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Methodenartikel

ELISpot-Assay zur Quantifizierung antigenspezifischer und gesamter antikörpersekretierender Zellen in Blut und Knochenmark immunisierter Rhesusaffen

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DOI:

10.3791/71836

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21. August 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der B-Zell-ELISpot ist eine validierte Methode zur Quantifizierung der Stärke und Dauerhaftigkeit antigenspezifischer IgG-, IgM- und IgA-langlebiger Plasmazellen sowie der gesamten antikörpersezierenden Zellen (ASCs) sowohl im Blut (die kurzlebige Plasmablasten nach Immunisierung widerspiegeln) als auch in den dauerhafteren ASCs des Knochenmarks.

Zusammenfassung

Die Bewertung neuartiger Impfstoffantigene und -adjuvantien beruht traditionell auf der Messung von Antikörpertitern, deren Entwicklung nach der Immunisierung Zeit in Anspruch nimmt. Die Quantifizierung antikörpersekrezierender Zellen (ASCs) nach primärer und booster Immunisierung liefert einen früheren, mechanistisch aufschlussreichen Parameter für die impfstoffinduzierte humorale Immunität und kann die Optimierung von Impfstoffformulierungen sowie Immunisierungsstrategien unterstützen. Hier wird ein Protokoll zur Zählung von ASCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) und Knochenmarkszellen (BM) von Rhesusmakaken beschrieben; Rhesusmakaken stellen ein wichtiges präklinisches Modell für die HIV-Impfstoffforschung dar. Dieser enzymgekoppelte Immunosorbens-Test (ELISpot) ermöglicht die Quantifizierung sowohl antigenspezifischer als auch insgesamt vorhandener IgG-, IgM- und IgA-ASCs durch Bestimmung ihrer absoluten und relativen Häufigkeiten. Im peripheren Blut erfasst der Test die maximale Plasmablastenantwort nach der Immunisierung, während im Knochenmark die Anreicherung antigenspezifischer Plasmazellen unterschiedlicher Isotypen nachgewiesen wird und somit die Dauerhaftigkeit langlebiger ASCs bewertet wird. Dieses Protokoll bietet einen robusten und reproduzierbaren Ansatz zur Beurteilung von Immunogen- und Adjuvanskombinationen in präklinischen Impfstoffstudien und liefert wertvolle Daten zur Unterstützung der Überführung aussichtsreicher Impfstoffkandidaten in die klinische Entwicklung.

Einleitung

Antikörpserzeugende Zellen (ASCs) sind Schlüsselkomponenten der adaptiven Immunität und umfassen sowohl kurzlebige Plasmablasten, die rasch nach einer Immunisierung entstehen, als auch langlebige Plasmazellen, die für eine anhaltende Antikörperproduktion verantwortlich sind. Plasmablasten sind vorübergehend im peripheren Blut und in sekundären lymphatischen Organen nachweisbar und erreichen ihre höchste Häufigkeit zu definierten Zeitpunkten nach der Immunisierung, die je nach Impfstoffformulierung und Wirtsspezies variieren (typischerweise Tag 4–5 bei Rhesusmakaken und etwa Tag 7 beim Menschen). Im Gegensatz dazu sind reife Plasmazellen langlebig und befinden sich hauptsächlich in sekundären lymphatischen Geweben und im Knochenmark (BM). Ein wirksamer Impfstoff sollte sowohl starke humoral vermittelte als auch zellvermittelte Immunantworten hervorrufen. Die Messung von Erinnerungsantworten, die sich in der schnellen Expansion von Plasmablasten in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) nach einer Auffrischimpfung widerspiegelt, liefert wertvolle Einblicke in die Stärke der durch den Impfstoff induzierten Immunantwort. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine robuste Methode zur Quantifizierung früher Plasmablasten- und langanhaltender Plasmazellantworten nach einer Env-spezifischen Immunisierung bei Rhesusmakaken bereitzustellen.

