Klinische Varianteninterpretation mit dem Integrative Genomics Viewer (IGV) für Molekularpathologen

Zusammenfassung

Die Software Integrative Genomics Viewer (IGV) bietet ein umfassendes und intuitives Fenster in die zugrundeliegenden Daten für die klinische Variantenidentifizierung. Hier stellen wir fünf Fallbeispiele vor, die zeigen, wie eine schnelle Unterscheidung zwischen echten pathogenen Ereignissen und Artefakten durchgeführt werden kann, wodurch letztendlich das diagnostische Vertrauen von Anwendern bei der molekularen Befundung von NGS-Assays gestärkt wird.

Zusammenfassung

Der Integrative Genomics Viewer (IGV) ist ein entscheidendes Werkzeug in der klinischen Genomik, das die Visualisierung und Interpretation komplexer Sequenzierungsdaten ermöglicht. Die Verknüpfung klinischer Kenntnisse mit der visuellen Auswertung von Sequenzierungsergebnissen ist die primäre Methode, mit der molekularpathologische und andere Fachkräfte Fälle bewerten und abschließen. Eine Vielzahl von Software-Tools kann dabei unterstützen, doch ihr Verhältnis zu den zugrundeliegenden Daten muss verstanden und systematisch angewendet werden. Diese Studie bietet grundlegende Hintergrundinformationen zu Dateitypen der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) (z. B. FASTQ, BAM, VCF) sowie eine Erläuterung ihres Formats und ihrer Funktion. Anschließend beschreiben wir IGV-Funktionen, die sich aus diesen Dateien ergeben. Wir verwenden eine Reihe kuratierter praktischer Fälle, die auf klinischen Fallbeispielen basieren, anhand derer der Leser mithilfe der IGV-Software klinische NGS-Sequenzierungsdaten analysiert und verschiedene Arten klinisch relevanter Varianten im Verhältnis zum menschlichen Referenzgenom überprüft. Diese klinischen Fallbeispiele wurden so zusammengestellt, dass sie exemplarisch für einige der Komplexitäten bei der Interpretation genomischer Daten stehen und aufzeigen, wie der Einsatz von IGV im routinemäßigen Arbeitsablauf zusätzliche interpretative Informationen zu Varianten liefern kann, die über die standardmäßigen bioinformatischen Algorithmus-Aufrufe hinausgehen. Die visuelle Inspektion genomischer Varianten unter Nutzung der Werkzeuge in IGV kann subtile kontextuelle Hinweise (z. B. Varianten-Allelfrequenz, Strangbias, gewebespezifischer Kontext) offenlegen, die die Interpretation genomischer Varianten beeinflussen können. Obwohl sich diese Studie auf den Einsatz von IGV zur Detektion und Interpretation somatischer Varianten konzentriert, können die dargestellten Anwendungen auch auf Keimbahn-Analysen übertragen werden, einschließlich der Untersuchung komplexer Varianten und des Nachweises von Mosaikformen.

Einleitung

Die Onkologiebehandlung hat sich in den letzten Jahren durch den Einsatz von Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation (NGS) zur Unterstützung von Diagnose, Prognose und Therapieauswahl grundlegend verändert¹. Die NGS-Testung ist mittlerweile zum Standard der Versorgung bei mehreren Tumortypen geworden, um 1) die Diagnose eines molekular definierten Tumors zu stellen, 2) therapieentscheidende biomarkerbasierte Ergebnisse unabhängig vom Tumortyp zu nutzen und 3) die Risikostratifizierung für bestimmte Tumortypen zu bestimmen^2,3. Genaue und zeitnahe Ergebnisse aus NGS- und anderen Biomarker-Tests sind mittlerweile ein entscheidender Bestandteil der Patientenversorgung und -planung in der Onkologie.

NGS-Tests werden typischerweise entweder in großen Referenzlaboren oder in krankenhausgebundenen/akademischen Laboren durchgeführt, sofern die Institutionen über ausreichend Fachkenntnisse und Ressourcen verfügen, um solche Tests zu entwickeln und aufrechtzuerhalten. Die Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) wurde als kollaboratives Netzwerk konzipiert, das auf den Austausch akademischen Wissens und gemeinsame Nutzung von Reagenzkosten fokussiert ist⁴. Ein wesentlicher Schwerpunkt des GOAL-Konsortiums bestand in Schulungsveranstaltungen zu kritischen Komponenten der Überprüfung und Berichterstattung klinischer Studien. Diese wurden als praktische Lehrveranstaltungen konzipiert und beinhalten einen interaktiven Workshop zum integrativen Genomik-Betrachter (IGV), um dessen grundlegende und erweiterte Funktionen in der genomischen Medizin zu demonstrieren.

IGV ist ein Visualisierungstool für Daten, das es Nutzern ermöglicht, NGS-Daten und andere große Datensätze einfach zu überprüfen, da die meisten NGS-Daten ohne grafische Benutzeroberfläche umfangreich und unhandlich sind⁵. IGV wurde ursprünglich nicht für die klinische Variantenanalyse konzipiert. Aufgrund seiner einfachen Handhabung für alle molekularen Fachkräfte, unabhängig von ihrem Bioinformatik-Kenntnisstand, hat es jedoch in vielen Laboren Eingang in den komplexen Workflow zur Datenauswertung gefunden⁶. Diese Studie wurde als Mechanismus entwickelt, um diese Informationen der breiteren Gemeinschaft genombasierter Laborfachkräfte zugänglich zu machen.

Die klinische Notwendigkeit, IGV als Teil eines klinischen Workflows zu verwenden, umfasst die Erkennung von Sequenzierungsfehlern, das Bewältigen von Komplexitäten bei der Identifizierung genomischer Varianten sowie weiterer wiederkehrender Veränderungen, bei denen eine zusätzliche Visualisierung bei der angemessenen Dateninterpretation hilfreich sein kann⁷. Die Verwendung von IGV erfordert standardmäßige bioinformatische Dateien, die aus einer NGS-Studie stammen⁸. Zu den Kernfunktionen der IGV-Software gehört die Visualisierung von Sequenzierungsdaten, wozu eine Konfiguration bestimmter Einstellungen und Optionen für die klinische Varianteninterpretation erforderlich ist (Supplementary File 1).

