Erzeugung von GABAergen Neuronen aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mittels doxycyclin-induzierbarer ASCL1/DLX2-Expression bei AAVS1

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von GABAergen Neuronen aus menschlich induzierten pluripotenten Stammzellen, indem doxycyclininduzierbare Transgene in den AAVS1-Safe-Harbor-Locus integriert werden. Die stabile, homogene Transgenexpression bietet einen effizienten Ansatz zur direkten Differenzierung in GABAerge Neuronen und begrenzt gleichzeitig die Transgen-Silencing, ein häufiges Problem bei lentiviralen Ansätzen.

Zusammenfassung

Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs) bieten eine beispiellose Möglichkeit, menschliche neurologische Erkrankungen in vitro zu modellieren. Eine zuverlässige Erzeugung definierter neuronaler Populationen, wie Gamma-Aminobuttersäure (GABAerge) Neuronen, ist für diese Studien unerlässlich. Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Differenzierung von hiPSCs in GABAerge Neuronen mittels eines doxycyclininduzierbaren Systems. Der Ansatz basiert auf der stabilen Integration von Transgene, die die Transkriptionsfaktoren ASCL1 und DLX2 codieren, in den Safe-Harbor-Adeno-assoziierten Virusintegrationsstandort 1 (AAVS1.) via CRISPR/Cas9-vermittelten Knock-in. Diese gezielte Integration vermeidet das Transgen-Silencing, das oft bei zufälliger lentiviraler Integration beobachtet wird. Das Protokoll umfasst die Erhaltung von hiPSCs, den Nukleofektionsprozess zur Transgenintegration, die Puromycin-Auswahl zur Anreicherung erfolgreich manipulierter Zellen sowie das Schritt-für-Schritt-Differenzierungsverfahren. Nach der Induktion mit Doxycyclin verlassen die konstruierten hiPSCs schnell den Zellzyklus, übernehmen neuronale Morphologie und exprimieren GABAerge Linienmarker innerhalb von 21 Tagen. Wichtige Schritte umfassen die Neuro-Induktion und anschließende Reifung unter Verwendung spezifischer Wachstumsfaktoren sowie mögliche Ansätze zur Verbesserung der Zelladhäsion während der Reifung. Diese standardisierte Methode liefert bereicherte Populationen induzierter Neuronen, die GABAerge Linienmarker exprimieren, was ein wertvolles Werkzeug für neurowissenschaftliche Forschung und zelluläre Modellierung darstellt.

Einleitung

Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs) bieten eine einzigartige Plattform, um menschliche neurologische Erkrankungen in vitro zu modellieren. und um die komplexen molekularen Mechanismen zu untersuchen, die Entwicklung und Degeneration¹ vorantreiben. Diese Technologie ermöglicht die Erstellung patientenspezifischer zellulärer Modelle, um eine Vielzahl von Zuständen zu untersuchen, von frühen neuroentwicklungsbedingten Anomalien in syndromischen Ciliopathien² bis hin zu subtilen epigenomischen Veränderungen bei sporadischer Alzheimer-Krankheit³. Folglich ist die gerichtete Differenzierung von hiPSCs zu einem Grundpfeiler der modernen molekularen Neurowissenschaft geworden.