Bei einem Enzyme-Linked-Immunospot-(ELISpot)-Assay werden ASCs in 96-Well-Platten mit Membranboden aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) oder gemischten Celluloseestern (MCE) kultiviert, deren Oberfläche mit Antigen (Ag) beschichtet ist, wodurch lebensfähige Zellen Proteine sezernieren können, die direkt an der Membranoberfläche gebunden werden. Die gebundenen Proteine werden anschließend mithilfe von Antikörpern in einem herkömmlichen Sandwich-Immunoassay nachgewiesen. Bei chromogenen ELISpot-Assays entstehen Spots durch die Umwandlung des Substrats 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) durch Meerrettichperoxidase (HRP) in ein unlösliches farbiges Präzipitat, wodurch die einzelnen ASCs sichtbar gemacht und gezählt werden können. Der ELISpot bietet mehrere wichtige Vorteile, darunter die Fähigkeit, antigenspezifische Reaktionen ex vivo nachzuweisen, eine hochsensitive funktionelle Beurteilung einzelner Immunzellen sowie eine quantitative Überwachung der T- und B-Zell-Immunantworten sowohl in präklinischen als auch in klinischen Studien1,2,3.

Hier wird ein B-Zell-ELISpot-Protokoll zur Quantifizierung von insgesamt sowie antigenspezifischen IgG-, IgM- und IgA-ASCs in PBMCs und BM Zellen von Rhesusmakaken beschrieben. Das Protokoll erläutert alle kritischen Schritte, einschließlich der Plattenbeschichtung, Blockierung, Zellaussaat, Assay-Entwicklung, Spot-Zählung und Datenanalyse, um die Kinetik der gesamten und Env-spezifischen Plasmablasten- und Plasmazellantworten zu charakterisieren. Diese Methode bietet einen reproduzierbaren Ansatz zur Bewertung und zum Vergleich der Immunogenität verschiedener Antigen- und Adjuvanzformulierungen in präklinischen Impfstoffstudien und unterstützt die Optimierung von Impfstrategien für die anschließende klinische Anwendung.

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Protokoll

Die in diesem Protokoll verwendeten Rhesusmakaken stammten aus den spezifisch pathogenfreien (SPF) Kolonien des New Iberia Research Center und wurden im Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research des University of Texas MD Anderson Cancer Center gehalten. Die Tierversuche und die Tierpflege entsprachen den Vorgaben des „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“ und wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee des University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt (Protokoll #2616RN00).

Dieses Protokoll stellt eine Optimierung der in früheren präklinischen Immunisierungsstudien beschriebenen Technik4,5,6,7 dar, die zur Detektion von ASC-Antworten entwickelt wurde. Das folgende Protokoll beschreibt das ELISpot-Verfahren unter Verwendung frischer PBMCs und BM Zellpräparationen von Rhesusmakaken, die an einem experimentellen HIV-Impfstoffprotokoll teilnahmen.

HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren aus den Abschnitten 1–4 in einem zertifizierten Biosicherheitswerkbank der Klasse II unter Verwendung aseptischer Technik durch. Verwenden Sie nach Möglichkeit Mehrkanalpipetten.

