Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Herstellung von Verteporfin-integrierten Lipidnanopartikeln, die durch sichtbares Licht oder Röntgenstrahlung aktiviert werden können, um eine räumlich und zeitlich kontrollierte Abgabe von CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinen und chemotherapeutischen Wirkstoffen zu ermöglichen, mit potenziellem Übertragungswert für ophthalmologische und onkologische Anwendungen.
Methodenartikel
Licht- und röntgenaktivierte Liposome für das kontrollierte Gene Editing und die Wirkstofffreisetzung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die photodynamische Therapie (PDT) nutzt die Aktivierung von Photosensibilisatoren zur Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), hauptsächlich von Singulett-Sauerstoff. Neben der direkten Zytotoxizität kann diese Photochemie für die bedarfsgesteuerte Freisetzung von Wirkstoffen aus lipidbasierten Nanotransportsystemen genutzt werden, wodurch eine räumliche und zeitliche Kontrolle über die therapeutische Abgabe erreicht wird, die mit herkömmlichen lipidbasierten Nanopartikeln nicht möglich ist. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Herstellung und Charakterisierung zweier unterschiedlicher, mit Verteporfin (VP) beladener lipidbasierter Nanopartikelformulierungen: (1) lichtgesteuerte Liposomen, bestehend aus DOTAP, DOPE, Cholesterin und VP, zur Abgabe von CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-(RNP)-Komplexen; und (2) röntgenstrahlenaktivierte Liposomen, bestehend aus DOTAP, DOPC, VP und Goldnanopartikeln, zur kontrollierten Freisetzung von Chemotherapeutika. Nach Aktivierung bei 690 nm (sichtbares Licht) oder durch klinische Röntgenstrahlung (6 MeV) erzeugt VP Singulett-Sauerstoff, der ungesättigte Lipidbestandteile oxidiert, die Nanopartikelmembran destabilisiert und die freigesetzten Wirkstoffe freisetzt. Es werden Protokolle für die Liposomenherstellung mittels Dünnschicht-Hydratation und Membranextrusion, für die physikochemische Charakterisierung, die Bewertung der licht- und röntgenstrahleninduzierten Wirkstofffreisetzung, die Gen-Knockout-Analyse in menschlichen Zellen in vitro sowie die in vivo-Validierung mittels eines quantitativen visuellen Reportersystems in Zebrafischembryonen und eines Maus-Xenotransplantat-Tumormodells bereitgestellt. Repräsentative Ergebnisse zeigen einen Knockout von bis zu etwa 326 Langsam-Muskel-Fasern pro Zebrafischembryo durch Lichtaktivierung sowie eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums durch röntgenstrahleninduzierte Doxorubicin-Freisetzung. Die klinische Anwendung von Verteporfin-Aktivierung im Bereich von 689–690 nm am Auge motiviert die Evaluierung dieser Plattform für die ophthalmologische Wirkstoffabgabe, obwohl die Verteilung im Augenhintergrund, die Pharmakokinetik und die Sicherheit an Großtieren noch zu untersuchen sind. Diese Methoden bieten einen experimentellen Ansatz mit translationaler Relevanz für die extern gesteuerte Freisetzung therapeutischer Wirkstoffe.
Einleitung
Lipidnanopartikel (LNPs) haben sich als die klinisch am besten validierte nichtvirale Plattform für die Abgabe nukleinsäurebasierter Therapeutika etabliert, wie ihre Verwendung in mRNA-Impfstoffen gegen COVID-19 zeigt1. Herkömmliche LNPs setzen jedoch ihr Frachtmaterial nach der zellulären Aufnahme durch endosomale Flucht frei und bieten keine externe Kontrolle über Zeitpunkt, Ort oder Ausmaß der Wirkstofffreisetzung2. Das Fehlen einer räumlich-zeitlichen Kontrolle beschränkt ihre Anwendbarkeit in Bereichen, in denen eine präzise, bedarfsgerechte Freisetzung therapeutische Vorteile bietet, wie beispielsweise bei standortspezifischer Genomeditierung, gezielter Chemotherapie in heterogenen Tumoren und dosisgenauer Genstilllegung in anatomisch zugänglichen Organen wie dem Auge3,4.
Die photodynamische Therapie (PDT) bietet einen gut etablierten Mechanismus für extern ausgelöste biologische Effekte. Bei Aktivierung mit bestimmten Wellenlängen erzeugen Photosensibilisatoren Singulett-Sauerstoff (1O2) und andere reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die benachbarte Biomoleküle oxidieren können5. Verteporfin (VP), ein klinisch zugelassenes Benzoporphyrinderivat, das unter dem Handelsnamen Visudyne zur photodynamischen Behandlung der subfovealen choroidalen Neovaskularisation bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) eingesetzt wird, eignet sich besonders gut als Bestandteil von nanopartikulären Photosensibilisatoren6. VP wird klinisch mit 689 nm für die ophthalmologische photodynamische Therapie aktiviert, wodurch eine etablierte Vorgehensweise für die Lichtabgabe ins Auge gegeben ist6,7,8. VP weist bei gewebedurchdringenden Wellenlängen eine etwa viermal höhere photodynamische Aktivität auf als die Photosensibilisatoren der ersten Generation auf Basis von Hämatoporphyrinderivaten6.
Diese duale Funktion, bei der VP gleichzeitig als klinisch zugelassener Photosensibilisator und als lichtempfindlicher Auslöser für die Freisetzung von Nanopartikel-Inhaltsstoffen dient, bildet die mechanistische Grundlage der hier beschriebenen Protokolle. Wenn VP in niedrigen molaren Verhältnissen in die Lipiddoppelschicht eingebaut wird, erzeugt es bei Bestrahlung 1O2, das gemäß früheren Literaturangaben ungesättigte Acylketten von Phospholipiden oxidiert, wodurch die Membran destabilisiert und die eingeschlossenen Inhaltsstoffe freigesetzt werden9. Der kurze Diffusionsradius von 1O2 (~20 nm in biologischen Umgebungen) begrenzt die Membran-Destabilisierung auf die unmittelbare Umgebung des Photosensibilisators und minimiert somit Schäden am Inhalt, während die Doppelschicht effizient gestört wird9,10. Darüber hinaus überwindet die Röntgenaktivierungsmodalität die Beschränkung der Eindringtiefe von sichtbarem Licht. Wenn Gold-Nanopartikel (3–5 nm) gemeinsam in die Lipiddoppelschicht eingebettet sind, verstärkt klinische Röntgenbestrahlung (6 MeV) die Aktivierung von VP durch energieübertragende Auger-Elektronen und erweitert so die Anwendbarkeit auf tiefliegende Tumore11,12. Direkte Messungen von Singulett-Sauerstoff mithilfe von Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) bestätigen, dass die 1O2-Bildung mit der Röntgendosis zunimmt und durch die gleichzeitige Beladung mit Gold-Nanopartikeln im Vergleich zu VP allein etwa 1,4-fach erhöht wird11.
Diese Plattform besitzt eine besondere translationale Relevanz für die ophthalmologische Gentherapie. Aktuelle anti-VEGF-Behandlungen für die neovaskuläre AMD erfordern häufige intravitreale Injektionen, wobei die Ergebnisse in der realen Welt bei chronischer Unterdosierung abnehmen13,14, während neuartige AAV-Gentherapien diese Belastung reduzieren, jedoch konstitutiv anti-VEGF exprimieren15,16 und daher nicht titriert oder abgesetzt werden können – ein Anliegen angesichts des Zusammenhangs zwischen anhaltender VEGF-Suppression und geographischer Atrophie, retinaler Ischämie und Fibrose17,18. Ein lichtgesteuerter, CRISPR-basierter Ansatz unter Verwendung von VP-Liposomen könnte hingegen eine ärztlich kontrollierte, räumlich begrenzte VEGF-A-Ausschaltung ermöglichen und so eine ärztlich steuerbare räumliche und zeitliche Steuerung des initialen Editierereignisses bieten, während die Dauerhaftigkeit der Genbearbeitung erhalten bleibt. Dasselbe Prinzip der ausgelösten Freisetzung lässt sich auf Retinadystrophien mit großen Genen wie die Stargardt-Krankheit (ABCA4)19,20 sowie auf das Uvealmelanom übertragen, wobei die konvergenten Mechanismen von VP gut zur Biologie des Tumors passen21,22.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, umfassende und reproduzierbare Methoden zur Herstellung von mit VP integrierten Lipidnanopartikeln mithilfe zweier unterschiedlicher Formulierungen bereitzustellen – eine wird durch sichtbares Licht (690 nm) aktiviert, die andere durch Röntgenstrahlung – sowie die Wirksamkeit der Abgabe in sowohl in-vitro- als auch in-vivo-Modellsystemen zu bewerten. Da sich diese Formulierungen in ihrer Lipidzusammensetzung, ihrer Strategie zur Beladung mit Wirkstoffen und ihrer Aktivierungsmodalität unterscheiden, werden sie als getrennte Protokolle dargestellt. Dieses Protokoll richtet sich an Forschende, die stimulierte Freisetzungssysteme auf Nanopartikelbasis, PDT-basierte Abgabestrategien, räumlich und zeitlich kontrollierte Genbearbeitung oder lichtaktivierte okulare und onkologische Arzneimittelabgabe untersuchen.
