Ein effizientes Aufzucht- und Mikroinjektionsprotokoll zur genetischen Modifikation der Stallfliege, Stomoxys calcitrans

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode der Mikroinjektion von Embryonen zur Integration fremdes genetisches Material in das Genom der stabilen Fliegen, ein fluoreszierendes Screening-System zur Überwachung der embryonalen Entwicklung nach der Injektion sowie ein Larvenaufziehsubstrat, bestehend aus mit aktiviertem Kohlenstoff angereichertem Eigelb-Agar, das mit Escherichia coli geimpft ist und die Entwicklung vom Ei zum Erwachsenen unterstützt.

Abstract

Stabfliegen sind blutfressende Schädlinge von Nutztieren, Haustieren und Menschen und kommen auf allen Kontinenten außer der Antarktis vor. Die schmerzhaften Bisse sowohl männlicher als auch weiblicher Erwachsener führen zu stressbedingten Verhaltensweisen bei Nutztieren, was zu Gewichtsverlust und erheblichen wirtschaftlichen Verlusten für die Produzenten führt. Sowohl männliche als auch weibliche Stallfliegen sind obligate Blutfresser, was eine Herausforderung für die sterile Insektentechnik und andere Schädlingsbekämpfungsstrategien darstellt, die eine Massenfreisetzung von Männchen erfordern. Aktuelle Strategien zur Bekämpfung stabiler Fliegenschädlinge schaffen es oft nicht, die Fliegenpopulationen ausreichend zu kontrollieren. Obwohl zahlreiche genetische Manipulationsmethoden zur Einführung exogener Substanzen oder zur Erzeugung von Gen-Knockouts für Mücken, Drosophila und andere Modellinsektengruppen entwickelt wurden, bleiben Methoden zur genetischen Transformation stabiler Fliegen begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt einen zuverlässigen und verbesserten Ansatz zur Einführung fremdes genetisches Material in stabile Fliegen, wobei eine hyperaktive Variante der piggyBac-Transposase und ein neuartiges, festes Larvenaufziehmedium verwendet wird, das die Larvengewinnung, das Schlüpfen, die Fütterung und das fluoreszierende Screening nach der embryonalen Mikroinjektion unterstützt.

Introduction

Stabile Fliegen (Stomoxys calcitrans L., 1758) sind wirtschaftlich bedeutende Schädlinge und Krankheitsüberträger von Nutztieren ^1,2,3 und haben weltweit eine kosmopolitische Verbreitung. Integrierte Schädlingsbekämpfungsstrategien (IPM) schaffen es oft nicht, stabile Fliegenpopulationen ausreichend zu kontrollieren ^2,3, was allein in den Vereinigten Staaten zu jährlichen Verlusten führt, die schätzungsweise 2 Milliarden US-Dollar betragen³. Darüber hinaus wurde Insektizidresistenz in Populationen stabiler Fliegen in Europa^{dokumentiert 4,5} und auch in den Vereinigten Staaten⁶. Daher stellen genetische Kontrollansätze wie die sterile Insektentechnik (SIT) und Gen-Drive-Systeme wünschenswerte Ergänzungen zu traditionellen IPM-Programmen dar.

Frühere Bemühungen zur Entwicklung genetischer Kontrollmethoden bei stabilen Fliegen, einschließlich der Erzeugung genetischer Geschlechtszuordnungsstämme für SIT, basierten auf selektiver Zucht und strahleninduzierter Translokation ^7,8. Diese Ansätze sind arbeitsintensiv und auf nicht-transgene Modifikationen beschränkt. Anschließend folgten O'Brochta et al.⁹ zeigte, dass der Einsatz des Hermes-Transposasesystems in der Lage war, Transgene in S. calcitrans zu integrieren; das Protokoll führte jedoch zu einer geringen Transformationseffizienz, wobei etwa 0,11 % der injizierten Embryonen transgene Nachkommen hervorbrachten und unter der Kontrolle eines exogenen Promotors⁹ eine schwache Expression des Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-Markers hervorbrachten.

Andere genetische Manipulationsansätze, darunter CRISPR-Cas-Systeme, wurden bei stabilen Fliegen noch nicht weit verbreitet angewandt, teilweise wegen der Schwierigkeiten, die widerstandsfähige Chorion stabiler Fliegenembryonen zu durchdringen. Der harte äußere Chorion ist vergleichbar mit dem anderer Muscidenfliegen^10,11. Versuche, das Chorion mit Quarznadeln zu injizieren oder das Chorion mit doppelseitigem Klebeband zu entfernen, waren erfolglos, weshalb eine Behandlung mit einer oxidierenden Lösung (3 % Natriumhypochlorit, NaOCl) erforderlich war, die die Schlüpfrate der Eier reduziert.

