Planung und Betrieb einer hauseigenen Kryo-Elektronenmikroskopie-Einrichtung mit IT-Infrastruktur und On-the-Fly-Datenverarbeitungspipelines

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen praktischen Rahmen für die Planung und den Betrieb der IT-Infrastruktur einer internen Kryogenen Elektronenmikroskopie (cryo-EM) Einrichtung. Es behandelt die Einrichtungsplanung, Netzwerkarchitektur, Datenspeicherung, GPU-Rechenleistung, Fernzugriff und die Echtzeit-Datenverarbeitung und ermöglicht so ein effizientes Management von mehreren Terabyte großen Datensätzen, während gleichzeitig skalierbare, nachhaltige und leistungsstarke cryo-EM-Abläufe gewährleistet werden.

Zusammenfassung

Die Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat sich zu einer führenden Methode für die hochauflösende Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle entwickelt. Mit dem weltweiten Wachstum der Anzahl institutioneller Kryo-EM-Einrichtungen ist jedoch eine anhaltende Herausforderung aufgetreten: Die Dateninfrastruktur, die zum Betrieb dieser Einrichtungen erforderlich ist, wird regelmäßig unterschätzt. Moderne Kryo-EM-Geräte in Kombination mit direkten Elektronendetektoren (DEDs) erzeugen zwischen 2 und 5 TB Rohdaten pro Tag, und eine Einrichtung mit 20 Nutzern kann innerhalb eines einzigen Betriebsjahres etwa 2 PB Daten ansammeln. Die Verarbeitung dieser Daten erfordert dedizierte GPU-Recheneinheiten, Hochgeschwindigkeits-Netzwerkinfrastruktur und robuste Langzeitarchivierungsstrategien – all dies muss bereits vor Beginn der Datensammlung vorhanden sein. Dieses Protokoll stellt einen integrierten Rahmen für die IT- und Rechenarchitektur einer internen Kryo-EM-Einrichtung vor. Wir behandeln die Anforderungen an die bauliche Infrastruktur (Raumgestaltung, Stromversorgung, Kühlung und Vibrationsschutz), die Auswahl der Geräte (Mikroskope, DEDs und unterstützende Instrumente) sowie den gesamten Rechenstapel: Konfiguration der Netzwerk-Switches, Auswahl und Dimensionierung von Speicherservern, Bereitstellung von GPU-Recheneinheiten und Architektur für den Fernzugriff. Anschließend geben wir ein detailliertes Protokoll zur Implementierung von Echtzeit-Datenverarbeitungspipelines an – einschließlich Bewegungskorrektur, Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF), Partikelidentifikation und 2D-Klassifizierung in Echtzeit während der Datensammlung – unter Verwendung etablierter Standardwerkzeuge. Auch Strategien zum Datentransfer für externe Nutzer werden erörtert. Dieser Leitfaden schließt eine entscheidende Lücke in der Literatur und ermöglicht es Forschern und Administratoren, Kryo-EM-Einrichtungen zu errichten, die von Tag eins an rechentechnisch voll einsatzfähig sind.

Einleitung

Die Kryo-EM-„Auflösungsrevolution“ hat die Strukturbiologie verändert und ermöglicht die Visualisierung von Proteinen, Nukleinsäuren und makromolekularen Komplexen auf atomarer Auflösung, ohne dass eine Kristallisation erforderlich ist^1,2. Drei technische Fortschritte trieben diese Entwicklung voran: die Entwicklung von DEDs mit hohen Bildraten, Verbesserungen in der Elektronenoptik und Mikroskopmechanik sowie die Optimierung von GPU-beschleunigter Bildverarbeitungssoftware^3,4,5,6. Gemeinsam haben diese Fortschritte Kryo-EM zur Methode der Wahl für eine wachsende Gemeinschaft strukturbiologischer Forscher gemacht.

Die Nachfrage nach Zugang zu Kryo-EM hat erhebliche Investitionen sowohl in große nationale Zentren als auch in kleinere institutionelle Einrichtungen ausgelöst. Nationale Zentren – wie NCCAT, S2C2, PNCC und MCCET in den USA sowie eBIC, NeCEN und SciLifeLab in Europa^3,5,6 – bieten Zugang zu den leistungsfähigsten Geräten für bewilligte Projekte. Hauseigene Einrichtungen ergänzen diese Ressourcen, indem sie iteratives, projektspezifisches Forschungsvorhaben mit kürzeren Durchlaufzeiten und engerer Interaktion zwischen Nutzern und Personal unterstützen. Die Einrichtung einer funktionsfähigen hauseigenen Einrichtung erfordert jedoch weitaus mehr als nur den Kauf eines Mikroskops: die unterstützende IT-Infrastruktur ist ebenso entscheidend, und deren Unzulänglichkeit ist eine der Hauptursachen für Betriebsstörungen in neuen Einrichtungen⁶.

Eine einzelne Hochleistungssitzung der Kryo-EM kann innerhalb von 24 Stunden 2–5 TB an rohen Filmdaten erzeugen. Bei mehreren Mikroskopen und Nutzern erreicht die Datenlast rasch petabytegroße Dimensionen. Die Verarbeitung dieser Daten erfordert GPU-beschleunigte Pipelines, die gleichzeitig mit der Datenaufnahme betriebsbereit sein müssen^7,8. Verzögerungen bei der Vorverarbeitung führen zu verzögertem Feedback zur Datenqualität und zu verschwendeter Gerätezeit. Trotz dieser Gegebenheiten widmen die meisten veröffentlichten Leitfäden zum Management von Kryo-EM-Einrichtungen den IT-Komponenten nur minimale Aufmerksamkeit, und keiner bietet ein schrittweises Betriebsprotokoll für den Aufbau und die Validierung einer vollständigen Dateninfrastruktur.

Dieses Protokoll schließt diese Lücke. Wir beschreiben die physikalischen und technischen Anforderungen für den Aufbau einer Einrichtung, die Auswahlkriterien für Mikroskope und Detektoren sowie – am wichtigsten – die Planung und Implementierung der IT-Infrastruktur, die eine betriebliche Durchführbarkeit einer Kryo-EM-Einrichtung ermöglicht⁶. Besonderes Augenmerk liegt auf der Echtzeit-Datenverarbeitung: der automatisierten, parallelen Vorverarbeitung der Daten während der Aufnahme, die eine Qualitätskontrolle in Echtzeit ermöglicht, Entscheidungen während der Datensammlung unterstützt und die Nachbearbeitungszeit nach einer Sitzung erheblich verkürzt^9,10,11. Durch die Befolgung dieses Protokolls sind Entwickler von Einrichtungen in der Lage, einen vollständigen, integrierten Kryo-EM-Betrieb aufzubauen, der nachhaltig und effizient einer breiten wissenschaftlichen Gemeinschaft dient.

Protokoll

Einzelheiten zu den Geräten, Software und Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

