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Methodenartikel

Standardisiertes mehrfarbiges Flowzytometrieprotokoll zur messbaren Resterkrankungsbeurteilung bei akuter Leukämie

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DOI:

10.3791/71756

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7. August 2026

1Department of Clinical Laboratory, The Second People's Hospital of Neijiang

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Workflow zur messbaren Resterkrankungsbewertung bei akuter Leukämie, integriert kontrollierte Probenverarbeitung, harmonisierte Erfassungsparameter, sequentielle Gating-Strategien und nenner-angepasste Interpretation, um die analytische Reproduzierbarkeit in routinemäßigen klinischen Laboren zu verbessern.

Zusammenfassung

Messbare Resterkrankung (MRD) ist ein wichtiger prognostischer Indikator bei der Behandlung akuter Leukämie. Die routinemäßige Multicolor-Flowzytometrie-(MFC)-Bewertung bleibt jedoch anfällig für präanalytische und analytische Variabilität, einschließlich Hämodilution, inkonsistenter Erwerbstiefe und subjektiver Interpretation. Dieser Artikel präsentiert einen standardisierten operativen Arbeitsablauf für die routinemäßige MRD-Untersuchung bei B-zelliger akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) und akuter myeloischer Leukämie (AML). Das Protokoll beinhaltet strenge Kriterien für die Abnahme von Probeproben, integrierte Hämodilutionsbewertung und verwendet eine Massen-Methode der roten Blutkörperchen-Lyse für Knochenmark- und periphere Blutproben. Die analytische Standardisierung wird durch krankheitsspezifische Zweiröhren-Achtfarb-Antikörperpanels, harmonisierte Erfassungsziele, die mindestens 500.000 CD45-positive Ereignisse erfordern, sowie feste sequentielle Garting-Strategien erreicht. Zusätzlich wendet der Workflow denominator-adjustierte Detektionsgrenzen (LOD) und Quantifizierung (LOQ) an, um ein objektives dreistufiges Berichtssystem zu unterstützen. Die Validierung bei 197 klinischen Proben zeigte eine starke Wiederholbarkeit, robuste Verdünnungslinearität und hohe Konkordanz mit gepaarten orthogonalen molekularen Assays. Gemeinsam bietet dieses Protokoll einen praktischen Rahmen für standardisierte MRD-Überwachung. für standardisierte MRD-Überwachung in routinemäßigen klinischen Laboren durch Integration kontrollierter voranalytischer Handhabung und harmonisierter analytischer Parameter.

Einleitung

Auch nach Erreichen morphologischer Remission benötigen Patienten mit akuter Leukämie eine kontinuierliche Überwachung auf messbare Resterkrankung (MRD), um das Rückfallrisiko genau einzuschätzen. Konventionelle morphologische und zytopathologische Untersuchungen verfügen nicht über die Sensitivität, die erforderlich ist, um niedrigstufige restleukämische Populationen zu erkennen. Daher ist die MRD-Bewertung zu einem wesentlichen Bestandteil der Krankheitsüberwachung sowohl bei akuter myeloider Leukämie (AML) als auch bei B-zelliger akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) geworden. Jüngste Empfehlungen des European LeukemiaNet betonen, dass eine zuverlässige MRD-Bewertung bei AML auf technischer Standardisierung und Interobserver-Reproduzierbarkeit basiert und nicht auf der einfachen Verfügbarkeit des Assays 1,2. Bei B-ALL bleibt die mehrfarbige Durchflusszytometrie (MFC) besonders wichtig für Patienten ohne stabile molekulare Ziele. Frühere Studien haben gezeigt, dass standardisierte mehrfarbige Flowzytometrische Ansätze mit strukturierten Antikörperpanel-Designs eine reproduzierbare und empfindliche Nachweis der Restkrankheit ermöglichenkönnen. Flusszytometrie wird aufgrund ihrer breiten Anwendbarkeit, schnellen Bearbeitungszeit und Kosteneffizienz weit verbreitet eingesetzt. Die Assay-Leistung bleibt stark abhängig von der standardisierten Probenpräparation, den Erfassungsparametern und der Dateninterpretation4.

