Eine definierte hydrogelbasierte Methode zur Erzeugung dreidimensionaler menschlicher Brustorganoide, die die Mammarienmorphogenese rekapitulieren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine definierte, hydrogelbasierte Methode zur Erzeugung menschlicher Brustorganoide, die zentrale Merkmale der Mammarienmorphogenese in einem kontrollierten dreidimensionalen Kultursystem nachbilden.

Zusammenfassung

Die Entwicklung physiologisch relevanter menschlicher Modellsysteme, die die Gewebearchitektur und Zellzustandsdynamik nachbilden, bleibt eine große Herausforderung bei der Untersuchung der Brustentwicklung und früher Ereignisse der Karzinogenese darstellen. Konventionelle zweidimensionale Kulturen und viele dreidimensionale Systeme versäumen es, die strukturelle Organisation und mikroökologischen Hinweise zu erfassen, die die menschliche Milchdrüse definieren. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung dreidimensionaler menschlicher Brustorganoide aus primären Epithelzellen, die in eine definierte Hydrogelmatrix eingebettet sind, die aus Typ-I-Kollagen, Laminin, Fibronectin und Hyaluronsäure besteht. Dieses System unterstützt den Fortschreiten einzelner Zellen durch Schlüsselstadien der Mammarienmorphogenese, einschließlich der Expansion des Vorläufers, epithellialer Musterbildung und der Bildung terminaler ductaler lobulärer Strukturen, ebenso wie das Entstehen eines mesenchymähnlichen Kompartiments über einen 21-tägigen Kulturzeitraum. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Hydrogel-Präparation, Zellaussaat und Kulturbedingungen an. Die Methode ist kompatibel mit hochgehaltsbildender Bildgebung und quantitativer Analyse von Organoidanzahl, Größenverteilung und architektonischer Komplexität. Diese Plattform ermöglicht mechanistische Studien zur epithelialen Plastizität und Umweltstörungen und bietet ein skalierbares und biologisch relevantes System zur Untersuchung früher Veränderungen auf Gewebeniveau, die mit dem Brustkrebsrisiko verbunden sind.

Einleitung

Das Verständnis der menschlichen Brustdrüsenentwicklung und der frühen Ereignisse, die Gewebe für bösartige Transformation prädisponieren, erfordert experimentelle Systeme, die die Gewebearchitektur, zelluläre Hierarchie und mikroumweltliche Signalübertragung getreu nachbilden. Obwohl zweidimensionale Epithelkulturen wichtige mechanistische Erkenntnisse geliefert haben, fehlt ihnen der strukturelle Kontext, der notwendig ist, um die epitheliale Organisation und Morphogenese¹ zu modellieren. Bestehende dreidimensionale Kultursysteme, einschließlich solcher, die auf Basalmembranextrakten basieren, haben das Feld vorangebracht, bleiben jedoch durch variable Zusammensetzung, unvollständige Kontrolle über extrazelluläre Matrixkomponenten und inkonsistente Unterstützung der höherordnungigen Gewebearchitektur¹ begrenzt. Darüber hinaus sind viele organoide Systeme, die auf Basalmembranextrakten basieren, durch ihre Unfähigkeit eingeschränkt, das Entstehen von gewebeähnlicher Organisation¹ konsequent zu unterstützen. Insbesondere verlassen sich viele Systeme auf exogene stromale Komponenten, anstatt die endogene Entwicklung unterstützender Mikroumgebungen zu ermöglichen, wodurch ihre Fähigkeit eingeschränkt wird, epithelial–mesenchymale Interaktionen zu modellieren, die zentral für Gewebeentwicklung und Erkrankungen sind. Diese Einschränkungen schränken die reproduzierbare Untersuchung von Entwicklungsprozessen, epithellialer Plastizität und den Auswirkungen von Umwelt- oder molekularen Störungen auf die Gewebeorganisation ein.

