Ein Split-Luciferase-Komplementationsassay zur zeitlich aufgelösten Messung der Tau-Clearance in Mikroglia

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine sensible, zeitaufgelöste quantitative Plattform zur Messung der Clearance von extrazellulärem Tau in menschlich induzierten, pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten Mikroglia mittels eines mikroplattenbasierten Lumineszenzsystems. Dieser Ansatz ermöglicht eine empfindliche Detektion der Tau-Abbaukinetik im Mikrowell-Format, was eine Hochdurchsatzuntersuchung der Tau-Handhabung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglicht.

Zusammenfassung

Als die ansässigen Immunzellen des zentralen Nervensystems sind Mikroglia zentrale Regulatoren der Gehirnhomöostase und wichtige Vermittler neurodegenerativer Erkrankungen. Diese Zellen untersuchen kontinuierlich die neuronale Umgebung und spielen eine entscheidende Rolle bei der Erkennung, Internalisierung und Abbau extrazellulärer Substrate, einschließlich fehlgefalteter und aggregierter Proteine wie pathologischer Tau. Trotz wachsender Belege, die Mikroglia mit der Tau-Clearance in Verbindung bringen, fehlt bestehenden Ansätzen zur Messung der Tau-Aufnahme und -Degradation die zeitliche Auflösung und Sensitivität, die nötig sind, um diese dynamischen Prozesse vollständig zu erfassen. Hier entwickelten wir einen lumineszenzbasierten Assay, um die Tau-Clearance quantitativ in menschlich induzierten, pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten Mikroglia zu überwachen. Diese Plattform nutzt ein auf Split-Luciferase-basiertes Komplementationssystem, um eine hochsensible, Echtzeit-Erkennung von Tau in lebenden Zellen zu ermöglichen und so eine präzise Nachverfolgung der intrazellulären Verarbeitung zu ermöglichen. Dieser Test ist skalierbar und anpassungsfähig über mehrere Zelltypen hinweg und bietet ein vielseitiges Werkzeug, um endolysosomale Signalwege und zelluläre Mechanismen zu untersuchen, die den Umgang mit Tau bei neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Alzheimer, steuern.

Einleitung

Tauopathien, einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD), zeichnen sich durch die Aggregation und Ausbreitung des mikrotubuliassozoziierten Protein-Tau über neuronale Schaltkreise ^1,2 aus. Glia werden zunehmend als Regulatoren der Tau-Krankheitsdynamik geschätzt, einschließlich Aufnahme, Abbau und Ausbreitung 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Zu verstehen, wie Glia zu Tauopathien beitragen, ist ein dringendes Anliegen, um zentrale Krankheitsdynamiken wie Neuroinflammation und Tau-Ausbreitung zu lösen. Unter den Gliapopulationen sind Mikroglia – die ansässigen Phagozyten des Gehirns – einzigartig positioniert, um die Tau-Entfernung zu vermitteln.

Trotz des dringenden Bedarfs, Mechanismen der Tau-Handhabung in Mikroglia zu erläutern, bleibt das Feld in der Auflösung und dem Durchsatz verfügbarer Tests begrenzt. Zentrale Fragen zur Tau-Internalisierung, zum intrazellulären Handel und zur zellulären Freigabe bleiben ungelöst. Jeder dieser Schritte stellt einen mechanistisch unterschiedlichen Prozess dar: Die Aufnahme bezieht sich auf die Internalisierung von extrazellulärem Tau an der Plasmamembran; Der Handel umfasst die Sortierung und den Transport internalisierter Tau durch endosomale, lysosomale und andere intrazelluläre Kompartimente; und Abbau bezeichnet den proteolytischen Abbau von Tau, hauptsächlich über lysosomale und proteasomale Bahnen. Obwohl diese Schritte für die extrazelluläre Tau-Verarbeitung sequentiell sind, da internalisiertes Tau intrazelluläre Kompartimente durchqueren muss, bevor es die abbauende Maschinerie erreicht, sind sie unabhängig reguliert und eine bestimmte experimentelle Störung kann einen Schritt beeinflussen, ohne andere zu verändern. Zum Beispiel könnte eine Verringerung des intrazellulären Tau-Signals auf eine beeinträchtigte Aufnahme, eine fehlgeleitete Umleitung von degradierenden Kompartimenten oder eine verstärkte Degradierung zurückzuführen. Die Lösung dieser Prozesse erfordert neue Prüfplattformen, die Proteinanwesenheit nachweisen und mit bestehenden Messgrößen kombiniert werden, um das Proteinschicksal im Zeitverlauf zu bestimmen.