Stabile Fliegen können unter Laborbedingungen langfristig aufrechterhalten werden, und unreife Stadien werden typischerweise in fermentierten zellulosehaltigen Substraten wie Holzspänen, Weizenkleie oder mit Stickstoffquellen ergänztem Strohhalm aufgezogen, darunter Kalbproteinergänzungen oder Fischflocken¹². Diese Substrate weisen jedoch mehrere Nachteile auf, wenn sie zur Aufzucht mikroinjizierter Embryonen verwendet werden. Ihre Opazität und hohe Autofluoreszenz erschweren die Identifizierung von GFP-positiven Larven nach dem Schlüpfen und dem Eingraben in das Substrat. Außerdem ist zwar eine gewisse bakterielle Präsenz für das Überleben der Larve^erforderlich, aber fermentierte Medien führen zu unvorhersehbaren bakteriellen und pilzartigen Gemeinschaften, die Embryonen vor dem Schlüpfen schädigen oder verzehren können. Diese Einschränkungen verhinderten die Wiedergewinnung transformierter Larven mit zuvor beschriebenen Injektions- und Aufzuchtmethoden^{9 und} unterstreicht die Notwendigkeit eines zuverlässigeren Injektionsprotokolls, das auch fluoreszierende Screenings während der gesamten Entwicklung ermöglicht.

Hier wird ein reproduzierbares Mikroinjektionsprotokoll vorgestellt, das Verbesserungen in der Transposaseauswahl, Injektionsmethode sowie bei Screening- und Aufzuchtmedien integriert. Diese Modifikationen erleichtern die Entwicklung genetisch veränderter Stallfliegen für Anwendungen wie genetische Geschlechtszuordnungsstämme für SIT, Gen-Antriebe und CRISPR-Cas-vermittelte Gen-Knockouts. Wesentliche Verbesserungen umfassen den Einsatz der hyperaktiven piggyBac-Transposase¹⁴ unter Kontrolle des stabilen Fliegen-Wärmeschockproteins (HSP)83-Promotors, die Austrocknung des Embryos zur Minimierung des Ooplasmaverlusts nach der Injektion sowie die Eliminierung von Klebeband und Halokarbonöl während der Embryoinjektion.

Die Rückgewinnung der injizierten Embryonen wurde weiter verbessert, indem das Bulk-Aufzuchtmedium durch flache, pigmentierte Nähragarplatten ersetzt wurde, die mit einem Rasen aus Escherichia coli inokkuliert wurden. Diese Agar-Formulierung bietet zwei große Vorteile. Erstens liefert sie eine vorhersehbare monogene bakterielle Nahrungsquelle für die Larvenentwicklung. Zweitens bietet sie einen kontrastreichen, niedrigen Autofluoreszenz-Hintergrund, der die Beobachtung von Morphologie, Entwicklung und GFP-Expression bei Larven der ersten Generation (G0) erleichtert. Hausfliegen und Stallfliegen entwickeln sich und verpuppen sich normal auf E. coli-inokulierten, eigelbbasierten Agarplatten^13,15. Die hier beschriebene Formulierung enthält Aktivkohlepulver als nicht-reaktiven, lebensmittelsicheren Zusatzstoff, um die Hintergrundfluoreszenz weiter zu reduzieren.

Protocol

Alle Experimente und Operationen wurden mit Zustimmung des Institutional Biosafety Committee der Texas A&M durchgeführt (Protokoll IBC2019-081). Die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, Chemikalien und Werkzeuge sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Fliegenzucht für die Eierproduktion

