 % und einem CV im 95. Perzentil von 0,222 %.

figure-results-1
Abbildung 2: Analytische Validierung des standardisierten mehrfarbigen Durchflusszytometrie-MRD-Workflows. (A) Verteilung der Probenlebensfähigkeit über analysierte Proben. (B) Korrelation zwischen erwarteten und beobachteten MRD-Werten in seriellen Verdünnungsexperimenten bei logarithmischer Analyse. (C) Übereinstimmung zwischen unabhängigen Replikationsanalysen während der Wiederholbarkeitsbewertung. (D) Stabilität der MRD-Messungen nach Lagerung bei Raumtemperatur bei 0 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Um das Verhalten der Niedrigstufe-Erkennung zu bewerten, wurden 12 serielle Verdünnungsexperimente mit insgesamt 72 Beobachtungen über den erwarteten niedrigeren MRD-Bereich analysiert. Beobachtete MRD-Werte zeigten eine starke Übereinstimmung mit den erwarteten Werten in einer logarithmischen Analyse (r = 0,999, bereinigt R2 = 0,998, Steigung = 1,009, Intercept = 0,018), was auf erhaltene Linearität über niedrigfrequente Ereignisbereiche hinweist.

Kurzfristige Stabilitätstests zeigten im Laufe der Zeit fortschreitende Abnahmen der Probenlebensfähigkeit, wobei die mittleren Viabilitäten von 89,1 % nach 0 Stunden auf 84,9 % nach 24 Stunden und 80,6 % nach 48 Stunden sanken. Im Gegensatz dazu blieb die mittlere absolute relative Änderung der MRD-Belastung begrenzt bei 24 Stunden (6,2 %) und 48 Stunden (12,0 %), was routinemäßige Verarbeitung innerhalb eines 24-Stunden-Intervalls nach der Entnahme unterstützte.

Interoperator- und Inter-Instrument-Reproduzierbarkeit

Die Reproduzierbarkeit zwischen Operatoren und Instrumenten wurde mit 24 Referenzproben bewertet, die über mehrere Operatoren analysiert wurden, sowie harmonisierten Durchflusszytometern, was insgesamt 96 Bewertungen ergab. Die mittlere absolute relative Abweichung von den Referenzwerten betrug 13,7 %. Diese Ergebnisse zeigen eine konsistente analytische Leistung nach Standardisierung der Probenpräparation, der Erfassungssettings und sequentiellen Gating-Strategien (Tabelle 2).

Tabelle 2: Analytische Validierungs- und Methodenvergleichsleistungsindikatoren für den standardisierten messbaren Restkrankheits-Workflow. Diese Tabelle beschränkt sich auf Validierungsergebnisse, darunter intraassay-Wiederholbarkeit, verdünnte Linearität, kurzfristige Stabilität, Interoperator- und Inter-Instrument-Reproduzierbarkeit sowie orthogonale molekulare Methodenvergleichsmetriken; sie dupliziert keine Patientendemografie oder Probenmerkmale, die in Tabelle 1 angegeben sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Klinische Anwendung und orthogonaler Methodenvergleich

Ein orthogonaler Vergleich wurde mit 117 gepaarten Proben durchgeführt, darunter 75 mit quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und 42 mit Next-Generation-Sequenzierung (NGS). Die qPCR-Bewertungen überwachten hauptsächlich krankheitsspezifische Fusionstranskripte, die bei der Diagnose erstellt wurden, darunter BCR::ABL1, RUNX1::RUNX1T1 und PML::RARA. Die NGS-Ansätze untersuchten klonale Immunglobulin- oder T-Zell-Rezeptor-Gen-Rearrangements bei lymphoblastischer Leukämie und verfolgten wiederkehrende somatische Mutationen mittels gezielter myeloider Panels für akute myeloide Leukämie. Flowzytometrische MRD-Werte zeigten eine starke Korrelation mit paarigen molekularen Ergebnissen über messbare Krankheitsniveaus hinweg (r = 0,893 in logarithmischer Analyse).