1. Planung der räumlichen Ausstattung, des Personals und der Infrastruktur

1. Führen Sie eine Standortbeurteilung durch. Wählen Sie einen Gebäudestandort, der Folgendes bietet: einen vibrationsisolierten Boden (Umweltvibrationsniveaus, idealerweise < 1 µm/s Effektivwert bei 1–100 Hz); magnetische Feldstabilität (< 1 mG/m räumlicher Gradient und < 0,1 mG/m zeitliche Variation für 300-kV-Geräte); stabile Raumtemperatur (18–22 °C mit < 0,5 °C Schwankung); Feuchtigkeitskontrolle (40–60 % rel. Feuchte); und geringe akustische Geräusche (< 50 dB). Ziehen Sie die Standortanforderungen des Mikroskopherstellers frühzeitig in der Planungsphase heran.
   ANMERKUNG: Die Sanierung eines bestehenden Raums kann genauso teuer sein wie ein Neubau. Als Daumenregel sollten Sie ungefähr 20 % des Mikroskopkaufpreises für die Raumbereitung einplanen.
2. Planen Sie die räumliche Anordnung der Einrichtung mit klarer Trennung der Funktionsbereiche: (a) Mikroskopieraum/-räume für kryogene Transmissions-Elektronenmikroskope (Cryo-TEMs); (b) einen Vorbereitungsraum für die Handhabung und Lagerung von Objekträgern; (c) einen Steuerungsraum mit Wasserkühlern, USV-Einheiten und Mikroskop-Kühlsystemen; und (d) einen separaten Serverraum oder Rechenzentrum für Speicher- und Recheneinrichtungen.
   ANMERKUNG: Der Steuerungsraum muss stets unter 26 °C gehalten werden, und es ist eine dedizierte Notstromversorgung und Kühlung bereitzustellen. Temperaturschwankungen im Steuerungsraum sind eine häufige Ursache für Ausfallzeiten des Mikroskops.
3. Planen Sie die Stromversorgungsinfrastruktur. Installieren Sie dedizierte Dreiphasen-Stromkreise für hochwertige Cryo-TEMs. Schließen Sie alle Mikroskope, Kameras und Serversysteme an die vorgesehene geschützte Stromversorgung an. Koordinieren Sie mit dem technischen Betrieb der Institution die Einbindung eines Notstromgenerators, der den Betrieb des Mikroskops und den Kühlwasserfluss während Stromausfällen aufrechterhalten kann.
   ANMERKUNG: Mehrere Geräte in einer Cryo-EM-Einrichtung benötigen mehr als einen Tag, um einen sicheren Einschaltzyklus durchzuführen. Ungeplante Stromausfälle können empfindliche Leiterplatten beschädigen und aktive Datenaufnahmesitzungen gefährden.
4. Installieren Sie Kühlwassersysteme für das Elektronenmikroskop und die zugehörige Hardware. Richten Sie einen Ersatz-Kühlwasserkreislauf mit automatischer Umschaltung ein. Überwachen Sie kontinuierlich Durchflussrate, Temperatur und Leitfähigkeit des Wassers mithilfe des integrierten Überwachungssystems des Mikroskops oder einer dedizierten Sensoranordnung.
5. Verlegen Sie Glasfaserkabel von den Mikroskopierräumen zum Serverraum während der Bauphase oder Renovierung. Verwenden Sie mindestens OM4 Multimode- oder OS2 Singlemode-Glasfaser mit ausreichendem Zugentlastungsspiel und beschrifteten Patchfeldern an beiden Enden.
   ANMERKUNG: Die Vorinstallation von Glasfaser ist deutlich kostengünstiger als eine nachträgliche Nachrüstung.
6. Bestimmen Sie dedizierte Mikroskopbediener oder Einrichtungswissenschaftler, die für die Wartung der Geräte, Benutzerschulungen, Terminplanung, Probenvorbereitungsoptimierung und Unterstützung bei der Datenaufnahme zuständig sind. Benennen Sie spezielle IT-Mitarbeiter, die für die Infrastruktur, Netzwerkleistung, Cybersicherheit, Datensicherung, Softwarebereitstellung, GPU-Rechenressourcen und Fernzugriff der Benutzer verantwortlich sind.
7. Bestimmen Sie den Personalbedarf entsprechend dem Umfang der Benutzerunterstützung und der Komplexität der Recheninfrastruktur. In kleineren Einrichtungen, wie beispielsweise der UCSC Biomolecular cryo-EM Facility, können diese Aufgaben von einer leitenden Person mit IT-Know-how oder zentralen institutionellen IT-Diensten übernommen werden; mit steigender Zahl an Mikroskopen, Benutzern und jährlichen Datenaufnahmesitzungen werden jedoch spezialisierte Fachkräfte zunehmend notwendig.
8. Stellen Sie eine dedizierte IT-Betreuung für Einrichtungen bereit, die mehrere Cryo-TEMs betreiben, um eine unterbrechungsfreie Datenaufnahme, effizientes Datenmanagement und skalierbare Rechenressourcen sicherzustellen. Investieren Sie frühzeitig in eine leistungsstarke IT-Infrastruktur und qualifiziertes Personal, um Betriebsausfallzeiten zu minimieren, eine zukünftige Erweiterung zu vereinfachen und ein nachhaltiges System zu schaffen, das wachsende Benutzergruppen und datenintensive Cryo-EM-Arbeitsabläufe unterstützen kann.

2. Auswahl von Mikroskop und Detektor

1. Definieren Sie die primäre wissenschaftliche Aufgabe der Einrichtung, bevor Sie ein Mikroskop auswählen. Berücksichtigen Sie: (a) ob der primäre Arbeitsablauf aus Einzelpartikelanalyse (SPA), Kryo-Elektronentomographie (cryo-ET), Mikro-Elektronendiffraktion (microED) oder einer Kombination daraus bestehen wird; (b) die erwartete Größe der Nutzergruppe und die Vielfalt der Projekte; (c) Budgetbeschränkungen sowohl für die Anschaffung als auch für laufende Serviceverträge.
2. Beurteilen Sie verfügbare Kryo-TEM-Plattformen entsprechend den geplanten Anwendungen. Für hochauflösende SPA und Subtomogramm-Mittelung (STA) ziehen Sie 300-kV-Instrumente in Betracht. Für Screening und Datenerfassung mittlerer Auflösung ziehen Sie 200-kV-Instrumente in Betracht. Für einen kostengünstigeren Einstieg mit Screening-Funktion bewerten Sie 100–120 kV (zusammengefasst in Tabelle 1).
   ANMERKUNG: Spezifikationsblätter ändern sich häufig. Fordern Sie stets aktuelle Konfigurationsdetails und Preise direkt beim Hersteller an, bevor Sie endgültige Geräteentscheidungen treffen.
3. Wählen Sie einen DED, der zum Mikroskop und zur Anwendung passt. Für hochauflösende SPA an Geräten von Thermo Fisher Scientific (TFS) ist der Falcon 4i derzeit die primäre Option für die Krios- und Glacios-Serie.
4. Für JEOL CryoARM-Geräte bietet der Gatan K3 eine hervorragende Empfindlichkeit und hohe Bildraten. Für Einrichtungen, die sowohl SPA als auch microED anstreben, bestätigen Sie die Kompatibilität des Detektors mit den Datenerfassungsmodi für Elektronendiffraktion (Tabelle 2).
   ANMERKUNG: Der DED ist eine der teuersten Komponenten der Einrichtung und beeinflusst maßgeblich die Datenqualität sowie die Anforderungen an die Datenspeicherung. Der Electron Event Register (EER)-Modus erzeugt beispielsweise deutlich größere Rohdateien als herkömmliche komprimierte Formate und erfordert entsprechend mehr Speicherplatz und Netzwerkbandbreite.
5. Beurteilen Sie die Rolle eines Energiefilters bei der Auswahl der Kryo-EM-Gerätekonfiguration, da dieser die Bildqualität, die Detektorwahl und die Gesamtleistung des Systems erheblich beeinflussen kann. Durch die Entfernung inelastisch gestreuter Elektronen verbessern Energiefilter den Kontrast und das Signal-Rausch-Verhältnis, was besonders vorteilhaft für anspruchsvolle Proben, hochauflösende SPA (vorteilhaft), Kryo-ET (entscheidend) und microED (vorteilhaft) ist.
6. Beurteilen Sie während der Geräteauswahl die verfügbaren Energiefiltersysteme. Gatan Bioquantum- und Biocontinuum- oder Thermo Fisher Scientific Selectris- und SelectrisX-Systeme kosten je nach Konfiguration typischerweise etwa 0,3–1,5 Mio. US-Dollar.
7. Beurteilen Sie die zusätzlichen Kosten und die erhöhte Komplexität, die mit Energiefiltern in Kombination mit den Detektorfunktionen, den Zielen der Einrichtung und den erwarteten Anwendungen der Nutzer verbunden sind, bevor Sie die endgültige Gerätekonfiguration festlegen.
8. Berücksichtigen Sie Serviceverträge bei der Berechnung der Gesamtanschaffungskosten. Serviceverträge decken in der Regel das Mikroskop, den Energiefilter, den Detektor und das Wasserkühlsystem ab.
9. Verhandeln Sie die Bedingungen der Serviceverträge – einschließlich Garantien für Reaktionszeiten und Verfügbarkeit von Leihersatzteilen – zum Zeitpunkt des Gerätekaufs. Planen Sie jährlich 8–15 % des Gerätekaufpreises für den Serviceumfang ein.