1. Vorbereitung von Erwachsenenkäfigen
   1. Stellen Sie das Thermostat einer Inkubatorkammer auf 28 °C ein und mischen Sie 3 kg Natriumchlorid mit ~5 Litern Leitungswasser in einer 10-Liter-Pfanne, wobei ~50 % des Salzes gelöst werden.
   2. Stellen Sie diese unbedeckte Sole-Pfanne am Boden der Inkubatorkammer, um eine Luftfeuchtigkeit von etwa 80 % RH zu halten. Halten Sie einen Tag-Nacht-Zyklus von 16:8 in der Kammer oder im Raum aufrecht.
   3. Säubern Sie den Boden der Insektenkäfige (30 x 30 x 30 cm Edelstahl-/Aluminium-Käfige mit Netzgitter) mit zwei Lagen Papiertüchern und legen Sie einen 45 ml Einweg-Gewürzbecher mit Kristallzucker auf die Papiertuchschicht (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Die Papiertücher helfen, Fliegenflecken aufzunehmen, und der Zucker liefert eine Nahrungsquelle vor der Blutfütterung.
   4. Füllen Sie einen 250 ml Griffin-Becher mit etwa 100 ml Leitungswasser bei Raumtemperatur und packen Sie ein 20 cm x 20 cm großes Quadrat aus schwarzem Baumwollstoff (aus schlichtem schwarzem Kissenbezug oder Bettlaken zugeschnitten) ins Wasser, bis der Stoff feucht ist. Stellen Sie den schwarzen Stoff so ein, dass die Ränder 1–2 cm über den Rand des Bechers hinausragen (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Dieses feuchte Tuch bietet sowohl flüssiges Wasser als auch eine Eiablagefläche für erwachsene Fliegen. Der Tod kann schnell eintreten, wenn die Erwachsenen keinen Zugang zu einer Feuchtigkeitsquelle haben.
   5. Übertragen Sie 500–1.500 Stallfliegenpuppen in eine kleine Schale oder Becher und setzen Sie sie in den Insektenkäfig. Stellen Sie den erwachsenen Käfig in die feuchte Aufzuchtkammer (Schritt 1.1.1) und überwachen Sie täglich die Eclosion. Sobald die erwachsenen Tiere gekommen sind, beginnen Sie täglich mit zitiertem Rinderblut (Abschnitt 1.2).
2. Füttern erwachsener Fliegen
   1. Stellen Sie zitiertes Rinderblut vor, indem Sie eine Endkonzentration von 10,9 mM Trinatriumcitratdihydrat zu frisch entnommenem Rinderblut hinzufügen.
   2. Kurz gesagt: Lassen Sie ~12,8 Gramm Citratsalz in einem minimalen Volumen deionisierten Wassers aufhängen und geben Sie 4 Liter Blut, das im örtlichen Schlachthaus gesammelt wird, hinzu.
      HINWEIS: Blutbehälter sollten Schraubdeckel haben (z. B. quadratische, weitläufige 4-Liter-Flaschen) und vor der Verwendung gründlich mit warmer Seife und Wasser gereinigt werden. Im Schlachthaus sollten Sie vermeiden, die ersten ~1 Liter Rinderblut von einem geschlachteten Tier zu entnehmen, um eine Verunreinigung mit Haaren, Schweiß, Schmutz und anderen Gerinnungsmitteln zu minimieren.
   3. Gefrieren Sie zitiertes Rinderblut in 200 ml Aliquots ein und tauen Sie bei Bedarf auf, wobei aufgetaute Aliquots bis zu einer Woche bei 4 °C gekühlt bleiben.
   4. Geben Sie ~40 ml Zimmertemperatur-Blut pro 600 Fliegen an jeden erwachsenen Käfig.
   5. Blut kann in einem Gewürzbehälter oder Becher angeboten werden, und ein gefalteter, nicht steriler Baumwoll-Gaze-Schwamm sollte ins Gefäß eingeführt werden, um das Blut abzuweichen. Rühre den Docht, bis die Baumwolle vollständig durchnässt ist, und führe sie in den Käfig ein.
      HINWEIS: Das Blut sollte ab 24 Stunden nach der Eklusion täglich gewechselt werden.
3. Eiersammlung
   1. Sobald Eier auf dem schwarzen Baumwollstoff beobachtet sind, entferne das Tuch vom Becher und wasche die Eier in einen separaten, flachen Plastikbehälter mit einer Waschflasche (Abbildung 2A) in einen separaten ~700 ml flachen Kunststoffbehälter. Die Eiablage erfolgt typischerweise, wenn die Fliegen 7–10 Tage alt sind.
      HINWEIS: Überprüfen Sie auch die Blutbecher auf Eier und sammeln Sie eventuelle Eier, die dort abgelegt werden könnten.
   2. Sammeln Sie Eier auf Filterpapier mittels Vakuumfiltration . Dies geschieht, indem ein schwarzes Filterpapier in einen Buchner-Trichter gelegt, ein Vakuum angewendet und die Eier aus Schritt 1.3.1. über das Setup gegossen werden.
   3. Anschließend werden die Eier mit einer Waschflasche in einen graduierten Zylinder oder ein graduiertes 1,7-ml-Mikrozentrifugenrohr übertragen und das Menge der gesammelten Eier erfasst (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Vermeiden Sie das längere Eintauchen der Eier im Wasser, da die Sterblichkeit ~10 Minuten nach dem Eintauchen zu steigen beginnt.
4. Herstellung von Massenlarvenmedien
   1. Sammeln Sie Materialien für das Bulk-Larvenmedium (Abbildung 3A), wie in Tabelle 1 dargestellt.
   2. In einem 1000-ml-Becher gibt man das Kalbproteinpräparat und das gesamte Leitungswasser dazu. Lassen Sie es über Nacht bei Zimmertemperatur rehydrieren.
   3. Geben Sie Weizenkleie und Vermiculit in einen separaten, größeren Mischbehälter.
   4. Nach der nächtlichen Rehydrierung rühren Sie das rehydrierte Kalb-Supplement gründlich um, um die Klumpen aufzulösen, und gießen Sie die Mischung dann mit Weizenkleie und Vermiculit in den Behälter. Gründlich mischen, bis es homogen ist und die gesamte Weizenkleie mit dem Kalbser-Ergällungsschlamm überzogen wurde.
   5. Übertragen Sie das Schüttmedium in einen Polypropylen-Lebensmittellagerbehälter in einer ~8 cm tiefen Schicht, die den gesamten Behälterboden bedeckt (Abbildung 3B).
   6. Fügen Sie ~1.000 Embryonen hinzu (etwa 0,2 ml Eizellen pro 2,2 Liter Schüttmedium), indem Sie Embryonen über entnehmen.Vakuumfiltration auf einem kreisförmigen Filterpapier mit 90 mm Durchmesser und anschließend das Filterpapier mit den Eiern mit der Bildfläche nach unten in die Mitte des Medienbehälters legen (Abbildung 3B, C).
   7. Bedecken Sie das Filterpapier mit ~1 cm Medium, um Feuchtigkeit zu speichern (Abbildung 3C), und bedecken Sie den Behälter mit einem übergroßen Rechteck aus schwarzem Baumwollstoff, wobei 5 cm überhängendes Baumwollstoff über den Rand des Behälters hinausragt.
   8. Schneiden Sie ein großes Loch (~12 cm Durchmesser) in den Deckel des Lebensmittelbehälters, um einen Gasaustausch zu ermöglichen, und klicken Sie den Deckel auf die Medienbox, während Sie das schwarze Baumwolltuch zwischen Behälter und Deckel einschließen (Abbildung 3D).
      HINWEIS: Dies dient als Dichtung, die verhindert, dass der Spalt zwischen Deckel und Behälter Larven des^{ersten Stadiums} in Kondenstropfen einfängt.
   9. Platzieren Sie das fertige Medienlager bis zur Verpuppung in der Aufzuchtkammer der Erwachsenen und überwachen Sie die Larvenentwicklung (Abbildung 4) (die Verpuppung erfolgt je nach Medientemperatur und Larvendichte in ~10 Tagen).
      HINWEIS: Die Stoffabdeckung sollte fein genug sein, um das Durchkommen der Larven im ersten Stadium zu verhindern, aber durchlässig genug, um Kondensation an den Innenwänden der Medienbehälter zu verhindern, die Larven einfangen und ertränken kann.
5. Puppentrennung
   1. Entferne die Stoffabdeckung aus Puppenbehältern und sammle die Puppen mit einem Löffel oder einer Löffel.
      HINWEIS: Stallfliegenpuppen erscheinen als nicht bewegliche rotbraune Zylinder, 4–7 mm lang, im Gegensatz zu den beweglichen gelb-weißen Larven. Puppen sammeln sich typischerweise am äußeren Rand der Behälterwände oder an feuchten, erhöhten Positionen in ihrem Medienbehälter an, während die Fliegen die Metamorphose von Larven zu Puppen zu Erwachsenen beginnen.
   2. Schichte 500–1.500 Puppen ~1 cm tief auf eine Schale und lege sie in einen neuen, sauberen Käfig, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben, um die nächste Generation zu vermehren.