Aktuelle Methoden zur Aufklärung der Tau-Internalisierung und -Degradation basieren auf Immunzytochemie, Durchflusszytometrie, Western Blotting und fluoreszierenden Markierungsmethoden zur Quantifizierung der Aufnahme, subzellulären Lokalisierung und intrazellulärer Verarbeitung von Tau-Spezies 13,14,15,16,17,18 . Allerdings weist jeder dieser Ansätze grundlegende Einschränkungen auf, wenn sie auf die Untersuchung der Protein-Clearance-Dynamik angewendet werden. Immunzytochemie und Western Blotting verfügen nicht über die Empfindlichkeit, um Tau-Arten mit geringer Häufigkeit zu erkennen, und sind arbeitsintensiv. Flowzytometrie und fluoreszenzbasierte Tests berichten nicht getreu über die Protein-Clearance, da Fluorophore auch nach der Abbau des konjugierten^{Proteins bestehen} bleiben können und so das fluoreszierende Signal vom tatsächlichen Schicksal des betreffenden Proteins entkoppeln. Zusammen hinterlassen diese Einschränkungen eine kritische Lücke, ohne dass eine bestehende Methode gleichzeitig die Empfindlichkeit, zeitliche Auflösung und Skalierbarkeit bietet, die nötig sind, um die Tau-Clearance-Dynamik quantitativ zu verfolgen. Daher war ein großes Hindernis für den Fortschritt im Verständnis der Tau-Handhabungsdynamik in Mikroglia das Fehlen quantitativer, zeitaufgelöster Hochdurchsatz-Assays zur Messung der Tau-Clearance in lebenden Zellen.

Um dem Fehlen einer quantitativen Plattform zur Überwachung der Live-Tau-Dynamik entgegenzuwirken, entwickelten wir einen sensitiven lumineszenzbasierten Test, der zur Erkennung intrazellulärer Tau-Proteindynamiken verwendet werden kann. Dieser Ansatz verwendet ein split-luciferase-basiertes Komplementationssystem, bei dem ein kleines Peptid-Tag (High Affinity Binary Technology oder HiBiT) mit Tau fusioniert wird, was kinetische Messungen in lebenden Zellen ermöglicht. Bei der Wechselwirkung mit seinem komplementären Bindungspartner (Large Binary Technology oder LgBiT) rekonstituiert das markierte Protein ein aktives Luciferase-Enzym und erzeugt ein quantitatives biolumineszentes Signal 20,21,22. Dieses lumineszente Signal liefert eine direkte, empfindliche Anzeige der Proteinhäufigkeit und ermöglicht so eine dynamische Nachverfolgung von Veränderungen der intrazellulären Niveaus im Zeitverlauf. Daher kann Lumineszenz als robuster Berichterstatter von Proteinpräsenz oder -verlust verwendet werden, wie im Fall der intrazellulären Degradation. Zusammen ermöglicht diese Plattform eine präzise, zeitlich geklärt Messung der Tau-Handhabung und bietet eine breit anwendbare Strategie zur Untersuchung des Proteinumsatzes.

Protokoll

Alle zellulären Experimente wurden in einem geeigneten Biosicherheits-Level-2-Labor durchgeführt, das von den Umwelt- und Gesundheitsdiensten der University of Massachusetts Amherst genehmigt wurde.