3. Design und Implementierung der Netzwerkarchitektur

1. Planen Sie das interne Facility-Netzwerk um einen zentralen Hochgeschwindigkeitsswitch herum. Schließen Sie alle datenerzeugenden und datenverbrauchenden Geräte direkt an diesen Switch mit der höchstmöglichen unterstützten Geschwindigkeit an: Mikroskop-Controller, Kamera-Controller (häufig ein separater Workstation), Speicher-Server und GPU-Compute-Knoten.
2. Stellen Sie eine Mindestverbindung von 10 Gbps zu jedem Gerät bereit. Richten Sie 25 Gbps oder schnellere Uplinks zwischen dem Switch und den Speicher- sowie Compute-Knoten ein, soweit das Budget dies zulässt.
   HINWEIS: Bei 1 Gbps würde die Übertragung von 20 TB Rohdaten 2–3 Tage dauern. Bei 10 Gbps dauert dieselbe Übertragung 5–6 Stunden. Bei 25 Gbps dauert sie etwa 2 Stunden. Die Netzwerkgeschwindigkeit bestimmt unmittelbar, ob die Echtzeitverarbeitung mit der Datenaufnahme Schritt halten kann.
3. Legen Sie die Spezifikationen für den Kern-Switch fest. Anforderungen: (a) nicht blockierende Switching-Matrix bei voller Leitungsrate; (b) ausreichend SFP+- oder QSFP-Ports für alle Facility-Geräte; (c) verwaltete Switch-Funktionalität (VLAN-Unterstützung, Traffic-Monitoring, Port-Mirroring für Diagnosen); (d) redundante Netzteile. Wählen Sie einen Managed-Switch der Enterprise-Klasse, der eine nicht blockierende Switching-Matrix, ausreichend Hochgeschwindigkeitsports, Traffic-Management-Funktionen und redundante Stromversorgung bietet.
4. Segmentieren Sie das Netzwerk mithilfe von VLANs, um folgende Bereiche zu trennen: (a) das Datenaufnahme-VLAN (Mikroskop- und Kamera-Controller, Speicher-Server); (b) das Compute-VLAN (GPU-Workstations und Cluster-Knoten); (c) das Management-VLAN (Fernzugriff, Monitoring, Administration).
   HINWEIS: Die Netzwerksegmentierung reduziert Broadcast-Verkehr, verbessert die Sicherheit und ermöglicht die unabhängige Fehlersuche in jedem Subsystem.
5. Verbinden Sie das Facility-Netzwerk über einen dedizierten Uplink-Port am Kern-Switch mit dem institutionellen WAN. Ein 1–10 Gbps Uplink zum Campus-Netzwerk reicht für Fernzugriff und externe Datentransfers aus.
6. Koordinieren Sie mit der institutionellen IT die Bereitstellung statischer IP-Adressen, DNS-Einträge und geeigneter Firewall-Regeln für alle von der Facility zugänglichen Geräte (Abbildung 1).
7. Installieren und beschriften Sie alle Netzwerkkabelstrecken. Verwenden Sie Direct-Attach-Kabel oder aktive optische Kabel für 10+ Gbps-Verbindungen bis 100 m (geschirmtes Cat6A funktioniert ebenfalls für 10 Gbps bis 100 m); verwenden Sie vorkonfektionierte Glasfaserkabel (LC-LC oder MTP) für 25+ Gbps-Verbindungen zwischen Racks.
8. Dokumentieren Sie das vollständige Verkabelungskonzept mit einem Netzwerkdiagramm, das Gerätenamen, IP-Adressen, Portzuweisungen und VLAN-Zugehörigkeit angibt.
   HINWEIS: Siehe Abbildung 2 für ein Schema der empfohlenen minimalen Netzwerktopologie für eine kleine Kryo-EM-Facility.

4. Entwurf und Bereitstellung des Spezerservers

1. Berechnen Sie die Speicheranforderungen, bevor Sie Hardware beschaffen. Als Grundlage: Eine einzelne Hochleistungs-Cryo-EM-Session erzeugt 2–5 TB Rohdaten pro Tag.
2. Schätzen Sie die langfristigen Speicheranforderungen auf der Grundlage der erwarteten Nutzung der Einrichtung ab. Eine Einrichtung mit 20 Nutzern und zwei Mikroskopen kann innerhalb von 3–6 Monaten Betrieb etwa 2 PB Daten erzeugen. Planen Sie sowohl die Speicherung von Rohdaten (kurzfristig, hoher Durchsatz) als auch die von verarbeiteten Daten (mittelfristig, größeres Volumen), da verarbeitete Datensätze häufig 10–20-mal größer sind als die ursprünglichen Rohdaten.
3. Wählen Sie eine robuste Speicherarchitektur. Standalone-Server auf Basis von ZFS sind für die meisten Einrichtungen der empfohlene Ausgangspunkt, da sie ein günstiges Preis-Kapazitäts-Verhältnis bieten, integrierte Datenintegritätsprüfung (Prüfsummen), flexible RAID-äquivalente Konfigurationen (RAIDZ, RAIDZ2) und Unterstützung für Snapshots. Geklammerte verteilte Dateisysteme (Gluster, Ceph, GPFS/IBM Spectrum Scale) können eine höhere Leistung und Skalierbarkeit bieten, erfordern jedoch mehrere physische Server und eine komplexere Administration.
4. Konfigurieren Sie ZFS-Speicherpools. Empfohlene Startkonfiguration: zwei RAIDZ2-vdevs (jeweils bestehend aus 6–8 SAS-Festplatten mit hoher Kapazität, 16–20 TB je Festplatte), die etwa 60–70 % nutzbare Kapazität bieten und Schutz vor zwei gleichzeitigen Festplattenausfällen gewährleisten.
5. Fügen Sie einen dedizierten SSD-Schreibcache (L2ARC) hinzu, bestehend aus 2–4 NVMe-SSDs, um die Leistung bei zufälligen Lesezugriffen für aktive Verarbeitungsaufgaben zu beschleunigen.
   HINWEIS: Verwenden Sie keine SATA-Laufwerke für den Verbrauchermarkt in produktiven Speicheranlagen. Für die anhaltenden zufälligen Ein-/Ausgabe-Muster von Cryo-EM-Workflows sind Enterprise-SAS- oder NL-SAS-Laufwerke mit angegebener Arbeitslastkapazität (z. B. 550 TB/Jahr) unerlässlich.
6. Richten Sie NFS-Exports (für Linux-Clients) und SMB-Freigaben (für Windows-Clients) auf dem ZFS-Speicherserver ein. Hängen Sie die primäre Datenspeicherfreigabe an allen GPU-Rechenknoten und am Kamerasteuerungsarbeitsplatz ein, um direkten Datenzugriff ohne Zwischenspeicherung zu ermöglichen.
7. Legen Sie eine Richtlinie für Datenspeicherung und Lebenszyklus fest. Definieren Sie: (a) Speicherdauer für Rohfilme (typischerweise 3–6 Monate nach Erfassung); (b) Speicherdauer für bewegungskorrigierte Mikrografien; (c) Speicherdauer für endgültige verarbeitete Datensätze (unbefristet bis zur Veröffentlichung); (d) Archivierungsverfahren für abgeschlossene Projekte.
8. Richten Sie automatisierte Warnmeldungen ein, wenn die Speichernutzung 70 % der Kapazität überschreitet, um rechtzeitig zusätzlichen Speicher beschaffen zu können.
   HINWEIS: Der Speicher ist die am häufigsten unterschätzte Kostenposition bei der Planung einer Cryo-EM-Einrichtung. Verwechseln Sie nicht die Genehmigung zum Erwerb des Mikroskops mit ausreichender Finanzierung für den Speicher. Die Beschaffung von Speicher muss parallel zur Installation des Instruments erfolgen, nicht erst nach Beginn der Datenerfassung.

5. GPU-Recheninfrastruktur

1. Bestimmen Sie die Rechenanforderungen basierend auf dem erwarteten Durchsatz. Für ein einzelnes Mikroskop, das 3.000–5.000 Mikroaufnahmen pro 24-Stunden-Session erzeugt, sind mindestens zwei Rechenknoten erforderlich, von denen jeder mit 4x NVIDIA-Grafikkarten (Maxwell oder neuer, 11+ GB VRAM, z. B. RTX 3090, RTX 4090 oder A100) ausgestattet ist, um die Vorverarbeitung während der Datenaufnahme in Echtzeit aufrechterhalten zu können.
2. Für größere Einrichtungen oder Cryo-ET-Arbeitsabläufe mit hohem Tilt-Serie-Volumen zusätzliche Knoten bereitstellen.
3. Legen Sie die Hardware der GPU-Rechenknoten fest. Jeder Knoten sollte Folgendes enthalten: (a) 4x NVIDIA-GPUs mit CUDA-Unterstützung (mindestens 24 GB VRAM pro GPU für CryoSPARC- und RELION-3D-Verfeinerungen); (b) eine CPU mit hoher Kernanzahl (AMD EPYC oder Intel Xeon, ≥32 Kerne), um parallele, CPU-intensive Schritte (CTF-Schätzung, Datei-Ein-/Ausgabe) zu unterstützen; (c) ≥256 GB System-Arbeitsspeicher; (d) 2–4 TB NVMe-SSD-lokalen Zwischenspeicher für aktive Job-Zwischenergebnisse; (e) eine 10/25-Gbps-Netzwerkkarten-Schnittstelle (NIC); (f) ausreichend lokalen Speicher für Arbeitsdatensätze (typischerweise ein RAID-Volume). HINWEIS: GPUs für den Consumer-Markt (RTX 4090) können bei deutlich geringeren Kosten eine vergleichbare Leistung wie Enterprise-GPUs (A100) für Cryo-EM-Arbeitslasten bieten. Bewerten Sie spezifische Benchmarks für CryoSPARC und RELION, da deren Speicherzugriffsmuster GPUs mit hohem Speicherbandbreite bevorzugen.
4. Installieren Sie den NVIDIA-Treiber-Stack, das CUDA-Toolkit (in einer mit CryoSPARC und RELION kompatiblen Version) und cuDNN auf jedem Rechenknoten. Verwenden Sie ein Konfigurationsverwaltungswerkzeug, um die Softwareumgebungen auf allen Knoten zu standardisieren und zukünftige Aktualisierungen zu vereinfachen.
5. Stellen Sie CryoSPARC in einer Standalone- oder Cluster-Konfiguration bereit. Für eine Mehrknoten-Einrichtung installieren Sie CryoSPARC-Master auf einem dedizierten Head-Knoten und CryoSPARC-Worker auf jedem GPU-Rechenknoten.
6. Konfigurieren Sie die Jobplanung, sodass mehrere Benutzer gleichzeitig verarbeitende Aufträge einreichen können. Befolgen Sie die offizielle CryoSPARC-Architekturdokumentation bezüglich der Mindestsystemanforderungen und der Netzwerkkonfiguration.
7. Installieren Sie RELION neben der primären Verarbeitungsplattform, um den Benutzern beide Verarbeitungsumgebungen zur Verfügung zu stellen. Konfigurieren Sie die Software so, dass sie die lokalen Rechenknoten über einen Scheduler (SLURM oder PBS/Torque) nutzt.
8. Installieren Sie Zusatztools: MotionCor2 (Bewegungskorrektur), CTFFIND4 und Gctf (CTF-Schätzung), TOPAZ (partikelbasierte Auswahl mittels maschinellem Lernen), crYOLO (Neuronal-Netzwerk-basierte Partikelauswahl) und cryoDRGN (Heterogenitätsanalyse). Siehe Tabelle 3 für einen Überblick über die verfügbaren Softwarepakete für SPA, Cryo-ET, STA und MicroED. 
9. Verwenden Sie die SBGrid-Konsortium-Bereitstellung oder containerbasiertes Software-Management (Singularity/Apptainer für HPC-Umgebungen; Docker für Workstations), um reproduzierbare, versionskontrollierte Softwareumgebungen zu gewährleisten.
   HINWEIS: SBGrid stellt vorkompilierte, validierte Versionen aller gängigen Cryo-EM-Softwaretools bereit, einschließlich automatisiertem Update-Management für akademische Einrichtungen.

