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Methodenartikel

Klinische Varianteninterpretation mit dem Integrative Genomics Viewer (IGV) für Molekularpathologen

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DOI:

10.3791/71808

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14. August 2026

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1University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 2University of Michigan, Department of Pathology, 3Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL), 4University of Chicago, Department of Pathology, 5University of Colorado, Department of Pathology, 6University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 7Broad Institute of MIT and Harvard, 8University of California San Diego, Department of Medicine, 9Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Division of Pathology and Laboratory Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Software Integrative Genomics Viewer (IGV) bietet ein umfassendes und intuitives Fenster in die zugrundeliegenden Daten für die klinische Variantenidentifizierung. Hier stellen wir fünf Fallbeispiele vor, die zeigen, wie eine schnelle Unterscheidung zwischen echten pathogenen Ereignissen und Artefakten durchgeführt werden kann, wodurch letztendlich das diagnostische Vertrauen von Anwendern bei der molekularen Befundung von NGS-Assays gestärkt wird.

Zusammenfassung

Der Integrative Genomics Viewer (IGV) ist ein entscheidendes Werkzeug in der klinischen Genomik, das die Visualisierung und Interpretation komplexer Sequenzierungsdaten ermöglicht. Die Verknüpfung klinischer Kenntnisse mit der visuellen Auswertung von Sequenzierungsergebnissen ist die primäre Methode, mit der molekularpathologische und andere Fachkräfte Fälle bewerten und abschließen. Eine Vielzahl von Software-Tools kann dabei unterstützen, doch ihr Verhältnis zu den zugrundeliegenden Daten muss verstanden und systematisch angewendet werden. Diese Studie bietet grundlegende Hintergrundinformationen zu Dateitypen der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) (z. B. FASTQ, BAM, VCF) sowie eine Erläuterung ihres Formats und ihrer Funktion. Anschließend beschreiben wir IGV-Funktionen, die sich aus diesen Dateien ergeben. Wir verwenden eine Reihe kuratierter praktischer Fälle, die auf klinischen Fallbeispielen basieren, anhand derer der Leser mithilfe der IGV-Software klinische NGS-Sequenzierungsdaten analysiert und verschiedene Arten klinisch relevanter Varianten im Verhältnis zum menschlichen Referenzgenom überprüft. Diese klinischen Fallbeispiele wurden so zusammengestellt, dass sie exemplarisch für einige der Komplexitäten bei der Interpretation genomischer Daten stehen und aufzeigen, wie der Einsatz von IGV im routinemäßigen Arbeitsablauf zusätzliche interpretative Informationen zu Varianten liefern kann, die über die standardmäßigen bioinformatischen Algorithmus-Aufrufe hinausgehen. Die visuelle Inspektion genomischer Varianten unter Nutzung der Werkzeuge in IGV kann subtile kontextuelle Hinweise (z. B. Varianten-Allelfrequenz, Strangbias, gewebespezifischer Kontext) offenlegen, die die Interpretation genomischer Varianten beeinflussen können. Obwohl sich diese Studie auf den Einsatz von IGV zur Detektion und Interpretation somatischer Varianten konzentriert, können die dargestellten Anwendungen auch auf Keimbahn-Analysen übertragen werden, einschließlich der Untersuchung komplexer Varianten und des Nachweises von Mosaikformen.

Einleitung

Die Onkologiebehandlung hat sich in den letzten Jahren durch den Einsatz von Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation (NGS) zur Unterstützung von Diagnose, Prognose und Therapieauswahl grundlegend verändert1. Die NGS-Testung ist mittlerweile zum Standard der Versorgung bei mehreren Tumortypen geworden, um 1) die Diagnose eines molekular definierten Tumors zu stellen, 2) therapieentscheidende biomarkerbasierte Ergebnisse unabhängig vom Tumortyp zu nutzen und 3) die Risikostratifizierung für bestimmte Tumortypen zu bestimmen2,3. Genaue und zeitnahe Ergebnisse aus NGS- und anderen Biomarker-Tests sind mittlerweile ein entscheidender Bestandteil der Patientenversorgung und -planung in der Onkologie.

NGS-Tests werden typischerweise entweder in großen Referenzlaboren oder in krankenhausgebundenen/akademischen Laboren durchgeführt, sofern die Institutionen über ausreichend Fachkenntnisse und Ressourcen verfügen, um solche Tests zu entwickeln und aufrechtzuerhalten. Die Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) wurde als kollaboratives Netzwerk konzipiert, das auf den Austausch akademischen Wissens und gemeinsame Nutzung von Reagenzkosten fokussiert ist4. Ein wesentlicher Schwerpunkt des GOAL-Konsortiums bestand in Schulungsveranstaltungen zu kritischen Komponenten der Überprüfung und Berichterstattung klinischer Studien. Diese wurden als praktische Lehrveranstaltungen konzipiert und beinhalten einen interaktiven Workshop zum integrativen Genomik-Betrachter (IGV), um dessen grundlegende und erweiterte Funktionen in der genomischen Medizin zu demonstrieren.