1. Vorbereitung der ELISpot-Platten

  1. ELISpot-Platten beschichten
    1. Die Platten für die Gesamtimmunglobuline (Ig) 1 und 3 mit 100 µL/Vertiefung einer 5 µg/mL Lösung von unkonjugiertem Ziegen-Anti-Affen-IgG + IgM + IgA in steriler DPBS beschichten. Die Platten bei 4 °C mindestens 8 h, vorzugsweise über Nacht, inkubieren (Abbildung 1A,C).
    2. Die antigen-spezifischen Platten 2 und 4 mit 100 µL/Vertiefung einer 20 µg/mL Lösung von Galanthus nivalis-Lektin (GNL) in DPBS beschichten. Die Platten bei 4 °C mindestens 8 h, vorzugsweise über Nacht, inkubieren (Abbildung 1B,D).
    3. Die beschichteten Platten bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
  2. Platten für Gesamtimmunglobuline waschen und blockieren
    1. Die Beschichtungslösung aus den Platten 1 und 3 entfernen, indem jede Platte rasch über einem Abfallbehälter invertiert wird. Die invertierte Platte fest auf saugfähigem Papier abklopfen, um restliche Flüssigkeit zu entfernen.
    2. Jede Platte zweimal mit je 200 µL/Vertiefung PBS, enthaltend 0,05 % Tween 20, waschen. Anschließend die Platten zweimal mit je 200 µL/Vertiefung DPBS waschen, um restliches Detergens zu entfernen.
      HINWEIS: Tween 20 ist zytotoxisch. Es muss vollständig entfernt werden, bevor Zellen ausgesät werden.
    3. 200 µL/Vertiefung RPMI-10 in jede Vertiefung geben. Die Platten 2 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator inkubieren.
  3. Platten für antigenspezifische Antikörper waschen und blockieren
    1. Die GNL-Beschichtungslösung aus den Platten 2 und 4 entfernen, indem jede Platte rasch über einem Abfallbehälter invertiert wird. Die invertierten Platten fest auf saugfähigem Papier abklopfen, um restliche Flüssigkeit zu entfernen.
    2. Jede Platte viermal mit je 200 µL/Vertiefung DPBS waschen.
      HINWEIS: Für GNL-beschichtete Platten kein PBS mit Tween 20 verwenden.
    3. 200 µL/Vertiefung RPMI-10 in jede Vertiefung geben. Die Platten 2 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator inkubieren.
    4. Die Blockierungslösung verwerfen. Jede Platte viermal mit je 200 µL/Vertiefung DPBS waschen.
    5. 100 µL/Vertiefung CH505 SOSIP-Antigen in einer Endkonzentration von 5 µg/mL hinzufügen. Die Platten 2 h bei 37 °C inkubieren.
    6. Die Antigenlösung verwerfen und jede Platte viermal mit steriler DPBS waschen.
      HINWEIS: Nach dem letzten Waschschritt DPBS in den Vertiefungen belassen, um zu verhindern, dass die MCE-Membran vor dem Aussäen der Zellen austrocknet.