6. Infrastruktur für den Fernzugriff

1. Richten Sie den VPN-basierten Remote-Zugriff als primären sicheren Zugangspunkt für alle externen Benutzer und Mitarbeiter ein. Arbeiten Sie mit der institutionellen IT zusammen, um ein standortspezifisches VPN-Profil oder einen Tunnel bereitzustellen, der Zugriff auf das Rechen- und Speichernetzwerk der Einrichtung ermöglicht, ohne die Geräte dem öffentlichen Internet auszusetzen.
2. Führen Sie eine zweistufige Authentifizierung (2FA) an allen Remote-Zugangspunkten ein (Abbildung 2).
3. Setzen Sie Remote-Desktop-Software für den grafischen Zugriff auf Mikroskopsteuerungen und GPU-Arbeitsstationen ein. Empfohlene Optionen: (a) TeamViewer (kommerziell, plattformübergreifend, NAT-Überwindung – geeignet für den Zugriff auf Mikroskopsteuerungen); (b) NoMachine (kommerziell, plattformübergreifend, unterstützt OpenGL-3D-Grafik-Weiterleitung – empfohlen für GPU-Arbeitsstationen mit Visualisierungstools); (c) TurboVNC mit VirtualGL (Open-Source, nur Linux, unterstützt Remote-3D-Rendering).
   HINWEIS: Viele Cryo-EM-Visualisierungstools nutzen OpenGL für die 3D-Darstellung. Die Standard-X11-Weiterleitung unterstützt keine hardwarebeschleunigte OpenGL-Nutzung. Verwenden Sie NoMachine oder VirtualGL/TurboVNC für diese Anwendungen.
4. Konfigurieren Sie den Remote-Zugriff auf die Software zur Datenaufnahme am Mikroskop. Nutzen Sie Leginon oder SerialEM für den Fernbetrieb über das institutionelle VPN. Auf die Datenaufnahmesoftware des Mikroskops kann über eine zugelassene Remote-Desktop-Anwendung zugegriffen werden.
5. Testen Sie die Remote-Verbindungen von repräsentativen externen Standorten (Heimnetzwerke, kooperierende Institutionen) aus, bevor der reguläre Benutzerbetrieb aufgenommen wird (Tabelle 4).
6. Richten Sie ein webbasiertes Überwachungsdashboard für die Einrichtung ein, das es Mitarbeitern und Benutzern ermöglicht, den Status der Datensammlung, Vorverarbeitungsergebnisse, Speicherauslastung und Warteschlangenstatus der Rechenressourcen aus der Ferne zu überwachen. Leginon bietet eine integrierte Web-Überwachungsschnittstelle.
7. Konfigurieren Sie für den CryoSPARC-Arbeitsablauf Grafana oder ein benutzerdefiniertes Web-Dashboard, das mit Daten aus Pipeline-Protokollen sowie Systemüberwachungstools (Prometheus, node_exporter) versorgt wird.
8. Legen Sie einen Mechanismus zur Datenübergabe für externe Benutzer fest. Richten Sie auf dem Speicher der Einrichtung einen authentifizierten Datentransferdienst wie Globus Connect Server ein.
9. Für Benutzer ohne Globus-Zugang bereiten Sie Verfahren zur Versendung von USB-Festplatten mit dokumentierten Prüfsummen vor. Eine Internetanbindung mit 10 Gbps Uploadgeschwindigkeit ist notwendig, um externen Benutzern den praktikablen direkten Download von mehreren Terabyte großen Datensätzen zu ermöglichen.

7. Workflow zur Datenverarbeitung in Echtzeit: Implementierung

1. Konfigurieren Sie den Datenflusspfad vor jeder Datensammlungssitzung. Stellen Sie sicher, dass: (a) der Kameracontroller Rohaufnahmen direkt auf den NFS-gemounteten Hochleistungsspeicher der Einrichtung schreibt; (b) das NFS-Share auf allen GPU-Rechennodes gemountet und zugänglich ist; (c) ausreichend freier Speicherplatz für die geplante Sitzung vorhanden ist (mindestens 5 TB frei für eine 24-Stunden-SPA-Sitzung); (d) die GPU-Rechennodes verfügbar sind und keine langlaufenden Jobs um Ressourcen konkurrieren.
2. Richten Sie eine Gain-Referenzkorrektur ein. Erstellen Sie vor jeder Sitzung ein Gain-Referenzbild gemäß den Angaben des Detektorherstellers (typischerweise eine Belichtung mit leerem Strahl auf einem leeren Gitterbereich).
3. Platzieren Sie die Gain-Referenzdatei im vorgesehenen Verzeichnis für die Vorverarbeitung. Alle Bewegungskorrektur-Software (MotionCor2, die eigene Implementierung in RELION) wendet diese Referenz automatisch an, wenn sie korrekt konfiguriert ist.
4. Starten Sie die Echtzeit-Vorverarbeitungspipeline mit CryoSPARC-Live (bevorzugt für die Echtzeitvisualisierung). Die Pipeline sollte gestartet werden, sobald die ersten Filme im Ausgabeverzeichnis erscheinen – typischerweise innerhalb der ersten 5–10 Minuten der automatischen Datensammlung.
   HINWEIS: CryoSPARC-Live überwacht kontinuierlich ein vorgegebenes Verzeichnis auf neue Filmdateien und verarbeitet diese, sobald sie eintreffen. Der entscheidende Unterschied besteht darin, dass CryoSPARC-Live eine interaktive Web-Schnittstelle in Echtzeit zur Überwachung bereitstellt.
5. CryoSPARC-Live-Arbeitsablauf
   1. Navigieren Sie in der Weboberfläche zu einem neuen oder bestehenden Projekt und erstellen Sie eine neue Live-Sitzung^11,36.
   2. Konfigurieren Sie die Eingabequelle: geben Sie den Verzeichnispfad an, auf den der Kameracontroller schreibt (der „Beobachtungsordner“), das Dateimuster, das den Rohfilmen entspricht (z. B. *.tif, *.mrc oder *.eer für EER-Format Falcon 4i-Daten), sowie den Pfad zur Gain-Referenzdatei.
   3. Legen Sie die Parameter für die Bewegungskorrektur fest: Anzahl der zu verwendenden Einzelbilder, bewegungsbasierte Korrektur pro Bildbereich (empfohlen: 5×5-Bereiche), Ausgabebinning-Faktor (typischerweise 1 für Datensammlung nahe der Nyquist-Frequenz; 2 für die erste Sichtung) und Elektronendosis pro Einzelbild (berechnet aus Gesamtdosis und Anzahl der Einzelbilder).
   4. Legen Sie die Parameter für die CTF-Schätzung fest: minimale und maximale Auflösung für die Anpassung (typischerweise 30 Å und 4 Å), Suchbereich für Defokus (0,5–5 µm empfohlen für SPA) und maximale akzeptable Astigmatismus. Aktivieren Sie die CTF-Schätzung pro Kippserie für Kryo-ET-Datensätze.
   5. Konfigurieren Sie die Partikelauswahl: wählen Sie die Auswahlmethode (Blob-Auswahl für Anfangssitzungen; Template-Auswahl, sobald die ersten guten 2D-Klassen verfügbar sind; TOPAZ-Auswahl für schwierige Proben). Legen Sie den erwarteten Partikeldurchmesser sowie minimale und maximale Partikelabstände fest.
   6. Um den Speicherbedarf, die Datenübertragungsbelastung und die Rechenkosten erheblich zu reduzieren, wird empfohlen, während der Partikel-Extraktion eine Fourier-Verkleinerung um den Faktor 4 durchzuführen (was einer vierfachen physikalischen Pixelgröße entspricht). Für die routinemäßige Beurteilung der Datenqualität sind mittlere Auflösungen von 3–5 Å während der Echtzeitverarbeitung typischerweise ausreichend.
   7. Aktivieren Sie die 2D-Klassifizierung innerhalb der Live-Sitzung. Legen Sie die Anzahl der 2D-Klassen (typischerweise 50–200), die Stapelgröße für inkrementelle Aktualisierungen (200–500 Partikel) und die Auflösungsgrenze für die Klassifizierung (6–8 Å für die erste Beurteilung) fest.
   8. Starten Sie die Live-Sitzung. Überwachen Sie das Echtzeit-Dashboard hinsichtlich: Anzahl und Rate eingehender Filme, Qualität der Bewegungskorrektur (gesamte Bewegung pro Film – verwerfen Sie Filme mit einer Gesamtbewegung von >30 Å als Daumenregel), Qualität der CTF-Anpassung (verwerfen Sie Mikrographien mit einer CTF-Anpassungsauflösung >6–8 Å), Partikelausbeute pro Mikrographie und sich entwickelnder Qualität der 2D-Klassenmittel.
   9. Legen Sie Annahmeschwellen für die automatisierte Sichtung fest. Definieren Sie im Filterbereich Kriterien für die Ablehnung von Bewegungsartefakten (Grenzwert für Gesamtbewegung), CTF-Qualität (Grenzwert für Anpassungsauflösung) und Defokusbereich (ausschließen von stark unter- oder überfokussierten Mikrographien). Kuratierte Partikel werden automatisch an den nachfolgenden 2D-Klassifizierungsjob weitergeleitet.