1. Expression, Reinigung und Endotoxinentfernung des Tau-SLP-Proteins

1. Fügen Sie das Split-Luciferase-Peptid oder SLP-Tag (VSGWRLFKKIS) an ein Tau-Konstrukt an, um ein getaggtes Konstrukt (Tau-SLP) mit Standardklonmethoden wie Gibson-Assembly²³ zu erstellen.
   HINWEIS: Die Komplementierung des Split-Luciferase-Peptid-Tags erzeugt ein robustes Signal, wenn es entweder am C-Terminal, N-Terminal oder in den internen Domänen von 2N4R Tau²⁴ platziert wird.
2. Druck und Reinigung von Tau-SLP mit den zuvor beschriebenen Methoden^25,26 und Sicherstellung der Reinheit mit SDS-PAGE und Immunoblotting.
3. Für die Verwendung mit Mikroglialzellen folgen Sie veröffentlichten Protokollen zur Entfernung bakterieller Endotoxine nach der Tau-SLP-Reinigung, um die Störreaktivität²⁷ zu begrenzen.
4. Quantifizieren Sie die Tau-SLP-Proteinkonzentration mit einem Standard-Bicinconinsäure-Assay (BCA) oder Bradford-Assay^28,29.
5. Falls gewünscht, aggregieren Sie Tau-SLP gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen²⁴.
6. Validieren Sie die funktionelle Lumineszenz von Tau-SLP, indem Sie eine Standardkurve mit einem kommerziell erhältlichen Luziferase-Substrat und Komplementierungsreagenz erzeugen, entsprechend den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).

2. iPSC-abgeleitete Mikroglia-Kultur (iTF-Mikroglia)

1. Kultivieren Sie Mikroglialzellen in 5 %_CO2 bei 37 °C im geeigneten Kulturmedium.
2. Differenzieren Sie eine induzierte pluripotente Stammzelllinie (iPSC) mit sechs doxycyclininduzierbaren Transkriptionsfaktoren, um eine mikroglialähnliche Zelle (induzierte Transkriptionsfaktor-Mikroglia-ähnlich oder iTF-Mikroglia) mit einem validierten Protokoll³⁰ (siehe Materialtabelle) zu erzeugen.
   HINWEIS: Dieser Test ist nicht auf iTF-Microglia beschränkt und kann mit jeder adhärenten Zelllinie angewendet werden. Optimierung der Clearance-Zeiten kann erforderlich sein, wenn mit anderen Zelllinien gearbeitet wird.

3. Tau-Clearance Assay

1. In eine 24-Well-Platte werden Plattenzellen mit einer Dichte von 1 x 10⁵ Zellen pro Bohrloch, in dreifachem Exemplar pro Bedingung, mit Kulturmedium (250 μL) und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert₍Abbildung 1A).
2. Entfernen Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS (250 μL) und ersetzen Sie sie durch 250 μL Kulturmedium.
3. Um die Tau-SLP-Clearance zeitlich zu messen, werden Zellen Tau-SLP gestaffelt ausgesetzt, sodass alle Bohrlöcher gleichzeitig genutzt werden, wobei sich nur die Clearance-Zeit unterscheidet. Zum Beispiel fügen Sie für 0-, 2-Stunden- und 4-Stunden-Clearance-Gruppen zuerst 100 nM Tau-SLP-haltiges Medium zur 4-H-Gruppe hinzu, dann 1 Stunde später zur 2-H-Gruppe und schließlich 1 H später zur 0-H-Gruppe (siehe Abbildung 1B für Zeitempfehlungen). Nach Abschluss der endgültigen Internalisierungsphase haben alle Bohrlöcher die gleiche Tau-SLP-Expositionsperiode durchlaufen, unterscheiden sich jedoch nur in der Räumdauer (Abbildung 1B).
4. Beziehen Sie Brunnen ein, die keine Tau-SLP-Behandlung für Hintergrundsubtraktion erhalten (Abbildung 1C).
5. Am Ende der Internalisierungsphase entfernen Sie das Tau-SLP-haltige Medium. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um extrazelluläre Tau-SLP zu entfernen, und ersetzen Sie sie durch Tau-SLP-freies Kulturmedium.
6. Inkubieren Sie die Zellen für den festgelegten Freigabezeitraum (Abbildung 1A). Die 0-h-Freigabegruppe, die unmittelbar nach der Internalisierungsphase geerntet wird, repräsentiert die Gesamtmenge an internalisiertem Tau-SLP zu Beginn der Freigabephase.
7. Nach allen Freigabezeiten entfernen Sie das Medium aus den Brunnen und waschen Sie mit 250μL PBS.
8. Behandle jeden Brunnen mit 250 μL Trypsin-EDTA 0,25 % für 5 Minuten bei 37 °C. Dieser Schritt entfernt oberflächengebundenes Tau, um sicherzustellen, dass die Lumineszenz internalisiertes Tau-SLP reflektiert. Neutralisieren Sie jeden Brunnen mit einem 250-μL-Trypsininhibitor (5 mg/mL).
9. Jeden Brunnen in ein entsprechend gekennzeichnetes 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr und Pellet durch Zentrifugation (500 x g, 5 min) aufzunehmen.
10. Bereiten Sie eine angemessene Menge Lysispuffer vor, der das Luziferase-Substrat und die Komplementierungskomponenten enthält (siehe Materialtabelle; 50 μL x # der Bohrlöcher + 10 %).
11. Entfernen Sie jeden Überstandsstoff mit einer Aspirationspipette und lassen Sie das Zellpellet in 50 μL Lysepuffer mit Luciferase-Substrat und Komplementationskomponenten wieder aufhängen. Dies erzeugt einen Split-Luciferase-Komplementationskomplex und erzeugt Lumineszenz (Abbildung 1D).
12. Transferiere lysierte Zellen auf eine weiße Halbvolumenplatte mit 96 Wellen.
13. Messung der Lumineszenz auf einem Mikroplattenmesser mit orbitalem Schütteln für 10 Sekunden bei Raumtemperatur (~23 °C) vor der Messung, um eine vollständige Lyse der Zellpellets sicherzustellen.
14. Bestimmen Sie die normalisierte Tau-SLP-Häufigkeit, indem Sie zunächst den mittleren Lumineszenzwert subtrahieren, der aus Bohrungen erhalten wird, die nicht Tau-SLP ausgesetzt sind. Normalisiere jeden Wert auf das mittlere hintergrundsubtrahierte Signal der 0-h-Freigabegruppe.
15. Plot normalisierte die Tau-SLP-Häufigkeit als Funktion der Clearance-Zeit. Eine fortschreitende Verringerung der Lumineszenz zeigt eine Abnahme der intrazellulären Tau-SLP-Häufigkeit an und wird als Tau-SLP-Clearance interpretiert, während stabile Lumineszenzwerte auf eine beeinträchtigte oder verzögerte Clearance hinweisen. Berechnen Sie den prozentualen Freistand als: % Freigabe = [1 − (RLUt / RLUt = 0)] x 100.