2. Probenvorbereitung: Isolierung von PBMCs und monozytären Zellen aus Knochenmark

  1. Isolierung von PBMCs aus Vollblut
    1. Zentrifugieren Sie 10 mL EDTA-Blut bei 450 x g für 20 min bei Raumtemperatur, ohne die Bremse zu verwenden.
    2. Entfernen Sie das Plasma und geben Sie 4 mL DPBS ohne Ca2+ und Mg2+ hinzu. Mischen Sie vorsichtig mit einer 10-mL-Serologischen Pipette.
    3. Schichten Sie das verdünnte Blut vorsichtig über 4 mL Ficoll in einem 15-mL-Zentrifugenröhrchen auf. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 30 min bei Raumtemperatur mit langsamer Beschleunigung und langsamer Verzögerung.
    4. Überführen Sie die Buffy Coat, die periphere mononukleäre Blutzellen enthält, in ein neues 15-mL-Röhrchen. Geben Sie 8–10 mL DPBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 450 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
    5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig.
    6. Geben Sie 2 mL Ammonium-Chlorid-Kalium-(ACK)-Lysispuffer zur Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur.
      ACHTUNG: Überschreiten Sie nicht die 5-minütige Inkubationszeit, da eine längere Exposition gegenüber dem ACK-Lysispuffer die Zellviabilität verringert.
    7. Beenden Sie die Erythrozytenlyse durch Zugabe von 10 mL DPBS mit 2 % fetalem Kälberserum (FBS). Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
    8. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in RPMI-10.
    9. Zählen Sie die PBMCs mithilfe einer geeigneten Zellzählmethode und stellen Sie sicher, dass die Viabilität >90 % beträgt, z. B. durch Trypanblau-Färbung.
    10. Einstellen eines Aliquots auf 5 × 106 Zellen/mL für antigenspezifische ELISpot-Assays. Einstellen eines zweiten Aliquots auf 1 × 106 Zellen/mL für Gesamtimmunglobulin-ELISpot-Assays.
  2. Isolierung von mononukleären Knochenmarkzellen
    1. Platzieren Sie einen 70-µm-Zellfilter in ein 50-mL-Zentrifugenröhrchen. Benetzen Sie den Filter vorab mit 1 mL DPBS.
    2. Geben Sie 4 mL DPBS zu 1 mL Knochenmarkaspirat hinzu. Mischen Sie gründlich mit einer serologischen Pipette.
    3. Führen Sie die Knochenmark-Suspension durch den 70-µm-Zellfilter. Spülen Sie den Filter mit 2 mL DPBS, bevor Sie ihn entsorgen.
    4. Schichten Sie die gefilterte Suspension über 4 mL Ficoll in einem 15-mL-Zentrifugenröhrchen auf. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 30 min bei Raumtemperatur mit langsamer Beschleunigung und langsamer Verzögerung.
    5. Überführen Sie die Schicht der mononukleären Zellen in ein neues 15-mL-Röhrchen. Geben Sie 8–10 mL DPBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 450 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
    6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig.
    7. Geben Sie 2 mL ACK-Lysispuffer zur Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur.
      ACHTUNG: Überschreiten Sie nicht die empfohlene Lysedauer, um die Zellviabilität zu erhalten.
    8. Beenden Sie die Erythrozytenlyse durch Zugabe von 10 mL DPBS mit 2 % FBS. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
    9. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in RPMI-10.
    10. Zählen Sie die mononukleären Knochenmarkzellen mithilfe einer geeigneten Zellzählmethode und stellen Sie sicher, dass die Viabilität >90 % beträgt, z. B. durch Trypanblau-Färbung.
    11. Einstellen eines Aliquots auf 5 × 106 Zellen/mL für antigenspezifische ELISpot-Assays. Einstellen eines zweiten Aliquots auf 1 × 106 Zellen/mL für Gesamtimmunglobulin-ELISpot-Assays.