8. Echtzeit-Qualitätskontrolle und Feedback während der Datenerfassung

1. Überwachen Sie die CTF-Statistiken kontinuierlich während der gesamten Sitzung. Zeichnen Sie die Defokussierwerte für jedes Mikrograf: Die Verteilung sollte innerhalb des vorgesehenen Defokussierbereichs liegen (typischerweise −0,5 bis −3,0 µm für SPA).
2. Ein systematischer Drift zu höheren Defokussierwerten kann auf einen Probentischdrift oder eine falsche Einstellung der euzentrischen Höhe hindeuten. Benachrichtigen Sie das Facility-Personal unverzüglich, wenn die CTF-Anpassungsauflösung unter 6 Å fällt, da dies typischerweise auf Eiskontamination, Strahlinstabilität oder einen Fokusdrift hinweist, der eingegriffen erfordert.
3. Überwachen Sie die Ergebnisse der Bewegungskorrektur. Die gesamte Bewegung innerhalb der Einzelbilder pro Film sollte bei hochwertigen Daten unter 10–30 Å liegen. Hohe Bewegung in den frühen Einzelbildern ist erwartet und wird korrigiert; jedoch kann anhaltend hohe Bewegung über den gesamten Film (>40 Å insgesamt) auf eine Instabilität des mechanischen Tisches oder auf Ladungseffekte der Probe hindeuten und sollte untersucht werden.
4. Prüfen Sie die 2D-Klassendurchschnitte, während sie während der Sitzung aktualisiert werden (alle 30–60 Minuten). Hinweise auf einen Datensatz hoher Qualität: Klassendurchschnitte, die sekundäre Strukturmerkmale zeigen, mehrere unterschiedliche Ansichten des Partikels aufweisen und keine Artefakte durch Stapeln oder Aggregation aufweisen.
5. Beobachten Sie Hinweise, die ein Eingreifen erfordern: Alle Partikel sortieren sich in strukturlose „Müll“-Klassen ein (was auf eine schlechte Probe oder Eisqualität hindeutet), bestimmte Ansichten fehlen vollständig (was auf bevorzugte Orientierung hindeutet – möglicherweise ist eine Optimierung des Gitters erforderlich) oder extrem geringe Partikelausbeute pro Mikrograf.
6. Dokumentieren Sie alle Beobachtungen in einem strukturierten Sitzungsprotokoll. Erfassen Sie: Start- und Endzeiten der Sitzung, Einstellungen von Mikroskop und Kamera, eine Zusammenfassung der Echtzeit-Statistiken (Gesamtanzahl der aufgenommenen Filme, Anteil, der den CTF-Filter passiert, Anteil, der den Bewegungsfilter passiert, Gesamtanzahl der ausgewählten Partikel, Bewertung der 2D-Klassen), sowie alle vorgenommenen Eingriffe. Dieses Protokoll ist unerlässlich für die retrospektive Qualitätsbewertung und die Berichterstattung zur Leistung der Facility.
7. Erstellen Sie am Ende der Sitzung einen zusammenfassenden Bericht zur Datenqualität. Die Echtzeit-Verarbeitungsplattform exportiert automatisch eine Sitzungszusammenfassung.
   HINWEIS: Eine weitere Möglichkeit zur Erstellung von Zusammenfassungen und Berichten besteht in der Nutzung von KI-Tools wie Vitreum. In der UCSC Biomolecular Cryo-EM Facility wird die Vitreum-Plattform zur Verwaltung von Laborabläufen und experimentellen Dokumentationen eingesetzt. Vitreum erfasst experimentelle Schritte, während sie durchgeführt werden, erzwingt protokollbasierte Einschränkungen, überprüft die Durchführung der Arbeitsabläufe anhand vordefinierter Qualitätskriterien und liefert eine nachvollziehbare Aufzeichnung der Laboraktivitäten. Durch die Integration der Laborabläufe mit der rechnerischen und datenverwaltungstechnischen Infrastruktur der Facility minimiert die Plattform manuelle Dokumentation, verbessert die Reproduzierbarkeit, erleichtert die Kommunikation zwischen Facility-Personal und Nutzern und ermöglicht eine konsistente Verfolgung von Experimenten von der Probenvorbereitung über die Datenaufnahme bis hin zur nachgelagerten rechnergestützten Analyse.

9. Datenverarbeitungspipeline nach der Probensammlung

1. Nach Abschluss der On-the-Fly-Verarbeitung wird der kuratierte, binierte Partikel-Stack zusammen mit den kuratierten, vorverarbeiteten Filmen exportiert.
2. Trennen Sie das CryoSPARC-Projekt vom Hauptarbeitsplatz und hängen Sie es anschließend an einen anderen, gemeinsam genutzten und remote zugänglichen Arbeitsplatz an. Dadurch wird eine schnelle Abladung und Umschaltung ermöglicht, um die nächste Datenaufnahme zu starten.
   HINWEIS: Eine typische Datensammlung kann zwischen 1–2 Tagen variieren und lässt sich problemlos mit CryoSPARC-Live überwachen. Die 3D-Verarbeitungsschritte können jedoch Wochen oder Monate in Anspruch nehmen, was die Übertragung des Projekts zwischen Arbeitsplätzen und Speicherservern rechtfertigt.
3. Exportieren Sie im CryoSPARC die kuratierten, binierten Partikel aus der Live-Sitzung in ein Standardprojekt zur Offline-3D-Verarbeitung³⁶. 
4. Führen Sie eine ab-initio-3D-Rekonstruktion durch. Verwenden Sie in CryoSPARC den Ab-Initio-Rekonstruktionsjob (3–5 Anfangsmodelle empfohlen bei heterogenen Proben). Erzeugen Sie 1–4 Anfangsmodelle, um die strukturelle Heterogenität zu bewerten.
5. Wenn die rekonstruierten Werte zufriedenstellend sind, extrahieren Sie die nicht-binierten Partikel erneut, um die Gesamtauflösung zu verbessern.
6. Führen Sie die 3D-Verfeinerung durch, gegebenenfalls unter Verwendung der heterogenen Verfeinerung (falls mehrere Konformationen oder Klassen vermutet werden), gefolgt von der homogenen Verfeinerung für die beste Klasse. Verwenden Sie in CryoSPARC die heterogene Verfeinerung, gefolgt von der nicht-uniformen Verfeinerung. 
7. Wenden Sie die Bayessche Polierung in RELION¹³ an, oder nutzen Sie die bewegungskorrigierte Einzelpartikel-CTF-Verfeinerung (CryoSPARC: CTF-Verfeinerungsjob), um das Signal pro Partikel zu verbessern, indem strahlungsinduzierte Bewegung und partikelspezifische Defokussierung berücksichtigt werden – je nach Präferenz des Benutzers. Dieser Schritt verbessert die endgültige Kartenauflösung regelmäßig um 0,2–0,5 Å. Zusätzlich kann die referenzbasierte Bewegungskorrektur (RBMC) in CryoSPARC eine Option zur Verbesserung der Auflösung und Kartenqualität darstellen.
8. Validieren Sie die endgültige Karte mithilfe des Gold-Standard-Fourier-Shell-Korrelationsverfahrens (FSC). Teilen Sie den Partikel-Stack in zwei unabhängige Halbsätze auf, verfeinern Sie diese separat und berechnen Sie die FSC zwischen den beiden Halbkarten. Geben Sie die endgültige Auflösung bei FSC = 0,143 an.
9. Berechnen Sie die Karten-zu-Modell-FSC (FSC-Q) und Q-Scores nach dem Anpassen des atomaren Modells als unabhängige Validierungsmetriken³⁷.
10. Führen Sie den Aufbau und die Validierung des atomaren Modells durch. Verwenden Sie ModelAngelo für den automatisierten, de-novo-Modellaufbau basierend auf der Dichtekarte²⁰. Verfeinern Sie das Modell mittels PHENIX-Realraum-Verfeinerung und validieren Sie es mit MolProbity.
11. Verwenden Sie COOT³⁵, nachdem das Anfangsmodell erstellt wurde, um die Dichtekarte zu visualisieren, atomare Koordinaten anzupassen oder zu korrigieren, Modellierungsfehler zu beheben, fehlende Bereiche aufzubauen und Protein-, Nukleinsäure- oder Ligandstrukturen zu optimieren. Dies ermöglicht die interaktive Bearbeitung von Resten, Seitenkettenkonformationen, Sekundärstrukturen und Sequenzzuweisungen, gefolgt von einer Realraum-Verfeinerung zur Verbesserung der Übereinstimmung zwischen atomarem Modell und experimenteller Dichte.
12. Deposieren Sie abschließend das endgültige atomare Modell in der Protein Data Bank (PDB), die Dichtekarte in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) sowie die Roh- oder Vorverarbeitungsdaten im Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR).