IGV ist ein Visualisierungstool für Daten, das es Nutzern ermöglicht, NGS-Daten und andere große Datensätze einfach zu überprüfen, da die meisten NGS-Daten ohne grafische Benutzeroberfläche umfangreich und unhandlich sind5. IGV wurde ursprünglich nicht für die klinische Variantenanalyse konzipiert. Aufgrund seiner einfachen Handhabung für alle molekularen Fachkräfte, unabhängig von ihrem Bioinformatik-Kenntnisstand, hat es jedoch in vielen Laboren Eingang in den komplexen Workflow zur Datenauswertung gefunden6. Diese Studie wurde als Mechanismus entwickelt, um diese Informationen der breiteren Gemeinschaft genombasierter Laborfachkräfte zugänglich zu machen.

Die klinische Notwendigkeit, IGV als Teil eines klinischen Workflows zu verwenden, umfasst die Erkennung von Sequenzierungsfehlern, das Bewältigen von Komplexitäten bei der Identifizierung genomischer Varianten sowie weiterer wiederkehrender Veränderungen, bei denen eine zusätzliche Visualisierung bei der angemessenen Dateninterpretation hilfreich sein kann7. Die Verwendung von IGV erfordert standardmäßige bioinformatische Dateien, die aus einer NGS-Studie stammen8. Zu den Kernfunktionen der IGV-Software gehört die Visualisierung von Sequenzierungsdaten, wozu eine Konfiguration bestimmter Einstellungen und Optionen für die klinische Varianteninterpretation erforderlich ist (Supplementary File 1).

Der Ablauf der Kurzsequenz-Sequenzierung wird durch die Dateistandards FASTQ, binäre Alignmentskarte (BAM) und Variant Call Format (VCF) gekennzeichnet. NGS erreicht seine hohe Durchsatzleistung, indem es Millionen von kurze Reads parallel. Während diese Strategie die Datenerzeugung erheblich beschleunigt, stellt jeder Read nur ein Fragment der ursprünglichen DNA oder RNA dar. Es ist über seine Adaptersequenz an einer bestimmten Position einer NGS-Flowcell befestigt. Sequenz- und Basenqualitätsinformationen aus der optischen Verarbeitung werden erfasst in FASTQ Dateien. Diese Rohdaten sind Nukleotidsequenzen zusammen mit ihren Qualitätsbewertungen pro Base. Daher besteht ein früher Schritt bei der Verarbeitung der Rohdaten darin, jede Sequenz einem Referenzgenom zuzuordnen.8Da jeder Read mit der höchsten Wahrscheinlichkeit einer spezifischen Position im Referenzgenom zugeordnet wird, werden die Reads, die derselben Position entsprechen "ansammeln" an jedem Locus, und solche Daten werden in einer BAM-Datei gemäß den Spezifikationen für die Sequenzalignierung und -kartierung (SAM, Sequence Alignment/Map) gespeichert (verfügbar unter https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf; letzte Überprüfung: 30.09.2025) (Abbildung 1A). Diese Informationen können mit einem Genombrowser wie IGV visuell überprüft werden. Wie in Abbildung 1B, der Vergleich der Reads untereinander oder mit der Referenzsequenz selbst kann Unterschiede oder Diskrepanzen zwischen den Nukleotidsequenzen aufzeigen. Zusammenfassungen lediglich dieser "Variante" Positionen über das gesamte Genom werden in einer VCF-Datei zusammengefasst, die daher viel kleiner sein kann als eine BAM-Datei, aber dennoch einen Großteil der für die Variantenanalyse erforderlichen nützlichen Informationen enthält. Aus diesem Grund ist die VCF-Datei üblicherweise die endgültige Ausgabe von Variantenaufruf-Pipelines.Abbildung 1C). Während FASTQ-Dateien die rohen Reads und Qualitätsdaten enthalten, liefert die BAM-Datei Aufschluss darüber, wie zuverlässig diese Reads auf das Genom aligniert sind, und die VCF-Datei stellt die Unterschiede zwischen der Referenzsequenz und der Probensequenz dar, wodurch eine deutlich überschaubarere Datenmenge für die Überprüfung auf potenzielle Befundung bereitgestellt wird.

Die sechs klinischen Fallbeispiele dieser Studie veranschaulichen häufige analytische Szenarien, die mit der Detektion somatischer Varianten in molekularbiologischen Laboren verbunden sind, sowie die Probleme, die das korrekte Verständnis und die Interpretation der zugrundeliegenden Daten erschweren. Insgesamt wurden diese Fallbeispiele ausgewählt, um zunehmend komplexe interpretative Szenarien darzustellen und zu zeigen, wie die Nutzung fortschrittlicher Funktionen in IGV umfassendere genomische Merkmale besser beschreiben kann. Obwohl sich diese Studie auf die Interpretation somatischer Varianten konzentriert, sind diese Funktionen auch bei der Nutzung von IGV zur Visualisierung und Interpretation keimlinienbedingter Veränderungen anwendbar6. Bemerkenswert ist, dass die in diesem Artikel verwendeten Begriffe auf der Sequenzierung-durch-Synthese-Chemie basieren und, wo zutreffend, andere analoge Begriffe bzw. Konzepte für andere Plattformen einbeziehen.