Ergebnisse

Mit diesem empfindlichen, lumineszenzbasierten Test könnte die intrazelluläre Tau-SLP-Häufigkeit über die Zeit überwacht werden, nachdem eine synchronisierte Aufnahmephase in humanen iPSC-abgeleiteten Mikroglia durchgeführt wurde. Nach dem Tau-SLP-Auswasch nahm die Lumineszenz stetig ab, was mit der intrazellulären Tau-SLP-Clearance übereinstimmt. Diese Plattform war empfindlich genug, um Unterschiede im Umgang mit monomeren und fibrillären Tau-SLP-Spezies durch Mikroglia zu erkennen. Das monomere Tau-SLP wurde in iTF-Microglia innerhalb von 60 Minuten vollständig beseitigt, während das fibrilläre Tau-SLP über 240 Minuten anhielt (Abbildung 2A). Zusätzlich haben wir den Test mit mutierten Tau (z. B. N279K) durchgeführt, um die Clearance-Kinetik zu bewerten, und festgestellt, dass TauN279K-SLP signifikant reduzierte Clearance-Kinetik nur bei kurzen Clearance-Zeiten (15 Min) zeigt (Abbildung 2B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der beobachtete Abbau nur aufgrund der hohen Empfindlichkeit dieses Tests sichtbar sein könnte. Wir haben das Tau-SLP-Abbauexperiment mit dem kleinen Molekül L-Leucyl-L-Leucin-Methylester (LLOMe) durchgeführt, um die lysosomale Beteiligung zu bestätigen. LLOMe ist ein Cathepsin-C-Substrat, das lysosomale Membranen permeabilisiert und die lysosomale Aktivität^stört. Bei der LLOMe-Behandlung haben wir signifikant erhöhte Stationäre Tau-SLP-Spiegel bei t=0 beobachtet (Abbildung 3A) und eine signifikant reduzierte Abbaurate (Abbildung 3B) mit einer Vervierfachung des Tau-SLP-Bestands nach einer 60-minütigen Clearing-Zeit. Abschließend haben wir den Tau-SLP-Clearance-Assay in iPSC-abgeleiteten Neuronen durchgeführt, um die Kompatibilität zwischen Zelltypen zu bestätigen. Hier haben wir festgestellt, dass iPSC-abgeleitete Neuronen eine reduzierte Clearance-Kinetik sowohl für monomere (Abbildung 4A) als auch für fibrille Formen (Abbildung 4B) von Tau-SLP aufweisen. Am auffälligsten bleiben die Tau-SLP-Fibrillenwerte über eine 240-minütige Clearance stabil bei ~100 %, während im gleichen Zeitraum die Tau-SLP-Fibrillenwerte bei iTF-Microglia unter 50 % gefallen sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass unsere auf Split-Luciferase-basierende Komplementationsplattform eine robuste und zuverlässige Detektion der intrazellulären endolysosomalen Clearance von Tau-SLP bietet und ein hoch anpassungsfähiges Assay-Design zeigt, das auf zahlreiche andere Proteine oder Zelltypen angewendet werden kann.