3. Aussäen und Inkubation der Zellen

  1. Besäen der Gesamtimmunglobulin-Platten
    1. Entfernen Sie das Blockiermedium von den Platten 1 und 3, indem Sie jede Platte rasch über einem Abfallbehälter umdrehen. Klopfen Sie die umgedrehten Platten fest auf saugfähiges Papier, um restliches Medium zu entfernen.
    2. Geben Sie 100 µL RPMI-10 in jedes Loch der ersten Reihe und 133 µL RPMI-10 in jedes Loch der zweiten und dritten Reihe. Dies erfolgt in technischen Duplikaten.
    3. Geben Sie 100 µL PBMC-Suspension (1 × 106 Zellen/mL) in das erste Loch jeder Spalte der Platte 1. Ordnen Sie die Proben gemäß dem Plattenlayout an [z. B. Löcher A1–A6 für Rhesusmakake 1 (RM1) und A7–A12 für Rhesusmakake 2 (RM2)].
    4. Geben Sie 100 µL Knochenmarkzell-Suspension (1 × 106 Zellen/mL) in das erste Loch jeder Spalte der Platte 3. Ordnen Sie die Proben gemäß dem Plattenlayout an.
    5. Bereiten Sie dreifache serielle Verdünnungen vor, indem Sie 67 µL von einem Loch in das nächste überführen und nach jeder Übertragung gründlich mischen. Fahren Sie mit der seriellen Verdünnung in den vorgesehenen Löchern fort und entsorgen Sie dann die letzten 67 µL, um ein Endvolumen von 133 µL pro Loch beizubehalten.
    6. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2.
      ​HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Platten während der Inkubation zu bewegen oder zu stören, um Doppelspots zu verhindern.
  2. Besäen der antigenspezifischen Platten
    1. Entfernen Sie das DPBS von den Platten 2 und 4, indem Sie jede Platte rasch über einem Abfallbehälter umdrehen. Klopfen Sie die umgedrehten Platten fest auf saugfähiges Papier, um restliches Puffermedium zu entfernen.
    2. Geben Sie 100 µL RPMI-10 in jedes Loch der ersten Reihe und 133 µL RPMI-10 in jedes Loch der zweiten und dritten Reihe.
    3. Geben Sie 100 µL PBMC-Suspension (5 × 106 Zellen/mL) in das erste Loch jeder Spalte der Platte 2. Fügen Sie die Proben gemäß dem Plattenlayout hinzu.
    4. Geben Sie 100 µL Knochenmarkzell-Suspension (5 × 106 Zellen/mL) in das erste Loch jeder Spalte der Platte 4. Fügen Sie die Proben gemäß dem Plattenlayout hinzu.
    5. Bereiten Sie dreifache serielle Verdünnungen vor, indem Sie 67 µL von einem Loch in das nächste überführen und nach jeder Übertragung gründlich mischen. Fahren Sie mit der seriellen Verdünnung in den vorgesehenen Löchern fort und entsorgen Sie dann die letzten 67 µL, um ein Endvolumen von 133 µL pro Loch beizubehalten.
    6. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, den Inkubator während der Inkubation zu stören, da Vibrationen Doppelspots oder Kometenschweif-Artefakte verursachen können.