Eine der größten technischen Herausforderungen bei der durchflusszytometrischen MRD-Bewertung ist die Erkennung seltener Ereignisse, die stark von der Erfassungstiefe und der Gesamtzahl der Ereignisse beeinflusst wird. Identische Antikörperpanels können unterschiedliche analytische Sensitivitäten erzeugen, wenn Proben mit inkonsistenten Nennergrößen5 entnommen werden. Die Standardisierung geht daher über die Antikörperauswahl hinaus und erfordert harmonisierte Probeverarbeitung, Massenlyse roter Blutkörperchen, Instrumentenkompensation, Erfassungsziele und Gating-Strategien. Bei Knochenmarkproben stellt Hämodilution auch eine bedeutende präanalytische Variable dar, da eine periphere Blutkontamination die scheinbare restliche leukämische Belastungkünstlich reduzieren kann 6,7. Darüber hinaus erfordert die Interpretation niedrigfrequenter Ereignisse klar definierte Berichtsschwellen, die auf der provenspezifischen Aufnahmetiefe basieren. Neuere Studien haben die Bedeutung von nenner-adjustierten Detektionsgrenzen (LOD) und Quantifizierung (LOQ) für die Verbesserung der Konsistenz der flowzytometrischen MRD-Interpretation8 betont.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten Arbeitsablauf für routinemäßige MFC-basierte MRD-Bewertung in B-ALL und AML bereitzustellen. Das Protokoll integriert Probenakzeptanzkriterien, Hämodilutionsbewertung, krankheitsspezifische Antikörperpanel-Design, Bulk-Lysis-Probenvorbereitung, harmonisierte Erfassungsziele, feste sequentielle Gating-Strategien und nenner-angepasste Berichtskriterien in einem einzigen operativen Rahmen 9,10. Durch die Kombination standardisierter voranalytischer und analytischer Verfahren bietet diese Methode einen praktischen und reproduzierbaren Ansatz für die routinemäßige klinische Laborumsetzung der MRD-Überwachung. Abbildung 1 illustriert den insgesamt standardisierten präanalytischen und analytischen Workflow, der in dieser Studie implementiert wurde. Tabelle 1 fasst die Kohorten- und Probenmerkmale der Patienten mit B-zelliger akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) und akuter myeloider Leukämie (AML) zusammen, die während des Validierungszeitraums über vordefinierte Überwachungsfenster (Ende der Induktion, Konsolidierung und Pre-HSCT) aufgenommen wurden.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Standardisierter Arbeitsablauf für routinemäßige mehrfarbige Flow-Cytometrie-MRD-Bewertung. (A) Voranalytischer Workflow, der Probenscreening und Qualitätsbewertung über vordefinierte Überwachungsintervalle hinweg zeigt. (B) Analytischer Workflow von Massenlyse roter Blutkörperchen und Antikörperfärbung bis hin zu sequentiellem Gating und Nenner-angepasster Interpretation und endgültiger MRD-Berichterstattung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Konsolidierte Patientendemografie, klinische Probenmerkmale und routinemäßige Erfassungskennzahlen. Diese einzelne überarbeitete Tabelle fasst die klinischen Ausgangsmerkmale der aufgenommenen Kohorte zusammen, bestehend aus B-zelligen Fällen von akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) und akuter myeloischer Leukämie (AML) und kombiniert Patienten-Demografie mit Merkmalen auf Probenebene, Behandlungsüberwachungsintervallen, Lebensfähigkeit, Hämodilutionswerten, Akquisitionstiefen und nenner-adjustierten messbaren Resterkrankungsklassifikationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Protokoll