Um diese Einschränkungen zu beheben, entwickelten wir ein definiertes, hydrogelbasiertes, dreidimensionales menschliches Brustorganoid-Modell, das es primären Epithelzellen ermöglicht, organisierte Strukturen innerhalb einer definierten extrazellulären Matrix 2,3,4,5,8 zu erzeugen. Das Hydrogel besteht aus Typ-I-Kollagen, Laminin, Fibronectin und Hyaluronsäure, Komponenten, die aufgrund ihrer etablierten Rolle bei der Entwicklung der Milchdrüse und der epithelialen Morphogenese ausgewählt wurden. Diese extrazellulären Matrixmoleküle beschäftigen sich mit unterschiedlichen zellulären Rezeptoren, darunter Integrine, Discoidin-Domänenrezeptoren, CD44 und RHAMM, und sind dafür bekannt, die Epithelpolarität, verzweigte Morphogenese, Stammzellerhaltung, Mechanotransduktion und Gewebeorganisation in der Mammarisdrüse ^6,7 zu regulieren. Frühere Studien, die dieses Hydrogel-System beschrieben, zeigten, dass die Einbindung dieser extrazellulären Matrixkomponenten die duktal-lobulare Morphogenese und die Epithelreifung im Vergleich zu ausschließlich kollagen- oder matrigelbasierten Bedingungen ^3,8 deutlich verbesserte. Darüber hinaus wurden die physikalischen Eigenschaften dieser Hydrogel-Formulierung zuvor durch eine Atomkraftmikroskopie charakterisiert, die zeigte, dass das zusammengesetzte extrazelluläre Matrix-Hydrogel eine geringere Steifigkeit und eine erhöhte Schwellung im Vergleich zu reinen Kollagen-Gelen aufwies (Young-Modul: 256,7 ± 20,0 Pa gegenüber 559,2 ± 204,0 Pa), was mit einer weicheren und stärker hydrierten Matrixumgebung⁸ übereinstimmt.

Wichtig ist, dass dieses Modell das Entstehen eines mesenchymähnlichen Kompartments unterstützt, das neben Epithelstrukturen entsteht und endogene strukturelle und Signalisierungsunterstützung bietet, die der Organisation des natürlichen Gewebes^{näher kommen 3}. Die physiologische Relevanz dieses Hydrogelsystems wurde durch direkte Vergleiche mit konventionellen matrigelbasierten Organoidkulturen sowohl mittels morphologischer als auch mit transkriptomischen Analysen bewertet. Frühere Studien zeigten, dass Hydrogelkulturen eine besser organisierte Bildung von duktallobulärem Gewebe und Multilineage-Differenzierung unterstützten als matrigelbasierte Kulturen und gleichzeitig die Hormonreaktion⁸ bewahrten. In jüngerer Zeit zeigten integrierte Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalysen, die Hydrogel-abgeleitete Organoide, matrigelgezüchtete Organoide und primäres menschliches Brustgewebe vergleichten, dass hydrogelgezüchtete Organoide die epitheliale Hierarchie, zelluläre Diversität und epithel-mesenchymale Interaktionen im nativen menschlichen Brustgewebe genauer wiedergeben³. Im Gegensatz dazu waren matrigelgezüchtete Organoide für proliferative hybride Basalzustände angereichert und hatten keine stromalähnlichen Populationen, was mit einer epithelialen Selbstassemblierung statt einer gerichteten Organogenese übereinstimmt.

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine reproduzierbare und skalierbare Methode zur Erzeugung von Organoiden aus primärem menschlichem Gewebe, mit optionalen Schritten zur Fibroblastenabbauung und -dissoziation zu Einzelzellen. Da diese Plattform mit Live-Imaging, High-Content-Imaging, quantitativer morphometrischer Analyse, Zellverfolgung und genetischen Perturbationsstudien kompatibel ist, kann sie mit nachgelagerten Ansätzen zur Bewertung von Organoidanzahl, Größe, Architektur und Wachstumsdynamik integriert werden. Diese Plattform bietet daher ein biologisch relevantes System zur Untersuchung der menschlichen Brustentwicklung, der epithelialen Plastizität, der Epithel-Mikro-Umwelt-Interaktionen sowie der Reaktionen auf Gewebe auf Entwicklungs-, molekulare oder Umweltstörungen.