Jeder klinische Fall beginnt mit einem sehr kurzen klinischen Kontext, gefolgt von Anweisungen zur Untersuchung der Variante oder Varianten und zur Klärung der Frage: Welche der vorhandenen Varianten ist echt (falls zutreffend) und welche ist ein Artefakt (falls zutreffend)? Der klinische Kontext zusammen mit den spezifischen Merkmalen der Sequenzierungsdaten ist entscheidend, um diese Frage zu beantworten.

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Protokoll

Die hier präsentierten Daten sind eine Mischung aus simulierten und echten NGS-Daten von Patienten. Alle Patientendaten werden jedoch durch eine Kombination aus Entfernung von Kennzeichnungen und Extraktion von Einzel-Lokus-Lesungen anonymisiert. Dieses Protokoll folgt den anwendbaren Leitlinien des Ethikkomitees für Humorforschung aller Institutionen der Autoren.

1. Herunterladen der aktuellsten Version des Integrative Genomics Viewer (IGV)

HINWEIS: IGV ist ein kostenloses, herunterladbares Programm zur Visualisierung verschiedener Genome, einschließlich des menschlichen Genoms (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV wird regelmäßig aktualisiert, um neue Versionen von Transkripten, Merkmalen und Tracks einzuschließen, wobei die aktuellste Version in der Regel oben in der Liste steht.

  1. Laden Sie die über die oben angegebene URL verfügbare Datei mit dem Namen „IGV für Windows, Java enthalten“ auf den Desktop herunter, wofür möglicherweise Administratorrechte erforderlich sind, abhängig von der Institution.
  2. Wählen Sie den menschlichen Genom-Assembly, der in den Berichten verwendet werden soll (z. B. hg19 oder hg38), der innerhalb von IGV gehostet wird.
    HINWEIS: Diese Studie verwendete IGV 2.19.7. In diesem Protokoll wurde die Version für Windows mit enthaltenem Java heruntergeladen. IGV wurde mit der standardmäßigen Speicherzuweisung von 8 GB RAM ausgeführt. Die in der Registerkarte „Einstellungen“ von IGV und anderen Abschnitten empfohlenen Konfigurationen sind in ergänzender Datei 1 annotiert.

2. Verständnis der klinischen Fallbeispiele und Herunterladen der erforderlichen Dateien

  1. Navigieren Sie zum GitHub-Repository: Alle Dateien können aus dem GitHub-Repository https://github.com/Eitan177/Demo_IGV heruntergeladen werden.
    HINWEIS: Im GitHub-Repository befindet sich für jede Vignette eine Sitzungsdatei. Durch das Laden dieser Sitzungsdatei entfällt die Notwendigkeit, die Dateien einzeln zu laden und zum betreffenden Genort zu navigieren, da die Sitzungsdatei diese Schritte übernimmt.
  2. Laden Sie eine Sitzungsdatei über das Dateimenü. Klicken Sie auf Datei > Sitzung öffnen und wählen Sie die entsprechende Sitzungsdatei aus.

3. Einrichten der Überlappungsanzeige

HINWEIS: Im Hauptfenster von IGV ist eine "Coverage-Track" enthalten. In bestimmten Kontexten kann bereits ein geringer Anteil an Reads, die spezifische Krebsvarianten enthalten, klinisch bedeutsam sein. Daher ist es entscheidend, eine sehr hohe Read-Tiefe über die untersuchten Genomabschnitte hinweg zu erreichen. Wenn nur 2 % der Reads eine bestimmte Variante enthalten, kann eine Read-Tiefe von mehreren Hundert oder Tausend erforderlich sein, um die Variante zuverlässig nachzuweisen – daher der Begriff "Deep Sequencing".

  1. Stellen Sie sicher, dass die Abdeckungsspur vorhanden ist: Klicken Sie im oberen Menü auf Ansicht > Einstellungen und wählen Sie den Reiter Ausrichtungen. Ganz oben auf diesem Reiter befindet sich ein Kästchen mit der Bezeichnung 'Abdeckungsspur anzeigen'. Stellen Sie sicher, dass es aktiviert ist.
  2. Stellen Sie einen klinisch signifikanten Schwellenwert für niedrige Variantenanteile sicher: Navigieren Sie zum Reiter Ausrichtungen, wie in Schritt 3.1 beschrieben, und scrollen Sie nach unten, bis das Feld mit der Bezeichnung Abdeckung Allelfrequenz sichtbar ist. Stellen Sie den Wert im Feld auf 0,01 ein und klicken Sie auf Speichern (das Einstellungsfenster sollte sich nach dem Klicken auf Speichern schließen).