Um die Feinheiten menschlicher neurologischer Prozesse effektiv zu erfassen, ist es unerlässlich, hochspezifische und reine neuronale Subtypen zu erzeugen. Beispielsweise sind definierte neuronale Populationen erforderlich, um die spezifischen transkriptionellen Rollen von Proteinen wie MECP2 in menschlichen Neuronen⁴ aufzuklären oder die gezielten Verwundbarkeiten peripherer sensorischer Neuronen gegenüber viralen Infektionen wie SARS-CoV-2⁵ zu bewerten. Darüber hinaus beruht der Aufbau komplexer, physiologisch relevanter Mikroumgebungen, wie die Integration funktioneller Mikroglia in 3D-Gehirnorganoide, grundlegend auf der robusten, vorhersehbaren Erzeugung unterschiedlicher neuronaler und glialer Linien⁶. Unter diesen Subtypen sind GABAerge Neuronen besonders interessant, da sie eine entscheidende hemmende Rolle im zentralen Nervensystem haben und ihre Bedeutung für verschiedene neurologische und psychiatrische Erkrankungen^{beeinflussen 7}. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein zuverlässiges, effizientes und reproduzierbares Protokoll für die gezielte Differenzierung von hiPSCs in induzierte Neuronen bereitzustellen, die GABAerge Linienmarker exprimieren. Traditionelle gerichtete Differenzierungsprotokolle für GABAerge Neuronen, die auf extrinsischen Signalmolekülen angewiesen sind, können zeitaufwendig, sehr variabel sein und zu heterogenen Zellpopulationen führen⁸.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat sich transskriptionsfaktorvermittelte Vorwärtsprogrammierung als leistungsstarke^Alternative erwiesen. Dieses Protokoll verwendet ein doxycyclin-induzierbares Expressionssystem, um die Expression der proneuralen Transkriptionsfaktoren ASCL1 und DLX2¹⁰ zu steuern. Indem diese Transgene mit CRISPR/Cas9 auf den adeno-assoziierten Virus-Integrationsstandort 1 (AAVS1.) Safe-Harbor-Locus gezielt werden, umgeht diese Methode das häufige Problem der Transgen-Silencing, die mit zufälliger lentiviraler Integration¹⁰ verbunden ist. Das Spenderkonstrukt enthält einen fluoreszierenden Reporter wie mCherry, um transgenpositive Zellen nach Selektion zu überwachen. Diese Strategie soll eine homogenere Transgenexpression unterstützen als zufällige Integrationsansätze, wobei jedoch Expressionsstabilität und Differenzierungsreproduzierbarkeit für jede ingenieurisierte Linie validiert werden sollten. Diese standardisierte Methode erzeugt in etwa 21 Tagen angereicherte Populationen induzierter Neuronen, die GABAerge Linienmarker exprimieren, ein kürzerer Zeitraum als bei traditionellen kleinen Molekül-Annähern^{von 8,10}. Dieses Protokoll ist besonders geeignet für Forscher, die skalierbare, konsistente neuronale Populationen für nachgelagerte Anwendungen wie Hochgehaltsmikroskopie, Einzelzelltranskriptomik oder funktionelle physiologische Tests benötigen.

Protokoll

VORSICHT: Humane HiPSC-Kulturen sollten im Rahmen institutioneller Biosicherheitsverfahren als potenziell biologisch gefährliches Material behandelt werden. Führen Sie alle menschlichen HiPSC-Kulturverfahren in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II unter steriler Technik durch. Alle Abfälle, die menschliche Zellen, Medien mit menschlichen Zellen und CRISPR/Cas9-Plasmidmaterial enthalten, sollten gemäß den lokalen Biosicherheitsrichtlinien vor der Entsorgung desinfiziert werden. Doxycyclin, Puromycin, DMSO und andere chemische Reagenzien sollten mit Handschuhen und angemessenem Augen- und Hautschutz behandelt werden, und Abfälle sollten gemäß institutionellen Verfahren für chemische Abfälle entsorgt werden. Basementmembran-Extrakt (BME) sollte mit steriler Technik behandelt und vor der Anwendung auf Eis gelagert werden, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern. Die Lagerung von flüssigem Stickstoff und die Kryoviale Behandlung sollten mit geeigneten kryogenen Handschuhen, Gesichtsschutz und Vorsicht erfolgen, um Kälteverbrennungen oder eine Explosion des Fläschchens während des Auftauens zu vermeiden.

HINWEIS: Vor CRISPR/Cas9-vermittelter Editierung und neuronaler Differenzierung sollten hiPSC-Kulturen vordefinierte Qualitätskontrollkriterien erfüllen. Die Zellen müssen negativ auf Mycoplasma bestätigt sein, einen normalen Karyotyp oder ein akzeptables genomisches Integritätsprofil aufweisen und eine robuste Expression von Pluripotenzmarkern wie OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 und/oder SSEA4 aufrechterhalten. Kulturen sollten eine typische kompakte HiPSC-Koloniemorphologie aufweisen, mit einem hohen Verhältnis von Kern zu Zytoplasma, definierten Koloniegrenzen und minimaler spontaner Differenzierung. Es sollten nur aktiv proliferierende Kulturen innerhalb des empfohlenen Durchgangsbereichs verwendet werden, und die Zellen sollten die im Labor definierte maximale Durchgangsanzahl, typischerweise unter Passage 40, nicht überschreiten, sofern nicht anders validiert. Kulturen mit abnormaler Morphologie, übermäßiger spontaner Differenzierung, schlechtem Wachstum, bestätigter Kontamination oder Hinweisen auf genomische Instabilität sollten von Editier- und Differenzierungsexperimenten ausgeschlossen werden. Alle für dieses Protokoll benötigten Materialien, einschließlich Medienrezepte, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von Reagenzien und Kulturplatten

