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Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Sorafenib in Kombination mit Gemcitabin zeigt vorläufige Hinweise auf eine additive Hemmung der Proliferation von HepG2-Zellen sowie korrelative Veränderungen in der Expression von p-ERK und VEGF und unterdrückt das Lebertumorwachstum in NOD/SCID-Mäusen.
Leberkrebs bleibt eine der häufigsten Ursachen für krebsbedingte Todesfälle aufgrund von Arzneimittelresistenz und begrenzten Behandlungsoptionen. Es besteht dringender Bedarf, therapeutische Strategien zur Verbesserung der Behandlungsergebnisse zu erforschen. Diese Pilotstudie stellt einen Protokollansatz zur Bewertung der potenziellen Wirkungen und zugrundeliegenden Mechanismen der Kombination von Sorafenib und Gemcitabin bei Leberkrebs vor. Es wurde die Leberkrebszelllinie HepG2 verwendet, und ein Xenotransplantat-Modell in nicht-adipösen diabetischen/sever kombiniert immundefizienten (NOD/SCID) Mäusen wurde etabliert. Wichtige experimentelle Schritte werden demonstriert, darunter: (1) Kultur der HepG2-Zellen und Behandlung mit Wirkstoffen; (2) Einrichten des MTT-Assays, Inkubation und Messung der Absorption; (3) Proteingewinnung, SDS-PAGE, Übertragung und Immunblotting für ERK und p-ERK; (4) subkutane Xenotransplantation in NOD/SCID-Mäusen; (5) Tumormessung und Berechnung des Tumorvolumens; sowie (6) VEGF-Immunhistochemie an Tumorschnitten. Kritische Arbeitsschritte, Tipps zur Fehlerbehebung und Gerätespezifikationen werden bereitgestellt. Die Kombination von Sorafenib (3 µmol/L) und Gemcitabin (10 µmol/L) erreichte nach 72 h eine Hemmrate von 71,23 % ± 6,76 %, mit einem q-Wert von 1,35, was auf einen synergistischen Effekt bei diesem spezifischen Dosispaar unter den getesteten Bedingungen hindeutet. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die Kombinationsbehandlung mit einer verminderten Expression von p-ERK, einer Verringerung des Tumorvolumens und einer qualitativ geringeren VEGF-Immunfärbung assoziiert. Diese Daten zeigen eine korrelative Beziehung zwischen der reduzierten p-ERK-Expression und der beobachteten antiproliferativen Wirkung auf, ohne jedoch Kausalität nachzuweisen. In HepG2-Zellen und einem NOD/SCID-Maus-Xenotransplantat-Modell zeigt die Kombination von Sorafenib und Gemcitabin vorläufige Hinweise auf antiproliferative Potenziale und ist mit einer verminderten VEGF-Expression assoziiert; dieser Befund stellt jedoch keine direkten Belege für antiangiogene Aktivität dar, da keine Analysen zur Mikrogefässdichte oder zur funktionellen Gefäßdurchblutung durchgeführt wurden. Dieses reproduzierbare Protokoll bietet einen nützlichen Rahmen zur Bewertung von Arzneimittelkombinationen in HCC-Modellen und kann für andere gezielte Therapie-Chemotherapie-Regime angepasst werden, obwohl weitere mechanistische Untersuchungen und Dosisvalidierungsstudien erforderlich sind, bevor klinische Schlussfolgerungen gezogen werden können.