Der Ablauf der Kurzsequenz-Sequenzierung wird durch die Dateistandards FASTQ, binäre Alignmentskarte (BAM) und Variant Call Format (VCF) gekennzeichnet. NGS erreicht seine hohe Durchsatzleistung, indem es Millionen von kurze Reads parallel. Während diese Strategie die Datenerzeugung erheblich beschleunigt, stellt jeder Read nur ein Fragment der ursprünglichen DNA oder RNA dar. Es ist über seine Adaptersequenz an einer bestimmten Position einer NGS-Flowcell befestigt. Sequenz- und Basenqualitätsinformationen aus der optischen Verarbeitung werden erfasst in FASTQ Dateien. Diese Rohdaten sind Nukleotidsequenzen zusammen mit ihren Qualitätsbewertungen pro Base. Daher besteht ein früher Schritt bei der Verarbeitung der Rohdaten darin, jede Sequenz einem Referenzgenom zuzuordnen.⁸Da jeder Read mit der höchsten Wahrscheinlichkeit einer spezifischen Position im Referenzgenom zugeordnet wird, werden die Reads, die derselben Position entsprechen "ansammeln" an jedem Locus, und solche Daten werden in einer BAM-Datei gemäß den Spezifikationen für die Sequenzalignierung und -kartierung (SAM, Sequence Alignment/Map) gespeichert (verfügbar unter https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf; letzte Überprüfung: 30.09.2025) (Abbildung 1A). Diese Informationen können mit einem Genombrowser wie IGV visuell überprüft werden. Wie in Abbildung 1B, der Vergleich der Reads untereinander oder mit der Referenzsequenz selbst kann Unterschiede oder Diskrepanzen zwischen den Nukleotidsequenzen aufzeigen. Zusammenfassungen lediglich dieser "Variante" Positionen über das gesamte Genom werden in einer VCF-Datei zusammengefasst, die daher viel kleiner sein kann als eine BAM-Datei, aber dennoch einen Großteil der für die Variantenanalyse erforderlichen nützlichen Informationen enthält. Aus diesem Grund ist die VCF-Datei üblicherweise die endgültige Ausgabe von Variantenaufruf-Pipelines.Abbildung 1C). Während FASTQ-Dateien die rohen Reads und Qualitätsdaten enthalten, liefert die BAM-Datei Aufschluss darüber, wie zuverlässig diese Reads auf das Genom aligniert sind, und die VCF-Datei stellt die Unterschiede zwischen der Referenzsequenz und der Probensequenz dar, wodurch eine deutlich überschaubarere Datenmenge für die Überprüfung auf potenzielle Befundung bereitgestellt wird.

Die sechs klinischen Fallbeispiele dieser Studie veranschaulichen häufige analytische Szenarien, die mit der Detektion somatischer Varianten in molekularbiologischen Laboren verbunden sind, sowie die Probleme, die das korrekte Verständnis und die Interpretation der zugrundeliegenden Daten erschweren. Insgesamt wurden diese Fallbeispiele ausgewählt, um zunehmend komplexe interpretative Szenarien darzustellen und zu zeigen, wie die Nutzung fortschrittlicher Funktionen in IGV umfassendere genomische Merkmale besser beschreiben kann. Obwohl sich diese Studie auf die Interpretation somatischer Varianten konzentriert, sind diese Funktionen auch bei der Nutzung von IGV zur Visualisierung und Interpretation keimlinienbedingter Veränderungen anwendbar⁶. Bemerkenswert ist, dass die in diesem Artikel verwendeten Begriffe auf der Sequenzierung-durch-Synthese-Chemie basieren und, wo zutreffend, andere analoge Begriffe bzw. Konzepte für andere Plattformen einbeziehen.

Jeder klinische Fall beginnt mit einem sehr kurzen klinischen Kontext, gefolgt von Anweisungen zur Untersuchung der Variante oder Varianten und zur Klärung der Frage: Welche der vorhandenen Varianten ist echt (falls zutreffend) und welche ist ein Artefakt (falls zutreffend)? Der klinische Kontext zusammen mit den spezifischen Merkmalen der Sequenzierungsdaten ist entscheidend, um diese Frage zu beantworten.

Protokoll

Die hier präsentierten Daten sind eine Mischung aus simulierten und echten NGS-Daten von Patienten. Alle Patientendaten werden jedoch durch eine Kombination aus Entfernung von Kennzeichnungen und Extraktion von Einzel-Lokus-Lesungen anonymisiert. Dieses Protokoll folgt den anwendbaren Leitlinien des Ethikkomitees für Humorforschung aller Institutionen der Autoren.

1. Herunterladen der aktuellsten Version des Integrative Genomics Viewer (IGV)

HINWEIS: IGV ist ein kostenloses, herunterladbares Programm zur Visualisierung verschiedener Genome, einschließlich des menschlichen Genoms (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV wird regelmäßig aktualisiert, um neue Versionen von Transkripten, Merkmalen und Tracks einzuschließen, wobei die aktuellste Version in der Regel oben in der Liste steht.

1. Laden Sie die über die oben angegebene URL verfügbare Datei mit dem Namen „IGV für Windows, Java enthalten“ auf den Desktop herunter, wofür möglicherweise Administratorrechte erforderlich sind, abhängig von der Institution.
2. Wählen Sie den menschlichen Genom-Assembly, der in den Berichten verwendet werden soll (z. B. hg19 oder hg38), der innerhalb von IGV gehostet wird.
   HINWEIS: Diese Studie verwendete IGV 2.19.7. In diesem Protokoll wurde die Version für Windows mit enthaltenem Java heruntergeladen. IGV wurde mit der standardmäßigen Speicherzuweisung von 8 GB RAM ausgeführt. Die in der Registerkarte „Einstellungen“ von IGV und anderen Abschnitten empfohlenen Konfigurationen sind in ergänzender Datei 1 annotiert.

2. Verständnis der klinischen Fallbeispiele und Herunterladen der erforderlichen Dateien

1. Navigieren Sie zum GitHub-Repository: Alle Dateien können aus dem GitHub-Repository https://github.com/Eitan177/Demo_IGV heruntergeladen werden.
   HINWEIS: Im GitHub-Repository befindet sich für jede Vignette eine Sitzungsdatei. Durch das Laden dieser Sitzungsdatei entfällt die Notwendigkeit, die Dateien einzeln zu laden und zum betreffenden Genort zu navigieren, da die Sitzungsdatei diese Schritte übernimmt.
2. Laden Sie eine Sitzungsdatei über das Dateimenü. Klicken Sie auf Datei > Sitzung öffnen und wählen Sie die entsprechende Sitzungsdatei aus.