1. Bereite das Gefriermedium vor, indem du 40 mL Knock-out-Serumersatz (KOSR) und 10 mL Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem 50 mL konischen Rohr kombinierst.
2. Homogenisiere das Gefriermedium, indem du zehnmal auf und ab pipetterst. Lagern Sie die Lösung bis zu einem Monat bei 4 °C.
3. Verdünnen Sie den Basalmembranextrakt (BME) im Medium Dulbeccos Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) bei einer Endkonzentration von 80 μg/mL.
   HINWEIS: Vor der Verdünnung sollten Sie die Konzentration der erhaltenen BME-Lösung anhand der Chargennummer auf der Website des Anbieters überprüfen.
4. Fügen Sie pro Bohrloch 1 ml des verdünnten BME zu einer 6-Well-Platte hinzu. Setzen Sie das BME sofort auf 4 °C für bis zu 1 Monat zurück.
5. Kippen Sie die Platte, um die Lösung gleichmäßig über die gesamte Oberfläche der Brunnen zu verteilen. Stellen Sie sicher, dass keine unbeschichteten Stellen vorhanden sind.
6. Inkubieren Sie den Teller mindestens 30 Minuten bei 37 °C vor der Benutzung.
   HINWEIS: Es gibt keine maximale Inkubationszeit. Wenn man länger als einen Tag inkubiert, achte darauf, dass das DMEM/F-12 nicht verdampft. Die für einen Brunnen verwendete BME-Lösung kann nur einmal wiederverwendet werden, um einen zweiten Brunnen zu beschichten. Die Manipulation von BME bei Raumtemperatur sollte aufgrund seiner schnellen Polymerisation kurz erfolgen.

2. Wartung und Weitergabe von hiPSCs

HINWEIS: In diesem Protokoll bezieht sich das hiPSC-Wartungsmedium auf mTeSR plus. mTeSR plus ist das empfohlene Medium für routinemäßige Pflege, Passaging, Erholung nach Nukleofektion und Puromycin-Selektion.

1. Führen Sie etwa alle 4–6 Tage eine HiPSC-Passaging durch, wenn die Zellen 60 % Konfluenz erreichen.
2. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Brunnen mit einer Aspirationspipelette.
3. Gib 1 ml ReLeSR in den Brunnen und inkubiere 30 Sekunden bei Zimmertemperatur.
4. Aspirieren Sie das Dissoziationsreagenz und inkubieren Sie die Platte 8 Minuten lang bei 37 °C.
5. Gib vorsichtig 1 ml hiPSC-Pflegemedium mit einer 5-ml-Pipette hinzu. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-mL-Rohr.
6. Mischen Sie 10 μL der Zellsuspension mit 10 μL Trypanblau in einem Mikrozentrifugenrohr. Laden Sie 10 μL der Mischung auf einen Zellzähler-Objektträger, um die lebensfähige Zellkonzentration zu bestimmen.
7. Aspiriere die BME-Beschichtung aus einem zuvor vorbereiteten Brunnen. Fügen Sie 2 ml hiPSC-Pflegemedium hinzu, ergänzt durch den Rho-assoziierten Coiled-Coil-Kinase (ROCK)-Inhibitor (Y-27632; 10 μM final).
8. Säe 100.000 hiPSCs in den Brunnen mit dem Ziel einer >90%-Viabilität. Bewegen Sie die Platte in einer Acht-Bewegung, um eine homogene Verteilung der Zellen sicherzustellen.
9. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 %_CO2.
10. Nach 24 Stunden ersetze das Medium durch 2 ml frisches mTeSR plus Medium ohne ROCK-Inhibitor.
    HINWEIS: Eine vorübergehende Änderung der Zellmorphologie (Zellverlängerung) wird in Anwesenheit des ROCK-Inhibitors erwartet. Überprüfen Sie, dass die Zellen nach der Entfernung ihre charakteristische Morphologie wiedererlangen.