Leberkrebs ist eine der häufigsten und tödlichsten Krebserkrankungen und zählt zudem zu den am schnellsten wachsenden bösartigen Tumoren1,2. Obwohl die Inzidenz von Leberkrebs zurückgegangen ist, hat die gesamte Krankheitslast weiter zugenommen. Die globalen epidemiologischen Daten aus dem Jahr 2022 ergaben, dass die altersstandardisierte Inzidenzrate von Leberkrebs in der Online-Datenbank Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022 bei 15,0 pro 100.000 Einwohner lag, während die altersstandardisierte Mortalitätsrate bei 26,7 pro 100.000 Einwohner lag, was Leberkrebs zur zweithäufigsten Todesursache durch Krebserkrankungen macht3. Derzeit sterben die meisten Patienten innerhalb eines Jahres nach der Diagnosestellung, da es an wirksamen Therapien für Leberkrebs mangelt und die Erkrankung oft schleichend beginnt. Sorafenib ist der erste für die klinische Anwendung zugelassene multizieltrichtige Kinaseinhibitor, der Rezeptortyrosinkinasen wie den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), den Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor (PDGFR) sowie Serin/Threonin-Kinasen gezielt hemmt4,5. Sorafenib, ein oraler Multikinaseinhibitor, entfaltet bei Leberkrebs durch die gezielte Beeinflussung mehrerer Wachstumsfaktorwege anti-proliferative und anti-angiogene Wirkungen. Historisch gesehen war Sorafenib die erste von der FDA zugelassene First-Line-Systemtherapie für Patienten mit fortgeschrittenem oder inoperablem Leberkrebs6. Jedoch hat sich das aktuelle First-Line-Behandlungsspektrum für das fortgeschrittene hepatzelluläre Karzinom (HCC) erheblich erweitert. Zu den empfohlenen Optionen zählen nun die Kombination aus dem Immunkontrollpunkt-Inhibitor Atezolizumab und Bevacizumab, Lenvatinib sowie die duale Immuntherapie-Kombination aus Durvalumab und Tremelimumab, unter anderem. Trotz dieser Fortschritte bleibt Sorafenib eine wichtige First-Line-Option, insbesondere in Regionen, in denen Kombinationen aus Immuntherapien nicht leicht verfügbar oder kontraindiziert sind. Angesichts der weiten Verbreitung der Anwendung von Sorafenib bei Leberkrebs stellen arzneimittelbedingte Nebenwirkungen ein Anliegen dar7. In der Analyse der FDA-Datenbank für Arzneimittelnebenwirkungen (FAERS) von 2006 bis 2023 betrafen die Nebenwirkungen von Sorafenib hauptsächlich das Verdauungssystem, die Haut und das Unterhautgewebe sowie unspezifische körperliche Beschwerden wie Infektionen und Verletzungen7. Während einige Patienten mit fortgeschrittenem Leberkrebs von der Behandlung mit Sorafenib profitieren können, entwickeln die meisten Patienten letztendlich eine Resistenz oder eine Therapieversagen, was zu einer schlechten Prognose führt8,9,10. Trotz seiner Anwendung profitieren nur etwa 30 % der HCC-Patienten von Sorafenib; zudem entwickeln Ansprecher häufig innerhalb von sechs Monaten eine Resistenz11. Zu den molekularen Signalwegen, die an der Sorafenib-Resistenz beteiligt sind, gehören der extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK)/phosphorylierte ERK (p-ERK)-Weg, die Proteinkinase B (Akt), der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)/AKT/mammal target of rapamycin (mTOR)-Weg, der Hypoxie-induzierbare Faktor 1α (HIF-1α)/HIF-2α-Weg sowie autophagiebezogene Signalwege, wobei ERK/p-ERK in dieser Studie speziell hervorgehoben und ausgewählt wurde11. Gemcitabin ist ein Cytidin-Analogon, das im Körper zu Difluorocytidin-Diphosphat und Difluorocytidin-Triphosphat metabolisiert wird und unterschiedliche hemmende Wirkungen auf die DNA-Synthese entfaltet12. Bei hepatobiliären Malignomen wurde Gemcitabin als Bestandteil einer Kombinationschemotherapie untersucht. Allerdings wurde klinisch berichtet, dass Gemcitabin ebenfalls eine erhöhte Arzneimittelresistenz aufweist, was dessen Wirksamkeit einschränkt12,13. Daher ist die Bestimmung des optimalen Arzneimittelregimes äußerst herausfordernd, sowohl effektiv als auch effizient. Neuere Studien haben gezeigt, dass die Kombination von Gemcitabin mit Sorafenib anhand einer neuartigen Vorhersage mittels eines Tumor-Stemness-Biomarkers eine verbesserte therapeutische Wirksamkeit aufweisen könnte14. Bislang ist uns jedoch keine Studie bekannt, die diese Kombination speziell bei Leberkrebs unter Verwendung von HepG2-Zellen und einem xenotransplantierten Mausmodell mit nicht-adipösem diabetischem/schwerem kombiniertem Immundefekt (NOD/SCID) untersucht hat. Daher fehlt bisher experimenteller Nachweis, der die additiven Effekte von Sorafenib und Gemcitabin bei Leberkrebs direkt belegt.