4. Einrichten von soft-geclippten Reads

HINWEIS: Diese Einstellung ist äußerst wertvoll für die Detektion größerer struktureller Varianten, wie Gen-Umlagerungen, Kopienzahlveränderungen oder kombinierte Insertions–Deletions-Ereignisse. Die erweiterten Beispiele – beispielsweise solche, die sich auf EGFR-Amplifikationen und -Deletionen konzentrieren – zeigen, wie soft-geclipte Reads das Vorhandensein struktureller Varianten bestätigen können, die andernfalls bei standardmäßigen Variantenidentifizierungsmethoden unentdeckt bleiben könnten.

  1. Weiche Clips aktivieren: Klicken Sie im oberen Menü auf Ansicht > Präferenzen, und wählen Sie die Ausrichtungen Tab. Scrollen Sie bis zum Feld nach unten Weiche gekürzte Basen anzeigen und stellen Sie sicher, dass es überprüft ist (Zusatzdatei 1), um teilweise ausgerichtete Reads offenzulegen – also solche, deren Ränder nicht eindeutig auf die Referenz abbilden und "abgeschnitten" aus.

5. Klinische Fallbeispiele

  1. Vignettenbeispiel #1: Unterscheidung eines echten KRAS (Kirsten-Ratten-Sarkomvirus-Onkogen-Homolog-)pathogenes Variant von einem Sequenzierungsartefakt
    HINWEIS: Fall A betrifft einen 65-jährigen Mann mit neu diagnostiziertem Lungenadenokarzinom, bei dem die histologische Beurteilung einen Tumoranteil von etwa 80 % ergab. Die NGS-Profilierung identifizierte eine KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C)-Variante, die eine bekannte treibende Mutation im nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) darstellt. Die resultierende Missense-Variante KRAS c.34G>T (p.G12C) tritt bei etwa 13 % der Lungenadenokarzinome auf und berechtigt zur Behandlung mit gezielten Therapien9. Fall B betrifft eine 54-jährige Frau mit einem bekannten Sarkom (geschätzte 50 % Tumorgewebe und 50 % normales Gewebe). Die identische KRAS c.34G>Die Variante T (p.G12C) wurde in dieser Probe identifiziert. Allerdings, da KRAS c.34G>T (p.G12C) wird selten in Sarkomen berichtet; sein Vorhandensein weckt daher den Verdacht auf ein mögliches Sequenzierungsartefakt. 
    1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei KRAS.xml)             
      1. Daten laden: Wählen Sie Hg19 im Genom-Auswahlfeld aus, laden Sie die BAM-Datei kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam und navigieren Sie zu chr12:25,398,281–25,403,833, um den Fokus auf den KRAS Genregion. Beachten Sie, dass sich die Indexdatei (gleicher Name wie die BAM-Datei, jedoch mit der Endung .bai) im selben Verzeichnis wie die BAM-Datei befinden muss.  
      2. Untersuchen Sie die Abdeckung und die VAF: Überprüfen Sie das Codon 12 im Exon 2 (NM_004985.5)) und klicken Sie auf die Variantenposition in der Coverage-Anzeige, um die Read-Tiefe an dieser Position anzuzeigen. Beachten Sie eine G→T-Substitution (Transversionsereignis) mit einer VAF von 35 %–40 %, was stark auf eine heterozygote, klonale Treibermutation hindeutet.Abbildung 2A), insbesondere im Kontext einer Tumorzellanteils von etwa 80 %.   
      3. Achten Sie auf Strangbias: Nach Strang farbcodieren (siehe Zusatzdatei 1, Schritt 4) ergibt eine nahezu 50:50-Verteilung der Vorwärts- (rot): Rückwärtsrichtung (blau) in der Lungenprobe.  
      4. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1.1–5.1.1.3 für Fall B, die Sarkomprobe: Laden Sie die BAM-Datei kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam und notieren Sie die <1 % VAF und nahezu ausschließliche Unterstützung durch den Vorwärtsstrang, was auf einen PCR-/Alignierungsartefakt hindeutet (Abbildung 2B).
  2. Vignettenbeispiel #2: Korrektur einer Fehlklassifizierung einer Multinukleotid-Variante (MNV)