4. Bearbeitung der ELISpot-Platten

  1. Verarbeitung der Gesamtimmunglobulin-Platten
    1. Entfernen Sie die Platten nach einer Inkubationszeit von etwa 18 h aus dem Inkubator.
    2. Entsorgen Sie die Zellen und das Kulturmedium, indem Sie jede Platte rasch über einen Abfallbehälter mit 10 % Bleichmittel umdrehen. Klopfen Sie die umgedrehten Platten fest auf saugfähiges Papier, um restliche Flüssigkeit zu entfernen.
      HINWEIS: Führen Sie die weiteren Verarbeitungsschritte unter nicht sterilen Bedingungen durch.
    3. Waschen Sie jede Platte viermal mit 200 µL/Well DPBS, das 0,05 % Tween 20 enthält.
      HINWEIS: Lassen Sie den letzten Waschpuffer in den Vertiefungen, um zu verhindern, dass die Membranen austrocknen.
    4. Alternativ können die Platten mit einem automatisierten Mikroplattenwascher gewaschen werden, wenn eine große Anzahl von Platten verarbeitet wird.
    5. Bereiten Sie die Detektionsantikörperlösung vor, indem Sie biotinylierte anti-Affen-IgG- und IgM-Antikörper 1:1.000 sowie biotinylierten anti-Affen-IgA-Antikörper 1:500 in DPBS mit 0,05 % Tween 20 und 1 % FBS verdünnen.
    6. Entfernen Sie den letzten Waschpuffer, indem Sie die Platten auf saugfähiges Papier klopfen. Geben Sie 100 µL/Well verdünnten anti-IgG-Antikörper in die Spalten 1 und 2, 7 und 8, anti-IgM-Antikörper in die Spalten 3 und 4, 9 und 10 sowie anti-IgA-Antikörper in die Spalten 5 und 6, 11 und 12.
      HINWEIS: Verarbeiten Sie jeweils eine Platte gleichzeitig, um zu verhindern, dass die Membranen austrocknen.
    7. Inkubieren Sie die Platten 2 h bei Raumtemperatur.
    8. Entsorgen Sie die Detektionsantikörperlösung und waschen Sie die Platten viermal mit DPBS, das 0,05 % Tween 20 enthält.
    9. Bereiten Sie das Enzymkonjugat vor, indem Sie HRP-Avidin 1:1.000 in DPBS mit 0,05 % Tween 20 und 1 % FBS verdünnen.
    10. Geben Sie 100 µL/Well verdünntes HRP-Avidin in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten 2 h bei Raumtemperatur, lichtgeschützt.
    11. Entsorgen Sie die HRP-Avidin-Lösung und waschen Sie die Platten viermal mit DPBS, das 0,05 % Tween-20 enthält.
      ​HINWEIS: Lassen Sie den letzten Waschpuffer in den Vertiefungen, bis die Substratentwicklung abgeschlossen ist.
  2. Verarbeitung der antigenspezifischen Platten
    HINWEIS: Das Verfahren ist vergleichbar mit dem für die Gesamtimmunglobulin-Platten. Führen Sie jedoch alle Waschschritte mit DPBS ohne Tween 20 durch, um die GNL-Beschichtung zu erhalten.
    1. Entfernen Sie die Platten nach einer Inkubationszeit von etwa 18 h aus dem Inkubator.
    2. Entsorgen Sie die Zellen und das Kulturmedium, indem Sie jede Platte rasch über einen Abfallbehälter mit 10 % Bleichmittel umdrehen. Klopfen Sie die umgedrehten Platten fest auf saugfähiges Papier, um restliche Flüssigkeit zu entfernen.
      HINWEIS: Führen Sie die weiteren Verarbeitungsschritte unter nicht sterilen Bedingungen durch.
    3. Waschen Sie jede Platte viermal mit 200 µL/Well DPBS.
      HINWEIS: Lassen Sie den letzten Waschpuffer in den Vertiefungen, um zu verhindern, dass die Membranen austrocknen.
    4. Bereiten Sie die Detektionsantikörperlösung vor, indem Sie biotinylierte anti-Affen-IgG- und IgM-Antikörper 1:1.000 sowie biotinylierten anti-Affen-IgA-Antikörper 1:500 in DPBS mit 1 % FBS verdünnen.
    5. Entfernen Sie den letzten Waschpuffer, indem Sie die Platten auf saugfähiges Papier klopfen. Geben Sie 100 µL/Well verdünnten anti-IgG-Antikörper in die Spalten 1 und 2, 7 und 8, anti-IgM-Antikörper in die Spalten 3 und 4, 9 und 10 sowie anti-IgA-Antikörper in die Spalten 5 und 6, 11 und 12.
      HINWEIS: Verarbeiten Sie jeweils eine Platte gleichzeitig, um zu verhindern, dass die Membranen austrocknen.
    6. Inkubieren Sie die Platten 2 h bei Raumtemperatur.
    7. Entsorgen Sie die Detektionsantikörperlösung und waschen Sie die Platten viermal mit 200 µL/Well DPBS.
    8. Bereiten Sie das Enzymkonjugat vor, indem Sie HRP-Avidin 1:1.000 in DPBS mit 1 % FBS verdünnen.
    9. Geben Sie 100 µL/Well verdünntes HRP-Avidin in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten 2 h bei Raumtemperatur, lichtgeschützt.
    10. Entsorgen Sie die HRP-Avidin-Lösung und waschen Sie die Platten viermal mit 200 µL/Well DPBS.
      HINWEIS: Lassen Sie den letzten Waschpuffer in den Vertiefungen, bis die Substratentwicklung abgeschlossen ist.
  3. Durchführung der automatisierten Wäsche (optional)
    1. Primen Sie den automatisierten Mikroplattenwascher gemäß den Herstelleranweisungen mit DPBS.
    2. Wählen Sie das vordefinierte ELISpot-Waschprogramm aus und führen Sie alle Waschschritte mit DPBS durch.
      HINWEIS: Verwenden Sie DPBS für alle automatisierten Wäschen, um wiederholtes Priming des Geräts mit unterschiedlichen Waschpuffern zu vermeiden.
    3. Verwenden Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Waschereinstellungen für den Mikroplattenwascher.