Protokoll
Alle Tierversuche mit Zebrafischen wurden unter Standardbedingungen gemäß Protokollen durchgeführt, die von dem Ausschuss für Tierversuche der Macquarie University genehmigt wurden (ARA: 2015-034). Maus-Xenotransplantat-Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Ausschuss für Tierversuche der Macquarie University (Genehmigungsnummer 2017/001) durchgeführt. Alle Verfahren wurden entsprechend dem Animal Research Act 1985 und der Animal Research Regulation 2010 durchgeführt.
Teil A: Lichtgesteuerte VP-Liposomen für die CRISPR-Cas9-Abgabe (basierend auf Aksoy et al.9)
1. Herstellung von lichtaktivierbaren VP-Liposomen, die CRISPR-Cas9-RNP enthalten
- Lösen Sie DOTAP, DOPE, Cholesterin (Chol) und VP in 500 µL Chloroform im molaren Verhältnis von 1:0,94:1:0,06 in einem runden Glaskolben9.
ACHTUNG: Chloroform ist toxisch und flüchtig. Führen Sie alle Schritte mit Chloroform in einem Abzug unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durch, einschließlich Nitrilhandschuhe und Schutzbrille. - Verdampfen Sie das Chloroform unter einem Argonstrom, bis ein dünner Lipidfilm an der Kolbenwand entsteht.
- Stellen Sie den Kolben über Nacht (≥12 h) unter Vakuum (z. B. in einen Gefriertrockner oder Exsikkator, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist), um das Restlösungsmittel vollständig zu entfernen.
- Bereiten Sie die Hydrationslösung vor, indem Sie sgRNA (endgültige Konzentration 0,01 µM) und Cas9-Protein (endgültige Konzentration 0,1 mg/mL) in 500 µL nukleasefreiem Wasser9 mischen. Inkubieren Sie sgRNA und Cas9 vor der Hydratation 5 min bei Raumtemperatur, um die Bildung des Ribonukleoprotein-(RNP)-Komplexes zu ermöglichen.
HINWEIS: Der RNP-Komplex wird während des Hydratationsschritts eingelagert, nicht nachträglich hinzugefügt. Dadurch wird eine Einschließung im wässrigen Kern des Liposoms gewährleistet. - Hydratisieren Sie den getrockneten Lipidfilm, indem Sie die 500 µL RNP-Lösung direkt auf den Film geben und so lange mischen, bis die Suspension homogen ist. Lassen Sie die hydratisierte Lipidsuspension 2 h bei Raumtemperatur stehen, um eine vollständige Hydratation der Lipide zu ermöglichen.
- Extrudieren Sie die resultierende mehrschichtige Suspension 11-mal durch eine 200-nm-Polycarbonatmembran mit einem Mini-Extruder, um einlagige Liposomen einheitlicher Größe herzustellen9.
HINWEIS: Als Verfahren zur Größenreduktion wird die Extrusion und nicht die Beschallung verwendet. Führen Sie eine ungerade Anzahl von Durchgängen (11) durch, um sicherzustellen, dass das Endprodukt auf der gegenüberliegenden Seite der Membran vom Ausgangsmaterial liegt, wodurch Kontaminationen mit nicht extrudierten Vesikeln reduziert werden. - Lagern Sie die VP-Liposomen bei 4 °C, lichtgeschützt. Verwenden Sie sie innerhalb von 48 h nach der Herstellung für optimale Aktivität. Diese 48-Stunden-Nutzdauer ist konservativ festgelegt: Die Freisetzung von VP bleibt über 96 h in 10 % FBS unter 3 %9.
HINWEIS: Für in-vitro- und in-vivo-Anwendungen bereiten Sie die Liposomen unter Verwendung standardmäßiger aseptischer Techniken vor und sterilisieren Sie die endgültige Suspension vor der Anwendung durch Filtration durch einen 0,22-µm-Filter.
2. Physikochemische Charakterisierung von VP-Liposomen
- Verdünnen Sie die Liposomensuspension 1:100 in nukleasefreiem Wasser. Messen Sie den hydrodynamischen Durchmesser, den Polydispersitätsindex (PDI) und das Zetapotential mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS). Führen Sie alle DLS-Messungen dreifach pro Probe durch (n = 3 technische Wiederholungen) und geben Sie die Werte als Mittelwert ± Standardabweichung an.
ANMERKUNG: Erwartete Eigenschaften einer erfolgreichen Formulierung aus Teil A sind ein hydrodynamischer Durchmesser von 167,5 ± 1,9 nm, PDI < 0,3, ein Zetapotential von +28 ± 1,1 mV und eine Cas9-Einschlusswirkung von etwa 75,09 %. Repräsentative physikochemische Eigenschaften erfolgreicher Formulierungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.9 - Für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) geben Sie 10 µL der verdünnten Liposomensuspension auf ein mit Kohlenstoff beschichtetes Kupfergitter. Färben Sie mit 2 % Uranylacetat für 20 s. Bildaufnahme bei 100 kV9, wobei mindestens 10 repräsentative Bilder pro Charge aufgenommen werden.
| Parameter | Teil A: VP-Liposom (lichtinduziert) | Teil B: VP/AuNP-Liposom (Röntgenstrahlen-aktiviert) | |||
| Hydrodynamischer Durchmesser | 167,5 ± 1,9 nm | ~100–150 nm | |||
| Polydispersitätsindex (PDI) | <0.3 | < 0,3 (typisch) | |||
| Zetapotential | +28 ± 1,1 mV | Positiv (auf DOTAP-Basis) | |||
| Einschlusswirkungsgrad | Cas9 RNP: 75,09 % | Doxorubicin: ferngesteuertes Laden mit Ammoniumsulfat; quantifiziert nach Lyse mit 0,1 % Triton X-100 | |||
| Beladung mit Gold-Nanopartikeln | Nicht zutreffend | 156 ± 24 AuNPs pro Liposom (ICP-MS) | |||
| Stabilität der Frachtfreisetzung | <3 % VP-Freisetzung über 96 h in 10 % FBS | Stabil über 48 h bei 0 %, 10 %, 25 % und 50 % FBS sowie bei pH 7,4, 6,0 und 5,0 | |||
| Aktivierungsbedingung | 690 nm, 0,15 mW/cm² LED-Bestrahlung | 6-MeV-klinische Röntgenstrahlenbestrahlung | |||
| Primärfracht | CRISPR-Cas9-RNP-Komplex | Doxorubicin | |||
| Aktivierungsmodalität | Sichtbares Licht | Röntgenstrahlung | |||
| Beabsichtigte Anwendung | Ausgelöste Genomeditierung | Gezielte Freisetzung von Chemotherapeutika | |||
Tabelle 1: Physikochemische Charakterisierungskriterien und Stabilitätsprofile der beiden Verteporfin (VP)-Liposomformulierungen. Repräsentative Formulierungsmerkmale, Ladeparameter, Stabilitätsprofile und Aktivierungsbedingungen für die lichtgesteuerte VP-Liposomformulierung (Teil A) und die Röntgenstrahlen-gesteuerte VP/AuNP-Liposomformulierung (Teil B). Diese Werte liefern erwartete Qualitätskontrollkriterien für die erfolgreiche Herstellung und Charakterisierung der Formulierungen und können als Referenzstandards verwendet werden, wenn die hier beschriebenen Protokolle reproduziert werden.
3. Lichtinduzierte Freisetzung von Fracht und Messung von Singulett-Sauerstoff
- Stellen Sie für lichtgesteuerte Freisetzungsassays VP-Liposomen mit der gleichen Lipidformulierung und Hydratations-/Extrusionsprotokoll her. Geben Sie 100 µL der Liposomensuspension in PBS in eine Dialysevorrichtung, die in 12 mL PBS bei 80 rpm gerührt wird.
- Bestrahlen Sie die Proben mit einer 690 nm LED-Lichtquelle bei 0,15 mW/cm2 für definierte Intervalle (2, 4 und 6 min)9.
- Entnehmen Sie Proben des äußeren Dialysats nach 0, 1, 3, 6 und 24 h und quantifizieren Sie das freigesetzte VP mittels Fluoreszenz; ermitteln Sie die Gesamtmenge an VP durch Lyse eines äquivalenten Aliquots mit 0,1 % Triton X-100.