    HINWEIS: Eine 50-jährige Frau mit metastasierendem Melanom unterzieht sich einer Tumorprofilierung mittels NGS. Die Analyse identifiziert einen potenziellen BRAF (B-Raf-Protonkogen, Serin/Threonin-Kinase) c.1798_1799delinsAA-Mutation. Während BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) ist bei verschiedenen soliden Tumoren häufiger anzutreffen, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) ist relativ spezifisch für Melanom, da UV-Licht eine C > T-Übergänge innerhalb von Dipyrimidinen10. Gemäß den HGVS-Regeln zwei Einzelnukleotid-Varianten (SNVs) in cis sollte als einzelne MNV bezeichnet werden. In vielen Fällen könnte eine Bioinformatik-Pipeline diese komplexe Variante fälschlicherweise als zwei benachbarte SNVs identifizieren in cis: BRAF c.1798G>A und BRAF c.1799T>A. Da es technische (d. h. auf den Variantenaufruf bezogene) und biologische (cis gegenüber trans Aufgrund dieser Unterscheidungsüberlegungen besteht die Sorge, dass die Mutation zum Zeitpunkt der Befundfreigabe falsch berichtet werden könnte, sofern die Daten während der klinischen Überprüfung nicht visuell überprüft werden.      
    1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei BRAF.xml)           
      1. Daten laden: Wählen Sie Hg38 im Genom-Auswahlfeld aus, laden Sie die BAM-Datei kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam und navigieren Sie zu chr7:140.453.136–140.753.336. Beachten Sie, dass die Indexdatei (gleicher Name wie die BAM-Datei, jedoch mit der Endung .bai) sich im selben Verzeichnis wie die BAM-Datei befinden muss.
      2. Vergrößerung auf Codon 600 von BRAF: Hinweis auf eine GT→AA-Dinukleotidänderung basierend auf benachbarten Positionen der Coverage-Track, die grün und blau statt grau sind, konsistent mit p.V600K. 
      3. Scannen Sie nach zwei einzelnen SNVs, um festzustellen, ob sie in cis oder trans: Beachten Sie, dass beide SNVs denselben Reads zugeordnet sind und sich in cis.  
      4. Untersuchen Sie Strang und Abdeckung: Färben Sie die Reads farblich, um eine ungefähr gleichmäßige Vorwärts-/Rückwärts-Unterstützung anzuzeigen (siehe Zusatzdatei 1, Schritt 4) und eine VAF von über 50 %, die mit einem klonalen Treiber übereinstimmt. Eine Bedeckungsschwellenmarke von 0,01 (siehe Zusatzdatei 1, Schritt 3 der Einrichtung) gewährleistet, dass partielle Subklone (falls vorhanden) sichtbar bleibenAbbildung 2C).  
      5. Beachten Sie den Kontext und die MNV-Nomenklatur: Die beiden Nukleotidveränderungen liegen benachbart zueinander. Basierend auf dem Expertenkonsens werden SNVs, die einen Abstand von weniger als 50 bp aufweisen und auf demselben Sequenzread liegen, als einzelnes Ereignis klassifiziert "komplex" oder "delins" Variante11. 
  3. Vignettenbeispiel #3: Untersuchen Sie ein KIT (KIT-Protonkogen, Rezeptortyrosinkinase) Exon-9-Insertion in einem gastrointestinalen Stromatumor (GIST)
    HINWEIS: Ein 58-jähriger männlicher Patient mit einem gastrointestinalen Stromatumor unterzieht sich einer Resektion, und eine NGS-Testung wird angeordnet. Die Ergebnisse zeigen eine mögliche Variante in KIT. KIT Mutationen sind ein häufiger Treiber bei GISTs und treten in etwa 75 % der Fälle auf; sie sind therapeutisch ansprechbar. Nach aktivierenden Mutationen im Exon 11 KIT Aktivierende Mutationen im Exon 9 sind die häufigsten identifizierten Treiber, wobei GISTs mit Exon-9-Mutationen und GISTs mit Exon-11-Mutationen bezüglich der Empfindlichkeit gegenüber Tyrosinkinaseinhibitoren unterschiedlich agieren12. 
    1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei KIT.xml)
      1. Daten laden: Wählen Sie das Genom Hg19 aus und laden Sie die BAM-Datei KITdupmod2.bam, wobei sichergestellt sein muss, dass sich die Indexdatei (gleicher Name wie die BAM-Datei, jedoch mit der Endung .bai) im selben Verzeichnis befindet. Navigieren Sie zu chr4:55.592.144-55.592.257, was einem Abschnitt von Exon 9 des KIT Gen
      2. Ansicht zusammendrücken: Rechtsklicken Sie auf die Alignmentspur und wählen Sie aus Zerquetscht um die Ansicht zu verkleinern (Abbildung 3A).