Die in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren werden zwar häufig angewendet, jedoch selten in einem detaillierten, visuellen, Schritt-für-Schritt-Format präsentiert, das für Nachwuchsforscher geeignet ist, um sie zu reproduzieren. Wir vermuteten, dass die Kombination aus Sorafenib und Gemcitabin die Proliferation von Leberkrebszellen und das Tumorwachstum additiv hemmen würde und dass dieser Effekt mit einer Herunterregulation des ERK/p-ERK-Signalwegs sowie einer verminderten, durch den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) vermittelten Angiogenese assoziiert wäre. Ziel dieser Studie ist es, den hemmenden Effekt der Kombination von Sorafenib mit Gemcitabin auf die Proliferation der HepG2-Leberkrebszelllinie in vitro und in vivo sowie dessen Wirkmechanismus vorläufig zu untersuchen (ergänzende Abbildung 1). Die Neuheit dieser Studie liegt in drei Aspekten: (1) Es ist die erste Studie, die die Kombination aus Sorafenib und Gemcitabin spezifisch bei Leberkrebs anhand der weit verbreiteten HepG2-Zelllinie und eines entsprechenden NOD/SCID-Mausmodells untersucht; (2) sie erforscht den bisher wenig untersuchten ERK/p-ERK-Signalweg als möglichen Wirkmechanismus; und (3) sie liefert direkte experimentelle Belege – im Gegensatz zu computergestützten Vorhersagen – für den additiven Effekt dieser Kombination bei Leberkrebs. Diese Merkmale unterscheiden die vorliegende Arbeit von früheren Berichten über Kombinationstherapien, die an anderen Tumortypen oder mit unterschiedlichen experimentellen Modellen durchgeführt wurden, insbesondere im Kontext von auf Sorafenib basierenden Therapieregimen.
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Die ethische Genehmigung wurde von der Kommission für Tierschutz und Ethikbewertung der Zhejiang University erteilt (Genehmigungsnummer ZJU20250049).
Tiere und Gruppierung
Insgesamt 40 weibliche NOD/SCID-Mäuse im Alter von 4–5 Wochen mit einem Gewicht von 18–20 g wurden von einem lizenzierten kommerziellen Zulieferer (Lizenznummer SCXK (Shanghai) 2013-0006) bezogen und in spezifischen, pathogenfreien (SPF) Tierhaltungsräumen untergebracht. Alle Tierversuchsprotokolle folgten den gängigen Richtlinien. Während des Experiments hatten die Tiere freien Zugang zu Futter und Wasser, wurden in Gruppen (5 Mäuse/Käfig) in einem gut kontrollierten SPF-Raum gehalten, wobei die Raumtemperatur bei 22 ± 2 °C, die Luftfeuchtigkeit bei 50–60 % und der Licht-Dunkel-Wechsel bei 12/12 h konstant gehalten wurde. Den Tieren wurde ad libitum Futter und Wasser zur Verfügung gestellt, und ihr Körpergewicht wurde alle zwei Wochen überwacht. Wenn bei den Mäusen anhaltende Schmerzen, Kachexie, Tumorgeschwüre, eine maximale Tumorgröße von 2 cm oder andere irreversible Gesundheitsprobleme auftraten, erfolgte die Tötung durch intraperitoneale Injektion von 0,45 % Natriumpentobarbital in einer Dosis von ≥150 mg/kg Körpergewicht, gefolgt von der Bestätigung des Atem- und Herzstillstands sowie des Verlusts der Hornhautreflexe oder gegebenenfalls durch Anwendung eines sekundären physikalischen Verfahrens, entsprechend den vom Tierversuchsethik-Ausschuss genehmigten Kriterien für eine humane Tötung. Die Stichprobengröße (n = 10 pro Gruppe) wurde basierend auf einer Power-Analyse festgelegt, die eine Effektgröße von 1,2 (abgeleitet aus Vorversuchen), α = 0,05 und β = 0,20 (80 % Power) annahm, zuzüglich einer Abschlagrate von 20 %. Die Tumorimplantation wurde vor der Behandlungszuordnung durchgeführt (siehe unten zur Xenotransplantat-Erzeugung).