- Berechnen Sie die VP-Freisetzung als Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100, wobei Ft, F0 und Fmax die Fluoreszenzwerte zum Zeitpunkt t, den Ausgangswert und den Wert nach Triton-Lyse angeben (n = 3).
- Bestätigen Sie die Membraninstabilität durch Messung der Änderung des hydrodynamischen Durchmessers mittels DLS vor und nach der Bestrahlung.
HINWEIS: Schützen Sie alle Proben, die VP enthalten, während der Vorbereitung und Lagerung vor Umgebungslicht. Verwenden Sie braune Röhrchen oder Aluminiumfolie zum Abdecken.
4. In-vitro-Transfektion und Gen-Knockout-Assay
- Säen Sie HEK293-GFP-Zellen (oder eine entsprechende Reporterlinie) in 96-Well-Platten mit einer Dichte aus, die zu einem Zeitpunkt der Behandlung einer Konfluenz von etwa 70 % entspricht. Kultivieren Sie die Zellen in komplettem Medium (DMEM + 10 % FBS + 1 % Penicillin-Streptomycin) bei 37 °C und 5 % CO₂2.
- Geben Sie VP-Liposomen, die anti-GFP-sgRNA/Cas9-RNP enthalten, in die Vertiefungen ein, sodass eine Endkonzentration von 50 µg/mL erreicht wird. Für die Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie inkubieren Sie 2 h; für die Analyse mittels Durchflusszytometrie inkubieren Sie 1 h.
- Ersetzen Sie das Medium durch frisches, komplettes Medium. Bestrahlen Sie die behandelten Mulden mit 690 nm LED-Licht bei 0,15 mW/cm². Für die Fluoreszenzmikroskopie-Analyse bestrahlen Sie 2, 4 oder 6 Minuten lang; für die Durchflusszytometrie-Analyse bestrahlen Sie 4 Minuten lang. Führen Sie dunkle Kontrollen (Liposomen ohne Bestrahlung) und Licht-allein-Kontrollen (Bestrahlung ohne Liposomen) mit.
- Beurteilen Sie den GFP-Knockout 48 h nach der Behandlung mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie.
HINWEIS: Leit-RNAs sollten vor der Verwendung validiert werden. In der Originalstudie wurden Kandidaten-egfp-Leitsequenzen mittels Restriktionslängenpolymorphismus-Analyse (RFLP) auf ihre Schneideffizienz geprüft, wobei die ausgewählte Leitsequenz (sg_eGFP_06) eine Schnittwirkung von 88,24 % erreichte. Das Off-Target-Risiko wurde mittels In-silico-Analyse minimiert, indem die Einzigartigkeit der Leitsequenz bestätigt wurde (BLASTN gegen das Referenzgenom unter Verwendung von Bowtie/Bowtie2, wobei in den ersten zehn 3’-Basen keine Mismatches toleriert wurden). Eine genomweite Off-Target-Sequenzierung wurde nicht durchgeführt und wird für therapeutische Anwendungen empfohlen.9. - Um die Einschlusswirkung zu messen, zentrifugieren Sie eine Liposomenprobe bei 15.000 U/min für 1 h bei 4 °C, gefolgt von einer Filtration des Überstandes durch einen 20 nm Whatman Anotop 10 Spritzenfilter.
- Quantifizieren Sie freies (nicht eingeschlossenes) Cas9 im Filtrat mittels BCA-Protein-Assay.
- Berechnen Sie die Einschlusswirkung als EE (%) = [(Ctot − Csup) / Ctot] × 100, wobei Ctot ist die gesamte hinzugefügte Cas9 und Csup wird das nicht verkapselte Cas9 im Überstand gewonnen. Siehe Tabelle 1 für repräsentative Leistungskennzahlen der Formulierung und erwartete Einschließungseffizienzen.
5. In-vivo-Validierung: Zebrafisch-Visuell-Berichter-Assay
- Stellen Sie die Injektions-MasterMix durch Kombination von VP-Liposomen, die eGFP-zielgerichtete sgRNA und Cas9-Protein in den im ursprünglichen Protokoll angegebenen Verhältnissen enthalten, her9. Die endgültige 8 µL MasterMix enthält 3,5 µL sgRNA (75 ng/µL), 1,0 µL Cas9-Protein (500 ng/µL), 2,5 µL VP-Liposomen und 1,0 µL Phenolrot. Für die Kontroll-MasterMix ersetzen Sie die Liposomen durch 2,5 µL nukleasefreies Wasser.
- Injizieren Sie mit einem kalibrierten Mikroinjektionssystem 2 nL der MasterMix in die Zelle (nicht in das Eiweiß) von Ein-Zell-Stadium-Zebrafischembryonen9.
ACHTUNG: Führen Sie alle Arbeiten mit Zebrafischen gemäß genehmigter Tierversuchsethikprotokolle durch. Handhaben Sie die Embryonen vorsichtig, um mechanische Schäden während der Injektion zu minimieren. - Beleuchten Sie die injizierten Embryonen 2 Stunden nach der Befruchtung (hpf) mit 690 nm LED-Licht bei 0,15 mW/cm2 für definierte Zeiträume (z. B. 0, 1, 2 und 5 min), um die Freisetzung des Cargos zu aktivieren9.
- Betäuben Sie die Embryonen nach 72 hpf in Tricaine und montieren Sie sie in 1 %igen Low-Melting-Point-Agarose. Quantifizieren Sie anhand der smyhc1:eGFP-transgenen Reportersorte den Knockout der langsamen Muskelfasern als Verlust der eGFP-Fluoreszenz mittels eines invertierten Fluoreszenzmikroskops und eines konfokalen Mikroskops.
- Erstellen Sie fokusgestapelte Bilder und zählen Sie die eGFP-negativen (knockout) langsamen Muskelfasern pro Embryo, wobei typischerweise 16 Embryonen pro Gruppe analysiert werden (z. B. in Imaris)9.
HINWEIS: Dieser Test liefert einen quantitativen, visuellen Nachweis der Knockout-Effizienz. In der smyhc1:eGFP-Reportersorte sind die langsamen Muskelfasern normalerweise eGFP-positiv; ein erfolgreicher Knockout wird als Verlust der eGFP-Fluoreszenz in diesen Fasern bewertet9.
Teil B: Röntgenstrahlen-aktivierbare VP-Liposomen für die Chemotherapeutikaabgabe (basierend auf Deng et al.11)
6. Herstellung von röntgenstrahlenaktivierten VP/AuNP-Liposomen, beladen mit Doxorubicin
- Kombinieren Sie 350 µL DOTAP (100 mg/mL in Chloroform) und 370 µL DOPC (100 mg/mL in Chloroform) in einem Glasrundkolben und ergänzen Sie mit Chloroform auf ein Gesamtvolumen von 1,0 mL11.
ANMERKUNG: In Teil B wird DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin), nicht DOPE, verwendet. Die beiden Formulierungen unterscheiden sich in ihrem Hilfslipid, und dieser Unterschied ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit. - Geben Sie 50 µL VP (2,3 mg/mL in DMSO) und 40 µL einer Gold-Nanopartikelsuspension (3–5 nm Durchmesser) zur Lipidmischung hinzu. Dies ergibt etwa 156 ± 24 Gold-Nanopartikel pro Liposom, quantifiziert mittels ICP-MS11.
ANMERKUNG: Die Gold-Nanopartikel müssen einen Durchmesser von 3–5 nm aufweisen, um in die Lipiddoppelschicht eingebettet werden zu können. Größere Partikel (z. B. 50 nm) integrieren sich nicht in die Membran und vermitteln nicht den für die Röntgenaktivierung erforderlichen Auger-Elektronenenergietransfer11.
ANMERKUNG: Die hier beschriebene Basisformulierung ist nicht gezielt. In der Originalstudie wurde eine optionale Modifikation zur aktiven Zielgerichtetheit durch Post-Insertion von DSPE-PEG2000-Folat eingeführt, um die Liposome gezielt zu Tumorzellen mit Folsäurerezeptor-Expression zu leiten; dieser Schritt kann hinzugefügt werden, ohne den Kernmechanismus der VP/AuNP-Freisetzung zu verändern11. - Verdampfen Sie das Chloroform unter Argon und trocknen Sie über Nacht im Vakuum, wie in den Schritten 1.2–1.3 beschrieben.
- Hydratisieren Sie den Lipidfilm mit 1,0 mL 250 mM Ammoniumsulfat-Puffer (pH 5,5). Vortexen Sie die Probe, lassen Sie die hydratisierte Suspension über Nacht stehen und extrudieren Sie diese 11-mal durch eine 200 nm Polycarbonatmembran11.