Ergebnisse

A successfully implemented facility IT infrastructure and on-the-fly data processing pipeline will produce the following verifiable outcomes at each stage:

Network and storage
Internal data transfer between the camera controller and storage server should sustain ≥800 MB/s (approaching theoretical 10 Gbps throughput) when measured with tools such as iperf3 or fio. This throughput is sufficient to transfer a 10–12 GB movie stack from the detector in under 15 seconds, ensuring that storage writing does not create a bottleneck during high-speed EER data collection. ZFS storage pool utilization and per-pool IOPS should be monitored daily; healthy pools show no degraded or faulted VDEVs and consistent read speeds of ≥500 MB/s for sequential reads.

On-the-fly preprocessing
The on-the-fly workflow should process each new movie—including motion correction, CTF estimation, and particle picking—within seconds of it being written to disk, thereby keeping pace with modern detector frame rates, such as the TFS Falcon 4i, operating at 5–15 movies per minute (considering 10–100 Gbps network connections and switches). For a 24 h SPA session generating ~8,000–12,000 micrographs at 150,000x magnification with the selected detector, the pipeline should deliver approximately 200,000–800,000 picked particles, a median CTF fit resolution of 3.0–5 Å, and an initial set of 2D class averages showing clear secondary structural features (alpha-helices, beta-strands) by 4–6 h into the session.

2D and 3D processing benchmarks
With 4x NVIDIA RTX 4090 GPUs per compute node and a dataset of 500,000 particles, CryoSPARC 2D classification (200 classes, 25 iterations) should complete in approximately 30–60 min. Ab initio 3D reconstruction from 100,000 particles should complete in 15–30 min. Full 3D refinement of a 300 kDa complex to near-atomic resolution typically requires 2–8 h, depending on particle count and target resolution. These benchmarks serve as a baseline for detecting performance regressions caused by hardware failures or resource contention.

Facility performance metrics
A well-functioning facility should track the following key performance indicators (KPIs) monthly: (a) instrument uptime percentage (target: >90%); (b) fraction of sessions with on-the-fly pipeline active from session start (target: 100%); (c) storage utilization and growth rate; (d) number of active users and projects; (e) number of structures deposited to EMDB/PDB; (f) fraction of sessions producing publishable-quality 2D classes. These metrics provide objective evidence of operational success and support facility reporting to funding agencies.

Figure 1: Overview of the cryo-EM facility data flow architecture. Schematic illustration of the complete data path from electron detector to final deposited structure. Raw movie frames are written from the camera controller to high-performance NFS storage via the 10 Gbps facility network switch. GPU compute nodes mount the same storage share and begin on-the-fly preprocessing (motion correction → CTF estimation → particle picking → 2D classification) concurrently with data collection. Preprocessed outputs and final 3D reconstructions are stored on the same or secondary storage pool. Remote users access compute resources and storage through an institutional VPN and approved remote desktop software. External data delivery is performed through an authenticated transfer service or by shipping physical storage media. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2: Minimal network topology for a small cryo-EM facility. All data acquisition and processing devices—camera controller, microscope controller, storage servers (>1 PB capacity), and GPU compute servers (N nodes)—are connected via a central 10 Gbps (or faster) managed network switch. The switch uplinks to the institutional internet/WAN for remote access. Remote data processing and remote monitoring are accessible over the public internet via VPN. Storage capacity shown is representative for a single-microscope, 20-user facility operating for 3–6 months. Please click here to view a larger version of this figure.

Manufacturer	Model	kVmax	Electron Source	Compatible DEDs	Primary Applications	Strengths	Limitations/Notes
Thermo Fisher Scientific	Krios G4/Krios 5	300 kV	XFEG/CFEG	Falcon 4i, Falcon 3EC, Gatan K3/K2	SPA, cryo-ET/STA, MicroED	Gold-standard platform, full automation (EPU), highest throughput, best for high-res (<2.5 Å)	Highest cost, infrastructure demanding
	Glacios 2	200 kV	XFEG	Falcon 4i, Falcon 4, Gatan K3	SPA, cryo-ET, MicroED	Strong performance at lower cost, compact footprint, high accessibility	Lower ultimate resolution vs 300 kV
	Talos Arctica	200 kV	XFEG	Falcon 3, Falcon 4, Gatan K2/K3	SPA, cryo-ET	Proven, robust, widely adopted	Older generation, less automation
	Talos L120C	120 kV	LaB6	Ceta CMOS (limited DED)	Screening, MicroED (limited)	Cost-effective, training/screening	Not suitable for high-resolution SPA
JEOL	CRYO ARM 300 II (JEM-Z300FSC)	300 kV	CFEG	Gatan K3/K2, Direct Electron DE64	SPA, cryo-ET/STA, MicroED	Cold FEG (high coherence), top-tier resolution, strong optics	Less integrated ecosystem
	CRYO ARM 200	200 kV	CFEG	Gatan K3/K2, DE64	SPA, cryo-ET	Excellent performance-cost ratio, high stability	Fewer turnkey automation tools
	JEM-3200FSC	300 kV	FEG	Gatan K2/K3, DE20	SPA, cryo-ET	Large installed base, proven	Legacy system, aging support
Hitachi High-Tech	HF8300	300 kV	FEG	Gatan K3/K2, DE64 (custom integration)	SPA, cryo-ET	High-voltage capability, flexible integration	Limited adoption in structural biology
	HT7800	120 kV	LaB6	CMOS, limited DED	Screening, MicroED	Reliable screening scope	Not suitable for high-resolution cryoEM
	SU9000 (TEM/STEM)	200 kV	CFEG	Limited cryo-compatible DEDs	Niche cryo, materials	Advanced optics	Not widely used for SPA/ET

Table 1: Comparison of current cryo-TEM platforms and recommended DEDs. Summary of commercially available cryo-TEMs organized by manufacturer (ThermoFisher Scientific, JEOL, Hitachi), including model name, maximum accelerating voltage (kV_max), compatible DEDs for cryogenic operation, and primary imaging applications (SPA, STA/cryo-ET, microED). Intended as a planning reference; consult manufacturers for current specifications. Abbreviations: DED = direct electron detector; XFEG = extreme field emission gun; CFEG = cold field emission gun; FEG = field emission gun; SPA = single-particle analysis; cryo-ET = cryo-electron tomography; STA = subtomogram averaging; MicroED = micro-electron diffraction; TEM = transmission electron microscope; STEM = scanning transmission electron microscope.

Detector	Vendor	Key Features	Typical Pairing	Best Use Case
Falcon 4i	Thermo Fisher Scientific	EER mode, very high frame rate, high DQE	Krios, Glacios	High-throughput SPA, cryo-ET
Gatan K3	Gatan (AMETEK)	Counting mode, large FOV, super-resolution	JEOL + Thermo	High-resolution SPA (standard)
Gatan K2	Gatan	Previous-gen counting detector	Legacy systems	Established pipelines
DE64	Direct Electron	Large sensor, high throughput	JEOL, selected Thermo	Cryo-ET, large field-of-view
Apollo	Direct Electron	High frame rate, high throughput	Krios, Glacios, JEOLs	SPA and microED

Table 2: Current available DEDs in the market. Summary of commercially available DEDs organized by manufacturer. Abbreviations: EER = Electron Event Register; DQE = detective quantum efficiency; FOV = field of view; SPA = single-particle analysis; cryo-ET = cryo-electron tomography; microED = micro-electron diffraction.