Die Mäuse wurden nach der Tumorimplantation und Bestätigung der Tumoranzucht mittels der Zufallszahltabellenmethode zufällig in vier Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, Sorafenib-Gruppe, Gemcitabin-Gruppe sowie Kombinationsgruppe aus Sorafenib und Gemcitabin, mit jeweils 10 Mäusen (5 Mäuse/Käfig), um das Transplantattumor-Modell an NOD/SCID-Mäusen aufzubauen. Da Tumorgewebe im Modellierungsprozess einen schlechten Allgemeinzustand oder sogar den Tod von NOD/SCID-Mäusen verursachen kann und da für die statistische Analyse in der Regel eine ausreichende Stichprobengröße erforderlich ist, wurden pro Gruppe mindestens 10 Mäuse eingeschlossen. Die randomisierte Gruppeneinteilung wurde durch unabhängige Techniker durchgeführt, und die Käfige wurden entsprechend beschriftet; während der Applikation der Wirkstoffe und der Tumormessung wurde keine Verblindung angewandt, was eine wesentliche Einschränkung darstellt. Die anschließenden Gewebeprobenentnahmen sowie biochemischen und pathologischen Bewertungen wurden jeweils durch verblindetes Laborpersonal durchgeführt. Die Daten wurden ebenfalls verblindet von Statistikern analysiert, die bis zum Abschluss der statistischen Auswertung und der Aufhebung der Verblindung nur Zugriff auf codierte Dateien hatten. Alle Tiere wurden in die endgültige Analyse eingeschlossen. Beide Wirkstoffe wurden intraperitoneal verabreicht, um eine systemische Resorption und eine konsistente Bioverfügbarkeit sicherzustellen; die einmal tägliche Gabe basierte auf früheren pharmakokinetischen Studien, die bei diesem Regime nachweislich anhaltende Plasmaspiegel zeigten. Die Kontrollgruppe erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 mL steriler isotonischer Kochsalzlösung. In der Sorafenib-Gruppe wurden 0,2 mL Sorafenib in einer Dosis von 40 mg/kg intraperitoneal injiziert. In der Gemcitabin-Gruppe wurden 0,2 mL Gemcitabin in einer Dosis von 100 mg/kg intraperitoneal verabreicht. Kombinationstherapiegruppe: Es wurden jeweils 0,2 mL Sorafenib (40 mg/kg) und Gemcitabin (100 mg/kg) intraperitoneal appliziert. Jede Gruppe erhielt die Behandlung einmal täglich über 20 aufeinanderfolgende Tage. Alle Tiere wurden in die endgültige Analyse eingeschlossen, und es wurde kein Tier aus der Studie ausgeschlossen. Während der 20-tägigen Behandlungsphase wurde in keiner Gruppe ein Todesfall beobachtet. Das Behandlungsschema und die Dosierungen wurden anhand publizierter Studien an Modellen von hepatobiliären Karzinomen ausgewählt. Es ist zu beachten, dass die tägliche intraperitoneale Gabe von Gemcitabin toxische Wirkungen hervorrufen kann. Länge und Breite der transplantierten Tumore wurden täglich gemessen, und das Volumen der transplantierten Tumore wurde berechnet. Nach 20 Tagen wurden die Tiere unter tiefer Anästhesie durch Halsbruch euthanasiert, und das transplantierte Tumorgewebe wurde in Formalin fixiert. Das Körpergewicht wurde im gesamten Studienverlauf alle zwei Tage bestimmt. Die Mäuse wurden täglich auf klinische Anzeichen von Toxizität überwacht, einschließlich gesträubten Fells, gekrümmter Haltung, verminderter Beweglichkeit, Durchfall und Lethargie. Es wurden jedoch keine Serum-Biochemie (z. B. Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase und Kreatinin) und keine histopathologische Untersuchung der Hauptorgane durchgeführt. Daher kann eine subklinische Toxizität nicht ausgeschlossen werden.