- Entfernen Sie freies Ammoniumsulfat durch Dialyse gegen PBS (pH 7,4) bei 4 °C mit vier Pufferwechseln, um einen transmembranären Ammoniumsulfat-Gradienten aufzubauen.
- Laden Sie Doxorubicin (Dox) ein, indem Sie die dialysierten Liposome bei einem Wirkstoff-zu-Lipid-Massenverhältnis von 1:10 für 1 h bei 60 °C inkubieren11. Der Ammoniumsulfat-Gradient bewirkt die Anreicherung von Dox im Inneren der Liposome.
- Entfernen Sie nicht eingeschlossenes Dox durch Dialyse gegen PBS bei 4 °C mit vier Pufferwechseln.
- Charakterisieren Sie die beladenen Liposome mittels DLS (erwartete Größe: ~100–150 nm) und messen Sie die Einschlusswirkung durch Lyse der Liposome mit 0,1 % Triton X-100 und Quantifizierung der Dox-Fluoreszenz (Anregung bei 485 nm, Emission bei 590 nm).
ANMERKUNG: Erfolgreiche Formulierungen aus Teil B weisen typischerweise einen hydrodynamischen Durchmesser von etwa 100–150 nm, einen PDI < 0,3 und eine Einbindung von etwa 156 ± 24 Gold-Nanopartikeln pro Liposom auf. Repräsentative physikochemische Eigenschaften sind in Tabelle 1 zusammengefasst.11
7. Röntgenstrahleninduzierte Arzneimittelfreisetzung und zelluläre Toxizität in vitro
- Bestrahlen Sie kalzienbeladene VP/AuNP-Liposomen unter Verwendung eines klinischen Linearbeschleunigers (6-MeV-Photonenstrahl) mit definierten Dosen (1, 2 und 4 Gy)11. Quantifizieren Sie die Freisetzung des Frachtmaterials durch Messung der Kalzienfluoreszenz (Anregung bei 485 nm, Emission bei 510 nm) und ermitteln Sie die Gesamtfreisetzung nach Zerstörung mit 0,1 % Triton X-100."
- Für Zytotoxizitätsassays säen Sie HCT116-Menschliche Darmkrebszellen in 96-Well-Platten aus (z. B. 2 × 104 Zellen/mL in 10 % FBS).
- Behandeln Sie die Zellen mit Doxorubicin-beladenen VP/AuNP-Liposomen und bestrahlen Sie sie wie oben beschrieben mit Röntgenstrahlen, einschließlich Kontrollen mit nur LipoDox, nur Röntgenstrahlung und unbehandelten Zellen. Bewerten Sie die Zellviabilität mittels MTS-Assay 0, 2, 4 und 24 h nach der Bestrahlung mit 4 Gy11.
8. In-vivo-Validierung: Maus-Xenotransplantat-Tumormodell
- Injizieren Sie 6–7 Wochen alte weibliche BALB/c-Nacktmäuse subkutan in die Flanke mit 5 × 106 HCT116-Zellen in 100 µL serumfreiem McCoy’s 5A-Medium11.
- Wenn die Tumore ein Volumen von etwa 100 mm3 erreichen, injizieren Sie Dox-beladene VP/AuNP-Liposomen (10 mg/kg Dox-Äquivalent) intratumoral in einem Volumen von 20 µL11.
- 24 Stunden nach der Injektion bestrahlen Sie die Tumore mit 4 Gy Röntgenstrahlung (6 MeV) unter Verwendung eines klinischen Linearbeschleunigers und geeigneter Abschirmung des nicht betroffenen Gewebes.
- Überwachen Sie das Tumorvolumen alle zwei Tage mithilfe digitaler Messschieber. Berechnen Sie das Tumorvolumen nach der Formel V = (π/6) × L × W2, wobei L die längste Ausdehnung und W die senkrecht dazu verlaufende Breite ist11.
- Zum experimentellen Versuchsende entnehmen Sie die Tumore, fixieren sie in 10 % neutralpufferter Formalinlösung und stellen 6 µm dicke Kryoschnitte für die histologische Analyse (H&E-Färbung)11 her.
9. Statistische Analyse
- Quantitative Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben, sofern nicht anders angegeben.
- Statistische Analysen für die Zebrafisch-Gen-Knockout-Studien wurden mittels einfaktorieller ANOVA durchgeführt, während Vergleiche zwischen zwei Gruppen mit einem zweiseitigen Student-t-Test analysiert wurden. t-Test, wie in den Quellenstudien berichtet. Statistische Signifikanz wurde definiert als p < 0.05.
- Für die Röntgenstrahlen-aktivierten Liposomen-Studien wurden Tumorwachstum, Körpergewicht, Freisetzung des Inhaltsstoffes und histologische Datensätze mit dem Student's t-Test analysiert. t-Tests, wie in der ursprünglichen Veröffentlichung beschrieben.
- Die Definition von n für jedes Experiment ist in den entsprechenden Abbildungserläuterungen angegeben.
- Die statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism Version 7.0 (GraphPad Software) durchgeführt.
HINWEIS: Dieses Protokoll reproduziert experimentelle Arbeitsabläufe und repräsentative Datensätze aus zuvor veröffentlichten Studien. Leser sollten gegebenenfalls die ursprünglichen Publikationen konsultieren, um vollständige Details zur statistischen Analyse zu erhalten.9,11.
Ergebnisse
Lichtgesteuerte Genomeditierung (Teil A):
Gemäß dem Protokoll von Teil A zeigten VP-Liposomen, die CRISPR-Cas9-RNP eingeschlossen hatten, eine lichtabhängige Freisetzung des Inhaltsstoffes. Unter Dunkelbedingungen wurde eine minimale Freisetzung beobachtet, während Bestrahlung bei 690 nm (0,15 mW/cm2) eine dosisabhängige Freisetzung hervorrief, die mit der Beleuchtungsdauer zunahm (Abbildung 1A)9. Der Zebrafisch-eGFP-Reporter-Assay lieferte eine quantitative visuelle Auswertung der Gen-Knockout-Effizienz. Lichtaktivierte Embryonen zeigten einen Knockout von 308,37 ± 40,21 eGFP-positiven langsamen Muskel-Fasern pro Embryo im Vergleich zu 53,15 ± 35,38 Fasern in dunklen Kontrollen (n = 80), der nach 5-minütiger Bestrahlung auf 326,12 ± 36,55 Fasern anstieg (n = 60) (Abbildung 1B,C)9. In vitro erzielten lichtaktivierte VP-Liposomen eine GFP-Reduktion, die vergleichbar war mit der von Lipofectamine 2000 (ca. 53 % gegenüber 50 % Reduktion), und boten dabei einzigartig lichtgesteuerte räumliche und zeitliche Kontrolle (Abbildung 1C)9. Diese Ergebnisse demonstrieren eine räumliche und zeitliche Kontrolle, da dieselbe Nanopartikel-Formulierung je nach Lichtexposition deutlich unterschiedliche Knockout-Effizienzen ergab (Abbildung 1A–C).
Abbildung 1. Lichtinduzierte Abgabe von CRISPR-Cas9 und räumlich-zeitliche Gen-Knockouts in Zebrafischembryonen. (A) Schematische Darstellung von Verteporfin (VP)-Liposomen (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06), die Cas9/sgRNA-Ribonukleoprotein-(RNP)-Komplexe einschließen. Bei Bestrahlung mit Licht der Wellenlänge 690 nm erzeugt VP reaktive Sauerstoffspezies, die die liposomale Membran destabilisieren und die intrazelluläre Freisetzung der CRISPR-Cas9-Ladung auslösen. (B) Repräsentative Fluoreszenzbilder von smyhc1:eGFP-Zebrafischembryonen 72 Stunden nach der Befruchtung (hpf) nach Behandlung mit VP-Liposomen und zunehmender Lichtexpositionszeit (0, 1, 2 und 5 min; 690 nm, 0,15 mW/cm2). Der Verlust der eGFP-Fluoreszenz weist auf einen Knockout der langsamen Muskel-Fasern hin. Die Einlegetafeln zeigen vergrößerte Ansichten der markierten Bereiche. (C) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität und der Anzahl der ausgeschalteten langsamen Muskel-Fasern pro Embryo, was die lichtabhängige Aktivierung von CRISPR-Cas9 und den Gen-Knockout belegt. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die Experimente an Zebrafischen wurden mittels einfaktorieller ANOVA analysiert (n = 80 Embryonen für die Fluoreszenzintensitätsmessung und n = 60 Embryonen für die Faseranzahl-Analyse; p < 0,0001). Die Validierungsexperimente an HEK293-GFP-Zellen wurden mit einem zweiseitigen t-Test ausgewertet (n = 4). Maßstabsbalken = 500 µm (Übersichtsbilder) und 100 µm (vergrößerte Bilder). Übernommen mit Genehmigung von Aksoy et al.9 Copyright © 2020 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Suboptimale Ergebnisse im Zebrafisch-Assay können Folgendes umfassen: (a) weniger als 50 gestörte Fasern pro Embryo, was auf eine schlechte Liposomqualität, unzureichende Cas9-Aktivität oder eine suboptimale Lichtdosis hindeutet; (b) eine Embryomortalität von über 20 %, was auf mechanische Schäden während der Mikroinjektion oder eine übermäßige VP-Phototoxizität hindeutet; oder (c) gestörte Fasern in nicht bestrahlten Kontrollen, was auf ein vorzeitiges Austreten der Fracht aus der Liposomformulierung hindeutet.