Alle Verfahren mit menschlichen Proben wurden gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Ethikausschuss des Zweiten Volkskrankenhauses von Neijiang genehmigt (Genehmigungsnummer PXTS887192). Die Studie verwendete deidentifizierte klinische Restproben, die nach routinemäßigen diagnostischen Tests entnommen wurden. Die informierte Einwilligung wurde aufgehoben, da die Studie die Patientenversorgung, die Behandlungszuweisung oder die Probeentnahmeverfahren nicht beeinflusste. Die im Protokoll verwendeten Chemikalien, Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Probenentnahme und voranalytische Bewertung

  1. Sammeln Sie Knochenmarkaspirate als bevorzugten Probentyp für die Bewertung der messbaren Resterkrankung (MRD). Verwenden Sie periphere Blutproben nur, wenn die Knochenmarkaspiration klinisch kontraindiziert ist oder bei ausgewählten Überwachungs- und Vergleichsanalysen.
  2. Sammeln Sie das Knochenmarkexemplar während des ersten Aspirations, wann immer möglich. Vermeiden Sie nachfolgende Aspirationsabzüge, um eine periphere Blutkontamination und die Untereinschätzung niedriger Resterkrankungen zu minimieren.
  3. Proben werden unmittelbar nach der Entnahme in Dikaliumethylendiamintetraessigsäure (K2-EDTA) oder Natriumheparin-Antikoagulanzröhrchen übertragen. Lagere und transportiere die Exemplare bei Raumtemperatur (18–25 °C) und schütze sie vor direktem Sonnenlicht.
    VORSICHT: Stellen Sie die Proben nicht in den Kühlschrank.
  4. Bearbeiten Sie alle Proben innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme. Für Stabilitätsstudien werden Aliquots für die Wiederholungsanalyse bei 24 und 48 Stunden aufbewahrt, während die Lagerbedingungen bei Raumtemperatur erhalten bleiben.
  5. Verifizieren Sie die Patientenkennung, den Antikoagulanstyp, die Integrität der Probe und die Entnahmezeit beim Empfang der Probe. Abstoßproben mit umfangreicher Gerinnung, schwerer Hämolyse oder ausgeprägter Zelldegeneration
  6. Untersuchen Sie Knochenmarkproben auf Hämodilution vor der endgültigen Interpretation. Berechnen Sie einen semi-quantitativen Hämodilutionswert von 0,00 bis 1,00, um die periphere Blutkontamination zu schätzen.
  7. Bestimmen Sie diesen Wert, indem Sie den Anteil der reifen Lymphozyten durch die Summe von CD34-positiven Vorläufern, unreifen Granulozyten und reifen Lymphozyten teilen, wobei ein höherer Quotient auf einen stärkeren Verdünnungseffekt hinweist.
    HINWEIS: Berechnen Sie die Punktzahl mit folgender Formel:
      figure-protocol-1
    wobei ein höherer Wert auf eine größere periphere Blutkontamination hinweist.
  8. Klassifizieren Sie Hämodilutionswerte wie folgt: <0,20, akzeptabel; 0,20–0,39, leicht gehämodilutiert; und ≥0,40, stark verdünnt.
    HINWEIS: Weisen Sie nicht eindeutig MRD-negativen Interpretationen auf deutlich gehämodilutierte Exemplare zu, es sei denn, eine ausreichende Nennergröße und eine erhaltene Markvorläuferarchitektur sind bestätigt.