Arzneimittel und Reagenzien
Sorafenib wurde in 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und bei -20 °C gelagert. Vor der Verwendung wurde die Lösung aufgetaut und auf eine endgültige DMSO-Konzentration von weniger als 0,5 % verdünnt, was keinen Einfluss auf das Zellwachstum hatte. Gemcitabin wurde von einer kommerziellen Quelle bezogen. Radioimmunpräzipitationsassay-(RIPA-)Lysepuffer, Thiazolylblau, primäre Antikörper gegen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), ERK, p-ERK und VEGF, sekundäre Antikörper, Dulbeccos modifiziertes Eaglesches Medium (DMEM) mit hohem Glucosespiegel, fetalen Kälberserum sowie die HepG2-Zelllinie wurden von kommerziellen Quellen bezogen.
Sorafenib und Gemcitabin sind zytotoxische Wirkstoffe. Alle Schritte zur Zubereitung und Handhabung der Arzneimittel müssen in einem dafür vorgesehenen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, wobei geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborcoat, Nitrilhandschuhe und Schutzbrille) getragen werden muss. DMSO, Methanol, Xylol und andere in diesem Protokoll verwendete organische Lösungsmittel sind gefährlich und sollten in einem Abzug gehandhabt werden, um Einatmen oder Hautkontakt zu vermeiden. Die Sicherheitsdatenblätter (MSDS) aller Reagenzien sollten vor der Verwendung eingesehen werden.
Zellkultur
Die HepG2-Zelllinie wurde aufgetaut und in Zellkulturgefäße inokuliert, die 10 mL DMEM-Hochglukose-Medium enthielten (ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin und 4 mmol/L Glutamin). Die Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ inkubiert. Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage gewechselt, und die Zellen wurden alle 4 Tage umgeimpft, um ein logarisches Wachstum aufrechtzuerhalten. Die HepG2-Zelllinie wurde von einem kommerziellen Anbieter bezogen; jedoch wurden in dieser Studie keine unabhängige Authentifizierung der Zelllinie (z. B. mittels Short-Tandem-Repeat-Profilierung) und kein Mykoplasmen-Test durchgeführt.
MTT-Methode zur Bestimmung der Proliferationshemmrate
Die 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Methode wurde verwendet, um die Proliferationshemmrate von Sorafenib und Gemcitabin an der HepG2-Zelllinie zu bestimmen. Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden 2 min lang mit 0,25 %iger Trypsinlösung verdaut, und der Verdauungsvorgang wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens vollständigen Mediums beendet. Nach einer Zentrifugation bei 1000 × g für 10 min wurden die Zellen in vollständigem Medium resuspendiert. Die Zelldichte wurde auf 1 × 105 Zellen/mL eingestellt, und 200 µL der Zellsuspension wurden in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte ausgesät. Diese Aussaatdichte wurde basierend auf vorläufigen Optimierungsexperimenten gewählt, bei denen Zelldichten im Bereich von 5 × 103 bis 5 × 104 Zellen/Vertiefung getestet wurden. Eine Dichte von 2 × 104 Zellen/Vertiefung führte zu einem linearen Anstieg der Absorption über 96 h und hielt die Konfluenz am Versuchsende unter 80 %, wie durch visuelle Inspektion unter einem invertierten