Röntgenstrahlenausgelöste Arzneimittelfreisetzung (Teil B):
VP/AuNP-Liposomen, die gemäß dem Protokoll aus Teil B hergestellt wurden, zeigten eine dosisabhängige Freisetzung von Calcein über 1–4 Gy hinweg (Abbildung 2A,B)11. Im HCT116-Xenotransplantatmodell zeigten Mäuse, die Dox-beladene VP/AuNP-Liposomen sowie anschließend eine 4-Gy-Röntgenbestrahlung erhielten, eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zu freiem Dox, alleiniger Röntgenbestrahlung und nicht bestrahlten Liposomenkontrollen (Abbildung 2C)11. Die histologische Analyse von Tumorproben ergab größere nekrotische Bereiche in der Gruppe mit Kombinationsbehandlung, wie mittels H&E-Färbung beurteilt (Abbildung 2D).
Abbildung 2. Röntgenstrahleninduzierte Doxorubicin-Freisetzung und Hemmung des Tumorwachstums. (A) Schematische Darstellung von Verteporfin (VP)/Gold-Nanopartikel (AuNP)-integrierten Liposomen, die Doxorubicin (Dox) enthalten. Die Exposition gegenüber Röntgenstrahlung aktiviert VP durch energieübertragungsvermittelte AuNPs, wodurch Singulett-Sauerstoff erzeugt wird, der die Lipiddoppelschicht destabilisiert und die Freisetzung des Inhalts auslöst. (B) Calcein-Freisetzungsprofile aus Liposomen nach Exposition gegenüber steigenden Röntgendosen (0–4 Gy), die eine dosisabhängige Freisetzung aus VP/AuNP-Liposomen zeigen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung aus vier Messungen dar. (C) Tumorvolumen (links) und Körpergewicht (rechts) bei HCT116-Xenotransplantat-tragenden Mäusen, die mit PBS, LipoDox, alleiniger Röntgenbestrahlung oder röntgenstrahleninduziertem LipoDox behandelt wurden. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt (n = 4 Mäuse pro Gruppe). Die statistische Signifikanz wurde mittels t-Test bewertet (P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001). (D) Repräsentative mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbte Tumorquerschnitte und morphometrische Analyse der mittleren nekrotischen Tumorfläche. Pfeile markieren repräsentative nekrotische Bereiche. Boxplots zeigen Median und Interquartilabstand, wobei die Whisker bis 1,5 × IQR reichen. Die Daten wurden mittels t-Test analysiert (n = 5). Maßstabsbalken = 50 µm. Übernommen und angepasst von Deng et al.11 gemäß den Bedingungen der Creative Commons Attribution 4.0 International License. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Suboptimale Ergebnisse im Xenotransplantatmodell können Folgendes umfassen: (a) keinen Unterschied im Tumorwachstum zwischen bestrahlten und nicht bestrahlten Liposomgruppen, was auf eine unzureichende, von VP vermittelte Freisetzung oder eine ungenügende Einbindung von Gold-Nanopartikeln hindeutet; oder (b) systemische Toxizität (Gewichtsverlust > 15 %), was auf ein Austreten von Dox aus den Liposomen vor der Röntgenaktivierung schließen lässt.
Diskussion
Mehrere Schritte in diesen Protokollen sind entscheidend für den Erfolg. In Teil A muss das molare Lipidverhältnis (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06) genau eingehalten werden, da die VP-Konzentration direkt die Intensität der 1O2-Erzeugung und damit die Effizienz der Frachtfreisetzung bestimmt9. Die Beladung des Cas9/sgRNA-RNP während des Hydratisierungsschritts, anstelle einer nachträglichen Komplexbildung, ist unerlässlich für die Einschließung in den wässrigen Kern. Die Extrusion durch eine 200 nm Polycarbonatmembran (11 Durchgänge) erzeugt gleichmäßige unilamellare Vesikel; eine Ultraschallbehandlung sollte nicht verwendet werden, da sie das Cas9-Protein denaturieren könnte. Für Teil B ist die Größe der Gold-Nanopartikel (3–5 nm) entscheidend, da die Partikel klein genug sein müssen, um in der Lipiddoppelschicht eingebettet zu sein, um unter Röntgenbestrahlung eine effektive, durch Auger-Elektronen vermittelte Energietransferierung an VP zu ermöglichen11. Die zum Einbringen von Dox verwendete Ammoniumsulfat-Gradientenmethode erfordert eine vollständige Dialyse des äußeren Ammoniumsulfats vor der Zugabe des Wirkstoffs; eine unvollständige Dialyse verringert die Beladeffizienz.
Die Lipidzusammensetzung kann für verschiedene Anwendungen angepasst werden, während der VP-vermittelte Freisetzungsmechanismus erhalten bleibt. Beispielsweise kann der Austausch eines Teils von DOTAP durch ein PEGyliertes Lipid (z. B. DSPE-PEG2000 bei 5 mol%) die Zirkulationszeit bei systemischer Applikation verbessern, wobei dies die positive Oberflächenladung verringert und die zelluläre Aufnahme in vitro möglicherweise reduziert2. Falls DLS-Messungen einen PDI > 0,3 zeigen, erhöhen Sie die Anzahl der Extrusionsdurchläufe oder überprüfen Sie die Membranintegrität. Falls trotz korrekter VP-Inkorporation eine geringe Singulett-Sauerstoff-Generierung auftritt, überprüfen Sie die Wellenlänge und Leistungsdichte der LED-Lichtquelle mit einem kalibrierten Leistungsmesser, da die VP-Aktivierung wellenlängenspezifisch ist (maximale Anregung bei 425 nm für das Soret-Band und therapeutische Aktivierung bei 689–690 nm für das Q-Band)9. Bei dem Zebrafisch-Assay: Falls die Embryonalsterblichkeit in behandelten Gruppen 20 % übersteigt, reduzieren Sie das Injektionsvolumen oder die Liposomenkonzentration, um die VP-assoziierte Phototoxizität zu minimieren. Ein strukturiertes Fehlersuchschema, abgestimmt auf die Referenzwerte in Tabelle 1, lautet wie folgt: PDI > 0,3: Erhöhen Sie die Anzahl der Extrusionsdurchläufe und überprüfen Sie die Membranintegrität. Geringe oder fehlende ausgelöste Freisetzung trotz korrekter VP-Inkorporation: Bestätigen Sie die 690-nm-Ausgangsleistung mit einem kalibrierten Leistungsmesser und überprüfen Sie das molare VP-Verhältnis. Weniger als etwa 50 knock-out-slow-Muskel-Fasern pro Embryo: Stellen Sie die Liposomen erneut her, bestätigen Sie die RNP-Aktivität oder verlängern Sie die Bestrahlungszeit. Verlust des eGFP-Signals in unbehandelten Kontrollen: Überprüfen Sie die Lagerbedingungen, indem Sie die Liposomen innerhalb von 48 Stunden nach der Herstellung verwenden und bei 4 °C im Dunkeln lagern, und bestätigen Sie die Membranstabilität. Im Xenotransplantatmodell deutet kein Unterschied zwischen bestrahlten und nicht bestrahlten Liposomengruppen darauf hin, dass die Einbettung von 3–5 nm großen Gold-Nanopartikeln sowie die applizierte Röntgendosis überprüft werden müssen.