3. Nukleofektion von hiPSCs

1. Lassen die Zellen passieren, wenn der Zusammenfluss etwa 60 % erreicht.
   HINWEIS: In diesem Protokoll entsprechen etwa 60 % der Konfluenz aktiv wachsenden HiPSC-Kolonien, die etwas mehr als die Hälfte der Bohrlochoberfläche bedecken, mit sichtbarem Abstand zwischen den Kolonien und minimaler spontaner Differenzierung. Kolonien sollten zum Zeitpunkt der Nukleofektion nicht überwuchert, stark verschmelzen oder dichte, mehrschichtige Zentren aufweisen.
2. Stellen Sie sicher, dass das Nukleofektionsgerät eingeschaltet und das Nukleofektionssupplement zur Nukleofektionslösung P3 hinzugefügt wird. Bereite einen Eiskübel vor.
3. Geben Sie 110 μL der Nukleofektionslösung P3 in ein auf Eis gestelltes Mikrozentrifugenrohr.
4. Fügen Sie dem Röhrchen 1 μg des CRISPR/Cas9-Plasmids und 1 μg des Spenderplasmids mit dem doxycyclininduzierbaren ASCL1-P2A-DLX2. Kassette, Fluoreszieren-Reporter und Puromycin-Widerstandskassette hinzu. Sanft mischen, ohne Blasen hinzuzufügen.
5. Bereite die Zielplatte vor, indem du das BME aus zwei beschichteten Bohrlöchern aspirierst. Fügen Sie jedem Bohrloch 2 ml hiPSC-Wartungsmedium mit einem ROCK-Inhibitor hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C.
6. Dissoziiere hiPSCs bei 60 % Konfluenz aus einem Brunnen einer 6-Well-Platte, wie in den Schritten 2.2 bis 2.5 beschrieben. Die Suspension in ein steriles Rohr übergeben und bei Raumtemperatur 5 Minuten bei 500 x g zentrifugieren.
7. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in den 110 μL der Nukleofektionslösung P3, die die Plasmide enthält. Pipette vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden.
8. Übertragen Sie 100 μL der Zellsuspension in eine Nukleofektionscuvette, die auf Eis gelegt wird.
9. Führen Sie die Cuvette in das Nukleofector-Gerät ein und führen Sie das CB-150-Programm für hiPSCs aus.
10. Die Zellen werden sofort mit einer Plastik-Pasteur-Pipette entnommen. Gleiche Volumen der Zellsuspension werden in die beiden zuvor vorbereiteten Brunnen übertragen.
11. Verteilt die Zellen mit einer Acht-Bewegung und inkubiert bei 37 °C.
12. Nach 24 Stunden ersetzen Sie das Medium durch mTeSR plus Medium ohne ROCK-Inhibitor. Überprüfen Sie die Nukleofektionseffizienz durch Beobachtung der Fluoreszenz, falls anwendbar.

4. Antibiotika-Auswahl

VORSICHT: Puromycin ist giftig. Behandeln Sie mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und entsorgen Sie Abfall gemäß den institutionellen Vorgaben.

HINWEIS: Bevor Sie bearbeitete hiPSCs auswählen, bestimmen Sie die optimale Puromycinkonzentration für jede HiPSC-Linie. Säe unbearbeitete hiPSCs bei 100.000 Zellen pro Bohrloch in einer BME-beschichteten 6-Well-Platte in einem hiPSC-Erhaltungsmedium, ergänzt mit ROCK-Inhibitor. Nach 24 Stunden wird das Medium durch ein frisches hiPSC-Erhaltungsmedium mit Puromycin bei 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 und 1,5 μg/ml ersetzt. Täglich puromycinhaltiges Medium ersetzen und die Zellmorphologie sowie das Überleben mit einer Brightfield-Mikroskopie 5 Tage lang überwachen. Die ausgewählte Konzentration sollte alle unbearbeiteten HiPSCs innerhalb von 3–5 Tagen eliminieren und gleichzeitig eine übermäßige Toxizität minimieren. In diesem Protokoll liegt die optimale Puromycinkonzentration typischerweise bei 0,4–0,6 μg/mL.