Software	Main Function	Key Features	Reference
RELION	End-to-end SPA processing	Bayesian refinement, classification, CTF refinement	7, 12, 13
cryoSPARC	End-to-end SPA	Fast GPU pipelines, ab initio reconstruction	11
EMAN2	Image processing suite	Reconstruction, heterogeneity analysis (e2gmm)	14
cisTEM	SPA processing	User-friendly GUI, refinement and validation	15
SPHIRE	SPA (SPARX-based)	High-resolution refinement workflows	16
cryoDRGN	Heterogeneity analysis	Deep learning latent space reconstruction	17
Topaz	Particle picking	Deep learning-based picking	18
crYOLO	Particle picking	Real-time neural network picking	16
Warp	Preprocessing	Motion correction, CTF estimation, real-time processing	19
Model Angelo	Model building	Automated model building from maps	20
cryoET + STA
Software	Main Function	Key Features	Reference
IMOD	Tilt-series alignment & reconstruction	Gold standard for tomogram reconstruction	21
Dynamo	STA	Geometry-based particle picking, flexible workflows	22
emClarity	STA refinement	High-resolution STA, template matching	23
RELION (ET module)	STA refinement	Bayesian STA, integration with SPA workflows	24
EMAN2 (SPT)	STA	Subtomogram refinement tools	14
Warp/M	Preprocessing + STA	Real-time tomographic preprocessing	19
AreTomo	Tomogram reconstruction	Fast alignment and reconstruction	25
PEET	STA	Subtomogram averaging (IMOD-based)	26
PyTom	STA	Template matching, classification	27
Tomo3D	Reconstruction	Fast GPU tomogram reconstruction	28
crYOLO (3D)	Particle picking	ML-based picking in tomograms	16
AITom	AI-based analysis	Deep learning for segmentation and classification	29
MicroED
Software	Main Function	Key Features	Reference
DIALS	Diffraction processing	Integration of diffraction data	30
XDS	Data processing	Indexing and integration of diffraction data	31
MOSFLM	Data processing	Crystallography indexing	32
SHELX	Structure solution	Phasing and refinement	33
Phenix	Structure refinement	Automated model building	34
COOT	Model building	Manual model correction	35

Table 3: Examples of commonly used software packages for SPA, cryo-ET, STA, and microED. Summary of commercially and publicly available software packages. Abbreviations: SPA = single-particle analysis; cryo-ET = cryo-electron tomography; STA = subtomogram averaging; MicroED = micro-electron diffraction; CTF = contrast transfer function; GUI = graphical user interface; ML = machine learning.

Category	Software	Type	Primary Function	Key Features / Role in Facility
Operating System	Linux (Ubuntu, CentOS/Rocky)	OS	Core compute environment	HPC standard, GPU support, scripting, cluster deployment
Operating System	Windows	OS	User interface / workstation OS	Compatibility with vendor software, remote desktop access
File System	ZFS	File system	Data storage & integrity	Snapshots, redundancy, data integrity (checksums), scalable storage
Network File Sharing	NFS	Protocol	Linux-based file sharing	High-performance sharing across compute nodes
Network File Sharing	SMB (CIFS)	Protocol	Cross-platform file sharing	Windows–Linux interoperability
Remote Access	Microsoft Remote Desktop (RDP)	Remote access	GUI-based remote control	Native Windows remote access
Remote Access	NoMachine	Remote access	High-performance remote desktop	Fast GPU-enabled visualization, widely used in cryoEM
Remote Access	TeamViewer	Remote access	Remote support/access	Easy setup, cross-platform support
Remote Access	VirtualGL + TurboVNC	Remote visualization	GPU-accelerated remote rendering	Essential for remote cryoSPARC/RELION visualization
GPU Computing	CUDA	Compute framework	GPU acceleration	Required for cryoSPARC, RELION, deep learning tools
Data Transfer	Globus	Data transfer	Secure large-scale transfer	High-speed, fault-tolerant data movement across institutions

Table 4: Software reference for cryo-EM facility IT operations and data processing. Reference list of key software tools covering operating systems (Linux, Windows), file systems (ZFS), network file sharing (NFS, SMB), remote access (Microsoft RDP, NoMachine, TeamViewer, VirtualGL/TurboVNC), GPU computing (CUDA), and data transfer (Globus). Abbreviations: OS = operating system; HPC = high-performance computing; NFS = Network File System; SMB = Server Message Block; CIFS = Common Internet File System; RDP = Remote Desktop Protocol; GUI = graphical user interface.

Diskussion

Die IT-Infrastruktur einer Kryo-EM-Anlage ist kein unterstützender Nachgedanke, sondern eine betriebliche Voraussetzung. Einrichtungen, die mit der Datenerfassung beginnen, ohne über ausreichende Speicher-, Netzwerk- und Rechenkapazitäten zu verfügen, stehen unweigerlich vor der Wahl, Rohdaten zu verwerfen, die Datenerfassung zu stoppen oder monatelange Verzögerungen bei der Strukturaufklärung hinzunehmen. Die hier beschriebenen Protokolle sollen diese Szenarien verhindern, indem sichergestellt wird, dass die rechnerische Infrastruktur bereits vor der ersten Nutzersitzung entworfen, getestet und validiert wurde.

Das wichtigste Prinzip beim IT-Design für die Kryo-EM besteht darin, dass die Speicher- und Netzwerkkapazität an die Datenausgabe des Detektors angepasst werden muss, nicht an die historische Intuition des Anlagendesigners. Im EER-Modus kann der Detektor 8–12 GB pro Filmstack schreiben; bei etwa 15 Filmen pro Minute über eine 24-Stunden-Session ergibt dies ungefähr 2–5 TB Rohdaten, bevor eine Komprimierung erfolgt. Obwohl eine verlustfreie Komprimierung in Echtzeit (verfügbar in CryoSPARC-Live) dies um 50–70 % reduzieren kann, müssen Netzwerk und Speicher in der Lage sein, die Schreibrate der unkomprimierten Daten zu bewältigen, falls die Komprimierung deaktiviert wird oder fehlschlägt. Die Planung muss auf der Spitzenkapazität und nicht auf der Durchschnittskapazität basieren.

Die Echtzeitverarbeitung stellt eine der bedeutendsten Fortschritte im Betrieb von Kryo-EM-Einrichtungen der letzten Jahre dar. Bevor Echtzeit-Pipelines verfügbar waren, hatten die Betreiber der Einrichtungen keine objektive Möglichkeit, die Datenqualität zu beurteilen, bis Stunden oder Tage nach der Datenaufnahme, zu einem Zeitpunkt, an dem die Sitzung bereits beendet war und das Probenraster möglicherweise bereits entsorgt worden war. Mit CryoSPARC-Live können innerhalb von 2–4 Stunden nach Sitzungsbeginn 2D-Klassenmittelwerte verfügbar sein, die erkennbare sekundäre Strukturen zeigen, wodurch fundierte Entscheidungen über die Auswahl der Raster, Anpassungen der Datenaufnahme-Parameter sowie über eine Verlängerung oder Beendigung der Sitzung möglich werden. Diese Rückkopplungsschleife ist vermutlich der direkteste Weg, auf dem die IT-Infrastruktur die wissenschaftlichen Ergebnisse verbessert.

Eine bekannte Einschränkung des On-the-Fly-Workflows ist seine Empfindlichkeit gegenüber Konfigurationsfehlern. Eine falsch angegebene Pixelgröße, ein falscher Gain-Referenzwert oder ein nicht übereinstimmender Wert für die Dosis pro Einzelbild wird sich durch die gesamte Pipeline fortpflanzen und irreführende Qualitätskennzahlen sowie beschädigte Partikel-Stapel erzeugen. Wir empfehlen daher eine standardisierte Checkliste vor der Sitzung, die ausdrücklich alle Konfigurationsparameter der Pipeline überprüft, bevor die Datensammlung beginnt. Diese Checkliste sollte als sicherheitskritische Unterlage behandelt werden, vergleichbar mit den Checklisten vor dem Flugstart im Luftfahrtbereich, wie sie in der umfassenden Fachliteratur zum Management von Kryo-EM-Einrichtungen beschrieben wird.

Die Wahl zwischen CryoSPARC-Live und RELION hängt von den Prioritäten der Einrichtung ab. Die Live-Verarbeitungsplattform bietet eine überlegene Echtzeit-Web-Schnittstelle, eine engere Integration zwischen den Umgebungen für Live- und Offline-Verarbeitung sowie eine einfachere Konfiguration für nicht-experte Nutzer. RELION ermöglicht eine feinere Kontrolle über die Verarbeitungsparameter und ist die bevorzugte Plattform für Nutzer, die spezifische algorithmische Optionen benötigen (z. B. Bayesian polishing, spezifische 3D-Klassifizierungsstrategien), im Vergleich zu den in CryoSPARC verfügbaren 3D-Klassifizierungsstrategien (z. B. 3DVAR oder 3D-Klassifizierung). Viele Einrichtungen setzen beide parallel ein, wobei CryoSPARC-Live für die Echtzeitüberwachung und RELION für die finale Strukturbestimmung verwendet wird.