      3. Lokalisieren Sie das Insert: Identifizieren Sie die Insertionsmarkierung in Form einer Pfeilspitze unmittelbar oberhalb der Coverage-Spur, positioniert zwischen 55.592.178 und 55.592.179, die auf ein kurzes Insert hinweistAbbildung 3B,C).
      4. Interagieren Sie mit dem Insert: Klicken Sie auf den Pfeil, um die Ansicht zu erweitern, und klicken Sie auf einen der Reads, bei dem die Basen die Lücke füllen, um die Details in einem Popup-Fenster anzuzeigen. Vergleichen Sie die eingefügte Sequenz mit der Referenzsequenz, um festzustellen, ob es sich um eine Duplikation handeltAbbildung 3D,E).
      5. Überprüfen Sie die Abdeckung: Klicken Sie auf die Abdeckungsspur direkt neben dem Insert-Pfeil, um die Anzahl der unterstützenden Reads anzuzeigen. Diese kann mit der Gesamtanzahl der Reads verglichen werden, um die ungefähre Frequenz des Variantenallels (VAF) zu bestimmen, in diesem Fall ~28 %.
      6. Auf Strangbias prüfen: Reads nach Read-Strang sortieren und soft-geclippte Basen anzeigen (siehe Zusatzdatei 1, Abschnitt 3), um einen interessierenden Bereich neben der Insertion in den Reverse Reads darzustellen (Abbildung 3F).
  4. Vignettenbeispiel #4: Untersuchen Sie ein EGFR (EGFR-Exon-19-Deletion bei nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC))
    HINWEIS: Eine 70-jährige Patientin mit neu diagnostiziertem nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) unterzieht sich einer chirurgischen Resektion des Tumors. Eine NGS-Analyse wird an einem Gewebeschnitt mit ausreichender Tumorreinheit angeordnet, und die Ergebnisse zeigen eine mögliche Variante in EGFR. Viele EGFR Mutationen sind anfällig für Tyrosinkinaseinhibitoren, und diese Variante könnte sich auf die Therapie und die Prognose des Patienten auswirken13.
    1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei EGFR.xml)
      1. Laden Daten: Wählen Sie das Genom Hg19 aus, laden Sie die BAM-Datei EGFRE746_A750delmod.bam und stellen Sie sicher, dass sich die Indexdatei (gleicher Name wie die BAM-Datei, jedoch mit der Endung .bai) im selben Verzeichnis befindet. Navigieren Sie anschließend zu chr7:55.242.420-55.242.513, was einem Abschnitt von Exon 19 entspricht. EGFR Gen
      2. Untersuchen Sie die Deletion mithilfe der Coverage-Spur: Überprüfen Sie die Coverage-Spur, um einen kleinen Bereich mit geringerer Abdeckung zu identifizieren, der nicht an den Enden der Reads liegt (Abbildung 4A,B). Die Untersuchung der Coverage-Spur zeigt eine geringere Abdeckung über einen kleinen Bereich von Exon 19.
      3. Untersuchen Sie die Deletion mithilfe der Reads: Erweitern Sie die Alignmentsicht, um Reads mit einer Alignierungslücke anzuzeigen, dargestellt als schwarze Linie innerhalb des Reads (Abbildung 4C,D).
      4. Berücksichtigen Sie den genomischen Kontext: Untersuchen Sie die Nukleotidsequenz der Referenz, die an der Deletion und in der unmittelbaren Umgebung beteiligt ist. Bewerten Sie den Deletionsbefund im Kontext der Position innerhalb der Referenzsequenz, da Deletionen in Homopolymer- oder repetitiven Regionen möglicherweise Sequenzierungsartefakte darstellen, insbesondere wenn sie mit geringer Variantenallelfrequenz vorliegen. Siehe die Ansicht einer kleinen Deletion Teil von Zusatzdatei 2 für eine detaillierte Beschreibung des Arbeitsablaufs.
  5. Vignettenbeispiel #5: Untersuchen EGFR Veränderungen bei einem Patienten mit Glioblastom.
    HINWEIS: Eine 77-jährige Frau mit IDH wildtypisches Glioblastom wird einer NGS-Testung (Next-Generation Sequencing) unterzogen. Ihre Ergebnisse weisen auf ein potenzielles EGFR Kopienzahlvermehrung und ein potenzielles EGFRvIII Umlagerung (Deletion der Exons 2–7). Beide EGFR Verstärkung und die EGFRvIII Veränderungen haben eine prognostische und therapeutische Bedeutung beim Glioblastom. Zudem treten diese beiden Veränderungen häufig gemeinsam auf, was bedeutet, dass das Vorhandensein der einen die Validität der anderen stützen kann, wenn sie in geringen Mengen nachgewiesen wird.