Ein schematischer Überblick über den Arbeitsablauf, einschließlich Gewebeverarbeitung, Hydrogelpräparation, Organoidkultur, Entwicklungsfortschritt und nachgelagerten Analysen, ist in Abbildung 1 dargestellt, während repräsentative organoide Morphologien, die mit dieser Plattform erzeugt wurden, in Abbildung 2 dargestellt sind.

Abbildung 1. Überblick über den hydrogelbasierten Workflow zur Organoid-Erzeugung. (A) Flussdiagramm, das den Protokollablauf zusammenfasst, einschließlich Gewebeentnahme, Gewebeverarbeitung, Kryokonservierung, Wiederherstellung und optionaler Zellvorbereitung, Hydrogelpräparation, Organoidkultur, Organoidentwicklung und nachgelagerten analytischen Anwendungen. (B) Visueller Schaltplan, der die Hauptstadien des hydrogelbasierten Organoid-Generierungsprotokolls darstellt, einschließlich Gewebeverarbeitung und -präparation, Wiederherstellung und optionaler Zellvorbereitung sowie Hydrogel-Präparation und Organoid-Seedung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Repräsentative organoide Morphologien, die im definierten Hydrogelsystem erzeugt werden. Repräsentative Hellfeldbilder von Organoiden, die aus verschiedenen menschlichen Geweben stammen, die in der definierten Hydrogelmatrix kultiviert wurden. Brustorganoide, die aus der Reduktion von Mammoplastie-abgeleiteten Einzelepithelzellen erzeugt wurden, wurden am 21. Tag der Kultur abgebildet. Patientenabgeleitete Xenograft-Organoide, die aus Tumorfragmenten erzeugt wurden, wurden am 16. Tag der Kultur abgebildet. Speicheldrüsenorganoide, die aus Epithelfragmenten erzeugt wurden, wurden am Tag 3 der Kultur abgebildet. Nierenorganoide, die aus Epithelfragmenten erzeugt wurden, wurden am 17. Tag der Kultur abgebildet. Skalenbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protokoll

Primärgewebe, das sonst nach einer Operation als medizinischer Abfall entsorgt worden wäre, wurde gemäß allen relevanten Gesetzen mithilfe von Protokollen gewonnen, die von den institutionellen Prüfungsgremien des Maine Medical Center und Tufts Medical Center genehmigt wurden. Alle Gewebe wurden vor dem Transfer anonymisiert und konnten nicht auf bestimmte Patienten zurückverfolgt werden. Aus diesem Grund erhielt diese Forschung vom Committee on the Use of Humans as Experimental Subjects am Massachusetts Institute of Technology und an der Tufts University Health Sciences (IRB #13521) den Ausnahmestatus. Alle an dieser Studie teilnehmenden Patienten unterschrieben ein Formular zur informierten Einwilligung, in dem sie sich bereit erklärten, an der Studie teilzunehmen und die Ergebnisse zu veröffentlichen.

1. Gewebeverarbeitung und -vorbereitung

HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren mit menschlichem Gewebe gemäß institutionellen Biosicherheits- und ethischen Richtlinien durch. Siehe die in Abbildung 1A und 1B gezeigten Workflow-Pläne für einen visuellen Überblick über die Protokollschritte und den Organoid-Vorbereitungsworkflow vor Beginn des Verfahrens.