Abbildung 1: Repräsentatives experimentelles Design des Tau-SLP-Freigabe-Assays. (A) Repräsentatives Hellfeldbild von iTF-Mikroglia, das für diesen Test verwendet wird (Skalenleiste = 100 μm) (B) Menschliche Mikroglia (iTF-Mikroglia) werden in gestaffelter Weise dem rekombinanten 2N4R-SLP ausgesetzt, was eine robuste, lumineszenzbasierte Detektion ermöglicht. Nach einer einstündigen Inkubation wird das extrazelluläre Tau durch Medienaustausch entfernt und die Zellen mit PBS gewaschen. Die Zellen werden während ihrer jeweiligen Räumungsphase (0 st, 2 st, 4 Stunden) vor der Ernte im Basalmedium aufrechterhalten. Am Endpunkt werden die Zellen lysiert und die Lumineszenz gemessen. (C) Vorgeschlagenes Plattendesign zur Messung der Tau-SLP-Freiheit im Vergleich der monomeren und fibrillären Degradation. (D) Das Tau-SLP-Protein wird in die Zellen internalisiert und zur lysosomalen Zersetzung weitergeleitet. Die Zugabe von LgBiT liefert eine quantitative Ablesung der Menge an Tau-SLP, die durch Komplementation und Erzeugung von Lumineszenz in der Zelle verbleibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: iTF-Microglia klare extrazelluläre Tau-SLP. (A) iTF-Microglia wurden monomeren Tau-SLP (100nM) oder fibrillaren Tau-SLP (50nM) ausgesetzt, Proben wurden auf die jeweilige Anfangsaufnahme (t = 0; 100%) und auf Zellen normalisiert, die nicht Tau-SLP ausgesetzt waren (0 %) (Mittelwert ± SD; n = 9 aus drei unabhängigen Differenzierungen). (B) iTF-Microglia wurden mit dem monomeren Tau-SLP oder TauN279K-SLP (100nM) inkubiert, und die Proben wurden auf die jeweilige Anfangsaufnahme (t = 0; 100 %) und Zellen normalisiert, die nicht Tau-SLP ausgesetzt waren (0 %) (Mittelwert ± SD); n ≥ 7 aus drei unabhängigen Differenzierungen; ∗ p < 0,05 unter Verwendung des ungepaarten Welch-t-Tests). Daten wurden von Shultz et al., 2025²⁴, nachgedruckt und unter einer Creative Commons Attribution (CC BY 4.0)-Lizenz verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Lysosomale Hemmung beeinträchtigt die Tau-SLP-Clearance. (A) Behandlung mit dem 1mM lysosomalen Inhibitor L-Leucyl-L-Leucin-Methylester (LLOMe) über 24 Stunden erhöhte die anfängliche Tau-SLP-Aufnahme (t = 0) in H4-Neurogliomzellen (Mittelwert ± SD; n = 9 unabhängige Kulturen; ∗ p < 0,05 mit ungepaartem Welch-t-Test). (B) Behandlung mit LLOMe (1 mM) über 24 Stunden erhöhte den % normalisierten Tau-SLP RLU nach 60 Minuten Abschaltzeit (t = 60 min) im Vergleich zum Fahrzeug (DMSO). Das lumineszente Signal wird auf die jeweiligen Anfangsaufnahmewerte (100 %) und Zellen normalisiert, die nicht Tau-SLP ausgesetzt waren (0 %) (Mittelwert ± SD; n = 9 unabhängige Kulturen; ∗∗∗∗ p < 0,0001, ∗ p < 0,05 mit ungepaartem Welch-t-Test). Daten wurden von Shultz et al., 2025²⁴, nachgedruckt und unter einer Creative Commons Attribution (CC BY 4.0)-Lizenz verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: iTF-Microglia und iNeurons zeigen Unterschiede in der Tau-SLP-Clearance. (A) iTF-Mikroglia oder iNeuronen wurden mit monomerem Tau-SLP (100 nM) inkubiert, Proben wurden auf die jeweilige Anfangsaufnahme normalisiert (t=0; 100 %) und Zellen, die nicht Tau-SLP ausgesetzt waren (0 %) (Mittelwert±SD; n ≥ 6 aus zwei-drei unabhängigen Differenzierungen; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 mit einer zweiseitigen ANOVA; Zeit: F(1, 28) = 7,489, p = 0,0107; Zelltyp: F(1, 28) = 46,61, p < 0,0001; Wechselwirkung: F(1, 28) = 3,229, p = 0,0831; Sidaks Mehrfachvergleichstest, p-Werte in der Abbildung angegeben, t=0, werden zur Referenz angegeben, aber aus der statistischen Analyse ausgeschlossen. (B) iTF-Mikroglia oder iNeuronen wurden mit fibrillärem Tau-SLP (50nM) inkubiert, Proben auf die jeweilige Anfangsaufnahme normalisiert (t=0; 100 %) und Zellen, die nicht Tau-SLP ausgesetzt waren (0 %) (Mittelwert±SD; n ≥ 6 von zwei zu drei unabhängigen Differenzierungen; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 mittels einer zweiseitigen ANOVA; Zeit: F(1, 26) = 0,3888, p = 0,5384; Zelltyp: F(1, 26) = 43,09, p < 0,0001; Wechselwirkung: F(1, 26) = 1,209, p = 0,2816; Sidaks Mehrfachvergleichstest, p-Werte in der Abbildung angegeben, t=0, werden zur Referenz angegeben, aber aus der statistischen Analyse ausgeschlossen. Daten wurden von Shultz et al., 2025²⁴, nachgedruckt und unter einer Creative Commons Attribution (CC BY 4.0)-Lizenz verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Dieser Test bietet eine skalierbare und quantitative Plattform zur Messung der extrazellulären Tau-SLP-Clearance durch Mikroglia mit hoher Sensitivität und zeitlicher Auflösung. Im Gegensatz zu traditionellen bildgebenden Ansätzen, die oft aufwendige Probenverarbeitung erfordern und in Durchsatz und zeitlicher Probenahme begrenzt sind, ermöglicht dieses lumineszenzbasierte System eine direkte, populationsnahe Quantifizierung der Tau-Behandlung im Mikroplattenformat. Die resultierende Anzeige liefert eine quantitative Messung der Tau-SLP-Clearance nach Exposition gegenüber extrazellulärem Tau. Da Messungen wiederholt über mehrere Zeitpunkte und längere Inkubationszeiten durchgeführt werden können, ermöglicht der Test eine hochdurchsätzende, kinetisch aufgelöste Analyse der Tau-Aufnahme- und Räumdynamik. Darüber hinaus stimmen Veränderungen der Lumineszenz im Laufe der Zeit mit Veränderungen der intrazellulären Tau-SLP-Häufigkeit überein, unterscheiden jedoch nicht zwischen Trafficking, Abbau oder Sekretion ohne komplementäre Ansätze. Obwohl das Tau-SLP-Tagging in unserer Begleitstudie²⁴ die Tau-Aufnahme oder -Aggregation nicht signifikant veränderte, könnten exogene Tags das Verhalten anderer Proteine beeinflussen. Daher sollten Assay-Ergebnisse mit orthogonalen Ansätzen ergänzt und, wo möglich, mit unmarkierten Tau-Präparaten verglichen werden. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass dieser Test rekombinante Tau-SLP-Arten anstelle endogener Tau- oder patientenabgeleitete pathologische Tau-Aggregate verwendet. Obwohl rekombinant 2N4R-Tau ein reproduzierbares experimentelles Substrat bietet, rekapituliert es nicht vollständig die endogene Heterogenität (d. h. posttranslationale Modifikationen) der aus menschlichen Patientenhirnen isolierten Tau-Arten. Es existieren viele Protokolle für die in-vitro-Phosphorylierung des rekombinanten Tau-Proteins und könnten leicht in diesen Workflow integriert werden. Diese Plattform könnte auch angepasst werden, um endogenes Tau zu untersuchen; dies würde den Einsatz von Gentechnik erfordern, um eine SLP-Tag-Sequenz am Tau-(MAPT-)Locus einzubeziehen.