2. Vorbereitung des krankheitsspezifischen Antikörperpanels

  1. Bereiten Sie standardisierte, krankheitsspezifische Zweiröhren-Achtfarb-Antikörperpanels für B-ALL- und AML-Analysen vor. Erreichen Sie die Standardisierung des Panels durch strikte Einhaltung fester Rückgratmarker über alle Röhren hinweg für stabile Populationsaufnahme.
  2. Verwenden Sie konsistente Fluorochromkonjugate für entsprechende Linienantigene und halten Sie sich strikt an die vom Hersteller empfohlenen Titrationsvolumen, um die Fluoreszenzvariabilität von Lot zu Lot zu minimieren.
  3. Siehe Ergänzende Tabelle 1 für Markerkombinationen, Fluorochromzuweisungen, Antikörperklone, Färbungsvolumen und Aufnahmeparameter.
  4. Für die B-ALL-Bewertung verwenden Sie CD19, CD45, CD34, CD10 und CD20 als Rückgratmarker in beiden Tuben, um Vorläuferpopulationen und Reifungsmuster zu definieren. Fügen Sie CD38, CD58 und CD81 in Röhre 1 hinzu.
  5. Fügen Sie CD66c, CD123 und entweder CD73 oder CD304 gemäß dem diagnostischen, leukämieassoziierten Immunophenotyp, der bei der Ausgangsbewertung festgelegt wurde, Tube 2 hinzu.
  6. Für die AML-Bewertung verwenden Sie CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 und HLA-DR als Rückgratmarker in beiden Röhren, um Blast- und unreife myeloide Populationen zu definieren.
  7. CD7 und CD56 in Röhre 1 hinzufügen, um die antigenkreuze Expression zu bewerten. CD11b und CD15 in Tube 2 geben, um Myeloid-Reifungsauffälligkeiten zu untersuchen.

3. Vorbereitung und Färbung der Massenlyse

  1. Übertragen Sie 2,0 ml gut gemischtes Knochenmark oder peripheres Blut in ein 15 ml Polypropylenrohr. Wenn das Probevolumen begrenzt ist, wird ein Mindesteingangsvolumen von 1,0 mL verwendet.
  2. Fügen Sie der Probe 10 ml vorgewärmten Ammoniumchlorid-Lysepuffer hinzu. Inkubiere die Suspension 10 Minuten bei Zimmertemperatur, um rote Blutkörperchen zu lysieren.
  3. Zentrifugiere die Probe bei 500 × g für 5 Minuten. Entsorgen Sie das Supernatant vorsichtig, ohne das nukleierte Zellpellet zu stören.
  4. Resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), das 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) enthält. Wiederholen Sie den Waschschritt einmal, wenn die restliche Hämoglobinkontamination sichtbar bleibt.
  5. Bestimmen Sie die nukleierte Zellkonzentration mit einem automatisierten Hämatologie-Analysator oder manueller Hämozytometerzählung unter Ausschluss von Trypan-Blau. Betrachten Sie eine minimale nukleäre Zellkonzentration von 5 × 106 Zellen/mL als optimal für die Standardaufnahme.
    HINWEIS: Wenn die zelluläre Ausbeute unter diesen Schwellenwert fällt, konzentriert man die Probe durch eine zusätzliche Zentrifugation bei 500 × g für 5 Minuten und reduziert vorsichtig das Puffervolumen der Resuspension, um die zelluläre Dichte zu maximieren.
  6. Aliquot 5 × 10 bis6 nukleierte Zellen pro Röhre für routinemäßige Färbungen. Erhöhen Sie den Eingang auf maximal 1 × 107 Zellen pro Tube für eine Analyse mit hoher Empfindlichkeit, wenn die Probengewinnung 6,7 erlaubt.
  7. Fügen Sie jedem Tub gemäß der validierten Konfiguration des Färbstoffpanels den individuell titrierten Antikörpercocktail und den in der Materialtabelle angegebenen fixierbaren Viabilitätsfarbstoff hinzu. Das routinemäßig validierte Panel verwendet 5 μL pro fluorochromkonjugiertem Antikörper, es sei denn, die vom Hersteller empfohlene Titration zeigt ein anderes antikörperspezifisches Volumen an.
  8. Stellen Sie sicher, dass das endgültige Färbungsreaktionsvolumen streng bei 100 μL pro Test gehalten wird, um die optimale Antikörper-zu-Antigen-Stöchiometrie zu erhalten. Inkubieren Sie die Exemplare 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  9. Waschen Sie die gefärbten Zellen einmal mit einem Waschpuffer und suspendieren Sie das endgültige Pellet in 500 μL Aufnahmepuffer neu.
  10. Bereiten Sie am selben Tag der Probenentnahme Einzel-gefärbte Kompensationskontrollen mit Kompensationsperlen vor.