1. Bereiten Sie MEGM mit Milchepithel-Basalmedium vor, ergänzt durch 52 μg/mL Rinder-Hypophysenextrakt, 10 ng/mL menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor, 5 μg/mL Insulin, 500 ng/mL Hydrocortison, 1% (v/v) GlutaMAX und 1% (v/v) Antimykotikum (100x).
2. Bereiten Sie das Dissoziationsmedium vor, indem Sie 1,5 mg/mL Kollagenase A (gespeichert bei −20°C) und 100 U/mL Hyaluronidase (bei 4°C) in das Milchepithelwachstumsmedium (MEGM) geben.
3. Erhalten Sie humanes Brustgewebe, das durch prophylaktische Mastektomien und Reduktionsmammoplastiken innerhalb von 24 Stunden nach der Exzision gewonnen wurde, nicht in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert und bei 4°C gehalten wird. Wiegen Sie das Gewebe auf einer präzisen Waage, um das Gesamtgewicht des Gewebes zu bestimmen.
4. Stellen Sie das Gewebe in einen sterilen Biosicherheitsschrank. Mechanisch wird das Gewebe mit sterilen Skalpellen in 3–^{5 mm große} Fragmente zerkleinert. Übertragen Sie etwa 2–3 g gehacktes Gewebe in ein 15 ml konisches Rohr. Fügen Sie jedem Röhrchen 10 ml Dissoziationsmedium hinzu.
5. Inkubieren Sie die Röhren bei 37°C auf einem Orbitalrotator bei 8 U/min für 12–18 Stunden, um das Gewebe enzymatisch zu verdauen. Betrachten wir die Verdauung als abgeschlossen, wenn keine großen Gewebefragmente mehr übrig sind und eine homogene Suspension aus gleichmäßig fragmentiertem Material im gesamten Medium sichtbar ist.
6. Lassen Sie die Epithelfragmente durch die Schwerkraft für 5 Minuten absinken. Bestätigen Sie, dass im Medium keine sichtbaren Fragmente mehr schweben und dass eine deutliche Kugel vorhanden ist. Vorsichtig dekantieren und das Supernatant entsorgen, ohne das Pellet zu stören.
   HINWEIS: Der Supernatant enthält Stromzellen und Matrixkomponenten und kann gewaschen, verwendet oder für andere Studien konserviert werden.
7. Setzen Sie das Pellet in einem 10-ml-Waschmedium mit 5 % fetalem Rinderserum (FBS) in PBS wieder auf. Zentrifugiere bei 250 × g für 5 Minuten in einer Schaukel-Eimer-Zentrifuge bei Raumtemperatur.
8. Wiederholen Sie den Waschschritt noch dreimal oder bis das Supernatant frei und frei von sichtbaren Ablagerungen ist.
9. Die endgültige Pellet in einem Gefriermedium aus 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) in MEGM mit einem Volumen von 1 ml pro Gramm Anfangsgewebegewicht wieder suspendieren.
   VORSICHT: DMSO ist beim Kontakt oder Einatmen schädlich. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie, wenn es die Institutionen vorschreiben, mit einer chemischen Sicherheitshaube.
10. Aliquot 1 ml der Suspension in jedes Kryoviale. Stellen Sie die Kryoviale vor der Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff bei −80°C in einen Gefrierbehälter.
    HINWEIS: Dieser Schritt stellt einen Pausenpunkt dar. Proben werden bei −80°C gelagert, bevor sie in Langzeitlagerung überführt werden.