Wichtig ist, dass die Interpretation der Signalreduktion als Degradation von der effektiven Entfernung von extrazellulärem und oberflächengebundenem Tau abhängt, zum Beispiel durch Trypsinisierung oder äquivalente Stripping-Schritte. Falsch-negative Ergebnisse können auftreten, wenn keine effektive Entfernung erreicht wird. Ein scheinbarer Signalverlust, der als falsch-positiver Tau-Degradation interpretiert werden würde, ist ebenfalls möglich. Dies könnte durch Zellablösung oder -tod, die Sekretion von Tau-SLP oder durch proteolytische Spaltung entstehen, die SLP von Tau trennt, ohne das Protein abzubauen. Dementsprechend sollten Abnahmen der Lumineszenz als Verringerung der intrazellulären Tau-SLP-Häufigkeit und nicht als direkte Messungen der lysosomalen Degradation interpretiert werden. Um Signaländerungen eindeutiger auf lysosomale Degradation zurückzuführen, werden orthogonale Validierungsstrategien empfohlen. Dazu können pharmakologische Störungen der lysosomalen Funktion gehören, wie die Behandlung mit Bafilomycin A1 oder LLOMe (Abbildung 3), sowie Puls-Verfolgungsexperimente zur Abgrenzung von Aufnahme- versus Abbaukinetik.