1. Warten Sie nach der Nukleofektion 3 Durchgänge, typischerweise etwa 1–2 Wochen je nach Erholung und Wachstumsrate, um den Verlust der nicht-integrierten Plasmide einzuplanen, bevor mit der Selektion begonnen wird.
2. Führen Sie einen Zelldurchgang durch und säen Sie 100.000 Zellen pro Bohrloch.
3. Nach 24 Stunden wird Puromycin in der durch die Killkurve bestimmten Konzentration hinzugefügt, typischerweise 0,4–0,6 μg/mL.
4. Halten Sie die Puromycin-Auswahl für die festgelegte Dauer aufrecht, in der Regel etwa 5 Tage.
5. Validieren Sie die ausgewählte Population mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie, um den Anteil der berichterpositiven Zellen zu schätzen.
   HINWEIS: Gehen Sie nur mit gepoolten Populationen fort, die eine überwiegend homogene Reporterexpression zeigen, idealerweise >80–90 % reporter-positive Zellen. Wenn die Reporterexpression weiterhin Mosaik bleibt, erweitern Sie die Selektion, wiederholen Sie die Anreicherung oder ziehen Sie die klonale Isolierung vor der Differenzierung in Betracht.
6. Korrektes AAVS1-Targeting durch Junction-PCR bestätigen, bevor die neuronale Differenzierung eingeleitet wird.
7. Wenn eine strenge Validierung erforderlich ist, verifizieren Sie PCR-Produkte mittels Sanger-Sequenzierung und bewerten Sie die Transgen-Kopienzahl mittels qPCR, ddPCR oder einem anderen geeigneten Kopienzahl-Test.
8. Bewerten Sie zufällige Integration mit PCR-basierten Assays für Plasmid-Backbone-Sequenzen oder einer breiteren genomweiten Integrationsanalyse, je nach beabsichtigter nachgelagerter Anwendung.
9. Bestätigen Sie, dass die ausgewählte HiPSC-Population Mycoplasma-negativ bleibt, die typische HiPSC-Koloniemorphologie beibehält und nach der Auswahl von Puromycin robustes Wachstum aufrechterhält.
10. Bewerten Sie die genomische Integrität neu durch Karyotypisierung, SNP-Array oder einen anderen validierten Test, insbesondere wenn bearbeitete Zellen für Krankheitsmodellierung, funktionelle Assays oder Langzeitstudien verwendet werden.
11. Bewerten Sie potenzielle Off-Target-Effekte von CRISPR/Cas9 durch gezielte Sequenzierung vorhergesagter Off-Target-Standorte oder, wenn erforderlich, breitere genomische Ansätze.
    HINWEIS: Verwenden Sie keine Kulturen zur Differenzierung, wenn sie eine abnormale Morphologie, schlechte Erholung nach Selektion, anhaltende Mosaik-Reporter-Expression, bestätigte genomische Anomalien oder gescheiterte AAVS1-Integration zeigen. In diesem Protokoll werden ausgewählte technisch hergestellte HiPSCs als gepoolte Population verwendet und können vor der Doxycyclin-Induktion kryokonserviert werden, sobald die Reporterexpression AAVS1 erfolgt. Zielsetzung, Morphologie und Wachstum wurden validiert. Die Kryokonservierung nach der Doxycyclin-Einleitung oder während der neuronalen Reifung ist nicht Teil des Standardablaufs und sollte empirisch vor der Anwendung validiert werden.