2. Genesung und optionale Zellvorbereitung

1. Auftauen und erste Bergung
   1. Entfernen Sie kryokonserviertes Gewebe aus der −80°C-Lagerung nach mindestens 24 Stunden oder aus der Langzeitlagerung des flüssigen Stickstoffs. Tauchen Sie das Kryovial sofort bis zur Kappe in ein 37°C Wasserbad ein und tauen Sie schnell für 1 Minute auf, um den Zelltod zu minimieren.
      HINWEIS: Bewegt das Kryovial während des Auftauens vorsichtig, um eine gleichmäßige Erwärmung sicherzustellen.
   2. Nach vollständigem Auftauen wird der Inhalt des Kryovials sofort in ein 15-mL konisches Rohr mit 10 mL MEGM übertragen. Zentrifugiere bei 250 × g für 5 Minuten.
2. Optionale Fibroblast-Depletion
   HINWEIS: Fibroblastenabbau durch Pre-Platting ist ein optionaler Anreicherungsschritt, der verwendet wird, um schnell adhärente stromale oder Fibroblastenpopulationen zu reduzieren, wenn eine epithelial angereicherte Anfangspopulation gewünscht ist. Dieser Schritt ist für die Bildung von Organoiden nicht erforderlich und kann je nach experimentellem Ziel angepasst werden.
   1. Das Pellet in 10 ml MEGM wieder suspendieren.
   2. Das resuspendierte Gewebe wird in eine 10 cm Zellkulturschale übertragen. Inkubieren Sie bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ für 90 Minuten, um eine Fibroblastenbindung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Stören Sie die Kulturschale während der Inkubation nicht, um eine effiziente Fibroblastenhaftung zu gewährleisten.
   3. Sammeln Sie den Überstand mit nicht haftenden Zellen mit einer 10-ml-serologischen Pipette auf, während Sie die Kulturschale sanft auf etwa 45° kippen. Spülen Sie den Teller vorsichtig mit 5 ml PBS ab und mischen Sie die Spülung mit dem gesammelten Supernatant.
   4. Zentrifugiere die kombinierte Suspension mit 250 × g für 5 Minuten, um epithelangereichertes Material zurückzugewinnen.
      HINWEIS: Zellen, die an der Platte haften, sind für Fibroblasten der Milchdrüse angereichert und können separat durch Zugabe eines Mediums aus DMEM + 10 % FBS und Antibiotika vermehrt werden.
3. Optionale Dissoziation zu Einzelzellen
   1. Das Pellet wird in 500 μL vorgewärmter (37°C) Dissoziationsenzymlösung aus 0,25 % Trypsin wieder suspendiert. Alternative Dissoziationsreagenzien erfordern möglicherweise Optimierung. Übertragen Sie die Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr. Triturieren Sie die Probe 20-mal mit einer P1000-Pipette zur Förderung der Dissoziation.
      VORSICHT: Enzymatische Dissoziationsreagenzien können schädlich sein. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und vermeiden Sie Haut- oder Blickkontakt.
   2. Inkubieren Sie das Rohr bei 37°C für 3-5 Minuten. Die Probe wird unmittelbar nach der Inkubation mechanisch dissoziiert, indem man 20 Mal mit einer P1000-Pipette trituriert.
   3. Fügen Sie 1 ml serumhaltiges Waschmedium hinzu, um die enzymatische Reaktion zu neutralisieren. Zentrifugiere bei 500 × g für 5 Minuten.
   4. Setzen Sie das Pellet in 300 μL Dispaselösung (5 U/mL) und 30 μL DNase-Lösung (1 mg/mL) wieder auf. Inkubieren Sie bei 37°C für 3–5 Minuten.
   5. Dissoziieren Sie die Probe mechanisch, indem Sie 15–20 Mal pipetieren. Fügen Sie 700 μL serumhaltiges Waschmedium zur Suspension hinzu.
   6. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb in ein sauberes Rohr. Entweder ein Standard-40-μm-Zellsieb oder ein Flowmi-Pipettspitzensieb kann verwendet werden. Flowmi-Siebe können den Probenverlust bei der Arbeit mit begrenzter Zellzahl reduzieren.
   7. Bestimmen Sie die lebensfähige Zellnummer unter Verwendung des Trypan-Blue-Ausschlusses. Mische 10 μL der Zellsuspension mit Trypanblau im Verhältnis 1:1 und gib 10 μL der Mischung in eine Zellzählkammer oder einen Zählschieber. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe eines automatisierten Zellzählers oder Hämozytomometers.
   8. Zentrifugiere die Suspension bei 500 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   9. Suspendieren Sie das Zellpellet in MEGM bei der gewünschten Konzentration für die Hydrogel-Aussaat.
      HINWEIS: Bei Einzelzell-Seeding-Experimenten liegen typische Eingaben je nach experimenteller Zielsetzung und Spenderprobeneigenschaften zwischen etwa 1.000 und 5.000 Zellen pro 200 μL Hydrogel. Niedrigere Samendichten werden im Allgemeinen für Live-Bildgebung und Morphogenese-Studien verwendet, um die Verfolgung der individuellen Organoidentwicklung zu erleichtern, während höhere Dichten häufig für Endpunkt-molekulare Analysen, einschließlich RNA- und Proteinsammlung, verwendet werden.