Die Flexibilität dieses Tests macht ihn gut geeignet, um Mechanismen zur Tauaufnahme, intrazellulärem Transport und Abbau zu untersuchen sowie pharmakologische oder genetische Modulatoren der Tau-Clearance in menschlichen Zellsystemen zu screenen. Obwohl die Plattform hier in iPSC-abgeleiteten Mikroglia demonstriert wurde, lässt sie sich leicht an andere Zelltypen anpassen (Abbildung 4), was eine breite Anwendung in Modellen der Tau-Biologie und neurodegenerativer Erkrankungen ermöglicht, einschließlich Alzheimer und anderer primärer und sekundärer Tauopathien. Da dieser Test auf der extrazellulären Exposition von Tau-SLP und lumineszenzbasierter Detektion basiert, sollte er leicht an Astrozyten, Oligodendrozyten oder häufig verwendete Zelllinien angepasst werden, obwohl eine Optimierung der Aufnahmebedingungen notwendig sein kann. Insgesamt bietet dieser Ansatz ein mächtiges Werkzeug zur Analyse zellulärer Signalwege, die an der Proteostase beteiligt sind, und um das mechanistische Verständnis neurodegenerativer Krankheitsprozesse voranzutreiben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Accutase	Thermo Scientific	A1110501
Konische sterile Polypropylen-Zentrifugenrohre	Fisher Scientific	12-565-268
Corning Matrigel Wachstumsfaktor-reduzierte (GFR) Basalmembran-Matrix, phenolrotfrei, LDEV-frei	Corning	356231
DMEM/F-12, HEPES	Thermo Scientific	11330057
Doxycyclin	Clontech	631311
DPBS	Thermo Scientific	14-190-250
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061
Grafik-Software	GraphPad Prism (oder ähnlich)	n/a
Humanes GM-CSF	Thermo Scientific	300-03
KnockOut DMEM	Thermo Scientific	10829018
Lumineszenter Plattenleser	SpectraMax i3x (oder ähnlich) - Molecular Devices	n/a
Mikrozentrifugenrohre	Fisher Scientific	02-682-002
Mikrotiterplatte, 96-Well, PS, Halbbereich, Weiß	Greiner	675075
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System	Promega	N3030
Poly-L-Lysin hydrobromid	Fisher Scientific	ICN15017750
Rekombinantes Human IL-34	Thermo Scientific	200-34
Rekombinantes Human M-CSF	Thermo Scientific	300-25
Rekombinantes Human TGF-β1	Thermo Scientific	100-21C
Oberflächenbehandelte sterile Zellkulturplatten	Fisher Scientific	FB012927
Tau-HiBiT-Protein	In house	n/a	Tau-Protein mit einem VSGWRLFKKIS-Peptid-Tag
Trypsin-Inhibitor	Sigma Aldrich	T9128
Trypsin-EDTA	Thermo Scientific	5-200-072
Y-27632 dihydrochlorid	Bio-techne	1254