Die Bland-Altman-Analyse zeigte eine mittlere logaritmische Differenz von −0,093 mit Übereinstimmung von Grenzen von −0,848 bis 0,663 (Abbildung 3). Unter diskordanten Fällen wurde ein falsch-negatives Ergebnis unter 25 molekular positiven Proben festgestellt. Der Workflow zeigte eine positive prozentuale Übereinstimmung von 78,1 %, eine negative Übereinstimmung von 97,6 % und eine Gesamtkonkordanzrate von 92,3 %.

figure-results-2
Abbildung 3: Klinische Anwendung und orthogonale Validierung der standardisierten MRD-Bewertung. (A) Verteilung der MRD-positiven Fälle auf verschiedene Krankheitsgruppen und Überwachungsintervalle. (B) Korrelation zwischen durchflusszytometrischen MRD-Werten und gepaarten molekularen Vergleichsergebnissen in logarithmischer Analyse. (C) Bland-Altman-Analyse zum Vergleich von Flowzytometrischen und gepaarten molekularen MRD-Messungen, wobei horizontale Linien den mittleren Bias und die 95%igen Übereinstimmungsgrenzen im analytischen Bereich angeben. (D) Verteilung der MRD-positiven Ergebnisse über die Überwachungsintervalle der Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diese Ergebnisse zeigen, dass der standardisierte mehrfarbige Flowzytometrie-Workflow eine starke Übereinstimmung mit orthogonalen molekularen MRD-Tests über routinemäßige klinische Proben erzielte.

Ergänzende Tabelle 1: Umfassende Betriebsparameter für den standardisierten, mehrfarbigen Flowzytometrie-Messfluss messbaren Restkrankheits-Workflow. Diese einheitliche Tabelle legt die wesentlichen methodischen Komponenten auf, unterteilt in verschiedene Abschnitte. Abschnitt A beschreibt die krankheitsspezifischen Antikörperpanel-Konfigurationen, bei denen die Auswahl von CD73 oder CD304 auf dem diagnostischen leukämieassoziierten Immunophenotyp basiert. Abschnitt B beschreibt die standardisierten voranalytischen Probenverarbeitungs- und Durchflusszytometrie-Erfassungsziele. Abschnitt C definiert die nennerberungsbereinigten Berichtsschwellen neben den endgültigen Interpretationskriterien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Hauptziel dieser Studie war es, einen standardisierten Arbeitsablauf für die mehrfarbige Flowzytometrie der messbaren Resterkrankung (MRD) bei akuter Leukämie zu etablieren. Eine zuverlässige MRD-Bewertung hängt nicht nur von der Auswahl des Antikörperpanels ab, sondern auch von der konsistenten Probenhandhabung, den Erfassungsparametern und der Dateninterpretation11. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass harmonisierte Probenverarbeitung, kontrollierte Erwerbstiefe und durch den Nenner angepasste Berichtskriterien die analytische Reproduzierbarkeit in routinemäßigen klinischen Laborumgebungen verbessern können. Diese Ergebnisse stimmen mit jüngsten Bemühungen überein, die Flowzytometrische MRD-Bewertung über verschiedene Institutionenund Betreiber hinweg zu standardisieren.

Ein wichtiger Bestandteil dieses Arbeitsablaufs ist das auf Ammoniumchlorid basierende Bulk-Verfahren der roten Blutkörperchen-Lyse. Die Erkennung von MRDs bei seltenen Ereignissen erfordert die Erfassung großer zellulärer Nenner, um eine angemessene analytische Empfindlichkeit zu erreichen. Die standardisierte Bulk-Lysis-Vorbereitung ermöglichte eine konsistente Rückgewinnung ausreichender nuklearer Zellanzahl, die häufig über 1,0–1,5 Millionen erworbene Ereignisse lag, während die akzeptable Probenlebensfähigkeit erhalten blieb. Frühere Studien des EuroFlow-Konsortiums betonten ähnlich, dass eine hohe Ereigniserfassung notwendig ist, um die empfindliche und reproduzierbare MRD-Detektion13 zu unterstützen. Bei Proben mit suboptimaler analytischer Sensibilität sollte die Fehlersuche die Bewertung des Probenvolumens, der zellulären Wiederherstellung und der Erfassungstiefe umfassen.