3. Hydrogel-Präparation und Organoid-Aussaaten

1. Lagervorbereitung und Volumenberechnungen
   1. Lamininlösung (1,18 mg/mL), Hyaluronsäurelösung (1 mg/mL in sterilem Wasser), Fibronektinlösung (2 mg/mL in sterilem Wasser) und PBS 1× vor der Anwendung auf Eis. Laminin- und Fibronektin-Aliquot bei −80°C und Hyaluronsäurelösung bei 4°C lagern. Tauen Sie gefrorene Komponenten langsam auf Eis bei 0°C–4°C vor der Nutzung auf.
   2. Bereiten Sie eine 25× extrazelluläre Matrix-Supplement-Lösung vor. Um 1 ml herzustellen, kombinieren Sie 425 μL Laminin, 250 μL Hyaluronsäure, 250 μL Fibronectin und 75 μL PBS in einem auf Eis gehaltenen Tube. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Rohr 3–4 Mal umkehren. Lagere die Lösung bis zu einem Monat bei 4°C.
   3. Bestimmen Sie vor der Vorbereitung das gewünschte Endvolumen und die Zusammensetzung des Hydrogels. Bereiten Sie mindestens 20 % Überschussvolumen vor, um Materialverluste während des Pipettierens und Transfers auszugleichen.
      HINWEIS: Die Hydrogel-Formulierung besteht aus Kollagen I, einer 1× Endkonzentration extrazellulärer Matrix-Ergänzungen (aus einem 25×-Lager) und 12,5 % (v/v) 0,1 N Natriumhydroxid im Verhältnis zum Kollagenvolumen I für pH-Neutralisation und Polymerisation.
      HINWEIS: Die endgültigen Hydrogelkonzentrationen sind 1,7 mg/mL Kollagen I, 20 μg/mL Laminin, 20 μg/mL Fibronectin und 10 μg/mL Hyaluronsäure.
   4. Berechnen Sie das erforderliche Volumen an Kollagen I (_V-Kollagen) mit folgender Formel:
      
      Hier gilt C_final = 1,7 mg/mL, V_insgesamt ist das gewünschte Endvolumen des Hydrogels und _C-Stock die Konzentration der Kollagenlösung. Verwenden Sie Kollagenkonzentrationen zwischen 2–12 mg/mL.
      HINWEIS: Die Konzentration des Kollagenstocks kann je nach Charge variieren. Höhere Konzentrationen erhöhen die Viskosität und sollten langsam pipettiert werden.
   5. Berechnen Sie das Volumen von 0,1 N Natriumhydroxid (V_NaOH) mit folgender Formel:
      V_NaOH = 0,125 x V_Kollagen
      Bereiten Sie eine 0,1 N Natriumhydroxid-Arbeitslösung vor, indem Sie 1 N natriumhydroxid in sterilem Wasser verdünnen.
   6. Berechnen Sie das Volumen des extrazellulären Matrixzusatzes (V_ES) mit folgender Formel:
      