4. Instrumentenaufbau und Datenerfassung

  1. Führen Sie die tägliche Qualitätskontrolle des Starts am Durchflusszytometer durch, bevor Sie Patientenproben entnehmen. Verifizieren Sie die Fluidik, die Laserausrichtung, die Detektorleistung und die Fluoreszenzzielwerte mithilfe von Kalibrierungskugeln und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
  2. Bereiten Sie Einzel-gefärbte Kompensationskontrollen mit denselben Fluorochromen vor, die auch in den Antikörperpanels enthalten sind. Passen Sie die Kompensationsmatrix vor der Patientenaufnahme an und bestätigen Sie, dass die Rückgratmarker innerhalb der vordefinierten Fluoreszenzzielbereiche bleiben.
  3. Verwenden Sie dieselbe Erfassungsvorlage, Detektoreinstellungen, Kompensationsstrategie und Gating-Hierarchie für alle während der Validierungsperiode analysierten Proben.
    HINWEIS: Sicherstellen Sie eine ordnungsgemäße Harmonisierung über Instrumente hinweg, indem standardisierte mediane Fluoreszenzintensitätswerte für alle Detektoren mit speziellen Kalibrierungsperlen festgelegt werden, und bestätigen, dass identische Proben vergleichbare Fluoreszenzprofile über verschiedene Plattformen hinweg liefern, bevor klinische Daten erfasst werden.
  4. Erfassen Sie Daten mit niedriger bis mittlerer Flussrate, um Koincident-Ereignisse zu reduzieren und die Genauigkeit der Erkennung seltener Ereignisse zu erhalten. Überwachen Sie die Ereignisrate kontinuierlich während der Erfassung.
  5. Erfassen Sie mindestens 500.000 CD45-positive nukleierte Ereignisse für jedes meldepflichtige MRD-Ergebnis. Wenn Probenqualität und Ereignisstabilität es erlauben, wird die Erwerbung auf 1,0–1,5 Millionen Gesamtereignisse ausgeweitet, insbesondere wenn eine niedrigstufige Resterkrankung vermutet wird.
  6. Erfassen werden pausiert oder abgebrochen, wenn fluidische Instabilität, Probenverstopfungen, abrupte Änderungen der Ereignisrate oder sichtbare Verschlechterung der Streuqualität auftreten. Filtern oder mischen Sie die Probe bei Bedarf erneut und nehmen Sie die Probe erst wieder auf, wenn stabiler Fluss wiederhergestellt ist.