5. Differenzierung in GABAerge Neuronen

1. Bereiten Sie die erforderliche Anzahl von BME-beschichteten Brunnen vor. Beachte, dass ein Gut am Tag 0 ausgesaatene Bohrloch einen Brunnen mit GABAergen Neuronen liefert.
2. Bereiten Sie 6,9 ml Neuro-Induktionsmedium pro Bohrloch vor, ergänzt durch Doxycyclin (1 μg/mL). Beziehen Sie ein Überschussvolumen von 15 % ein, um Verdunstungs- oder Pipettierungsfehler auszugleichen.
   HINWEIS: Doxycyclin wird ab Tag 0 in einer Endkonzentration von 1 μg/mL verwendet und während der Differenzierung und Reifung aufrechterhalten. Bei jedem Mediumwechsel wird ein frisches, doxycyclinhaltiges Medium hergestellt, um eine konstante Transgeninduktion aufrechtzuerhalten. Diese Dosis wurde ausgewählt, weil sie eine robuste Expression des Reporters und eine effiziente neuronale Umwandlung in unseren Händen ermöglichte. In diesem Protokoll wurde keine formelle Doxycyclin-Dosis-Reaktion durchgeführt; daher können Labore, die die Methode anpassen, empirisch 0,1–2 μg/mL Doxycyclin testen, wenn die Transgeninduktion suboptimal erscheint.
3. Am Tag 0 werden die hergestellten hiPSCs dissoziiert und 200.000 Zellen in die vorbereiteten, mit BME beschichteten Brunnen ausgesaat. Inkubieren bei 37 °C.
4. An den Tagen 1, 2 und 3 aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 2 ml frisches Neuro-Induktionsmedium mit Doxycyclin hinzu.
   HINWEIS: Ab Tag 3 sollte die Zellexpansion deutlich abnehmen, und dendritische Strukturen können entstehen. Wenn eine experimentelle Bestätigung des Zellzyklusaustritts erforderlich ist, kann eine Ki-67-Immunfärbung oder die Inkorporation von EdU/BrdU am Tag 3–4 durchgeführt werden.
5. Am 4. Tag bereiten Sie ein Neuroreifungsmedium vor, das Gehirn-abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF), glialzelllinien-abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) und Neurotrophin-3 (NT-3) enthält, jeweils mit einer Endkonzentration von 10 ng/mL, Doxycyclin bei 1 μg/mL und PluriSln bei 20 μM.
6. Aspiriere das Neuro-Induktionsmedium. Fügen Sie vorsichtig 2 ml des Neuro-Reifungsmediums tropfen für tropfen entlang der Wand des Bohrlochs hinzu, um die neu gebildeten Neuronen nicht zu stören.
7. Am 7. Tag aspirieren Sie das Medium und fügen Sie vorsichtig 2 ml Neuro-Reifungsmedium mit den Neurotrophinen und Doxycyclin hinzu, wobei der pluripotente Zellüberlebenshemmer weggelassen wird.
8. Zur langfristigen Erhaltung sollte das Neuroreifungsmedium alle 3 bis 4 Tage vollständig ersetzt werden, wobei die Häufigkeit an die Zelldichte angepasst wird.
   HINWEIS: Tag 21 ist der Standardendpunkt zur Beurteilung der GABAergen neuronalen Identität. Bis zum 21. Tag sollten die Zellen GABAerge neuronale Merkmale zeigen, einschließlich DLX1.Ausdruck und ihre axonalen Netzwerke weiter reifen. Eine Aussaatdichte von 200.000 Zellen pro Brunnen wurde empirisch ausgewählt, um gut verteilte Kolonien zu bilden und gleichzeitig Überbelegung und reifungsbedingten Zelltod zu vermeiden. Dichten von 150.000–300.000 Zellen pro Bohrloch sind kompatibel, wobei niedrigere Dichten für die Morphologie und höhere für die Materialgewinnung bevorzugt werden. Um die Ablösung zu reduzieren, führen Sie häufigere Halbmediumwechsel mit einer 1.000 μL-Pipette bei geringem Durchfluss ohne Kippen der Platte vor. Bei Bedarf können die Zellen einmal nach der dreitägigen Doxycyclin-Induktion neu beschichtet werden, bevor das Reifemedium hinzugefügt wird, wobei verstärkte Beschichtungen wie Poly-L-Lysin/Laminin oder Laminin-521 verwendet werden. Weiteres Sterben nach Beginn der Reifung sollte vermieden werden.
9. Kulturen können über Tag 21 hinaus für eine verlängerte Reifung erhalten bleiben, sofern Netzwerke verbunden, lebensfähig und frei von sich proliferierenden hiPSC-ähnlichen Kolonien bleiben. Nach Tag 21 werden alle 3–4 Tage Halbmediumwechsel mit frischem Neuroreifungsmedium durchgeführt, das Doxycyclin und neurotrophe Faktoren enthält.
   HINWEIS: Verwenden Sie Kulturen für nachgelagerte Assays, sobald die neuronale Morphologie und Neuritennetzwerke stabil sind, die Abtrennung minimal ist und keine undifferenzierten Kolonien sichtbar sind. In unseren Händen werden Kulturen typischerweise zwischen Tag 21 und Tag 35 verwendet.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls führt zu einer angereicherten Population induzierter Neuronen mit GABAergen molekularen Merkmalen. Die Strategie basiert auf der gezielten Einführung einer doxycyclin-induzierbaren ASCL1-P2A-DLX2-Kassette in den AAVS1-Locus (Abbildung 1A). Nach der Auswahl der hergestellten hiPSCs wird die Doxycyclin-Induktion verwendet, um die GABAerge neuronale Differenzierung voranzutreiben, wie in de...