3. Einrichten der Überlappungsanzeige

HINWEIS: Im Hauptfenster von IGV ist eine "Coverage-Track" enthalten. In bestimmten Kontexten kann bereits ein geringer Anteil an Reads, die spezifische Krebsvarianten enthalten, klinisch bedeutsam sein. Daher ist es entscheidend, eine sehr hohe Read-Tiefe über die untersuchten Genomabschnitte hinweg zu erreichen. Wenn nur 2 % der Reads eine bestimmte Variante enthalten, kann eine Read-Tiefe von mehreren Hundert oder Tausend erforderlich sein, um die Variante zuverlässig nachzuweisen – daher der Begriff "Deep Sequencing".

1. Stellen Sie sicher, dass die Abdeckungsspur vorhanden ist: Klicken Sie im oberen Menü auf Ansicht > Einstellungen und wählen Sie den Reiter Ausrichtungen. Ganz oben auf diesem Reiter befindet sich ein Kästchen mit der Bezeichnung 'Abdeckungsspur anzeigen'. Stellen Sie sicher, dass es aktiviert ist.
2. Stellen Sie einen klinisch signifikanten Schwellenwert für niedrige Variantenanteile sicher: Navigieren Sie zum Reiter Ausrichtungen, wie in Schritt 3.1 beschrieben, und scrollen Sie nach unten, bis das Feld mit der Bezeichnung Abdeckung Allelfrequenz sichtbar ist. Stellen Sie den Wert im Feld auf 0,01 ein und klicken Sie auf Speichern (das Einstellungsfenster sollte sich nach dem Klicken auf Speichern schließen).

4. Einrichten von soft-geclippten Reads

HINWEIS: Diese Einstellung ist äußerst wertvoll für die Detektion größerer struktureller Varianten, wie Gen-Umlagerungen, Kopienzahlveränderungen oder kombinierte Insertions–Deletions-Ereignisse. Die erweiterten Beispiele – beispielsweise solche, die sich auf EGFR-Amplifikationen und -Deletionen konzentrieren – zeigen, wie soft-geclipte Reads das Vorhandensein struktureller Varianten bestätigen können, die andernfalls bei standardmäßigen Variantenidentifizierungsmethoden unentdeckt bleiben könnten.

1. Weiche Clips aktivieren: Klicken Sie im oberen Menü auf Ansicht > Präferenzen, und wählen Sie die Ausrichtungen Tab. Scrollen Sie bis zum Feld nach unten Weiche gekürzte Basen anzeigen und stellen Sie sicher, dass es überprüft ist (Zusatzdatei 1), um teilweise ausgerichtete Reads offenzulegen – also solche, deren Ränder nicht eindeutig auf die Referenz abbilden und "abgeschnitten" aus.