Abbildung 1: Materialien zur Aufzucht der erwachsenen Fliegen. (A) Erwachsener Fliegenaufzucht-Käfig mit der Saccharose-Tasse (S) und der Eiablage-Tasse (O). (B) Eiablagungsbecher, vorbereitet aus wassergesättigtem schwarzem Baumwollstoff, der etwas über den Rand des Bechers hinausragt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Eiabnahme. (A) Entnahme von Eiern aus dem Eiablagungstuch mit einer Waschflasche. (B) Rückgewinnung von Eiern durch Vakuumfiltration auf Hochkontrastfilterpapier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Materialien für Massen-Larvenmedien
Reagenz	Masse (g)
Wasser	900
Weizenkleie	230
Kalbserpräparat	100
Vermiculit (A4-grob)	70
Materialien für Entchorionationslösungen
Lösung	Zusammensetzung
Oxidierendes Bad	3 % Natriumhypochlorit in deionisiertem Wasser
Waschbad	Triton X-100 0,02%-Lösung in deionisiertem Wasser
Spülen	Deionisiertes Wasser
Materialien für Schwarzagar-Abschirmung und Aufziehplatten
Reagenz	Masse (g)
Wasser	500
Eigelbpulver	18
Aktivkohle	4
Natriumchlorid	1

Tabelle 1: Reagenzien für Bulk-Larvenmedien, Dechorionationslösungen und schwarze Agarplatten. Reagenzien, die zur Herstellung von Bulk-Larvenmedien zur Koloniepflege verwendet werden, sowie zur Zusammensetzung der Lösungen, die zur Schwächung und Entfernung des Chorions aus stabilen Fliegenembryonen verwendet werden, und Materialien, die zur Herstellung von 500 ml Schwarzagar-Screening- und Aufzuchtmedium benötigt werden.

Abbildung 3: Vorbereitung von Massenmaterial der Larven. (A) Materialien für die Herstellung von Massen-Larvenmedien: Kalbsprotein-Ergänzung (CM), Weizenkleie (WB), Vermiculit (VM), Aufbewahrungsbehälter (SC), Deckel (L) und Stoffdichtung (FG). (B) Gründliches Mischen der Medienkomponenten. (C) Lagerung des eiüberzogenen Filterpapiers (EP) verdeckt mit der Bildfläche auf der Medienoberfläche und Überdeckung mit zusätzlichem Medium, um Austrocknung zu verhindern. (D) Installation der Baumwollstoffdichtung zwischen Behälter und Deckel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Larvenentwicklung in Massenmedien. Transparente Behälter ermöglichen die Überwachung der Larvenentwicklung und des Medienzustands. Larven (L) sind an den Behälterwänden, dem Deckel und im Medium sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Vorbereitung auf die Injektion: Entchorionation und Austrocknung