Diskussion

Die erfolgreiche Erzeugung von GABAergen Neuronen hängt stark von mehreren kritischen Schritten innerhalb dieses Protokolls ab. Die Aufrechterhaltung hochwertiger, undifferenzierter hiPSCs ist von größter Bedeutung; Spontane Differenzierung vor der Nukleofektion verringert die Integrationseffizienz und die nachgeschaltete neuronale Reinheit⁸ drastisch. Darüber hinaus ist eine präzise Bestimmung der Puromycin-Kill-Kurve unerlässlich, um die vollständige Eliminierun...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4D-Nucleofector™ Core Unit	Lonza	AAF-1002B	Für Elektroporation/Nukleofektion von hiPSCs.
6-Well-Kulturplatten	Sarstedt	83.3920300	Gewebekultur-behandelte Platten für hiPSC-Wartung und -Differenzierung.
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78005	Rekombinantes menschliches Protein für neuronale Reifung; gemäß Herstelleranweisungen vorbereiten und bei einer Endkonzentration von 10 ng/ml verwenden.
Zellzähler (Countess)	Thermo Fisher Scientific	C10283	Zur Zellzählung.
Zentrifuge	VWR	76468-134	Zum Pelletieren von Zellen.
CO2-Inkubator	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i oder Äquivalent	Zellkultur-Inkubator zur Aufrechterhaltung von 37 °C, feuchter Atmosphäre und 5% CO2.
Cryotubes	Thermo Fisher Scientific	5000-0020	Sterile Kryovials für das Einfrieren von hiPSCs; äquivalente äußere Gewinde 1,8–2,0 ml Kryovials können verwendet werden.
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	Bio-Techne	BME001-05	Standard-BME-Beschichtungsmatrix, die im Protokoll verwendet wird. Überprüfen Sie die Chargen-spezifische Stammkonzentration aus dem Bio-Techne-Analysenzertifikat und verdünnen Sie in DMEM/F-12 auf eine Arbeitskonzentration von 80 µg/mL.
DMEM/F-12	Wisent	319-090-CL	Basismedium, das zur Verdünnung von BME verwendet wird.
DMSO (Dimethylsulfoxid)	Sigma-Aldrich	D2650	Kryoprotektor, der bei der Herstellung des Einfriermediums verwendet wird.
Donor-Plasmid: induzierbare ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 Targeting-Kassette	Custom-Plasmid	Addgene-Zugang steht noch aus	Custom AAVS1 Donor-Plasmid, das eine durch Doxycyclin induzierbarer ASCL1-P2A-DLX2 Kassette und Selektions-/Reporter-Elemente enthält. Plasmid-Karte und vollständige Sequenz als Ergänzungsdatei oder auf Anfrage bereitstellen.
Doxycyclin-Hyklat	Sigma-Aldrich	D9891	Zur Induktion der ASCL1-P2A-DLX2 Expression. Sterile Stammlösung herstellen, aliquotieren, vor Licht schützen, eingefroren lagern und bei einer Endkonzentration von 1 µg/mL verwenden.
Ethanol (70%)	Commercial Alcohols / Greenfield Global	P016EAAN	Zur Sterilisation im biologischen Sicherheitsschrank; verwenden Sie institutionell genehmigtes 70% Ethanol oder Äquivalent.
Fluoreszenzmikroskop	ECHO	Revolve R4	Mikroskop zur Phasenkontrast- und Fluoreszenzbildgebung der Reporter-Expression und der neuronalen Morphologie.
GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78058	Rekombinantes menschliches Protein für neuronale Reifung; gemäß Herstelleranweisungen vorbereiten und bei einer Endkonzentration von 10 ng/mL verwenden.