5. Klinische Fallbeispiele

1. Vignettenbeispiel #1: Unterscheidung eines echten KRAS (Kirsten-Ratten-Sarkomvirus-Onkogen-Homolog-)pathogenes Variant von einem Sequenzierungsartefakt
   HINWEIS: Fall A betrifft einen 65-jährigen Mann mit neu diagnostiziertem Lungenadenokarzinom, bei dem die histologische Beurteilung einen Tumoranteil von etwa 80 % ergab. Die NGS-Profilierung identifizierte eine KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C)-Variante, die eine bekannte treibende Mutation im nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) darstellt. Die resultierende Missense-Variante KRAS c.34G>T (p.G12C) tritt bei etwa 13 % der Lungenadenokarzinome auf und berechtigt zur Behandlung mit gezielten Therapien⁹. Fall B betrifft eine 54-jährige Frau mit einem bekannten Sarkom (geschätzte 50 % Tumorgewebe und 50 % normales Gewebe). Die identische KRAS c.34G>Die Variante T (p.G12C) wurde in dieser Probe identifiziert. Allerdings, da KRAS c.34G>T (p.G12C) wird selten in Sarkomen berichtet; sein Vorhandensein weckt daher den Verdacht auf ein mögliches Sequenzierungsartefakt. 
   1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei KRAS.xml)             
      1. Daten laden: Wählen Sie Hg19 im Genom-Auswahlfeld aus, laden Sie die BAM-Datei kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam und navigieren Sie zu chr12:25,398,281–25,403,833, um den Fokus auf den KRAS Genregion. Beachten Sie, dass sich die Indexdatei (gleicher Name wie die BAM-Datei, jedoch mit der Endung .bai) im selben Verzeichnis wie die BAM-Datei befinden muss.  
      2. Untersuchen Sie die Abdeckung und die VAF: Überprüfen Sie das Codon 12 im Exon 2 (NM_004985.5)) und klicken Sie auf die Variantenposition in der Coverage-Anzeige, um die Read-Tiefe an dieser Position anzuzeigen. Beachten Sie eine G→T-Substitution (Transversionsereignis) mit einer VAF von 35 %–40 %, was stark auf eine heterozygote, klonale Treibermutation hindeutet.Abbildung 2A), insbesondere im Kontext einer Tumorzellanteils von etwa 80 %.   
      3. Achten Sie auf Strangbias: Nach Strang farbcodieren (siehe Zusatzdatei 1, Schritt 4) ergibt eine nahezu 50:50-Verteilung der Vorwärts- (rot): Rückwärtsrichtung (blau) in der Lungenprobe.  
      4. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1.1–5.1.1.3 für Fall B, die Sarkomprobe: Laden Sie die BAM-Datei kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam und notieren Sie die <1 % VAF und nahezu ausschließliche Unterstützung durch den Vorwärtsstrang, was auf einen PCR-/Alignierungsartefakt hindeutet (Abbildung 2B).
2. Vignettenbeispiel #2: Korrektur einer Fehlklassifizierung einer Multinukleotid-Variante (MNV)
   HINWEIS: Eine 50-jährige Frau mit metastasierendem Melanom unterzieht sich einer Tumorprofilierung mittels NGS. Die Analyse identifiziert einen potenziellen BRAF (B-Raf-Protonkogen, Serin/Threonin-Kinase) c.1798_1799delinsAA-Mutation. Während BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) ist bei verschiedenen soliden Tumoren häufiger anzutreffen, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) ist relativ spezifisch für Melanom, da UV-Licht eine C > T-Übergänge innerhalb von Dipyrimidinen¹⁰. Gemäß den HGVS-Regeln zwei Einzelnukleotid-Varianten (SNVs) in cis sollte als einzelne MNV bezeichnet werden. In vielen Fällen könnte eine Bioinformatik-Pipeline diese komplexe Variante fälschlicherweise als zwei benachbarte SNVs identifizieren in cis: BRAF c.1798G>A und BRAF c.1799T>A. Da es technische (d. h. auf den Variantenaufruf bezogene) und biologische (cis gegenüber trans Aufgrund dieser Unterscheidungsüberlegungen besteht die Sorge, dass die Mutation zum Zeitpunkt der Befundfreigabe falsch berichtet werden könnte, sofern die Daten während der klinischen Überprüfung nicht visuell überprüft werden.      
   1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei BRAF.xml)           
      1. Daten laden: Wählen Sie Hg38 im Genom-Auswahlfeld aus, laden Sie die BAM-Datei kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam und navigieren Sie zu chr7:140.453.136–140.753.336. Beachten Sie, dass die Indexdatei (gleicher Name wie die BAM-Datei, jedoch mit der Endung .bai) sich im selben Verzeichnis wie die BAM-Datei befinden muss.
      2. Vergrößerung auf Codon 600 von BRAF: Hinweis auf eine GT→AA-Dinukleotidänderung basierend auf benachbarten Positionen der Coverage-Track, die grün und blau statt grau sind, konsistent mit p.V600K. 
      3. Scannen Sie nach zwei einzelnen SNVs, um festzustellen, ob sie in cis oder trans: Beachten Sie, dass beide SNVs denselben Reads zugeordnet sind und sich in cis.  
      4. Untersuchen Sie Strang und Abdeckung: Färben Sie die Reads farblich, um eine ungefähr gleichmäßige Vorwärts-/Rückwärts-Unterstützung anzuzeigen (siehe Zusatzdatei 1, Schritt 4) und eine VAF von über 50 %, die mit einem klonalen Treiber übereinstimmt. Eine Bedeckungsschwellenmarke von 0,01 (siehe Zusatzdatei 1, Schritt 3 der Einrichtung) gewährleistet, dass partielle Subklone (falls vorhanden) sichtbar bleibenAbbildung 2C).  
      5. Beachten Sie den Kontext und die MNV-Nomenklatur: Die beiden Nukleotidveränderungen liegen benachbart zueinander. Basierend auf dem Expertenkonsens werden SNVs, die einen Abstand von weniger als 50 bp aufweisen und auf demselben Sequenzread liegen, als einzelnes Ereignis klassifiziert "komplex" oder "delins" Variante¹¹. 
3. Vignettenbeispiel #3: Untersuchen Sie ein KIT (KIT-Protonkogen, Rezeptortyrosinkinase) Exon-9-Insertion in einem gastrointestinalen Stromatumor (GIST)
   HINWEIS: Ein 58-jähriger männlicher Patient mit einem gastrointestinalen Stromatumor unterzieht sich einer Resektion, und eine NGS-Testung wird angeordnet. Die Ergebnisse zeigen eine mögliche Variante in KIT. KIT Mutationen sind ein häufiger Treiber bei GISTs und treten in etwa 75 % der Fälle auf; sie sind therapeutisch ansprechbar. Nach aktivierenden Mutationen im Exon 11 KIT Aktivierende Mutationen im Exon 9 sind die häufigsten identifizierten Treiber, wobei GISTs mit Exon-9-Mutationen und GISTs mit Exon-11-Mutationen bezüglich der Empfindlichkeit gegenüber Tyrosinkinaseinhibitoren unterschiedlich agieren¹². 
   1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei KIT.xml)
      1. Daten laden: Wählen Sie das Genom Hg19 aus und laden Sie die BAM-Datei KITdupmod2.bam, wobei sichergestellt sein muss, dass sich die Indexdatei (gleicher Name wie die BAM-Datei, jedoch mit der Endung .bai) im selben Verzeichnis befindet. Navigieren Sie zu chr4:55.592.144-55.592.257, was einem Abschnitt von Exon 9 des KIT Gen
      2. Ansicht zusammendrücken: Rechtsklicken Sie auf die Alignmentspur und wählen Sie aus Zerquetscht um die Ansicht zu verkleinern (Abbildung 3A).
      3. Lokalisieren Sie das Insert: Identifizieren Sie die Insertionsmarkierung in Form einer Pfeilspitze unmittelbar oberhalb der Coverage-Spur, positioniert zwischen 55.592.178 und 55.592.179, die auf ein kurzes Insert hinweistAbbildung 3B,C).
      4. Interagieren Sie mit dem Insert: Klicken Sie auf den Pfeil, um die Ansicht zu erweitern, und klicken Sie auf einen der Reads, bei dem die Basen die Lücke füllen, um die Details in einem Popup-Fenster anzuzeigen. Vergleichen Sie die eingefügte Sequenz mit der Referenzsequenz, um festzustellen, ob es sich um eine Duplikation handeltAbbildung 3D,E).