1. Lege ein angefeuchtetes schwarzes Baumwolltuch in einen Becher, wie in Schritt 1.1.4 beschrieben, und überbringe es für 25 Minuten in einen erwachsenen Käfig, um Eier zu sammeln. Spülen Sie die Eier mit einem 106 μm großen Edelstahlsieb mit einer Waschflasche ab.
   HINWEIS: Eine Entnahmephase von 25 Minuten ergibt typischerweise etwa 400 Eier.
2. Lassen Sie die Embryonen weitere 30 Minuten ungestört auf dem Sieb ruhen.
3. Während die Embryonen altern, bereiten Sie jeweils 150 ml der oxidierenden, waschenden und spülenden Lösungen vor, die im Abschnitt "Materialien für Entchorionationslösungen" in Tabelle 1 (Abbildung 5) beschrieben sind. Verwenden Sie genügend Volumen, um die Embryonen mit etwa 1 cm Lösung zu bedecken.
4. Tauchen Sie das Sieb mit den Embryonen für 2 Minuten in das oxidierende Bad und bewegen Sie die Embryonen vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette (Abbildung 6A).
   HINWEIS: Wiederholtes Aspiratieren und Abgeben der Lösung zur Bildung eines kreisförmigen Wirbels hilft, Embryonen im Zentrum des Siebs zu konzentrieren und verhindert, dass frisch dechorionierte Embryonen an den Siebwänden haften.
5. Nehmen Sie das Sieb aus dem oxidierenden Bad und tappen Sie die überschüssige Lösung ab. Siebe das Sieb in die Waschlösung und rühre durch Aspiration und Dosieren für 2 Minuten.
6. Übertragen Sie das Sieb mit den Embryonen in die Spüllösung und bewegen Sie wie in Schritt 2.4 beschrieben für 2 Minuten. Nehmen Sie das Sieb aus der Spüllösung und tappen Sie überschüssiges Wasser ab.
7. Legen Sie einen sterilen Glasdeckel auf das Sieb und verwenden Sie unter einem Sektionsmikroskop einen feinspitzigen Nylonpinsel, um Embryonen (Abbildung 6B) vom Sieb an den Rand des Deckzettels zu übertragen. Die Embryonen werden dicht beieinander positioniert, ohne dass sie sich berühren dürfen, wobei der breitere hintere Pol zum Rand des Deckschilds zeigt. Vermeiden Sie das Biegen, Verzerren oder Reißen von Embryonen während des Transfers.
8. Bereiten Sie eine Austrocknungskammer vor, indem Sie den Boden einer 1-Liter-Flasche mit 100 ml Calciumsulfat-Austrocknungsmittel abdecken und den Kolben mit einem Gummiverschluss versiegeln.
   HINWEIS: Nach 24 Stunden Gleichgewicht erreicht die Austrocknungskammer typischerweise eine relative Luftfeuchtigkeit von <5 % bei 23 °C.
9. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Deckmantel und legen Sie den Deckzettel mit entchorierten Embryonen auf das Trockenmittel. Verschließen Sie die Flasche wieder mit einem Gummiverschluss und trocknen Sie die Embryonen 8 Minuten lang aus.
10. Entfernen Sie den Deckdeckel aus der Austrocknungskammer und legen Sie ihn unter einem 20×-Objektiv für die Mikroinjektion auf die Mikroskop-Bühne.

Abbildung 5: Dechorionationslösungen. Von links nach rechts: Edelstahlsieb, oxidierende Lösung, Waschlösung und Spüllösung für die Embryo-Dechorionation. Natriumhypochlorit wird als 6%ige Lagerlösung erhalten, die vor Licht geschützt ist, und Triton X-100 wird als 10×%-Lagerlösung erhalten und vor der Verwendung auf eine Endkonzentration von 0,02% verdünnt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Embryo-Dechorionation. (A) Sanfte Aspiration und Abgabe der Lösung erzeugen einen Wirbel, der die Embryonen im Zentrum des Siebs konzentriert und die Haftung an den Siebwänden reduziert. (B) Dechorionierter Embryo, der nach dem Ausspülen aus dem durchscheinenden Chorion hervorgeht. Der vordere Pol (schmaleres Ende) tritt typischerweise vor dem hinteren Pol hervor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Mikroinjektion