Mikroskop bestätigt wurde. Um sicherzustellen, dass die MTT-Messungen im linearen Bereich blieben, wurden Pilotversuche zu jedem Zeitpunkt mit Kontrollvertiefungen, die nur das Lösungsmittel enthielten, durchgeführt. Das Medium wurde alle 48 h gewechselt, um Nährstoffverarmung und Anreicherung von Stoffwechselnebenprodukten zu verhindern. Die Konfluenz wurde täglich mittels eines invertierten Mikroskops überwacht. Nach 96 h erreichten die Kontrollvertiefungen etwa 75–80 % Konfluenz, und es wurden keine offensichtlichen Anzeichen einer Nährstoffverarmung beobachtet. Nach der Zellanheftung wurde das Medium entfernt und das medikamentöse Medium hinzugefügt. Eine medikamentenfreie Lösung wurde der unbehandelten Kontrollgruppe hinzugefügt (Lösungsmittelkontrolle für in vivo-Experimente). Der Versuch wurde in eine unbehandelte Kontrollgruppe, eine Sorafenib-Gruppe, eine Gemcitabin-Gruppe und eine Kombinationsbehandlungsgruppe unterteilt. Die Dosierungen von Sorafenib betrugen 1,5 µmol/L, 3 µmol/L, 4,5 µmol/L und 6 µmol/L, und die Dosierungen von Gemcitabin betrugen 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/L und 20 µmol/L. Die kombinierten Dosierungen von Sorafenib und Gemcitabin betrugen 1,5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4,5 µmol/L + 15 µmol/L und 6 µmol/L + 20 µmol/L. Die Zellen jeder Gruppe wurden 24 h, 48 h, 72 h und 96 h kultiviert. Nach der Inkubation wurden 20 µL MTT (5 mg/mL) in jede Vertiefung gegeben, und die Zellen wurden 4 h im Zellinkubator inkubiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen, anschließend wurden 150 µL DMSO in jede Vertiefung gegeben, und die Platte wurde 10 min lang geschüttelt, um das Formazan vollständig aufzulösen. Der optische Dichtewert (OD-Wert) jeder Vertiefung wurde bei 490 nm mit einem multifunktionalen Mikroplattenreader gemessen. Der Versuch wurde dreimal wiederholt, und jede Gruppe umfasste fünffache Wiederholungen. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) der drei biologischen Wiederholungen dargestellt. Die Zellwachstumshemmrate (%) = (1 – ODExperimentalgruppe / ODunbehandelte Gruppe) × 100 %. Die Wechselwirkung zwischen den beiden Wirkstoffen wurde anhand des q-Werts beurteilt, der mit der Formel: q = EAB / (EA + EB – EA × EB) berechnet wurde. Dabei sind EA und EB die Hemmraten der Wirkstoffe A und B bei alleiniger Anwendung, und EAB ist die Hemmrate bei gemeinsamer Anwendung beider Wirkstoffe. Wenn q größer als 1,15 ist, deutet dies auf einen synergistischen Effekt zwischen den beiden Wirkstoffen hin; ein Wert zwischen 0,85 und 1,15 zeigt einen additiven Effekt an; und ein q-Wert unter 0,85 weist auf einen antagonistischen Effekt hin. Die q-Wert-Methode ist ein einfaches Screening-Verfahren und ersetzt keine strengeren Synergieanalysen. Es wurden nur wenige Dosispaare mit festem Verhältnis getestet, was die Robustheit der Synergieaussage einschränkt. Daher bezieht sich der Begriff „Synergie“ in dieser Studie auf q > 1,15 bei bestimmten Dosispaaren und Zeitpunkten und nicht auf eine validierte additive Wechselwirkung über die gesamte Dosis-Wirkungs-Matrix hinweg.