Die primäre Einschränkung der lichtgesteuerten Modalität (Teil A) ist die Eindringtiefe von 690 nm-Licht, die eine direkte Aktivierung auf oberflächlich zugängliche Gewebe oder solche beschränkt, die einer Lichtabgabe mittels Lichtleitfaser zugänglich sind5. Die röntgenstrahleninduzierte Modalität (Teil B) überwindet diese Tiefenbeschränkung, erfordert jedoch den Zugang zu einem klinischen Linearbeschleuniger und führt zu einer Exposition des umgebenden Gewebes gegenüber ionisierender Strahlung, wenn auch in therapeutischen Dosen11,12. Beide Formulierungen basieren derzeit auf DOTAP, einem kationischen Lipid, das mit einer dosisabhängigen Zytotoxizität assoziiert ist und das therapeutische Fenster für eine systemische Applikation möglicherweise einschränken könnte2. Die vorübergehende Natur der RNP-vermittelten Genbearbeitung ist aus Sicherheitsgründen vorteilhaft, bedeutet jedoch, dass eine unvollständige Knockout-Wirkung in einer Zielzellpopulation nicht durch wiederholte Applikation an derselben Stelle verstärkt werden kann, ohne die Nanopartikel erneut zu verabreichen. Zudem wurden diese Protokolle bisher nur in Zelllinien und Kleintiermodellen validiert; die Übertragung auf größere Tiermodelle und letztlich auf die klinische Anwendung beim Menschen wird eine Optimierung der Formulierung, pharmakokinetische Untersuchungen sowie eine formale toxikologische Bewertung unter GLP-Bedingungen erfordern. Insbesondere enthält dieses Protokoll keine Daten zur Pharmakokinetik, Biodistribution oder Netzhautpenetration. Obwohl die Lichtdurchlässigkeit durch okulare und andere Gewebe in der Literatur gut charakterisiert ist und von Wellenlänge, Pigmentierung und Gewebetyp abhängt (und durch optische Klärungsmittel verbessert werden kann), sind quantitative Studien zur Pharmakokinetik, Biodistribution und Netzhautabgabe weiterhin wichtige nächste Schritte, bevor translationsrelevante Aussagen fundiert werden können.
Konventionelle LNP-Systeme, einschließlich derer, die in mRNA-Impfstoffen verwendet werden, setzen ihre Fracht passiv nach zellulärer Aufnahme durch endosomale Flucht frei und bieten keine zeitliche oder räumliche Kontrolle über die Abgabe1,2. Virale Vektoren wie AAV ermöglichen eine effiziente Gentransfer, sind jedoch durch die Verpackungskapazität (~4,7 kb), Immunogenität bei erneuter Gabe und konstitutive Transgenexpression begrenzt, die nach der Verabreichung nicht moduliert werden kann3. Die VP-Liposom-Plattform behebt diese Einschränkungen, indem sie einen extern steuerbaren Freisetzungsmechanismus bereitstellt, der unabhängig von der Art der Fracht ist, mit großen Lasten (Proteine, RNP-Komplexe und kleine Moleküle) kompatibel ist und nicht-viral sowie potenziell mit wiederholter Verabreichung vereinbar ist, vorbehaltlich von Immunogenitäts- und Toxizitätsstudien bei Mehrfachdosierung. Im Gegensatz zu optogenetischen oder thermoresponsiven Systemen nutzt der VP-basierte Ansatz einen klinisch zugelassenen Photosensibilisator mit etablierten Sicherheitsdaten und bestehender klinischer Laserinfrastruktur, insbesondere in der Augenheilkunde, wo der 689 nm Visudyne-Laser bereits Standardausrüstung ist6. Sang et al. zeigten zudem, dass lipid-polymer-hybride Nanopartikel mit VP die Wirksamkeit der strahlenverstärkten Therapie in Modellen des kolorektalen Karzinoms verbessern und damit die Anpassungsfähigkeit der VP-vermittelten ROS-Generierung über verschiedene Nanopartikelarchitekturen hinweg bestätigen12.
Die hier beschriebenen Methoden sind besonders relevant für drei ophthalmologische Erkrankungen. Bei der neovaskulären AMD stellt die Belastung durch Anti-VEGF-Injektionen weiterhin eine entscheidende Hürde für optimale Behandlungsergebnisse dar. Registrierungsdaten aus der Realwelt zeigen eine deutliche Unterversorgung im Vergleich zu klinischen Studienprotokollen (im ersten Jahr durchschnittlich 7,3 statt 12 Injektionen, wobei 38,8 % der Patienten die Therapie abbrechen und nur minimale Verbesserungen der Sehschärfe erzielt werden)14 sowie einen langfristigen Sehverlust trotz häufiger Dosierung23. AAV-Gen-Therapien, die entwickelt wurden, um diese Belastung zu verringern – wie ixoberogene soroparvovec15, ABBV-RGX-31416 und der mit RMAT-Status ausgezeichnete Wirkstoff 4D-150 (83 % weniger Injektionen)24 –, exprimieren Anti-VEGF-Transgene konstitutiv und können weder dosiert noch abgesetzt werden. Dies ist besorgniserregend angesichts von Hinweisen darauf, dass eine kontinuierliche VEGF-Suppression mit geografischer Atrophie assoziiert ist (CATT17; eine Metaanalyse mit 4.609 Augen18; und eine Zunahme der Atrophieprävalenz auf 78,3 % über acht Jahre25). Ein lichtgesteuerter VP-Liposom-System, das CRISPR-Cas9 zur gezielten VEGF-A-Genunterdrückung transportiert, könnte stattdessen eine räumlich begrenzte Gen-Knockout ermöglichen und dabei eine klinikerseitig kontrollierbare räumliche und zeitliche Steuerung des initialen Editierereignisses erlauben, während die Dauerhaftigkeit der Genbearbeitung erhalten bleibt. Präklinische Studien belegen die Durchführbarkeit dieses Ansatzes. Die kooperative Verabreichung von Cas9-mRNA und sgRNA, die auf VEGFA abzielen, mittels LNP reduzierte die laserinduzierte choroidale Neovaskularisation (CNV) bei Mäusen26, PEG-variante LNPs ermöglichten die Genomeditierung im retinalen Pigmentepithel (RPE)27, und peptidgeführte LNPs transportierten mRNA zu Photorezeptoren bei nichtmenschlichen Primaten28. Bis Anfang 2026 ist jedoch noch keine auf LNPs basierende retinale Gentherapie in klinische Studien eingetreten29, was die translative Chance unterstreicht. Bei der Stargardt-Krankheit übersteigt die etwa 6,8 kb lange kodierende Sequenz von ABCA4 die Verpackungskapazität von AAV, wodurch duale Vektorstrategien mit reduzierter Transduktionseffizienz erforderlich werden19. Klinische Kandidaten umfassen die Dual-AAV-Plattformen SB-007 und VG80130 sowie die genunabhängige Modifikationstherapie OCU410ST31. Die nichtvirale Nukleinsäureabgabe kann die Verpackungsbeschränkungen von AAV umgehen. PEG-ECO-Nanopartikel, die ein ABCA4-Plasmid tragen, verringerten die A2E-Akkumulation bei Abca4-/--Mäusen20, während separate Studien die Abgabe großer retinaler DNA-Konstrukte32 und die LNP-vermittelte mRNA-Expression in okularen Geweben33 demonstrierten. Da eine lokalisierte Behandlung der Makula und Fovea ausreicht, um das zentrale Sehvermögen zu erhalten, eignen sich VP-Liposomen besonders gut, um hohe Konzentrationen von Gentherapeutika gezielt in diese Regionen zu liefern. Bei dem uvealen Melanom wirkt Verteporfin über drei komplementäre Mechanismen: PDT-vermittelte Zytotoxizität, Hemmung des YAP/TAZ-Signalwegs (wobei der YAP1-Expression die stärksten metastatischen Marker, Monosomie 3 und BAP1-Verlust, korrelieren)21 sowie immunogene Zelltodinduktion über die Aktivierung des cGAS-STING-Pfads. Die Kombination aus VP-vermittelter YAP-Hemmung und PDT mit einer Anti-PD-L1-Therapie wandelte immunologisch kalte Tumoren in immunologisch aktive Tumoren um, wodurch das Tumorwachstum deutlich gehemmt und das Überleben in orthotopen Modellen verlängert wurde22. Diese Befunde stimmen mit der berichteten Ansprechrate von 80 % für eine Verteporfin-basierte PDT als Erstbehandlung des Choroidmelanoms überein34. Die optische Zugänglichkeit des Auges für die Aktivierung bei 689 nm sowie die gut definierte Lokalisation der meisten uvealen Melanome machen VP-Liposomen zu einer vielversprechenden Plattform für die gezielte Abgabe von Therapeutika, die möglicherweise die Morbidität im Vergleich zu aktuellen Brachytherapie- und Protonenstrahlverfahren verringert.