Dieses Protokoll beinhaltet außerdem eine routinemäßige Hämodilutionsbewertung vor der Interpretation von niedrigstufigen MRD-negativen Ergebnissen. Hämodilution bleibt eine bedeutende voranalytische Einschränkung bei Knochenmark-basierten MRD-Tests, da eine periphere Blutkontamination die scheinbare leukämische Belastung künstlich verringern kann. Die direkte Einbindung eines semi-quantitativen Hämodilutionswerts in den Berichtsablauf bietet einen zusätzlichen Schutz gegen Fehlinterpretationen als falsch negativ. Frühere Studien haben berichtet, dass Hämodilution die Zuverlässigkeit der durchflusszytometrischen MRD-Analyse bei akuter myeloischer Leukämie7 signifikant beeinflusst. Exemplare mit erheblicher Hämodilution (≥0,40) sollten daher mit Vorsicht interpretiert werden, insbesondere wenn die Erwerbstiefe oder die Erhaltung des Markvorläufers unzureichend ist.

Der in dieser Studie durchgeführte orthogonale Vergleich zeigte eine starke Gesamtübereinstimmung zwischen Flowzytometrischen und molekularen MRD-Bewertungsmethoden. Die disharmonischen Fälle unterstreichen jedoch auch, dass Flowzytometrie und molekulare Assays unterschiedliche biologische Aspekte der Resterkrankung bewerten. Frühere Studien haben gezeigt, dass phänotypische Verschiebungen, klonale Evolution und regenerative Hämatopoese zu Abweichungen zwischen analytischen Plattformen beitragen können14. In B-ALL bleibt die Unterscheidung von restlichen leukämischen Vorläufern von normalen Hämatogenen besonders schwierig bei niedrigen Krankheitslasten und erfordert eine integrierte Interpretation multidimensionaler immunophenotypischer Muster statt isolierter Antigenabnormalitäten15. Aus diesem Grund wurden alle Borderline- und Low-Level-MRD-Fälle in diesem Workflow unabhängig von einem zweiten Analysten geprüft.

Diese Studie hat mehrere Einschränkungen. Erstens wurde die Validierung an einer einzigen Institution mit einer begrenzten Anzahl harmonisierter Instrumente durchgeführt. Zweitens wurden periphere Blutproben nur in ausgewählten klinischen Situationen einbezogen, da sie das Knochenmark für die routinemäßige MRD-Beurteilung nach der Behandlung in den meisten akuten Leukämie-Situationen nicht ersetzen können. Darüber hinaus erfordern einige analytische Parameter, darunter Hämodilutionsbewertung und niedrigstufige Ereignisinterpretation, trotz des standardisierten Arbeitsablaufs eine Überprüfung erfahrener Operatoren. Dennoch bietet das Protokoll einen praktischen Rahmen für die routinemäßige klinische Umsetzung der standardisierten mehrfarbigen Flowzytometrischen MRD-Bewertung16,17. Durch die Integration von präanalytischer Qualitätsbewertung, harmonisierten Beschaffungsstrategien und nennerungsangepassten Interpretationskriterien unterstützt dieser Workflow eine reproduzierbarere und klinisch konsistentere MRD-Berichterstattung über die routinemäßige Laborpraxis hinweg.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Autor dankt der Abteilung für Klinisches Labor am Zweiten Volkskrankenhaus von Neijiang für die Bereitstellung von Laboreinrichtungen und technischer Unterstützung für diese Studie. Der Autor würdigt außerdem das Laborpersonal und das klinische Personal für ihre Unterstützung bei der Probenverarbeitung und Datenerhebung. Abschließend dankt der Autor den Patienten, deren klinische Restproben zu dieser Arbeit beigetragen haben. Diese Forschung erhielt keine spezifische Finanzierung von öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Förderorganisationen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Acquisition bufferLaboratory-preparedPBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µLFinale Resuspension vor der zytometrischen Durchflussanalyse
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abFrühe myeloische/Blasten-Identifikation
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMyeloische Linienverankerung
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMyeloische Linienverankerung
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abUnreifemarker
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abLeukozyten-Rückgratmarker und Denominatordefinition
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abAberrant blast-assoziierte Phänotypisierung
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abKreuzlinien-Aberranzidetektion
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMaturations- und Subtypdiskriminierung
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abFrühe myeloische/Blasten-Identifikation
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMaturationsdiskordanzbewertung
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMyeloische Linienverankerung
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abUnterschiedlich von normalem myeloischem Musterbewertung
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMyeloische Linienverankerung
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abUnreifemarker
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abLeukozyten-Rückgratmarker und Denominatordefinition
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMaturations- und Subtypdiskriminierung
Ammoniumchloridbasierter roter Blutkörperchen-LysepufferLaborpräparation / kommerzieller LieferantAmmoniumchloridbasierter Lysepuffer; 10 mL/Test; 10 min bei RaumtemperaturGroßflächige rote Blutkörperchen-Lyse
AnalysesoftwareBeckman Coulter (Brea, CA, USA)Kaluza 2.1Datenanalyse und sequentielle Gating
Automatisiertes Hämatologie-AnalysatorKommerzieller LieferantAutomatisierter Hämatologie-Analysator, der für die nukleierte Zellkonzentration und Lebensfähigkeitsbewertung verwendet wirdNukleierte Zellkonzentration und Lebensfähigkeitsbewertung
B-ALL Tube 1 anti-CD10-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: HI10a; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht ab