Western-Blot-Analyse der Expression der Proteine ERK und p-ERK
Die Zellkultur und die experimentelle Gruppeneinteilung wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Zur Detektion von ERK und p-ERK mittels Western Blot betrug die Dosis von Sorafenib 3 µmol/L; die Dosis von Gemcitabin betrug 10 µmol/L; und die kombinierte Dosis betrug 3 µmol/L + 10 µmol/L. Nach 72-stündiger Behandlung wurden die Zellen mit RIPA-Lysepuffer lysiert und das Gesamtprotein aus jeder experimentellen Gruppe extrahiert. Die Proteinmenge wurde nach der Bicinchoninsäure-(BCA)-Methode bestimmt. Gleichmäßige Proteinmengen (30 µg pro Lane) wurden geladen und mittels 10%iger Natriumlaurylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bei 120 V für 90 min getrennt. Die Proteine wurden 90 min bei 4 °C mit 300 mA auf Polyvinylidenfluorid-(PVDF)-Membranen (Porengröße 0,45 µm) übertragen. Nach dem Blockieren mit 5%iger fettfreier Milch in Tris-gepufferter Salzlösung mit 0,1% Tween-20 (TBST) für 1 h bei Raumtemperatur wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit TBST (jeweils 10 min) wurden die Membranen 1 h bei Raumtemperatur mit sekundären Antikörpern inkubiert. Proteinbande wurden mittels Substrat für verstärkte Chemilumineszenz (ECL) sichtbar gemacht und mit einem digitalen Gelaufnahmesystem abgebildet. Die Belichtungszeiten wurden für jeden Antikörper optimiert, um Sättigungseffekte zu vermeiden. Die dichtometrische Quantifizierung erfolgte mit der Software ImageJ unter Verwendung des Gel-Analyse-Tools. Die Intensitäten aller Zielproteinbande wurden relativ zu GAPDH als Ladekontrolle normalisiert, und der p-ERK-Spiegel wurde zusätzlich relativ zur Gesamt-ERK-Expression normalisiert. Es wurden keine weiteren Blockierschritte zusätzlich zur 5%igen fettfreien Milch durchgeführt. Die Quantifizierungsergebnisse wurden als Faltungsänderung relativ zur Kontrollgruppe dargestellt, die auf 1,0 gesetzt wurde. Jedes Experiment wurde dreimal unabhängig wiederholt. Stellvertretende Immunoblots sind dargestellt.
Immunhistochemischer Nachweis der VEGF-Expression in HepG2-Xenotransplantat-Tumoren bei NOD/SCID-Mäusen
Zur Xenotransplantat-Etablierung: HepG2-Zellen in der log-Phase wurden durch Trypsinierung gewonnen, zweimal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in serumfreiem DMEM resuspendiert. Insgesamt 2 × 106 Zellen in 0,2 mL serumfreiem DMEM (ohne Matrigel) wurden subkutan in die rechte Achselregion (eine Region mit reichlicher Blutversorgung) jedes NOD/SCID-Mäuschen mit einer 1-mL-Spritze injiziert, um ein subkutanes HepG2-Xenotransplantatmodell in NOD/SCID-Mäusen zu etablieren. Die Tumorentwicklung wurde alle zwei Tage überwacht. Die Tumorgröße wurde alle zwei Tage gemessen, und sobald der Tumordurchmesser 0,3–0,5 cm erreichte (ca. 7–10 Tage nach der Injektion, definiert als Behandlungsbeginn), wurden die Mäuse zufällig in vier Gruppen für das Experiment eingeteilt. Die Länge (L) und Breite (W) des subkutanen Xenotransplantats wurden täglich mit einer digitalen Messschiebelehre erfasst, und das Tumorvolumen (V) wurde nach der Formel berechnet: V = (L × W2) / 2. Alle Messungen wurden von einem Untersucher durchgeführt, der bezüglich der Gruppenzuteilung verblindet war. Nach 20 Tagen wurden die Tiere unter tiefer Anästhesie durch Halsbruch euthanasiert, und das Xenotransplantatgewebe wurde 24 h bei Raumtemperatur in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Gewebeschnitte (5 µm dick) wurden mit einem Rotationsmikrotom hergestellt und auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern aufgebracht. Für die Immunhistochemie wurden die Schnitte in Xylol (drei Wechsel, jeweils 5 min) deparaffinisiert und durch eine abgestufte Ethanolreihe (100 %, 95 %, 70 %, 50 %; jeweils 3 min) rehydriert. Die Antigen-Retrieval-Behandlung erfolgte durch Erhitzen der Schnitte in 10 mM Natriumcitrat-Puffer in der Mikrowelle für 15 min, gefolgt von einer Abkühlung bei Raumtemperatur für 20 min. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde mit 3 % Wasserstoffperoxid in Methanol für 10 min bei Raumtemperatur blockiert. Nichtspezifische Bindungen wurden mit 5 % normalem Ziehenserum in PBS für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurden die Schnitte mit dem primären anti-VEGF-Antikörper (Verdünnung 1 : 200) über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS (jeweils 5 min) wurden die Schnitte mit einem mit HRP (horseradish peroxidase) konjugierten sekundären Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper (1 : 500) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das Signal wurde mit dem 3,3′-Diaminobenzidin (DAB)-Substrat detektiert. Die Schnitte wurden für 30 s mit Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert, geklärt und mit Deckgläsern mit einem permanenten Eindeckmedium versehen. Die Bildaufnahme erfolgte mit einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop im Hellfeldmodus bei einer Vergrößerung von ×100. Repräsentative Bilder werden zur qualitativen Veranschaulichung gezeigt.