Neben den oben diskutierten ophthalmologischen und onkologischen Anwendungen eignet sich die VP-Liposom-Plattform für jeden therapeutischen Kontext, der eine extern gesteuerte, bedarfsgerechte Freisetzung des Wirkstoffs erfordert. Mögliche Anwendungen umfassen lichtinduzierte Genbearbeitung bei dermatologischen Erkrankungen, die einer transkutanen Bestrahlung zugänglich sind, röntgeninduzierte Freisetzung von Chemotherapeutika, synchronisiert mit klinischen Fraktionierungsplänen der Strahlentherapie, sowie räumlich abgestimmte Gen-Knockouts für Untersuchungen in der Entwicklungsbiologie. Mehrere photoaktivierbare Genbearbeitungssysteme wurden bereits in nicht-retinalen Geweben nachgewiesen, darunter der Mag-ABE-Photoaktivierbare-Basen-Editor für räumlich-zeitlich kontrollierte Genomeditierung in vivo35 und ein NIR-aktiviertes Upconversion-Nanopartikelsystem für räumlich-zeitlich kontrollierte CRISPR-Cas9-Editierung und photodynamische Therapie36. In der Ophthalmologie unterstreicht das wachsende Interesse an langanhaltenden Strategien zur VEGF-Suppression weiterhin die Notwendigkeit von Abgabesystemen, die langfristige therapeutische Wirksamkeit mit externer Kontrolle über Zeitpunkt und Ort der biologischen Aktivität verbinden37. Die Integration dieser Herstellungsverfahren mit neuartigen Technologien zur retinalen LNP-Abgabe und photoaktivierbaren Genbearbeitungssystemen stellt eine Konvergenz einzelner validierter Komponenten dar, deren kombinierte Anwendung am Auge noch unerschlossen ist und ein potenziell wirkmächtiges Forschungsfeld darstellt. Aktuelle Arbeiten in unserer Gruppe zielen darauf ab, Formulierungen für subretinale und intravitreale Applikationswege zu optimieren, Sicherheitsprofile in okularen Großtiermodellen zu evaluieren und die röntgeninduzierte Modalität für den gleichzeitigen Einsatz mit etablierten Strahlentherapieprotokollen in der klinischen Onkologie anzupassen.
Offenlegungen
Y.A.A. ist Direktor und Mitbegründer von EosGene Therapeutics Pty Ltd, das Patente im Zusammenhang mit der hier beschriebenen lichtaktivierten Lipid-Nanopartikel-Technologie hält. E.M.G. und W.D. sind Mitbegründer von EosGene Therapeutics.
Danksagungen
Die Autoren danken den Einrichtungen und der technischen Unterstützung durch die Macquarie University Zebrafish Facility (Zebrafisch-Arbeiten) und das Macquarie University Animal Ethics Committee. Diese Arbeit wurde teilweise vom ARC Centre of Excellence for Nanoscale BioPhotonics (CE140100003) unterstützt. Die Autoren danken außerdem für die Unterstützung durch EosGene Therapeutics Pty Ltd.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 20 nm Filtrationsmembran (Anotop 10 oder äquivalent) | Whatman (Cytiva) | N/V | Wird zur Trennung von freiem Cas9 während der Messung der Einschließungseffizienz verwendet |
| 690 nm LED-Lichtquelle | Thorlabs | M690L4 | Lichtquelle zur Auslösung der VP-vermittelten Freisetzung des Liposomeninhalts; einstellbare Leistungsdichte |
| Antibiotikum–Antimykotikum (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Zellkulturzusatzmittel; endgültige Konzentration 1 % |
| Argon-Gasflasche und Druckminderer | N/V | N/V | Wird zur Lösungsmittelverdampfung während der Lipidfilmherstellung verwendet |
| Avanti Mini Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | Manuelles Extrudersystem, verwendet mit 200 nm Polycarbonatmembranen zur Standardisierung der Liposomengröße |
| BALB/c Nude-Mäuse (weiblich, 5–6 Wochen) | Animal Resources Centre | N/V | Immunodefiziente Mäuse, verwendet für das HCT116-Xenotransplantat-Tumormodell |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Thermo Fisher Scientific | N/V | Wird zur Quantifizierung von freiem Cas9 und zur Bestimmung der Einschließungseffizienz verwendet |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad Laboratories | 12003154 | System zur Bildgebung von Gele und Western Blots |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Fluoreszierender Farbstoff für Freisetzungsassays; selbstverlöschend bei hohen Konzentrationen |
| Cary 5000 UV-Vis-NIR-Spektrophotometer | Agilent Technologies | N/V | UV-Vis-Absorptionsspektroskopie von Liposomen und Verteporfin |
| CCD841 CoN-Zellen (menschliche normale Kolonepithelzellen) | ATCC | CRL-1790 | Normale Kolonepithelzelllinie; dient als nicht-kontrollierte Kontrolle |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Organisches Lösungsmittel zur Lipidfilmherstellung |
| Cholesterin | Sigma-Aldrich | C8667 | Komponente der Liposomenmembran, verwendet in der lichtgesteuerten Formulierung |
| Klinischer Linearbeschleuniger (6 MeV Photonenstrahl) | Varian Medical Systems | N/V | Klinische Röntgenquelle für Bestrahlungsstudien |
| Digitalmessschieber | N/V | N/V | Wird zur Volumenmessung von Xenotransplantat-Tumoren verwendet |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | Lösungsmittel zur Herstellung von Verteporfin-Stammlösungen |
| DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) | Avanti Polar Lipids | 850375P | Lipidkomponente, verwendet in der Röntgenstrahlen-gesteuerten Formulierung |
| DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin) | Sigma-Aldrich | P1223 | Hilfslipid, verwendet in der lichtgesteuerten Formulierung |
| DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propan) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Kationisches Lipid, verwendet in beiden Formulierungen |
| Doxorubicinhydrochlorid | Sigma-Aldrich | D1515 | Chemotherapeutikum, in Röntgenstrahlen-gesteuerte Liposome eingelagert |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Polar Lipids | 880120P | PEGyliertes Lipid, verwendet in der Röntgenstrahlen-gesteuerten Formulierung |
| Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Zellkulturmedium für HEK293- und PC12-Zellen |
| Dulbeccos phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | Waschpuffer |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | Zellkulturzusatzmittel; endgültige Konzentration 10 % |
| Fluorolog-Tau3 Spektrofluorometer | HORIBA Scientific | N/V | Fluoreszenzspektroskopie zur Charakterisierung von Verteporfin |
| Software zur Fokusstapelung (z. B. Zerene Stacker) | N/V | N/V | Wird zur Erzeugung fokusstapelnder Bilder bei der Zebrafisch-Bildgebung verwendet |
| Gefriertrockner (Alpha 1-4 LDplus) | Martin Christ / John Morris Scientific | N/V | Wird zur Vakuumtrocknung und Lösungsmittelentfernung verwendet |
| GFP-sgRNA | Thermo Fisher Scientific | A35943 | Einzelstrang-RNA, die eGFP gezielt ansteuert; verwendet zur Validierung des Knockouts |
| Goldnanopartikel (3–5 nm, zitronensäurestabilisiert) | NanoComposix | N/V | Radiosensibilisator, verwendet in der Röntgenstrahlen-gesteuerten Formulierung |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 7.0 | Statistische Analyse und Datenvisualisierung |
| HCT116-Zellen (menschliches kolorektales Karzinom) | ATCC | CCL-247 | Kolorektale Krebszelllinie, verwendet für in-vitro- und in-vivo-Studien |
| HEK293/GFP-Zellen | GenTarget | SC001 | Stabile GFP-exprimierende Zelllinie, verwendet zur Validierung des CRISPR-Knockouts |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Kernfärbung; Arbeitskonzentration 5 µg/mL |
| Software zur Bildanalyse (z. B. Imaris) | Bitplane (Oxford Instruments) | N/V | Wird zur Quantifizierung der ausgeknockten langsamen Muskel-Fasern verwendet |
| ImageJ/Fiji | National Institutes of Health (NIH) | Open source | Software zur Bildanalyse |
| Invertiertes Fluoreszenzmikroskop | Leica Microsystems | DMi3000 | Wird für die Reporter-Bildgebung beim Zebrafisch und die Beurteilung der GFP-Fluoreszenz verwendet |
| IVIS SpectrumCT In-vivo-Bildgebungssystem | PerkinElmer | 128201 | In-vivo-Fluoreszenzbildgebungssystem |
| JEOL JEM-1400 Transmissionselektronenmikroskop | JEOL | JEM-1400 | TEM-Bildgebung von Liposomen |
| Leica SP2 Konfokalmikroskop | Leica Microsystems | N/V | Konfokale Bildgebung der zellulären Aufnahme |
| Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt | N/V | N/V | Wird zum Einbetten von Zebrafischembryonen während der Bildgebung verwendet |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfektionsreagenz, verwendet als positiver Kontrollwert |
| Living Image Software | PerkinElmer | N/V | Software zur Bildaufnahme und -analyse |
| McCoy's 5A Medium | Thermo Fisher Scientific | 16600082 | Zellkulturmedium für HCT116-Zellen |