Der Fernzugriff auf die Infrastruktur verdient besondere Beachtung. Nach unserer Erfahrung resultieren die meisten vom Anwender gemeldeten Probleme während der Datensammlung aus Fehlern beim Fernzugriff und nicht aus Problemen mit dem Mikroskop oder den Detektoren. Zuverlässiger, latenzarmer Fernzugriff auf den Desktop des Mikroskops und der Arbeitsstationen zur Datensammlung ist kein Luxus – er stellt die primäre Interaktionsform der meisten Nutzer mit der Einrichtung dar. Die Investition in professionell konfigurierte Fernzugriffsserver, die Überprüfung der Konnektivität von typischen Nutzerstandorten aus sowie die eindeutige Dokumentation des Verbindungsvorgangs wirken sich stärker auf die Nutzererfahrung positiv aus als viele teurere Hardware-Investitionen.

Abschließend muss vor Beginn des Betriebs eine Richtlinie zur Datenverwaltung erstellt und den Nutzern mitgeteilt werden. Nutzer schätzen die Größe ihrer Datensätze häufig unterschätzen und die Dauer ihrer Speicherplatzzuweisung überschätzen. Eine klare schriftliche Regelung, die die Aufbewahrungsfristen für Rohdaten, Nutzerdatenkontingente, Archivierungsverfahren sowie die Kostenrückerstattung bei Überschreitung des Speicherplatzes festlegt, schützt sowohl die Einrichtung als auch ihre Nutzer und verhindert betriebliche Krisen, die entstehen, wenn der Speicherplatz mitten in einer Sitzung erschöpft ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Krios 5	ThermoFisher Scientific	https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-5-cryo-tem.html	Transmissionselektronenmikroskop
Krios G4	ThermoFisher Scientific	https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html	Transmissionselektronenmikroskop
Glacios	ThermoFisher Scientific	https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/glacios-cryo-tem.html	Transmissionselektronenmikroskop
Glacios 2	ThermoFisher Scientific	https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/glacios-2-cryo-tem.html	Transmissionselektronenmikroskop
Glacios 3	ThermoFisher Scientific	https://www.thermofisher.com/ (neueste Generation; Produktseite kann je nach Region variieren)	Transmissionselektronenmikroskop
Talos Arctica	ThermoFisher Scientific	https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/talos-arctica.html	Transmissionselektronenmikroskop
Talos L120C	ThermoFisher Scientific	https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/talos-l120c.html	Transmissionselektronenmikroskop
CRYO ARM 300 II (JEM-Z300FSC)	JEOL	https://www.jeol.com/products/scientific/tem/cryoarm300ii.php	Transmissionselektronenmikroskop
CRYO ARM 200	JEOL	https://www.jeol.com/products/scientific/tem/cryoarm200.php	Transmissionselektronenmikroskop
JEM-3200FSC	JEOL	https://www.jeol.com/products/scientific/tem/jem3200fsc.php	Transmissionselektronenmikroskop
HF8300	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/tem/hf8300.html	Transmissionselektronenmikroskop
HT7800	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/tem/ht7800.html	Transmissionselektronenmikroskop
SU9000 (TEM/STEM)	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/sem-tem/su9000.html	Transmissionselektronenmikroskop
Falcon 4i	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/direct-electron-detectors/falcon-4i.html	Direkter Elektronendetektor
Gatan K3	Gatan (AMETEK)	https://gatan.com/products/tem-cameras/k3-is-camera	Direkter Elektronendetektor
Gatan K2	Gatan	https://gatan.com/products/tem-cameras/k2-camera	Direkter Elektronendetektor
Apollo	Direct Electron	https://directelectron.com/apollo/	Direkter Elektronendetektor
DE64	Direct Electron	https://directelectron.com/de-64/	Direkter Elektronendetektor
RELION	MRC-Labor für Molekularbiologie (MRC-LMB), Universität Cambridge	https://relion.readthedocs.io	SPA-Softwarepaket
cryoSPARC	Structura Biotechnology	https://cryosparc.com	SPA-Softwarepaket
EMAN2	Baylor College of Medicine (entwickelt vom Steven Ludtke Labor)	https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2	SPA-Softwarepaket
cisTEM	National Research Council Canada (entwickelt von Tim Grant und Kollegen)	https://cistem.org	SPA-Softwarepaket
SPHIRE	Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie und Baylor College of Medicine	https://sphire.mpg.de	SPA-Softwarepaket
cryoDRGN	Princeton University (entwickelt vom Ellen Zhong Labor)	https://cryodrgn.cs.princeton.edu	SPA-Softwarepaket
Topaz	Harvard Medical School (entwickelt vom Travis Bepler Labor)	https://github.com/tbepler/topaz	SPA-Softwarepaket
crYOLO	Max-Planck-Institut für Biophysik	https://cryolo.readthedocs.io	SPA-Softwarepaket
Warp	MRC-Labor für Molekularbiologie (entwickelt von Dmitry Tegunov)	http://www.warpem.com	Softwarepaket für cryo-ET und STA
ModelAngelo	MRC-Labor für Molekularbiologie	https://www.modelangelo.org	Softwarepaket für cryo-ET und STA
IMOD	University of Colorado Boulder	https://bio3d.colorado.edu/imod	Softwarepaket für cryo-ET und STA
Dynamo	Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC)	https://www.dynamo-em.org	Softwarepaket für cryo-ET und STA
emClarity	University of California, San Francisco	https://github.com/StochasticAnalytics/emClarity	Softwarepaket für cryo-ET und STA
RELION (ET-Modul)	MRC-Labor für Molekularbiologie (MRC-LMB), Universität Cambridge	https://relion.readthedocs.io	Softwarepaket für cryo-ET und STA
EMAN2 (SPT)	Baylor College of Medicine	https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2	Softwarepaket für cryo-ET und STA
Warp/M	MRC-Labor für Molekularbiologie	https://warpem.github.io	Softwarepaket für cryo-ET und STA
AreTomo	Stanford University (entwickelt von den Gruppen Fei Sun und Wah Chiu)	https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo2	Softwarepaket für cryo-ET und STA
PEET	University of Colorado Boulder	https://bio3d.colorado.edu/PEET	Softwarepaket für cryo-ET und STA
PyTom	Max-Planck-Institut für Biochemie	https://pytom.org	Softwarepaket für cryo-ET und STA
Tomo3D	Spanisches Nationales Zentrum für Biotechnologie (CNB-CSIC)	https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d	Softwarepaket für cryo-ET und STA
crYOLO (3D)	Max-Planck-Institut für Biophysik	https://cryolo.readthedocs.io	Softwarepaket für cryo-ET und STA
AITom	Carnegie Mellon University	https://github.com/xulabs/aitom	Softwarepaket für cryo-ET und STA
DIALS	Diamond Light Source und Kooperationspartner	https://dials.github.io	Softwarepaket für microED
XDS	Max-Planck-Institut für medizinische Forschung (entwickelt von Wolfgang Kabsch)	https://xds.mr.mpg.de	Softwarepaket für microED
MOSFLM	MRC-Labor für Molekularbiologie (MRC-LMB), Universität Cambridge	https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/mosflm	Softwarepaket für microED
SHELX	Universität Göttingen (entwickelt von George M. Sheldrick)	https://shelx.uni-goettingen.de	Softwarepaket für microED
Phenix	Lawrence Berkeley National Laboratory (PHENIX-Konsortium)	https://phenix-online.org	Softwarepaket für microED
Coot	MRC-Labor für Molekularbiologie (MRC-LMB), Universität Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot	Softwarepaket für microED
Linux (Ubuntu, CentOS/Rocky)	Ubuntu: Canonical Ltd.; CentOS: CentOS-Projekt; Rocky Linux: Rocky Enterprise Software Foundation (RESF)	https://ubuntu.com / https://www.centos.org (veraltet) /  https://rockylinux.org	Betriebssystem
Windows	Microsoft	https://www.microsoft.com/windows	Betriebssystem
ZFS	Oracle Corporation (ursprünglich Sun Microsystems); OpenZFS wird von der OpenZFS-Community betreut	https://openzfs.org	Dateisystem
NFS	Sun Microsystems (heute als IETF-Standard betreut)	https://www.rfc-editor.org/rfc/rfc8881	Protokoll
SMB (CIFS)	Microsoft	https://learn.microsoft.com/windows-server/storage/file-server/file-server-smb-overview	Protokoll
Microsoft Remote Desktop (RDP)	Microsoft	https://learn.microsoft.com/windows-server/remote/remote-desktop-services	Fernzugriff
NoMachine	NoMachine	https://www.nomachine.com	Fernzugriff
TeamViewer	TeamViewer SE	https://www.teamviewer.com	Fernzugriff
VirtualGL + TurboVNC	VirtualGL: Das VirtualGL-Projekt; TurboVNC: Das TurboVNC-Projekt	https://virtualgl.org und https://turbovnc.org	Fernzugriff
CUDA	NVIDIA	https://developer.nvidia.com/cuda-toolkit	Computer-Framework