Alle kontaminierten Spitzen, Röhrchen und Zellkulturabfälle wurden als biohazardöser Abfall gesammelt und vor der Entsorgung autoklaviert. Chemischer Abfall, einschließlich lösungsmittelhaltiger Lösungen, DMSO, Xylol und Methanol, wurde in getrennten, gekennzeichneten Abfallbehältern gesammelt und gemäß den örtlichen institutionellen Vorschriften für gefährliche chemische Abfälle entsorgt.
Statistische Analyse
Zur statistischen Analyse wurde die Software SPSS 19.0 verwendet. Die experimentellen Daten wurden als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen biologischen Wiederholungen für in vitro-Experimente und als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus n = 10 Mäusen pro Gruppe für in vivo-Experimente angegeben. Zum Vergleich zwischen zwei Gruppen wurden zweiseitige ungepaarte t-Tests verwendet. Bei Vergleichen zwischen mehreren Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Tukey-Post-hoc-Test durchgeführt. p < 0,05, p < 0,01 und p < 0,001 wurden angegeben.
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Die hemmende Wirkung von Sorafenib und Gemcitabin auf die Proliferation von HepG2-Zellen
Sorafenib und Gemcitabin hemmten die Proliferation von HepG2-Zellen dosisabhängig, wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Kombinationstherapie zeigte zu allen Zeitpunkten signifikant höhere Hemmraten im Vergleich zur Monotherapie. Der MTT-Test misst die metabolische Aktivität, die mit der Zellzahl korreliert, aber Proliferation oder Zytotoxizität nicht direkt bestimmt. Daher so...
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Leberkrebs weist aufgrund seines insidiosen Beginns, der schnellen Progression und der geringen Anzahl wirksamer Behandlungsmöglichkeiten eine hohe Mortalitätsrate auf3,15. Fortgeschrittener Leberkrebs zeigt häufig eine Resistenz gegenüber Chemotherapie und Strahlentherapie, und die derzeit verfügbaren Optionen, einschließlich chirurgischer Resektion und Lebertransplantation, bleiben unzureichend15,16. Di...
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Die Autoren haben keine Danksagungen.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Digitales Gel-Imaging-System | Bio-Rad Laboratories, Inc., USA | 1708280 | |
| DMEM-Hochglukose-Medium | HyClone, USA | SH30243.01 | |
| ERK-Kaninchen-monoklonaler Antikörper | Santa Cruz, USA | sc-94 | |
| Fetales Rinderserum | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., China | 11011-8611/11011-8615 | |
| Fluoreszenz-Invertiertes Mikroskop | Olympus, Japan | IX73 | |
| GAPDH-Kaninchen-polyklonaler Antikörper | Santa Cruz, USA | sc-25778 | |
| Gemcitabin | Eli Lilly and Company | 95058-81-4 | |
| Zweitantikörper Ziege-anti-Kaninchen | Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., China | D111018 | |
| ImageJ-Software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.8.0_112 | |
| Mikroplattenreader | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | MK3 | |
| p-ERK-Kaninchen-monoklonaler Antikörper | Santa Cruz, USA | 9106 | |
| Kühlzentrifuge | Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd. | DL-5M | |
| RIPA-Lysepuffer | Biyuntian Biological Technology Research Institute, China | P0013B | |
| Rotationsmikrotom | Leica, Germany | CM3050 | |
| Sorafenib | Bayer Company, Germany | 284461-73-0 | |
| Thiazolylblau (MTT) | Sigma, USA | M5655 | |
| Drei-Gas-Inkubator | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | 51026402 | |
| VEGF-Kaninchen-monoklonaler Antikörper | BioLegend, USA | B199116 |
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