    1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei copynumber.xml):
      1. Daten laden: Wählen Sie das Genom Hg38 aus, laden Sie die Segmentdatei proband.seg und Vergleichsproben, c1.seg-c9.seg, indem Sie sie per Drag & Drop in das IGV-Fenster ziehen. Navigieren Sie zu Chr7.
        HINWEIS: Die aus CNVKit generierten Segmentierungsdateien stehen zum Herunterladen zur Verfügung. Der vollständige Workflow zur Erstellung der Kopienzahlquantifizierung mithilfe von CNVKit liegt außerhalb des Rahmens dieser Studie. Kurz gefasst wurde jedoch CNVKit-Version 0,9,9 (erhältlich unter https://github.com/etal/cnvkit) mit einer vorgefertigten gepoolten Referenz, bestehend aus normalen, euploiden Proben, verwendet. Die Eingabedatei besteht aus einer BED-Datei mit 9.144 genomweit verteilten Positionen der CNV-Backbone-Proben. Ein wichtiger Aspekt hierbei ist, dass die spezifischen Eingabedaten und Parameter der Kopienzahl-Analysepipeline weniger entscheidend sind als die Tatsache, dass alle Proben innerhalb eines Durchlaufs mit identischem Setup verarbeitet werden. Dies erleichtert die Erkennung systematischer Verzerrungen.
      2. Bewerten Sie die Heatmap: Vergleichen Sie die relative Farbintensität zwischen der Probe von Interesse (suchen Sie die Zeile der Heatmap, die dieser Probe entspricht, beschriftet mit) Proband) und andere Proben (c1-9), um echte Kopienzahlveränderungen von Artefakten zu unterscheiden.
        HINWEIS: Der vertikale visuelle Vergleich eines Locus über alle Proben hinweg dient der Identifizierung von Anomalien (qualitative Unterschiede basierend auf Farbunterschieden zwischen den Zeilen, nicht quantitative Unterschiede) an einem bestimmten Locus in jeder Probe im Verhältnis zum Hintergrund. Siehe Abbildung 5 und Analyse von Kopplungszahlveränderungen Abschnitt von Zusatzdatei 2 für detaillierte Schritte.
  6. Vignettenbeispiel #6: Untersuchen EGFRvIII bei einem Patienten mit Glioblastom.
    HINWEIS: Derselbe Patient weist ebenfalls Anzeichen einer EGFRvIII Umlagerung (Deletion der Exons 2–7). Beide die EGFR Verstärkung und die EGFRvIII Veränderungen haben eine prognostische und therapeutische Bedeutung beim Glioblastom. Zudem treten diese beiden Veränderungen häufig gemeinsam auf, was bedeutet, dass das Vorhandensein der einen die Validität der anderen stützen kann, wenn sie in geringen Mengen nachgewiesen wird.
    1. IGV-Arbeitsablauf (Sitzungsdatei egfr_vIII.xml):
      1. Daten laden: Wählen Sie das Genom Hg19 aus, laden Sie die BAM-Datei des Patienten, proband.bam, und stellen Sie sicher, dass sich die Indexdatei (gleicher Name wie die BAM-Datei, jedoch mit der Endung .bai) im selben Verzeichnis befindet, und navigieren Sie zu EGFR Gen
      2. Visualisieren Sie Bruchstellen von EGFRvIII: Passen Sie die Ansicht an, um die in Frage kommenden Bruchpunkte einzeln zu untersuchen (上游 von Exon 2 und downstream von Exon 7 für EGFRvIII) und führen Sie eine „Sortierung nach Base“ durch  (oder verwenden Sie die Abkürzung Strg+S unter Windows/Linux oder Cmd-s unter Mac) an den Breakpoints, um Anhäufungen von soft-clipped Reads zu visualisieren.
      3. BLAT aligniert Reads: Rechtsklicken Sie auf eine weich gekürzte Sequenz und wählen Sie aus BLAT-Sequenz (IGV verwendet Standardeinstellungen von UCSC, siehe https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html für die BLAT-Standardparameter). Klicken Sie auf die erste Zeile und beobachten Sie die Blat-Track das am unteren Rand des IGV-Spurabschnitts erscheint.
        HINWEIS: Selbst ein einzelner Read, der an die Übergänge von Exon 1/Intron 1 sowie von Intron 6/Exon 7 aligniert, kann ausreichender Nachweis für EGFRvIII, solange eine Kreuzkontamination durch eine andere Probe als Grund für dieses Ergebnis ausgeschlossen werden kann. Verweise auf Abbildung 6 und die Strukturelle Umordnung beobachten Abschnitt von Zusatzdatei 2 für detaillierte Schritte.