1. Ziehen Sie Quarz-Mikroinjektionsnadeln aus 100 mm filamentierten Glaskapillaren (I.D. 0,7 mm, O.D. 1,0 mm) unter Verwendung der in Tabelle 2 aufgeführten Parameter. Bewahren Sie die Nadeln bis zur Verwendung an einem staubfreien Ort auf.
   HINWEIS: Borosilikatnadeln mit ähnlicher Geometrie können ebenfalls verwendet werden.
2. Bereiten Sie einen Injektionspuffer vor (0,1 % w/v Phenolrot in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4) und filtersterilisieren Sie durch einen 0,22 μm Spritzenfilter.
3. Bereiten Sie 20 μL Injektionsmischung vor, indem Sie jeweils 10 μg PiggyBac-Helferplasmid und Spenderplasmid kombinieren, das die genetische Last zwischen den linken und rechten PiggyBac-invertierten Endwiederholungen enthält, mit 4 μL Injektionspuffer. Verdünnen Sie auf eine Endkonzentration von 500 ng/μL mit nukleasefreiem Wasser.
   HINWEIS: Das Helferplasmid besteht aus der 3,1 kb hsp83-Promotorsequenz stromaufwärts des HSP83-Codons und der hyperaktiven PiggyBac-Transposase-Codierungssequenz.
4. Übertragen Sie das Injektionsgemisch in einen niedrigvolumigen 0,20 μm PTFE-Spritzenfilter und setzen Sie den Filter in die Öffnung eines 0,5-mL-Mikrozentrifugenrohrs (Abbildung 7A). Zentrifugieren Sie mit ≥11.000 x g für 10 Minuten oder bis das gesamte Injektionsgemisch den Filter passiert hat. Lagern Sie die unbenutzte Injektionsmischung bei -20 °C.
5. Füllen Sie eine Quarz-Mikroinjektionsnadel mit etwa 2 μL Injektionsmischung mit einer mikrogelgeladenen Pipettenspitze aus (Abbildung 7B). Vermeiden Sie es, beim Beladen Luftblasen einzuführen.
   HINWEIS: Richten Sie die Mikroinjektionsnadel parallel zur Längsachse des Embryos aus und halten Sie keinen horizontalen oder vertikalen Winkelversatz aufrecht, um Risse und Scheren zu minimieren.
6. Klopfen Sie vorsichtig mit der Nadelspitze gegen den Rand eines Glasverschlusses, bis die Injektionsmischung durch die Nadelspitze fließt (Abbildung 7C).
   HINWEIS: Brechen Sie die Nadelspitze allmählich auf, um die kleinste, schärfste Öffnung zu schaffen, die dennoch einen Injektionsdurchfluss ermöglicht.
7. Injizieren Sie den Embryo unmittelbar nach der Austrocknung durch den hinteren Pol mit etwa 700 hPa Injektionsdruck und 300 hPa Rückdruck.
8. Den Embryo vorsichtig durchbohren und etwa ein Zehntel des Embryovolumens mit der Injektionsmischung injizieren (Abbildung 7D–F).
   HINWEIS: Minimieren Sie das Nadeleindringen, um eine Störung der Vitellinmembran zu verringern und den Verlust von Ooplasma während des Nadelentzugs zu verhindern.
9. Umleiten Sie den Deckzettel unmittelbar nach der Injektion in eine Petrischale, die mit sterilem, angefeuchtetem 90 mm schwarzem Filterpapier ausgekleidet ist, und inkubieren Sie 48 Stunden bei Zimmertemperatur.
   HINWEIS: Alle Injektionen werden innerhalb von 2 Stunden nach der Eiablage abgeschlossen, um Zielembryonen vor dem Synzytialstadium zu erreichen.
10. Untersuchen Sie die Embryonen auf das Schlüpfen alle 12–16 Stunden. Übertragen Sie frisch geschlüpfte Larven und das Glasdeckblatt auf eine geimpfte und konditionierte Agarplatte, die wie in Abschnitt 4 beschrieben hergestellt wurde.

Parameter	Hitze	Fil	Vel	Del	Zieh
Wert	825	5	60	150	175

Tabelle 2: Nadelziehparameter. Parameter, die zur Herstellung von Quarz-Mikroinjektionsnadeln verwendet werden.

Abbildung 7: Embryo-Mikroinjektion. (A) Filtration der Injektionsmischung mit einem Spritzenfilter, der in einem 0,5-mL-Mikrozentrifugenrohr eingebettet ist. (B) Einladen der gefilterten Injektionsmischung in eine Mikroinjektionsnadel mit einer gelgeladenen Pipettenspitze. (C) Endgeometrie einer Quarz-Mikroinjektionsnadel. (D) Ausrichtung der Nadel mit dem hinteren Pol des Embryos. (E) Eindringung der Embryooberfläche bei Minimierung einer Störung der Vitellinmembran. (F) Injektion von etwa einem Zehntel des Embryovolumens, gefolgt von Nadelabzug. Eine erhöhte Transparenz zeigt eine Verschiebung von Ooplasma durch das Injektionsgemisch an. Maßstabsleiste = 400 μm (D–F) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Behandelte Plattenvorbereitung

1. Agarmedium-Formulierung
   1. Bereiten Sie das im Abschnitt "Materialien für Schwarzagar-Screening and Rezing-Platten" in Tabelle 1 beschriebenes Medium und Autoklaven für 15 Minuten bei 121 °C vor. Gießen Sie den Agar bei 40 °C oder lagern Sie ihn bei Zimmertemperatur, bevor Sie ihn erhitzen und in 90 mm Petrischalen geben.
      HINWEIS: Kräftig wirbeln, bevor man sie gießt, um feste Partikel wieder aufzuhängen.
2. Platteninokulation
   1. Verdünnen Sie eine 24-h-Kultur von K12 Escherichia coli auf OD600 = 0,200 in Luria-Bertani-Brühe und geben Sie 200 μL auf eine abgekühlte, verfestigte Agarplatte. Verteilen Sie die Kultur gleichmäßig mit sterilen Glasperlen oder einem Glasstreuer und lassen Sie die Platte überschüssige Feuchtigkeit aufnehmen (Abbildung 8A, B).
      HINWEIS: Verwenden Sie Agarplatten innerhalb eines Monats nach dem Gießen oder entsorgen Sie sie, um ein zuverlässiges bakterielles und larvenes Wachstum sicherzustellen.
3. Plattenaufbereitung
   1. Falten Sie 6 × 6 cm große Stücke schwarzes Filterpapier, um 6–10 Wellblechrille zu erzeugen, und sterilisieren Sie sie durch Backen oder Autoklaven. Lege ein steriles, gewelltes Filterpapier aseptisch auf die geimpfte Petrischale und befeuchte sie mit mehreren Tropfen sterilem Wasser (Abbildung 8C).
   2. Sterilisieren Sie unbehandelte, uninjizierte Wildtyp-Larven (WT) des ersten Stadiums an der Oberfläche und übertragen Sie 10 Larven auf das angefeuchtete Filterpapier.
      HINWEIS: Sterilisieren Sie WT-Embryonen, indem Sie sie 1 Minute lang in 10 % Bleichmittel (0,6 % NaOCl) eintauchen und anschließend 2 Minuten in sterilem deionisiertem Wasser spülen.
   3. Lege ein 90-mm-Filterpapier zwischen Deckel und Körper der Petrischale, um als Dichtung zu dienen.
   4. Lassen Sie die WT-Larven die Platten 24 Stunden lang konditionieren, bevor sie injizierte Embryonen auf Glasdeckfolien legen (Abbildung 8C). Entfernen Sie die WT-Larven, nachdem die ersten injizierten Embryonen geschlüpft sind.