      5. Überprüfen Sie die Abdeckung: Klicken Sie auf die Abdeckungsspur direkt neben dem Insert-Pfeil, um die Anzahl der unterstützenden Reads anzuzeigen. Diese kann mit der Gesamtanzahl der Reads verglichen werden, um die ungefähre Frequenz des Variantenallels (VAF) zu bestimmen, in diesem Fall ~28 %.
      6. Auf Strangbias prüfen: Reads nach Read-Strang sortieren und soft-geclippte Basen anzeigen (siehe Zusatzdatei 1, Abschnitt 3), um einen interessierenden Bereich neben der Insertion in den Reverse Reads darzustellen (Abbildung 3F).
4. Vignettenbeispiel #4: Untersuchen Sie ein EGFR (EGFR-Exon-19-Deletion bei nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC))
   HINWEIS: Eine 70-jährige Patientin mit neu diagnostiziertem nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) unterzieht sich einer chirurgischen Resektion des Tumors. Eine NGS-Analyse wird an einem Gewebeschnitt mit ausreichender Tumorreinheit angeordnet, und die Ergebnisse zeigen eine mögliche Variante in EGFR. Viele EGFR Mutationen sind anfällig für Tyrosinkinaseinhibitoren, und diese Variante könnte sich auf die Therapie und die Prognose des Patienten auswirken¹³.
   1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei EGFR.xml)
      1. Laden Daten: Wählen Sie das Genom Hg19 aus, laden Sie die BAM-Datei EGFRE746_A750delmod.bam und stellen Sie sicher, dass sich die Indexdatei (gleicher Name wie die BAM-Datei, jedoch mit der Endung .bai) im selben Verzeichnis befindet. Navigieren Sie anschließend zu chr7:55.242.420-55.242.513, was einem Abschnitt von Exon 19 entspricht. EGFR Gen
      2. Untersuchen Sie die Deletion mithilfe der Coverage-Spur: Überprüfen Sie die Coverage-Spur, um einen kleinen Bereich mit geringerer Abdeckung zu identifizieren, der nicht an den Enden der Reads liegt (Abbildung 4A,B). Die Untersuchung der Coverage-Spur zeigt eine geringere Abdeckung über einen kleinen Bereich von Exon 19.
      3. Untersuchen Sie die Deletion mithilfe der Reads: Erweitern Sie die Alignmentsicht, um Reads mit einer Alignierungslücke anzuzeigen, dargestellt als schwarze Linie innerhalb des Reads (Abbildung 4C,D).
      4. Berücksichtigen Sie den genomischen Kontext: Untersuchen Sie die Nukleotidsequenz der Referenz, die an der Deletion und in der unmittelbaren Umgebung beteiligt ist. Bewerten Sie den Deletionsbefund im Kontext der Position innerhalb der Referenzsequenz, da Deletionen in Homopolymer- oder repetitiven Regionen möglicherweise Sequenzierungsartefakte darstellen, insbesondere wenn sie mit geringer Variantenallelfrequenz vorliegen. Siehe die Ansicht einer kleinen Deletion Teil von Zusatzdatei 2 für eine detaillierte Beschreibung des Arbeitsablaufs.
5. Vignettenbeispiel #5: Untersuchen EGFR Veränderungen bei einem Patienten mit Glioblastom.
   HINWEIS: Eine 77-jährige Frau mit IDH wildtypisches Glioblastom wird einer NGS-Testung (Next-Generation Sequencing) unterzogen. Ihre Ergebnisse weisen auf ein potenzielles EGFR Kopienzahlvermehrung und ein potenzielles EGFRvIII Umlagerung (Deletion der Exons 2–7). Beide EGFR Verstärkung und die EGFRvIII Veränderungen haben eine prognostische und therapeutische Bedeutung beim Glioblastom. Zudem treten diese beiden Veränderungen häufig gemeinsam auf, was bedeutet, dass das Vorhandensein der einen die Validität der anderen stützen kann, wenn sie in geringen Mengen nachgewiesen wird.
   1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei copynumber.xml):
      1. Daten laden: Wählen Sie das Genom Hg38 aus, laden Sie die Segmentdatei proband.seg und Vergleichsproben, c1.seg-c9.seg, indem Sie sie per Drag & Drop in das IGV-Fenster ziehen. Navigieren Sie zu Chr7.
         HINWEIS: Die aus CNVKit generierten Segmentierungsdateien stehen zum Herunterladen zur Verfügung. Der vollständige Workflow zur Erstellung der Kopienzahlquantifizierung mithilfe von CNVKit liegt außerhalb des Rahmens dieser Studie. Kurz gefasst wurde jedoch CNVKit-Version 0,9,9 (erhältlich unter https://github.com/etal/cnvkit) mit einer vorgefertigten gepoolten Referenz, bestehend aus normalen, euploiden Proben, verwendet. Die Eingabedatei besteht aus einer BED-Datei mit 9.144 genomweit verteilten Positionen der CNV-Backbone-Proben. Ein wichtiger Aspekt hierbei ist, dass die spezifischen Eingabedaten und Parameter der Kopienzahl-Analysepipeline weniger entscheidend sind als die Tatsache, dass alle Proben innerhalb eines Durchlaufs mit identischem Setup verarbeitet werden. Dies erleichtert die Erkennung systematischer Verzerrungen.
      2. Bewerten Sie die Heatmap: Vergleichen Sie die relative Farbintensität zwischen der Probe von Interesse (suchen Sie die Zeile der Heatmap, die dieser Probe entspricht, beschriftet mit) Proband) und andere Proben (c1-9), um echte Kopienzahlveränderungen von Artefakten zu unterscheiden.
         HINWEIS: Der vertikale visuelle Vergleich eines Locus über alle Proben hinweg dient der Identifizierung von Anomalien (qualitative Unterschiede basierend auf Farbunterschieden zwischen den Zeilen, nicht quantitative Unterschiede) an einem bestimmten Locus in jeder Probe im Verhältnis zum Hintergrund. Siehe Abbildung 5 und Analyse von Kopplungszahlveränderungen Abschnitt von Zusatzdatei 2 für detaillierte Schritte.
6. Vignettenbeispiel #6: Untersuchen EGFRvIII bei einem Patienten mit Glioblastom.
   HINWEIS: Derselbe Patient weist ebenfalls Anzeichen einer EGFRvIII Umlagerung (Deletion der Exons 2–7). Beide die EGFR Verstärkung und die EGFRvIII Veränderungen haben eine prognostische und therapeutische Bedeutung beim Glioblastom. Zudem treten diese beiden Veränderungen häufig gemeinsam auf, was bedeutet, dass das Vorhandensein der einen die Validität der anderen stützen kann, wenn sie in geringen Mengen nachgewiesen wird.
   1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei egfr_vIII.xml):
      1. Daten laden: Wählen Sie das Genom Hg19 aus, laden Sie die BAM-Datei des Patienten, proband.bam, und stellen Sie sicher, dass sich die Indexdatei (gleicher Name wie die BAM-Datei, jedoch mit der Endung .bai) im selben Verzeichnis befindet, und navigieren Sie zu EGFR Gen
      2. Visualisieren Sie Bruchstellen von EGFRvIII: Passen Sie die Ansicht an, um die in Frage kommenden Bruchpunkte einzeln zu untersuchen (上游 von Exon 2 und downstream von Exon 7 für EGFRvIII) und führen Sie eine „Sortierung nach Base“ durch  (oder verwenden Sie die Abkürzung Strg+S unter Windows/Linux oder Cmd-s unter Mac) an den Breakpoints, um Anhäufungen von soft-clipped Reads zu visualisieren.
      3. BLAT aligniert Reads: Rechtsklicken Sie auf eine weich gekürzte Sequenz und wählen Sie aus BLAT-Sequenz (IGV verwendet Standardeinstellungen von UCSC, siehe https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html für die BLAT-Standardparameter). Klicken Sie auf die erste Zeile und beobachten Sie die Blat-Track das am unteren Rand des IGV-Spurabschnitts erscheint.
         HINWEIS: Selbst ein einzelner Read, der an die Übergänge von Exon 1/Intron 1 sowie von Intron 6/Exon 7 aligniert, kann ausreichender Nachweis für EGFRvIII, solange eine Kreuzkontamination durch eine andere Probe als Grund für dieses Ergebnis ausgeschlossen werden kann. Verweise auf Abbildung 6 und die Strukturelle Umordnung beobachten Abschnitt von Zusatzdatei 2 für detaillierte Schritte.