hiPSC-Linie PGP1	EditCo Bio	PGP1 menschliche iPSC-Linie	Kommerziell verfügbare Open-Consent-menschliche iPSC-Linie, die in diesem Protokoll verwendet wird; Passagennummer und QC-Status vor dem Editieren und Differenzieren notieren.
Bildanalyse-Software	ImageJ/Fiji	Open-Source; verwendete Version sollte angegeben werden	Zur Fluoreszenzquantifizierung und zur Verarbeitung repräsentativer Bilder.
KnockOut™ Serumersatz (KOSR)	Thermo Fisher Scientific	10828028	Bei der Herstellung des Einfriermediums verwendet.
Laminin-521	STEMCELL Technologies	200-0117	Optionales Hilfsmittel zur Fehlerbehebung. Nicht Teil des Standard-Beschichtungsprotokolls; kann als Alternative oder Doppelbeschichtungsmatrix verwendet werden, wenn neuronales Ablösen weiterhin auftritt.
Flüssigstickstoff-Dewar	Thermo Fisher Scientific	Locator 6 Plus oder Äquivalent	Langzeitlagerung von eingefrorenen hiPSCs in der Dampfphase oder flüssigem Stickstoff gemäß den institutionellen kryogenen Sicherheitsverfahren.
Mr. Frosty™ Einfriercontainer	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Für kontrolliertes Einfrieren von Zellen bei -80 °C.
mTeSR™ Plus	STEMCELL Technologies	100-0276	Fütterungsfreies Erhaltungsmedium für hiPSCs.
Neuro-Induktionsmedium	STEMCELL Technologies	08582	Kommerzielles Neuro-Induktionsmedium, das für die frühe neuronale Induktion verwendet wird.
Neuro-Reifungsbasismedium (BrainPhys™ Neuronales Medium)	STEMCELL Technologies	05790	Basismedium für neuronale Reifung; gemäß dem Protokoll mit BDNF, GDNF, NT-3, Doxycyclin und PluriSln-1 ergänzen.
NT-3 (Neurotropher Faktor 3)	STEMCELL Technologies	78074	Rekombinantes menschliches Protein für neuronale Reifung; gemäß Herstelleranweisungen vorbereiten und bei einer Endkonzentration von 10 ng/mL verwenden.
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit	Lonza	V4XP-3024	Kit mit Lösung P3 und Küvetten für die hiPSC-Nukleofektion.
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Optionales Antibiotikum zur Reduzierung des Risikos bakterieller Kontamination.
Plasmocin™ prophylaktisch	InvivoGen	ant-mpp	Optionales Antibiotikum zur Verhinderung einer Mykoplasma-Kontamination.
PluriSIn-1	STEMCELL Technologies	72822	Pluripotenter Zellüberlebensinhibitor zur Eliminierung undifferenzierter hiPSCs; gemäß Herstelleranweisungen vorbereiten und bei einer Endkonzentration von 20 µM verwenden.
Puromycin-Dihydrochlorid	Thermo Fisher Scientific	A1113803	Antibiotikum, das zur Selektion verwendet wird; sterile Stammlösung herstellen, aliquotieren, eingefroren lagern und die endgültige Arbeitskonzentration durch eine Abtötungskurve bestimmen, typischerweise 0,4–0,6 µg/mL.
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA Plasmid	Addgene	85802	CRISPR/Cas9 Plasmid, das für AAVS1-Targeting verwendet wird; die AAVS1 gRNA-Sequenz in der Plasmid-Karte oder in den ergänzenden Informationen angeben.
qPCR-Analyse-Software	Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific	QuantStudio Design & Analysis Software oder Äquivalent	Für Ct-Extraktion und RT-qPCR-Analyse; verwendete Softwareversion angeben.
qPCR-Master-Mix	Thermo Fisher Scientific