Abbildung 8: Vorbereitung der Agarplatten und Rückgewinnung nach der Injektion. (A) Inokulation von Agarplatten mit einer OD600 = 0,2-Kultur von Escherichia coli unter Verwendung steriler Glasperlen. (B) Aufnahme überschüssiger Oberflächenfeuchtigkeit vor dem Embryotransfer. (C) Platzierung einer 90-mm-Filterpapierdichtung zwischen Deckel und Körper der Petrischale. (D) Screening der Larven auf fluoreszierende Marker auf konditionierten Agarplatten. Die injizierten Embryonen werden auf einem deionisierten, wassergesättigten 90-mm-Filterpapier geborgen, das in den Deckel einer umgekehrten Petrischale gelegt und 48 Stunden inkubiert wird, bevor es auf Siebplatten umgeleitet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Results

Mit diesem Protokoll wurden 431 Embryonen der stabilen Fliegen dechorioniert und mit piggyBac-Hsp83-Spenderplasmid und Hsp83-Helferplasmid bei einer Endkonzentration von 500 ng/μL injiziert.Von den 431 injizierten Embryonen schlüpften 18 ZsGreen-positive Larven (4,2 %) und 8 ZsGreen-negative Larven (1,9 %) 48–76 Stunden nach der Injektion, wenn sie auf schwarzen Agarplatten gescreent wurden (Tabelle 3). Insgesamt schlüpften 26 von 431 injizierten Embryonen (6,0 %), und 16 von 26 geschlüpften Larven überlebten das Erwachsenenalter (61,5 %).

Arten	Art der Injektion	Konstrukt	# injiziert	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) Puppen	ZsGreen(-) Puppen	ZsGreen(+) Erwachsene	ZsGreen(-) Erwachsene	# Erwachsene, die ZsGreen(+)-Nachkommen hervorbringen
Stomoxys calcitrans	Transposase-Einfügung	Hsp83:hy-pBac (Helfer, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (Spender, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	Transposase-Einfügung	Hsp83:hy-pBac (Helfer, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (Spender, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

Tabelle 3: Injektionsstatistiken. Überlebens-, Transformations- und Genesungsraten nach einer Embryonal-Mikroinjektion.

Von den 18 ZsGreen-positiven G0-Larven überlebten 12 die Verpuppung (66,7 %) und 10 wurden als Erwachsene eingekapselt. Sechs ZsGreen-positive Erwachsene (1,4 % der injizierten Embryonen, 60 % der fruchtbaren G0-Überlebenden) brachten ZsGreen-positive Nachkommen hervor. Diese Nachkommen (Abbildung 9A–E) waren selbstgekreuzt und behielten zum Zeitpunkt des Schreibens sechs Generationen lang fluoreszenz.

Von den acht ZsGreen-negativen Larven überlebten sechs das Erwachsenenalter (75 %). Keiner der nicht-fluoreszierenden Erwachsenen brachte fluoreszierende Nachkommen hervor.

Abbildung 9: Fluoreszierendes Screening transgener Fliegen. (A) Vergleich von ZsGreen-exprimierenden F1-Larven und WT-Larven. (B) Fluoreszenz, sichtbar durch die Puppenkutikula, was eine transgene Screening im Puppenstadium ermöglicht. (C,D) Vergleich von drei ZsGrün-exprimierenden Larven und Puppen (links) mit drei WT-Larven und Puppen (rechts) unter Weißlicht- (C) und Fluoreszenzbeleuchtung (D). (E) Erwachsene transgene F1-Fliege mit ZsGreen (links) im Vergleich zu einer WT-adulten Fliege (rechts). Maßstabsbalken = 1 mm (A), 2 mm (B,E) und 3 mm (C,D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Discussion

Die genetische Transformation von nicht-modellierten Insektenarten bleibt ein wesentlicher Engpass bei der Entwicklung und Bewertung genetischer Kontrollstrategien für Gliedertierschädlinge und -vektoren.

Bei Stable Flies reduziert das hier beschriebene Protokoll die Zeit, Ressourcen, Arbeit und Variabilität, die mit der Injektion und Aufzucht von G0-Fliegen nach der Mikroinjektion des Embryos verbunden sind. Darüber hinaus ermöglicht der Einsatz von schwarzen Agar-Screeningplatten eine direkte Beobachtung der Entwicklung während des gesamten Lebenszyklus, was die Identifikation und Korrektur von Problemen erleichtert, die während der Injektion, Erholung und Larvenaufziehung auftreten. Anhand der in dieser Studie untersuchten Plasmidkonstrukte erzeugte das Protokoll transgene stabile Fliegenlinien mit weniger injizierten Embryonen als zuvor berichtete Methoden⁹. Obwohl außerhalb des Rahmens dieses Methodenartikels, können die Bestätigung und Lokalisierung von Transgen-Einfügungsstellen mit etablierten Ansätzen wie inverser PCR und Splinkerette-PCR durchgeführt werden.