Ergebnisse

Hervorzuheben ist, dass diese Studie sich darauf konzentriert, die Feinheiten der Variantenbewertung in IGV für die klinische Berichterstattung zu beschreiben. Die endgültige klinische Berichterstattung sollte von der validierten Pipeline, den Qualitätskriterien und der Berichtsrichtlinie jedes einzelnen Labors abhängen. Eine vollständige Erörterung dieses wichtigen Themas geht über den Rahmen der vorliegenden Studie hinaus; empfohlene Standards und Leitlinien wurden jedoch vom American College of Medical Genetics and Genomics und der Association for Molecular Pathology⁷ zusammengestellt und werden regelmäßig in klinischen Labors umgesetzt.

Interpretation des klinischen Falls #1:

Angesichts des hohen VAF, der ausgewogenen Strangverteilung und der bekannten Häufigkeit von KRAS c.34G>T (p.G12C) beim Lungenkrebs (Abbildung 2A) kann die Variante im Fall A zu einer zielgerichteten Therapie führen und ist daher klinisch von entscheidender Bedeutung. Trotz eines positiven Befunds für dieselbe KRAS-c.34-G>T-Variante im zweiten Fall (Sarkom) (Abbildung 2B) liegen mehrere Warnzeichen für einen falsch-positiven Befund vor: (1) Der angegebene Anteil der variablen Allele (VAF) beträgt etwa 1 %, was deutlich unter dem liegt, was für ein treibendes Ereignis bei einer Probe mit geschätzter, selbst geringer Tumorzellanteiligkeit (20 %) zu erwarten wäre, und (2) die Reads, die diese Variante stützen, weisen eine Strangbias auf und erscheinen nahezu ausschließlich am Vorwärtsstrang. Zusammen mit der fehlenden biologischen Plausibilität für diesen Krebstyp legen die Befunde nahe, dass die Beobachtung im Fall B ein Artefakt darstellt.

Interpretation des klinischen Fallbeispiels #2:

Dieses Vignettenbeispiel veranschaulicht mehrere unterschiedliche Fehler, die Kliniker beachten müssen. Erstens können Variantenaufrufer benachbarte genetische Varianten entweder korrekt oder inkorrekt entweder als zwei SNVs oder als eine einzige MNV aufrufen (Abbildung 2C). Dies liegt an Unterschieden in der Implementierung des haplotypbasierten Variantenaufruf-Algorithmus in somatischen Variantenaufrufern. Nur wenige, erst kürzlich veröffentlichte Variantenaufrufer integrieren diese Funktion^14,15. Zweitens werden technische und nomenklatorische Variationen wie diese von Sequenzierungszentren, die unterschiedliche bioinformatische Pipelines verwenden, in externe Datenbanken eingespeist. Daher können diese mehrere unterschiedliche Einträge enthalten, die eigentlich als eine einzige genetische Variante aufgeführt sein sollten. Sofern keine regelmäßige Phasierung der Datenbankinhalte erfolgt, kann dies eine Vielzahl unerwünschter Auswirkungen auf die klinische Interpretation im Nachgang haben. Insgesamt können diese möglichen Fehlerquellen zusammenwirken und zu einem falschen Patientenbericht führen. Dieses komplexe Szenario unterstreicht den Wert der Variantenvisualisierung mithilfe hochwertiger Software wie IGV.

Interpretation des klinischen Falls #3:

Angesichts der Multi-Read-Unterstützung für die Duplikation und des bekannten Mechanismus der konstitutiven Aktivierung von KIT mit Exon-9-Duplikationen in GIST können wir schlussfolgern, dass dies KIT Die Variante c.1504_1509dup (p.A502_Y503dup) ist echt und kein Artefakt (Abbildung 3). KIT-Mutationen sind häufige Treiber in GISTs und treten in etwa 90 % der Fälle auf. Eine genaue Charakterisierung der Varianten ist hier entscheidend, da zwar Aktivierungsmutationen im Exon 11 am häufigsten vorkommen, GISTs mit Mutationen im Exon 9 sich jedoch hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Tyrosinkinaseinhibitoren anders verhalten, was die therapeutische Herangehensweise beeinflusst. Angesichts der klinischen Bedeutung von KIT Mutationen in GISTs sollten diese Variante in den endgültigen Bericht aufgenommen werden.

Interpretation des klinischen Falls #4:

Angesichts der Abdeckungsspur, des typischen Erscheinungsbilds einer kurzen Deletion, der Reads-Unterstützung und des bekannten Mechanismus der konstitutiven Aktivierung von EGFR-Exon-19-Deletionen beim NSCLC kann geschlossen werden, dass diese EGFR c.2235_2249del (p.E746_A750del)-Variante echt ist und kein Artefakt darstellt (Abbildung 4). Viele EGFR-Mutationen, einschließlich dieser bekannten Exon-19-Deletion, sind hochgradig empfindlich gegenüber Tyrosinkinaseinhibitoren. Angesichts der klinischen Bedeutung von EGFR-Mutationen bei NSCLCs sollte diese Variante in den endgültigen Befund aufgenommen werden.

Interpretation der klinischen Fallbeispiele #5 und #6:

Die Heatmap-Ansichten bestätigen die EGFR-Amplifikation, und die mit BLAT evaluierte Bruchpunktstelle zwischen den Exons 1 und 8 bestätigt beide Befunde bei diesem Patienten (Abbildung 5 und Abbildung 6). Die EGFR-Amplifikation wird allgemein als prognostischer Faktor für eine aggressivere Erkrankung angesehen, und die EGFRvIII-Genumordnung ist ein GBM-spezifischer Biomarker, der potenziell therapeutisch ansprechbar ist^16,17.

Ausgewählte Workflows können mithilfe von Dateien reproduziert werden, die im Hauptzweig des GitHub-Repositories https://github.com/Eitan177/Demo_IGV (aktualisiert am 6.9.2026) gespeichert sind. Das Repository enthält sechs Sitzungsdateien, eine für jeden Abschnitt, fünf Paare aus bam- und bai-Dateien, jeweils eine für jeden Abschnitt, der eine Alignmentsdatei verwendet, sowie 10 seg-Dateien für Abschnitt fünf, der Segmentdateien anstelle von Alignmentsdateien verwendet.