5. Nachweis

  1. Bereiten Sie die Substratlösung vor
    1. Bereiten Sie das AEC-Arbeitssubstrat unmittelbar vor der Verwendung zu, indem Sie einen Tropfen Chromogenlösung zu je 1 mL Substratlösung hinzufügen. Mischen Sie gründlich durch Vortexen.
      HINWEIS: Bereiten Sie etwa 40 mL Arbeitssubstrat für vier 96-Well-Platten vor.
  2. Entwickeln Sie die ELISpot-Platten bei Raumtemperatur
    1. Verarbeiten Sie jeweils eine Platte. Entsorgen Sie die letzte Waschpufferlösung und geben Sie sofort 100 µL/Welle AEC-Arbeitssubstrat hinzu.
    2. Überwachen Sie die Spotentwicklung visuell, bis deutliche rote Spots sichtbar werden, typischerweise innerhalb von 2–4 min.
      ACHTUNG: Überentwickeln Sie die Platten nicht, da eine übermäßige Entwicklung die Hintergrundfärbung erhöht und die Spotauflösung beeinträchtigt.
    3. Beenden Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie die Platte gründlich unter fließendem Leitungswasser spülen.
    4. Waschen Sie die Platte vier bis fünfmal mit Leitungswasser. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit saugfähigen Papiertüchern.
    5. Entfernen Sie den Unterboden der Platte und lassen Sie die Platten vor dem Zählen der Spots etwa 24 h lufttrocknen.
      HINWEIS: Stoppen Sie die Reaktion, sobald Spots in den Vertiefungen mit den höchsten Zellkonzentrationen sichtbar werden, um eine Überentwicklung zu vermeiden.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1–5.2.5 für jede verbleibende Platte.

6. Quantifizierung der Flecken

  1. ELISpot-Bilder erfassen
    1. Jede Platte mit einem ELISpot-Lesegerät, das über eine Bildaufnahmesoftware verfügt, scannen.
    2. Die geeignete Plattenvorlage auswählen, die zu analysierenden Vertiefungen definieren und gemäß der Softwareanweisungen Bilder aufnehmen.
    3. Die Rohdaten speichern und die Plattenbilder im TIFF-Format zur Archivierung exportieren.
  2. Antikörpersekretierende Zellen zählen
    1. Die automatischen Spot-Zählungen für jede Vertiefung überprüfen.
    2. Jede Vertiefung manuell verifizieren, um falsch zusammengeführte oder geteilte Spots zu erkennen. Einzelspots bei Bedarf manuell markieren, um genaue Zählungen zu erhalten.
      HINWEIS: Eine manuelle Verifizierung wird empfohlen, da große Spots von der automatischen Analyse-Software möglicherweise mehrfach gezählt werden.
    3. Die Spot-Zählungen zusammen mit den entsprechenden Verdünnungsfaktoren in einer Tabellenkalkulation erfassen, wie in Tabelle 2 beschrieben.
    4. Doppelte Vertiefungen für IgG, IgM und IgA getrennt analysieren, bevor der durchschnittliche Spot-Zählwert für jede Verdünnung berechnet wird.
    5. Die Anzahl der antikörpersekretierenden Zellen pro eine Million eingesetzter Zellen berechnen, indem der durchschnittliche Spot-Zählwert mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert wird.
      HINWEIS: Für Gesamtimmunglobulin-Assays Verdünnungsfaktoren von 15×, 45× und 135× verwenden und für antigenspezifische Assays 3×, 9× und 27×.
    6. Alle Berechnungen in einer Tabellenkalkulationssoftware durchführen und Diagramme mithilfe einer statistischen Grafiksoftware erstellen.