   7. Berechnen Sie das verbleibende Volumen, das mit Wachstumsmedium gefüllt werden soll, mit folgender Formel:
      _{V-Wachstumsmedium} = V_Gesamt - (V_Kollagen + V_NaOH + V_ES + V_{Zellen/Gewebe})
      HINWEIS: Bestimmen Sie das Volumen der Zellen oder Gewebefragmente für jedes Experiment einzeln. Verwenden Sie einen typischen Bereich von 10–100 μL innerhalb des zulässigen Volumens. Eine präzise Fragmentzählung wird nicht durchgeführt, da Fragmentgröße und -zusammensetzung zwischen den Präparaten erheblich variieren. Standardisieren Sie die Aussaat durch visuelle Bewertung der Fragmenthäufigkeit und -verteilung.
2. Herstellung des Hydrogel-Master-Mixes
   1. Kollagen I, extrazelluläre Matrix-Ergänzung, Natriumhydroxid (0,1 N) und Wachstumsmedium auf Eis bei 0°C–4°C legen. Halten Sie alle Komponenten bei niedriger Temperatur, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern.
   2. Gib das berechnete Volumen Kollagen I in ein gekühltes Mikrozentrifugenrohr.
   3. Gib das berechnete Volumen des vorgekühlten Wachstumsmediums zur Kollagenlösung hinzu.
   4. Fügen Sie das berechnete Volumen von 0,1 N Natriumhydroxid hinzu, um die Lösung zu neutralisieren.
      HINWEIS: Die vorherige Optimierung hat festgestellt, dass diese Bedingungen den entsprechenden Gel-pH-Wert erzeugen; daher ist eine routinemäßige pH-Messung der Hydrogelmischung nicht erforderlich.
      HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte zügig durch, um eine vorzeitige Kollagenpolymerisation zu verhindern.
   5. Mische die Lösung, indem du das Rohr kräftig schüttelst, etwa einmal pro Sekunde für mindestens sechs Schüttelungen.
   6. Fügen Sie das berechnete Volumen des extrazellulären Matrixzusatzes zur Mischung hinzu.
   7. Addieren Sie das berechnete Volumen von Einzelzellen oder Gewebefragmenten mit einer P1000-Pipette oder einer Breitrohrpipettenspitze. Mischen Sie sofort durch Schütteln wie in Schritt 3.2.5 beschrieben und gehen Sie sofort zum nächsten Schritt über.
3. Hydrogelabscheidung
   1. Pipettieren Sie die Hydrogelmischung in Kulturgefäße mit dem gewünschten Volumen pro Bohrloch. Verwenden Sie 200 μL Hydrogel pro Bohrloch für 4-Bohrloch-Kammer-Objektträger, 100 μL pro Bohrloch für 8-Bohrloch-Kammer-Objektträger und 20 μL pro Bohrloch für 96-Bohrloch-Platten.
   2. Verteile das Hydrogel zu einem dünnen Pad über die Oberfläche, wenn du Kammer-Objektträger verwendest. Positionieren Sie die Pipettenspitze an der mittleren oberen Kante des Kammerschachts und ziehen Sie die Spitze während des Dosierens des Gels über die Oberfläche, um ein gleichmäßiges Polster zu erzeugen. Bei 96-Brunnenplatten wird die Pipettenspitze in der Mitte des Bohrlochs positioniert, während der Kontakt zur Oberfläche erhalten bleibt, und das Gel zentral verteilt, um eine Kuppelstruktur zu erhalten. Vermeiden Sie es, Luft in das Gel zu pipetten, da dies Blasen erzeugt.
   3. Inkubieren Sie die Kulturgefäße bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2 für 60 Minuten, um eine vollständige Polymerisation zu ermöglichen.
      HINWEIS: Die hier beschriebenen Polymerisationsbedingungen wurden für die in dieser Studie verwendeten Kulturformate optimiert. Kleine Anpassungen der Polymerisationszeit können je nach Geometrie des Kulturgefäßes, Hydrogelvolumen und Inkubationsbedingungen erforderlich sein.
4. Kultur und Pflege
   1. Füge jedem Brunnen vorgewärmtes MEGM hinzu. Passen Sie die Lautstärke entsprechend dem verwendeten Kulturformat an.
   2. Lösen Sie das Hydrogel vorsichtig von der Kulturoberfläche mit einer Pipettenspitze, damit das Gel schwimmen kann. Schieben Sie die Pipettenspitze um den Rand des Gels und heben Sie vorsichtig unter dem polymerisierten Hydrogel an, um es von der Oberfläche zu lösen.
   3. Ersetze das MEGM zweimal wöchentlich durch frisches, vorgewärmtes Medium. Kulturen werden etwa 3–4 Wochen in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ aufbewahrt und die Kulturen abgebrochen, bevor ein vollständiger Hydrogelkollaps eintritt. Identifizieren Sie kollabierte Hydrogele anhand des Auftretens dichter, undurchsichtiger, stopfenartiger Strukturen, die durch umfangreiches zelluläres Auswachsen innerhalb des Gels entstehen (siehe repräsentative Beispiele in ergänzender Abbildung 1).