Abbildung 1: NGS-Dateistandards und Sequenzierablauf. (A) Kurze Reads, die auf einer Flowcell erzeugt werden, werden durch optische Messungen verfolgt und im FASTQ-Format gespeichert, das sowohl Sequenzdaten als auch Qualitätsbewertungen pro Base enthält. Diese Reads werden anschließend sortiert und an ein Referenzgenom ausgerichtet, wodurch eine BAM-Datei entsteht, bei der jeder Read an seiner übereinstimmenden Position „aufgestapelt“ ist. (B) Abweichungen zwischen der Referenz und den Reads (z. B. Punktmutationen, kleine Indels) werden mithilfe von Variantenaufruf-Algorithmen identifiziert. (C) Schließlich werden diese erkannten Varianten in einer VCF-Datei zusammengefasst, die ihre Positionen, Referenz- und Alternativbasen sowie weitere Anmerkungsdaten enthält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: IGV-basierte Visualisierung der KRAS-Mutation c.34G>T (p.G12C) und der BRAF-Mutation c.1798_1799delinsAA (p.V600K). (A) Visualisierung einer echten Variante (KRAS c.34G>T (p.G12C)) in IGV, die eine hohe Readtiefe (mehrere tausend Reads) und etwa 35–40 % Reads mit einer G→T-Veränderung zeigt. Vorwärts (rot) und rückwärts (blau) sequenzierte Reads sind ausgewogen, was auf eine echte heterozygote Mutation hindeutet. (B) Verdächtiger Artefakt in nicht-relevantem Gewebe mit einer Variante mit minimalem Read-Unterstützung (1 % VAF). Die meisten varianten Reads stammen von der Vorwärtsschwarm (rot), was auf eine Strangbias hinweist. (C) Eine komplexe Variante BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K), dargestellt in IGV, zeigt eine Zwei-Basen-Substitution (GT→AA) in cis. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Visualisierung einer kleinen Insertion. (A) Die „zusammengedrückte“ Ansicht von KIT Exon 9 in IGV hilft, den Bereich von Interesse zu identifizieren. (B) Bereich von Interesse (roter Kasten), identifiziert durch Visualisierung des Insertionsbalkens und der weich gekürzten Basen. (C) Einstellen der „Erweiterten“ Ansicht in IGV, um die Visualisierung der Insertion zu ermöglichen. (D) Durch Anklicken des Insertionsbalkens (roter Kasten) wird die eingefügte Sequenz angezeigt. (E) Die eingefügte Sequenz wird mit der Referenzsequenz verglichen, um die duplizierten Basen zu identifizieren. (F) Sortierung der Reads nach Read-Strang, wodurch sichtbar wird, dass die weich gekürzten Basen der Insertion in den reversen Reads entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Visualisierung einer kleinen Deletion. (A) „Zusammengedrückte“ Ansicht von EGFR-Exon 19, die die in zahlreichen Reads vorliegende Deletion zeigt. (B) Nutzung der Coverage-Spur, um die Anzahl der Reads an Positionen innerhalb und benachbart zur Deletion zu überprüfen. (C) „Erweiterte“ Ansicht, die die Deletion zeigt und die Anzahl der deletierten Basen identifiziert. (D) Der Vergleich mit der Referenzsequenz (roter Kasten) identifiziert die deletierten Basen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Visualisierung einer Kopienzahlzunahme. (A) Eine seg-Datei enthält sechs Spalten: Proben-ID, Chromosom, Start, Ende, Marker im Segment und Mittelwert des Segments. (B) Das direkte Laden der seg-Dateien in IGV ermöglicht eine übersichtliche Visualisierung. (C) Visualisierung der Daten in einer genomweiten Ansicht. Jede Probe erscheint als eine Datenreihe, wobei Farben Werte angeben: rot für >0 und blau für <0, wobei intensivere Farben Werte darstellen, die weiter von 0 entfernt liegen. Nach dem Öffnen der interessierenden Probe und neun zufälliger Proben derselben Sequenzierung ergeben sich Ergebnisse in Form einer mehrfachen Heatmap mit zehn Reihen. Die interessierende Probe ist unten im roten Kasten hervorgehoben. (D) Bei Verengung der Ansicht auf das EGFR-Lokus ist in der interessierenden Probe unten ein roter Balken sichtbar, während die zufälligen Proben weiße oder blaue Balken aufweisen. Dieser Farbunterschied zwischen der interessierenden Probe und den zufälligen Proben in den anderen Reihen zeigt, dass der Amplifikationsbefund in der interessierenden Probe über dem Hintergrund- oder Rauschpegel an diesem Locus liegt. (E) Bei einer Vergrößerung auf chr7 fällt ein Kontrast zwischen dem Locus mit EGFR in unserer Probe und dessen Abwesenheit in den zufälligen Proben auf. Die EGFR-Amplifikation erscheint als roter Strich in der unteren Probe. (F) Bei Verengung der Ansicht auf das MET-Lokus wird die MET-Amplifikation in unterschiedlichem Ausmaß sowohl in der interessierenden Probe als auch in den neun zufälligen Proben nachvollzogen, was darauf hindeutet, dass dieser Amplifikationsbefund ein Artefakt ist. Dies verdeutlicht den Unterschied im Erscheinungsbild zwischen einem echten Kopienzahlbefund am EGFR-Lokus und einem Artefakt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Visualisierung einer EGFRvIII-Genumordnung. Stellen Sie vor Bearbeitung dieses Falls sicher, dass die Visualisierung weich gekürzter Basen eingerichtet ist (siehe Ergänzende Datei 1 für weitere Einzelheiten). (A) Navigieren Sie zur ersten Kandidatenverbindung und stellen Sie die Ansicht der Alignmentspur auf „Zusammengepresst“ ein. (B) Bewegen Sie sich entlang des Locus und wenden Sie iterativ die Tastenkombination zum Sortieren nach Base, „Strg-s“, an, bis sich am oberen Rand der Alignmentspur eine Ansammlung ähnlich weich gekürzter Reads sichtbar macht. Je größer die Anzahl der ähnlich weich gekürzten Reads (roter Kasten) in der Ansammlung, desto höher die Zuverlässigkeit einer strukturellen Umordnung. (C) Das BLAT-Tool ruft die Sequenz der weich gekürzten Basen ab und identifiziert, wo im Genom diese Sequenz vorhanden ist, zusammen mit einem quantitativen Score, der misst, wie eng die Sequenz mit einer bestimmten Sequenz in einer Ziel-Datenbank übereinstimmt. Die Auswahl einer bestimmten Zeile führt zur entsprechenden Position. (D) Die erneute Verwendung der Funktion „Strg-s“ zum Sortieren nach Base zeigt eine Ansammlung von weich gekürzten Reads, diesmal auf der gegenüberliegenden Seite der Reads. Um zu bestätigen, dass bezüglich der Referenz hg38 keine zusätzlichen Basen im Probenmaterial vorhanden sind, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf einen Read mit einer Sequenz weich gekürzter Basen und führen Sie erneut BLAT mit den weich gekürzten Basen durch. Die resultierende Tabelle zeigt den ersten Bruchpunkt der Verbindung, den ursprünglich visualisierten Locus, die Exon-1-Intron-1-Verbindung. (E) Die Auswahl der obersten Zeile kehrt zum ersten Bruchpunkt zurück. Die Basen an der Verbindungsstelle des BLAT-Referenzalignments stimmen mit den als Abfrage verwendeten weich gekürzten Basen überein, was darauf hinweist, dass die gesamte Sequenz der weich gekürzten Reads in der Referenzsequenzalignierung enthalten ist. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zusatzdatei 1: Empfohlene IGV-Einrichtung.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 2: Zusammengefasste Arbeitsabläufe.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Eine genaue Variantenanalyse für die klinische Berichterstattung hängt von komplexen bioinformatischen Algorithmen und der Einbeziehung einer visuellen Überprüfung komplexer Varianten mithilfe von IGV^5,6 ab. Diese Studie wurde durchgeführt, um eine prägnante Ressource empfohlener Einstellungen zur Visualisierung einfacher und komplexer genomischer Veränderungen in IGV zusammenzustellen (Zusatzdatei 1). Der Fokus dieser Studie liegt auf häufigen somatischen Veränderungen und der Vorgehensweise zu deren Überprüfung in IGV.