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Ergebnisse

In diesem B-Zell-ELISpot-Assay wurden Antikörper-sekretierende Zellen (ASCs) mithilfe von CH505 SOSIP nachgewiesen, einem löslichen HIV-1-Hüllglykoprotein-(Env-)Trimer, das als Beschichtungsantigen in einer Impfstoffstudie eingesetzt wurde, die darauf abzielt, breit neutralisierende Antikörper (bnAbs) gegen HIV-1 auszulösen. Abbildung 1 veranschaulicht das ELISpot-Plattenlayout, das zur Quantifizierung von gesamten und antigenspezifischen ASCs auf separaten Platten verwendet wurde. Das Layou...

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Diskussion

Der B-Zell-ELISpot ist eine empfindliche Methode zur Detektion von gesamten Immunglobulin- und antigenspezifischen antikörpersekreierenden Zellen (ASC) in Blut, Plasma und Knochenmarkzellen8,9,10,11. Mehrere Schritte sind entscheidend, um die Reproduzierbarkeit des Protokolls sicherzustellen. Zunächst sollten die Membranen präzise mit der optimalen Konzentration des Erfassungsantikörpers beschi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen anzugeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten den Tieren und dem Pflegepersonal am Keeling Center for Comparative Medicine and Research für ihre Betreuung danken sowie vielen ehemaligen Teammitgliedern und Kooperationspartnern für die schrittweisen Verbesserungen des Verfahrens. Die Finanzierung für dieses NHP-HIV-Impfstoffprojekt wurde durch die NIH-Fördermittel 5R01AI183472 an MBZ und R24OD010947 an FJV bereitgestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ACK-LyseQuality Biological118-156-101500 ml
70µm-SiebFisher22363548Steriler Zellfilter, passend für 50 mL kegelförmige Röhrchen
AEC-Arbeits-SubstratBD Biosciences551951Reagenzien für 10 Platte(n)
Analyse: ExcelMicrosoft OfficeVersion 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel für Microsoft 365
Analyse: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Anti-Rhesus-IgA-BiotinNHPRRAB-3086851lyophilisiert
Anti-Makaken-IgG-BiotinRocklandP/N 617-106-012lyophilisiert
Anti-Makaken-IgM-BiotinRocklandP/N 617-106-007lyophilisiert
BlockiermediumIm Labor hergestellte Reagenzienin EigenformulierungRPMI-10
Puffer zum Verdünnen des sekundären Antikörpers und HRPIm Labor hergestellte Reagenzienin Eigenformulierung1X DPBS mit 1 % FBS
Zentrifuge Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, Baujahr: 2013, TX-750-Rotor und 75003608 (Rundkorb)
Coating-PufferIm Labor hergestellte Reagenzienin Eigenformulierung1X DPBS
DPBSGibco14190-1361X
ELISpot-PlattenMillipore SigmaMSHAN4B5050-Platten-Packung
Fötales Rinderserum (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL, unbeleuchtetVector LaboratoriesL-1240-5lyophilisiert
Meerrettichperoxidase (HRP)-AvidinVector LaboratoriesA-20045 mg/ml, gebrauchsfertig
Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpot-LesegerätMabtech ABP/N: 2000Automatisierte Bildgebung und Analyse für ELISpot- und Fluorospot-Assays
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122100X
PlattenwascherBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRS405 TS Mikroplattenwascher
RPMI-10Im Labor hergestellte Reagenzienin EigenformulierungRPMI-1640 + 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life SciencesP7949500 ml
Unkonjugiertes polyklonales Ziegen-Anti-Makaken-IgG+IgA+IgM-Antikörper IgG/IgM/IgALS-BioC347340lyophilisiert
Waschpuffer (antigenspezifische Platten)Im Labor hergestellte Reagenzienin Eigenformulierung(nur DPBS 1X)
Waschpuffer (Gesamt-Ig-Platten)Im Labor hergestellte Reagenzienin Eigenformulierung(DPBS 1X + 0,05 % Tween 20)

Referenzen

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