5. Sequentielle Gating und nenner-angepasste Interpretation

  1. Analysieren Sie die Durchflusszytometriedaten mit validierter Flusszytometrie-Analysesoftware. Verwenden Sie für alle Proben dieselbe sequentielle Gating-Strategie, um die Variabilität zwischen den Betreibern zu verringern.
  2. Herstellen Sie normale und regenerierende Reifungsmuster, indem Sie unabhängig eine Referenzbank mit mindestens 20 normalen oder regenerierenden Knochenmarkproben erwerben und analysieren, die als Ausgangsvorlagen für die Expression dienen.
  3. Ausschließen Sie Trümmer unter Verwendung von Vorwärtsstreu- und Seitenstreuparametern. Isolieren Sie einzelne Zellen, indem Sie Vorwärts-Streuflächen- versus Vorwärts-Streu-Höhen-Gating anwenden.
  4. Nicht-lebensfähige Zellen mit dem in der Material-Tabelle aufgeführten Viabilitätsfarbstoff-Gate ausschließen. Eliminieren Sie diese nicht lebensfähigen Zellen routinemäßig, da sie eine unspezifische Antikörperbindung zeigen und künstlich Hintergrundgeräusche erhöhen oder seltene abweichende Populationen nachahmen können.
    HINWEIS: Für eine optimale nachgelagerte Analyse wird eine Mindestlebensfähigkeit von 75 % gefordert, wobei beachtet wird, dass Exemplare, die unter diesen Wert fallen, eine vorsichtige Interpretation hinsichtlich potenzieller seltener Ereignisse-Artefakte erfordern. Definiere den Leukozytennenner durch Gating auf lebensfähige CD45-positive Ereignisse mit geeigneten Seitenstreueigenschaften.
  5. Für B-ALLE Proben beschränken Sie die Analyse auf das CD19-positive Vorläuferkompartiment. Implementierung eines alternativen Gating-Rahmens für Patienten, die gezielte Anti-CD19-Therapien erhalten.
  6. Die primäre Bewertung wird auf CD22-, CD24- oder CD34-positive Kompartimente verlagert, um die leukämische Population unabhängig von CD19-Expression zu erfassen. Bewertung der Reifungsmuster von CD34, CD10 und CD20 und identifiziere abweichende Populationen anhand der Expressionsmuster CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123 und CD73 oder CD304.
  7. Für AML-Proben definieren Sie den Blast- oder Vorläuferbereich mit CD45, Seitenstreuung, CD34 und CD117-Expression.
  8. Bewertung der aberranten oder asynchronen Expression myeloider und kreuzer Linienmarker, einschließlich CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b und CD15.
  9. Berechnen Sie die probenspezifische Detektionsgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) unter Verwendung der Gesamtzahl der erworbenen lebensfähigen CD45-positiven Ereignisse als Nenner:
     figure-protocol-2
      figure-protocol-3
  10. Klassifizieren Sie die endgültige MRD-Interpretation in eine von drei Kategorien: MRD-positiv, unterhalb des LOD oder analytisch begrenzt.
    1. Das Ergebnis wird als MRD-positiv zugeordnet, wenn ein klarer, zusammenhängender Cluster abweichender Ereignisse den probenspezifischen LOD überschreitet und einen intern konsistenten Immunophenotyp zeigt, der sich von normalen oder regenerierenden hämatopoetischen Populationen unterscheidet.
      HINWEIS: Klassifizieren Sie verstreute, nicht geclusterte Ereignisse nicht als MRD-positiv. Nutzen Sie einen integrierten Analyseansatz, der sowohl den leukämieassoziierten Immunophenotyp (LAIP), der aus der Ausgangsstichprobe verfolgt wurde, als auch unterschiedliche Methoden zur Erkennung von Mustern (DfN) kombiniert.
    2. Weisen Sie das Ergebnis als unterstehende LOD zu, wenn seltene verdächtige Ereignisse vorliegen, aber nicht die meldepflichtige Schwelle für das Exemplar erreichen.
    3. Das Ergebnis wird als analytisch begrenzt zugeordnet, wenn die Nennergröße unzureichend ist, die Hämodilution erheblich ist, die Probequalität schlecht ist oder voranalytische oder analytische Einschränkungen eine sichere negative Interpretation verhindern.
  11. Überprüfen Sie alle MRD-positiven und grenzwertigen Low-Level-Fälle unabhängig von einem zweiten qualifizierten Analysten.
  12. Finalisieren Sie die Interpretation der Flusszytometrie, bevor Sie gepaarte Molekularvergleichsdaten prüfen, einschließlich quantitativer Polymerase-Kettenreaktion oder Next-Gen-Sequenzierungsergebnisse.

6. Analytische Validierungsmethodik

  1. Bewerten Sie die analytische Wiederholbarkeit, indem Sie doppelte Aliquots aus derselben Post-Lyse-Zellsuspension herstellen. Erfassen und analysieren Sie mindestens 30 gepaarte Exemplare unabhängig voneinander.
  2. Bewerten Sie die Verdünnungslinearität, indem Sie serielle Verdünnungen über sechs Niveaus innerhalb des erwarteten niedrigen Belastungsbereichs vorbereiten. Vergleichen Sie die beobachteten MRD-Werte mit den erwarteten MRD-Werten über die Verdünnungsreihe hinweg.
  3. Bewertung der Reproduzierbarkeit zwischen Operatoren und Instrumenten durch Analyse von Referenzproben über mehrere qualifizierte Operatoren und harmonisierte Durchflusszytometer.
  4. Transformieren Sie Flusszytometrische und gepaarte molekulare MRD-Prozentsätze mittels log10-Transformation vor statistischem Vergleich. Quantitative Übereinstimmung mit Korrelationsanalyse und Bland-Altman-Analyse bewerten.