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heuser M, et al. 2021 update on measurable residual disease in acute myeloid leukemia: A consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2021;138(26):2753–67.
  2. Cloos J, Heuser M, Freeman SD. 2025 update on MRD in acute myeloid leukemia: A consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2025;147(11):1147–64.
  3. Verbeek MWC, Lucio P, Szczepański T. Minimal residual disease assessment in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia by standardized next-generation flow cytometry. eJHaem. 2024;5(2):110–20.
  4. Virk H, Jain P, Sengar M. Flow cytometric MRD assessment in acute lymphoblastic leukemia: Practical advantages and interpretive considerations. Indian J Hematol Blood Transfus. 2023;39(3):350–62.
  5. Brando B. Rules in rare event acquisition: An overview. Cytometry B Clin Cytom. 2019;96(6):448–53.
  6. EuroFlow Consortium. Standardized EuroFlow Protocols [Internet]. EuroFlow; 2025. Available from: https://euroflow.org/protocols/ (accessed 2026 Jan 15).
  7. Tettero JM, Heidinga ME, Mocking TR. Impact of hemodilution on flow cytometry-based measurable residual disease assessment in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2024;38(2):297–305.
  8. Buccisano F, et al. Prognostic and therapeutic implications of measurable residual disease in acute myeloid leukemia. Blood. 2012;119(2):332–41.
  9. Schuurhuis GJ, Heuser M, Freeman S. Minimal/measurable residual disease in AML: A consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2018;131(12):1275–91.
  10. Terwijn M, van Putten WLJ, Kelder A. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: Data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol. 2013;31(31):3889–97.
  11. Smith AB, Jones CD. Computational models, and tools for future development in flow cytometry. Cancer Metastasis Rev. 2026;45(1):88–102.
  12. Jum’ah HA, Ali S, Hwang Y. Measurable residual disease analysis by flow cytometry: Assay validation and characterization of 385 consecutive cases of acute myeloid leukemia. Cancers. 2025;17(7):1155.
  13. Theunissen P, et al. Standardized EuroFlow flow cytometric method for B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL) MRD assessment. Blood. 2017;129(3):347–57.
  14. Haaksma LH, Mocking TR, Kelder A. Flow cytometric and molecular measurable residual disease in acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma. 2025;66(1):45–55.
  15. Das N, Yadav P, Seth T. Analytical appraisal of hematogones in B-ALL MRD assessment using multidimensional dot-plots by multiparametric flow cytometry: A critical review and update. Indian J Hematol Blood Transfus. 2024;40(1):12–24.
  16. Korkina YS, Popov AM, Tserenov DG. False-positive flow cytometric measurable residual disease in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Cytometry B Clin Cytom. 2024;106(2):120–31.
  17. Mocking TR, et al. Computational measurable residual disease assessment in acute myeloid leukemia: a retrospective validation in the HOVON-SAKK-132 trial. Leukemia. 2025;39(10):2559–62.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

MedizinAusgabe 234Ausgabe 234Leerer WertAusgabeB ALLAML

Verwandte Artikel