| Mikroinjektionssystem | N/V | N/V | Wird zur Mikroinjektion in Zebrafischembryonen im Ein-Zell-Stadium verwendet |
| MTS-Zellproliferationsassay | Promega | G3582 | Zellviabilitätsassay |
| NanoDrop-Spektrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Messung der RNA-Reinheit und -konzentration |
| Nukleasefreies Wasser | Thermo Fisher Scientific | R0582 | Wird zur Herstellung von CRISPR-Cas9-RNP verwendet |
| Opti-MEM Medium mit reduziertem Serum | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Transfektionsmedium |
| Paraformaldehyd (4 %) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixiermittel für die histologische Analyse |
| PC12-Zellen (Ratten-Pheochromozytom) | ATCC | CRL-1721 | Neuronal-ähnliche Zelllinie, verwendet für Aufnahmestudien |
| Polycarbonat-Membranfilter (200 nm) | Avanti Polar Lipids | 610006 | Extrusionsmembranen zur Größenbestimmung von Liposomen |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | RNA-Extraktionskit |
| Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) | Thermo Fisher Scientific | S36002 | Fluoreszierender Sondenfarbstoff zum Nachweis von Singulett-Sauerstoff |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysegeräte (10 kDa MWCO) | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Dialysegeräte zur Liposomenherstellung und Arzneimittelladung |
| SYBR Gold Nukleinsäure-Gel-Färbemittel | Thermo Fisher Scientific | S11494 | Nukleinsäure-Gel-Färbemittel |
| Tg(ubi:EGFP)-Zebrafisch | Zebrafish International Resource Center | ZDB-GENO-080606-2 | Transgener Zebrafisch, verwendet für die in-vivo-CRISPR-Validierung |
| TNF-α (human rekombinant) | Life Technologies | RTNFAI | Zytokin, verwendet in Studien zur TNFAIP3-Induktion |
| TNFAIP3-sgRNA | Thermo Fisher Scientific | N/V | sgRNA, die TNFAIP3 gezielt ansteuert |
| Tricainmethansulfonat (MS-222) | N/V | N/V | Zebrafisch-Anästhetikum, verwendet vor der Bildgebung |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Tensid, verwendet zur Lyse von Liposomen und Freisetzungsassays |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | Cas9-Nuklease, verwendet zur Herstellung von CRISPR-Cas9-RNP |
| Trypsin-EDTA (0,25 %) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | Zelldissoziationsreagenz |
| Uranylacetat (2 %) | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Negativkontrastierung für die TEM-Bildgebung |
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Fotosensibilisator, in Liposomenformulierungen eingebaut |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | ZEN3600 | Dynamische Lichtstreuung und Messung des Zeta-Potentials |
Referenzen
- Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-15.
- Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Mol Ther. 2017;25(7):1467-75.
- Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-78.
- Kim S et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-19.
- Wilson BC, Patterson MS. The physics, biophysics and technology of photodynamic therapy. Phys Med Biol. 2008;53(9):R61-R109.
- Scott LJ, Goa KL. Verteporfin. Drugs Aging. 2000;16(2):139-46.
- Treatment of Age-related Macular Degeneration With Photodynamic Therapy (TAP) Study Group. Photodynamic therapy of subfoveal choroidal neovascularization in age-related macular degeneration with verteporfin: one-year results of 2 randomized clinical trials—TAP Report 1. Arch Ophthalmol. 1999;117(10):1329-45. doi:10.1001/archopht.117.10.1329.
- Boettner EA, Wolter JR. Transmission of the ocular media. Invest Ophthalmol. 1962;1(6):776–83.
- Aksoy YA et al. Spatial and temporal control of CRISPR-Cas9-mediated gene editing delivered via a light-triggered liposome system. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(47):52433-44.
- Ogilby PR. Singlet oxygen: there is indeed something new under the sun. Chem Soc Rev. 2010;39(8):3181-209.
- Deng W et al. Controlled gene and drug release from a liposomal delivery platform triggered by X-ray radiation. Nat Commun. 2018;9(1):2713.
- Sang R et al. Unlocking the in vivo therapeutic potential of radiation-activated photodynamic therapy for locally advanced rectal cancer with lymph node involvement. EBioMedicine. 2025;116:105724.
- Fleckenstein M, Schmitz-Valckenberg S, Chakravarthy U. Age-related macular degeneration: a review. JAMA. 2024;331(2):147-57.
- Wykoff CC et al. Impact of anti-VEGF treatment and patient characteristics on vision outcomes in neovascular age-related macular degeneration: up to 6-year analysis of the AAO IRIS Registry. Ophthalmol Sci. 2024;4(2):100421.
- Khanani AM et al. Safety and efficacy of ixoberogene soroparvovec in neovascular age-related macular degeneration in the United States (OPTIC): a prospective, two-year, multicentre phase 1 study. EClinicalMedicine. 2024;67:102394.
- Campochiaro PA et al. Gene therapy for neovascular age-related macular degeneration by subretinal delivery of RGX-314: a phase 1/2a dose-escalation study. Lancet. 2024;403(10436):1563-73.
- Maguire MG et al. Five-year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials. Ophthalmology. 2016;123(8):1751-61.
- Eshtiaghi A et al. Geographic atrophy incidence and progression after intravitreal injections of anti-vascular endothelial growth factor agents for age-related macular degeneration: a meta-analysis. Retina. 2021;41(12):2424-35.
- Li R et al. Split AAV8 mediated ABCA4 expression for gene therapy of mouse Stargardt disease (STGD1). Hum Gene Ther. 2023;34(13-14):616-28.
- Sun D et al. Effective gene therapy of Stargardt disease with PEG-ECO/pGRK1-ABCA4-S/MAR nanoparticles. Mol Ther Nucleic Acids. 2022;29:823-35.
- Brouwer NJ et al. Targeting the YAP/TAZ pathway in uveal and conjunctival melanoma with verteporfin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2021;62(4):3.
- Zhang S et al. Combination of YAP inhibition and photodynamic therapy induces dual DNA damage and activates STING pathway to enhance immunotherapy in uveal melanoma. Redox Biol. 2026;89:103965. doi:10.1016/j.redox.2025.103965.
- Cheema MR, DaCosta J, Talks J. Ten-year real-world outcomes of anti-vascular endothelial growth factor therapy in neovascular age-related macular degeneration. Clin Ophthalmol. 2021;15:279-87.
- Kay C et al. Interim results from the phase 2b population extension cohort in the PRISM clinical trial evaluating 4D-150 in adults with neovascular (wet) age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025;66(8):1861.
- Vofo BN et al. Long-term macular atrophy growth in neovascular age-related macular degeneration: influential factors and role of genetic variants. Eye (Lond). 2025;39(9):1717-23.
- Cao D et al. Dynamically covalent lipid nanoparticles mediate CRISPR-Cas9 genome editing against choroidal neovascularization in mice. Sci Adv. 2025;11(28):eadj0006.
- Gautam M et al. Lipid nanoparticles with PEG-variant surface modifications mediate genome editing in the mouse retina. Nat Commun. 2023;14(1):6468.
- Herrera-Barrera M et al. Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates. Sci Adv. 2023;9(2):eadd4623.
- Wu H et al. Innovative gene delivery systems for retinal disease therapy. Neural Regen Res. 2026;21(2):542-52.
- Riedmayr LM et al. mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy. Nat Commun. 2023;14(1):6578.
- Khanani AM et al. A novel modifier gene therapy to treat Stargardt disease: Phase 1 GARDian1 Trial Insights. Eye (Lond). 2026;40:429–30.
- Goddaer S et al. Overcoming size barriers in retinal gene therapy via lipid nanoparticle-mediated delivery of full-length EYS DNA. Drug Deliv Transl Res. 2026;16(8):2921–36. doi:10.1007/s13346-025-02036-y.
- Chambers CZ et al. Lipid nanoparticle-mediated delivery of mRNA into the mouse and human retina and other ocular tissues. Transl Vis Sci Technol. 2024;13(7):7.
- Yordi S, Soto H, Bowen RC, Singh AD. Photodynamic therapy for choroidal melanoma: What is the response rate? Surv Ophthalmol. 2021;66(4):552-59.
- Zou Q et al. Photoactivatable base editors for spatiotemporally controlled genome editing in vivo. Biomaterials. 2023;302:122328.
- Zeng J et al. Near-infrared optogenetic nanosystem for spatiotemporal control of CRISPR-Cas9 gene editing and synergistic photodynamic therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2025;17(1):701-10.
- Campochiaro PA. Sustained suppression of VEGF for treatment of retinal and choroidal vascular diseases. Am J Ophthalmol. 2025;277:1-6.
Nachdrucke und Genehmigungen