Ergebnisse

Die erfolgreiche Ausführung dieses Protokolls führt zur Bildung dreidimensionaler organoider Strukturen, die eine organisierte Epithelmorphologie und gewebespezifische architektonische Merkmale aufweisen. Organoide beginnen sich innerhalb von 3–7 Tagen nach der Aussaat zu bilden und entwickeln sich während der gesamten Kultur weiter. Frühere Charakterisierungen dieses Hydrogel-Organoid-Systems zeigten reproduzierbare Organoidbildung bei mehreren unabhängigen primären menschlichen Spender...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Erzeugung dreidimensionaler menschlicher Brustorganoide innerhalb einer definierten Hydrogel-Mikroumgebung, die Schlüsselmerkmale der Mammarienmorphogenese³ unterstützt. Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg dieser Methode. Erstens müssen Gewebeverarbeitung und enzymatische Dissoziation sorgfältig kontrolliert werden, um die Epithelvitalität zu erhalten und gleichzeitig eine Überverdauung z...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL Konustuben	VWR	89039-664	Sterile Röhrchen für Gewebeverarbeitung und Zentrifugation
40 µm Zellsieb	VWR	732-2757	Filtrationsvorrichtung für die Herstellung von Einzelzellsuspensionen
40 µm Zellsieb für geringe Volumina	Bel-Art	136800040	Filtrationsvorrichtung für die Herstellung von Einzelzellsuspensionen
Automatischer Zellzähler	Bio-Rad	1450102	Gerät zur Zellzählung und Bestimmung der Lebensfähigkeit
Rinderhypophysenextrakt	Thermo Scientific	13028014	Ergänzung für Epithelzellmedien
Zellzählungsschieber	Bio-Rad	145-0011	Doppelkammerschieber zur Zellzählung
Zentrifuge	N/A	N/A	Tischzentrifugen/en müssen eine Geschwindigkeit von mindestens 500 x g aufweisen und 15 ml- und 1,5 ml-Röhrchen aufnehmen können.
Kollagen I	Millipore Sigma	08-115	Extrazelluläres Matrixprotein zur Hydrogelbildung
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzym zur Gewebedissoziation
Cryovials	Corning	976171	Steriler Behälter für die kryogene Lagerung von Proben
Kulturgefäße (z.B. Kammerschieber, Multiwellplatten)	Corning	354104 354108 3603	Plattformen für die Hydrogelablagerung und Organoidkultur.
Dimethylsulfoxid	Millipore Sigma	317275	Kryoprotektor, der in Gefriermedium verwendet wird
Dispase II	Roche	4942078001	Enzym zur sekundären Gewebedissoziation
DNase I	Roche	10104159001	Enzym, das während der Zelldissoziation verwendet wird.
Fötales Kälberserum	Gibco	10437	Serenergänzung, die in Wasch- und Neutralisationsmedien verwendet wird
Fibronektin	Sigma-Aldrich	F2006	Komponente der extrazellulären Matrix
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Ergänzung für Epithelzellmedien
Humaner epidermaler Wachstumsfaktor	Sigma-Aldrich	E9644	Ergänzung für Epithelzellmedien
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Ergänzung für Epithelzellmedien
Hyaluronsäure	Millipore Sigma	385908	Extrazelluläre Matrixkomponente für die Hydrogelformulierung
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzym zur Gewebedissoziation
Inkubator	Thermo Scientific	3598	Gerät zur Gewebekulturinkubation
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Ergänzung für Epithelzellmedien
Laminin	Gibco	23017-015	Komponente der extrazellulären Matrix
Mammaepithelbasmales Medium	Thermo Scientific	M171500	Wachstumsmedium für Epithelzellen
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)	Thermo Scientific	3451	Röhrchen für Reaktionen mit geringem Volumen
Orbitalrotator	Thermo Scientific	400110	Rotator zur Gewebedispersion während der enzymatischen Dissoziation
P1000 Pipette	Gilson	P1000	Gerät zum Mischen und Übertragen von Volumina bis zu 1.000 µL
Penicillin-Streptomycin	Thermo Scientific	15140122	Antibiotische Ergänzung für Epithelzellmedien
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung	Gibco	20012-027	Pufferlösung zum Waschen und Spülen
Präzisionswaage	Mettler Toledo	ML303E	Waage zur Gewebewägung
Serologische Pipette	Nunc	170356N	Pipette zur Gewinnung nicht adhäsiver Epithelzellen
Natriumhydroxid (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagenz zur Kollagenneutralisation
Sterile Skalpelle	Bard-Parker	372615	Werkzeuge zur mechanischen Gewebezerkleinerung
Trypanblaulösung	Gibco	15250061	Farbstoff zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit
Trypsin (0,25%)	Gibco	25200056	Enzymatisches Reagenz zur Zelldissoziation
Wasserbad (37 °C)	VWR	10LA	Gerät zur kontrollierten Auftauung von Proben