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Ergebnisse

Merkmale des routinemäßigen Implementierungsdatensatzes

Während des Studienzeitraums bestanden 197 aufeinanderfolgende Proben das Eignungsscreening und die präanalytische Qualitätsbewertung und nahmen den meldepflichtigen Workflow ein. Die Studienkohorte umfasste 98 Patienten, 62 (63,3 %) mit B-zelliger akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) und 36 (36,7 %) mit akuter myeloider Leukämie (AML). Die Kohorte bestand aus 64 Männern (65,3 %) und...

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Diskussion

Das Hauptziel dieser Studie war es, einen standardisierten Arbeitsablauf für die mehrfarbige Flowzytometrie der messbaren Resterkrankung (MRD) bei akuter Leukämie zu etablieren. Eine zuverlässige MRD-Bewertung hängt nicht nur von der Auswahl des Antikörperpanels ab, sondern auch von der konsistenten Probenhandhabung, den Erfassungsparametern und der Dateninterpretation11. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass harmonisierte Probenverarbeitung, kontrollierte Erw...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Der Autor dankt der Abteilung für Klinisches Labor am Zweiten Volkskrankenhaus von Neijiang für die Bereitstellung von Laboreinrichtungen und technischer Unterstützung für diese Studie. Der Autor würdigt außerdem das Laborpersonal und das klinische Personal für ihre Unterstützung bei der Probenverarbeitung und Datenerhebung. Abschließend dankt der Autor den Patienten, deren klinische Restproben zu dieser Arbeit beigetragen haben. Diese Forschung erhielt keine spezifische Finanzierung von öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Förderorganisationen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Acquisition bufferLaboratory-preparedPBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µLFinale Resuspension vor der zytometrischen Durchflussanalyse
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abFrühe myeloische/Blasten-Identifikation
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMyeloische Linienverankerung
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMyeloische Linienverankerung
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abUnreifemarker
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abLeukozyten-Rückgratmarker und Denominatordefinition
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abAberrant blast-assoziierte Phänotypisierung
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abKreuzlinien-Aberranzidetektion
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMaturations- und Subtypdiskriminierung
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abFrühe myeloische/Blasten-Identifikation
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMaturationsdiskordanzbewertung
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMyeloische Linienverankerung
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abUnterschiedlich von normalem myeloischem Musterbewertung
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMyeloische Linienverankerung
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abUnreifemarker
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abLeukozyten-Rückgratmarker und Denominatordefinition
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht abMaturations- und Subtypdiskriminierung
Ammoniumchloridbasierter roter Blutkörperchen-LysepufferLaborpräparation / kommerzieller LieferantAmmoniumchloridbasierter Lysepuffer; 10 mL/Test; 10 min bei RaumtemperaturGroßflächige rote Blutkörperchen-Lyse
AnalysesoftwareBeckman Coulter (Brea, CA, USA)Kaluza 2.1Datenanalyse und sequentielle Gating
Automatisiertes Hämatologie-AnalysatorKommerzieller LieferantAutomatisierter Hämatologie-Analysator, der für die nukleierte Zellkonzentration und Lebensfähigkeitsbewertung verwendet wirdNukleierte Zellkonzentration und Lebensfähigkeitsbewertung
B-ALL Tube 1 anti-CD10-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: HI10a; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test im routinemäßig validierten Panel, es sei denn, die Antikörper-spezifische Titration weicht ab

Referenzen

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  3. Verbeek MWC, Lucio P, Szczepański T. Minimal residual disease assessment in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia by standardized next-generation flow cytometry. eJHaem. 2024;5(2):110–20.
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