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Ergebnisse

Hervorzuheben ist, dass diese Studie sich darauf konzentriert, die Feinheiten der Variantenanalyse in IGV für die klinische Berichterstattung zu beschreiben. Der endgültige klinische Bericht muss auf der validierten Pipeline, den Qualitätskriterien und der Berichterstattungsrichtlinie jedes einzelnen Labors basieren. Eine umfassende Diskussion dieses wichtigen Themas liegt außerhalb des Rahmens der vorliegenden Studie; empfohlene Standards und Leitlinien wurden jedoch vom American College of Medical Genetics and Genomics...

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Diskussion

Eine genaue Variantenanalyse für die klinische Berichterstattung hängt von komplexen bioinformatischen Algorithmen und der Einbeziehung einer visuellen Überprüfung komplexer Varianten mithilfe von IGV5,6 ab. Diese Studie wurde durchgeführt, um eine prägnante Ressource empfohlener Einstellungen zur Visualisierung einfacher und komplexer genomischer Veränderungen in IGV zusammenzustellen (Zusatzdatei 1). Der Fokus dieser Studie liegt auf häufigen s...

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Offenlegungen

Alle Autoren geben an, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Wir danken allen Entwicklern der IGV-Software sowie dem NIH-Zuschuss, der die IGV-Entwicklung derzeit finanziert: U24CA258406. Für die Entwicklung dieser Studie wurden keine Mittel eingeworben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BLATBLAT-Genomsuchehttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatEigenständige BLAT-Webseite. Die BLAT-API ist innerhalb von IGV verfügbar, kein zusätzlicher Installationsaufwand erforderlich
CNVKitGitHubhttps://github.com/etal/cnvkitÖffliches GitHub-Repository mit CNVKit zum kostenlosen Download. Anleitungen zum Herunterladen und Ausführen von CNVKit sind ebenfalls hier verfügbar.
Vergleichssegmentdatei #1 für Vignettenbeispiel #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.segKopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #2 für Vignettenbeispiel #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.segKopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #3 für Vignettenbeispiel #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.segKopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #4 für Vignettenbeispiel #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.segKopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #5 für Vignettenbeispiel #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.segKopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #6 für Vignettenbeispiel #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.segKopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #7 für Vignettenbeispiel #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.segKopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei #8 für Vignettenbeispiel #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.segKopienzahldateien
Vergleichssegmentdatei für Vignettenbeispiel #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.segKopienzahldateien
Menschliche GenomsequenzMenschliche Genomsequenzhttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gzHerunterladbare FASTA-Datei mit dem Hg38-Menschen-Genom-Release.  Diese ist innerhalb von IGV verfügbar, kein zusätzlicher Download erforderlich
Menschliche GenomsequenzMenschliche Genomsequenzhttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gzHerunterladbare FASTA-Datei mit dem Hg19-Menschen-Genom-Release. Diese ist innerhalb von IGV verfügbar, kein zusätzlicher Download erforderlich
IGV-SoftwarepaketIGV-Softwarehttps://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exeIGV-Softwareversion 2.19.7 mit Java (JDK 21), kostenlos zum Download. Der Link hier ist für Windows, Links für Linux und Mac sind ebenfalls verfügbar.
Segmentdatei für Vignettenbeispiel #5 FallGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.segKopienzahldateien
Tutorial-GitHub-RepositoryGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/mainÖffentliches GitHub-Repository mit allen notwendigen Dateien, um die sechs Vignettenbeispiele nachzuvollziehen
Vignettenbeispiel #1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xmlSitzungsdateien
Vignettenbeispiel #1 Fall A bai-IndexGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam.bai		Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #1 Fall A BAM-AusrichtungsdateiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam		Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #1 Fall B bai-IndexGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam.bai		Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #1 Fall B BAM-AusrichtungsdateiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam		Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xmlSitzungsdateien
Vignettenbeispiel #2  bai-IndexGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai		Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #2  BAM-AusrichtungsdateiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam		Ausrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xmlSitzungsdateien
Vignettenbeispiel #3 bai-IndexdateiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.baiAusrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #3 BAM-AusrichtungsdateiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bamAusrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xmlSitzungsdateien
Vignettenbeispiel #4 AusrichtungsdateiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bamAusrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #4 bai-IndexGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.baiAusrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xmlSitzungsdateien
Vignettenbeispiel #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xmlSitzungsdateien
Vignettenbeispiel #6 bai-IndexGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.baiAusrichtungsdateien
Vignettenbeispiel #6 BAM-AusrichtungsdateiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bamAusrichtungsdateien

Referenzen

  1. Tjota MY, Segal JP, Wang P. Clinical utility and benefits of comprehensive genomic profiling in cancer. J Appl Lab Med. 2024;9(1):76-91.
  2. Freedman AN, et al. Use of next-generation sequencing tests to guide cancer treatment: results from a nationally representative survey of oncologists in the United States. JCO Precis Oncol. 2018;2:PO.18.00169.
  3. Ghoreyshi N, et al. Next-generation sequencing in cancer diagnosis and treatment: clinical applications and future directions. Discov Oncol. 2025;16:578.
  4. Aisner DL, et al. The Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL): A vision for a genomics future for academic pathology. Acad Pathol. 2023;10(3):100090.
  5. Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Wenger AM, Zehir A, Mesirov JP. Variant review with the Integrative Genomics Viewer (IGV). Cancer Res. 2017;77(21):e31-e34.
  6. Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 2013;14(2):178-192.
  7. Richards S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-424.
  8. Larson NB, Oberg AL, Adjei AA, Wang L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 2023;18(2):143-157.
  9. Jänne PA, et al. Adagrasib in non-small-cell lung cancer harboring a KRAS G12C mutation. N Engl J Med. 2022;387(2):120-131.
  10. Vandenberg BN, et al. Contributions of replicative and translesion DNA polymerases to mutagenic bypass of canonical and atypical UV photoproducts. Nat Commun. 2023;14(1):2576.
  11. Dunn T, Narayanasamy S. vcfdist: accurately benchmarking phased small variant calls in human genomes. Nat Commun. 2023;14(1):8149.
  12. Trent JC. Toward personalized, targeted therapy of gastrointestinal stromal tumor. Gastrointest Cancer Res. 2008;2(5):256-257.
  13. Xu CW, et al. Molecular characteristics and clinical outcomes of EGFR Exon 19 C-helix deletion in non-small cell lung cancer and response to EGFR TKIs. Transl Oncol. 2020;13(9):100791.
  14. Guille A, et al. A benchmarking study of individual somatic variant callers and voting-based ensembles for whole-exome sequencing. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae697.
  15. Cooke DP, Wedge DC, Lunter G. A unified haplotype-based method for accurate and comprehensive variant calling. Nat Biotechnol. 2021;39(7):885-892.
  16. Ezzati S, Salib S, Balasubramaniam M, Aboud O. Epidermal Growth Factor Receptor inhibitors in glioblastoma: current status and future possibilities. Int J Mol Sci. 2024;25(4):2316.
  17. Vivanco I, et al. Differential sensitivity of glioma- versus lung cancer-specific EGFR mutations to EGFR kinase inhibitors. Cancer Discov. 2012;2(5):458-471.

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