Das Protokoll beginnt mit der Bewertung einer einfachen Substitutionsmutation (Abbildung 2A) und einer komplexen Substitutionsmutation (Abbildung 2C), wobei insbesondere darauf geachtet wird, ob der identifizierte Befund echt ist oder ein Artefakt darstellt. Anschließend werden eine einfache Insertion (Abbildung 3) und eine einfache Deletion (Abbildung 4) behandelt, wobei hervorgehoben wird, wie diese Veränderungen in IGV aussehen. Zuletzt werden komplexe genomische Veränderungen diskutiert, einschließlich Kopienzahlveränderungen (Abbildung 5) und struktureller Umarrangierungen (Abbildung 6). Zusammengefasste Arbeitsabläufe, die die wichtigsten Schritte für jede dieser Veränderungen hervorheben, sind in Zusatzdatei 2 dargestellt. Diese Studie soll dem Leser vermitteln, wie unterschiedliche genomische Veränderungen in IGV⁵ erscheinen.

Beachten Sie, dass IGV nicht als Pipeline-Tool zur eigenständigen Detektion von Varianten verwendet wird. Obwohl dies außerhalb des Rahmens dieser Veröffentlichung liegt, sollten Laborrichtlinien und -verfahren Berichterstattungspflichtige Varianten unter Berücksichtigung der Validierungsgrenzen des Assays hinsichtlich der Anteile der Variantenallele und der Abdeckungstiefe adressieren; außerdem wird dringend empfohlen – und für klinische Labore ist es erforderlich – festzulegen, ob unter bestimmten Umständen eine orthogonale Bestätigung der Varianten notwendig ist, wie mit Komplexitäten durch die Versionierung der Bioinformatik-Software umgegangen werden soll und wie interindividuelle Unterschiede bei der visuellen Interpretation gehandhabt werden^1,7.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BLAT	BLAT-Genomsuche	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat	Eigenständige BLAT-Webseite. Die BLAT-API ist innerhalb von IGV verfügbar, kein zusätzlicher Installationsaufwand erforderlich
CNVKit	GitHub	https://github.com/etal/cnvkit	Öffliches GitHub-Repository mit CNVKit zum kostenlosen Download. Anleitungen zum Herunterladen und Ausführen von CNVKit sind ebenfalls hier verfügbar.
Vergleichssegmentdatei #1 für Vignettenbeispiel #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.seg	Kopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #2 für Vignettenbeispiel #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.seg	Kopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #3 für Vignettenbeispiel #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.seg	Kopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #4 für Vignettenbeispiel #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.seg	Kopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #5 für Vignettenbeispiel #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.seg	Kopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #6 für Vignettenbeispiel #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.seg	Kopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #7 für Vignettenbeispiel #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.seg	Kopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #8 für Vignettenbeispiel #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.seg	Kopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei für Vignettenbeispiel #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.seg	Kopienzahldateien
Menschliche Genomsequenz	Menschliche Genomsequenz	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gz	Herunterladbare FASTA-Datei mit dem Hg38-Menschen-Genom-Release.  Diese ist innerhalb von IGV verfügbar, kein zusätzlicher Download erforderlich
Menschliche Genomsequenz	Menschliche Genomsequenz	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gz	Herunterladbare FASTA-Datei mit dem Hg19-Menschen-Genom-Release. Diese ist innerhalb von IGV verfügbar, kein zusätzlicher Download erforderlich
IGV-Softwarepaket	IGV-Software	https://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exe	IGV-Softwareversion 2.19.7 mit Java (JDK 21), kostenlos zum Download. Der Link hier ist für Windows, Links für Linux und Mac sind ebenfalls verfügbar.
Segmentdatei für Vignettenbeispiel #5 Fall	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.seg	Kopienzahldateien
Tutorial-GitHub-Repository	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/main	Öffentliches GitHub-Repository mit allen notwendigen Dateien, um die sechs Vignettenbeispiele nachzuvollziehen
Vignettenbeispiel #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xml	Sitzungsdateien
Vignettenbeispiel #1 Fall A bai-Index	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam.bai	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #1 Fall A BAM-Ausrichtungsdatei	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #1 Fall B bai-Index	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam.bai	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #1 Fall B BAM-Ausrichtungsdatei	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xml	Sitzungsdateien
Vignettenbeispiel #2  bai-Index	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #2  BAM-Ausrichtungsdatei	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xml	Sitzungsdateien
Vignettenbeispiel #3 bai-Indexdatei	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bai	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #3 BAM-Ausrichtungsdatei	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bam	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xml	Sitzungsdateien
Vignettenbeispiel #4 Ausrichtungsdatei	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bam	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #4 bai-Index	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bai	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xml	Sitzungsdateien
Vignettenbeispiel #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xml	Sitzungsdateien
Vignettenbeispiel #6 bai-Index	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bai	Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #6 BAM-Ausrichtungsdatei	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bam	Ausrichtungsdateien