Ein effizientes Injektionsprotokoll erleichtert zudem zukünftige Studien in der funktionellen Genomik, einschließlich der Promotorcharakterisierung mit fluoreszierenden Reportern; Vektorkompetenz durch reverse-genetische Analysen von Genen, die mit der Pathogenübertragung assoziiert sind; Nuklease-Charakterisierung, einschließlich der Bewertung von CRISPR-Cas9 und anderen programmierbaren Nukleasen in stabilen Fliegen; Forschung zur Insektizidresistenz durch Modifikation von Kandidatenresistenzallelen; und Untersuchungen der Grundlagenbiologie, einschließlich der Gene, die an der Bluternährung, Paarung und Entwicklung beteiligt sind. Unser Protokoll beseitigt außerdem die Notwendigkeit von ölgetränkten Embryonen und sauerstoffreichen Feuchtigkeitskammern für die Embryo-Erholung nach der Injektion, wie in früheren Musca-Haus- und Lucilia cuprina piggyBac-Transformationsliteratur^16,17 dokumentiert.

Mehrere Parameter sind entscheidend für eine erfolgreiche Transgenese. Die Trocknung des Embryos und der Zeitpunkt der Injektion sind besonders wichtig, da Plasmid-DNA vor der Zellbildung eingeführt werden muss, um die Einbindung in Keimbahnvorläuferzellen sicherzustellen. Der genaue Zeitpunkt der Synzytiumbildung in stabilen Fliegenembryonen ist jedoch weiterhin unbekannt. Darüber hinaus wird die embryonale Entwicklungsrate von der Temperatur beeinflusst, und der Entwicklungszeitstrahl stabiler Fliegenembryonen unter unterschiedlichen Umweltbedingungen ist noch nicht vollständig charakterisiert. Zukünftige Forschungen zu den Entwicklungsraten und der Embryogenese stabiler Fliegen-Laborstämme könnten Einblicke in die Optimierung von Mikroinjektions- und Transformationsprotokollen liefern und so die Effizienz und Reproduzierbarkeit weiter steigern. Bis dahin bleibt jedoch die Bestimmung des optimalen Einspritzfensters eine methodische Beschränkung, die die Transformationseffizienz beeinflussen kann. Wenn die Überlebensraten niedrig sind, kann die Fehlersuche durchgeführt werden, indem Schlüpf- und Erwachsenenüberlebensraten zwischen unbehandelten Embryonen, dechorionierten Embryonen, Embryonen, die mit filtersterilisiertem PBS injiziert wurden, und WT-Embryonen, die auf Agarplatten aufgezogen werden, verglichen werden. Frühere Literatur, die die Transformation von Musca Domestic beschrieb, ergab 14 Integrationsereignisse bei 1.668 Injektionen (0,84 % der Injektionen)¹⁶, und die Transformation des Schafschädlings Lucilia cuprina etablierte 3 transgene Linien aus etwa 900 Embryoinjektionen (0,33% der Injektionen)^17, was darauf hindeutet, dass das in diesem Protokoll beschriebene Stable Fly Transformationsprotokoll (6 Integrationsereignisse in 431 Injektionen), 1,4 % der injizierten) bietet eine Verbesserung der Injektionseffizienz im Vergleich zu anderen Schädlingsdipterarten in der Literatur.

Der stabile Fliege-Hsp83-konstitutiver Promotor sorgte während der gesamten Entwicklung für eine robuste Expression von ZsGreen und unterstützte die Expression der hyperaktiven piggyBac-Transposase während der frühen Embryogenese, wodurch die Sichtbarkeit des fluoreszierenden Markers und die Transformationseffizienz im Vergleich zu einem zuvor berichteten stabilen Fliegentransformationsprotokoll⁹ verbessert wurden. Das in dieser Studie verwendete Helferplasmid wurde erzeugt, indem 3,1 kb genomische DNA unmittelbar oberhalb des hsp83-Startcodons in einen minimalen Plasmidvektor oberhalb der hyperaktiven PiggyBac-Transposase-kodierenden Sequenz subkloniert wurde. Das Hilfs-zu-Fracht-Plasmid-Verhältnis wurde empirisch mit 1:1 nach Masse festgelegt und während der gesamten Studie verwendet. Obwohl keine zusätzlichen Plasmidverhältnisse bewertet wurden, könnten alternative Verhältnisse ebenfalls wirksam sein.

Die hier beschriebenen Verbesserungen könnten auf Transgenese-Protokolle für andere Gliederfütter anwendbar sein. Darüber hinaus wird das agarbasierte Screening- und Aufzuchtsystem derzeit auf die Injektion und das Screening von Schwarzen Soldatenfliege (Hermetia illucens) eingesetzt. Das Protokoll kann besonders nützlich für Transgenese-Bemühungen bei anderen musciden Fliegen, darunter Musca domestica und Haematobia irritans, da sie eine ähnliche Larvenökologie und Entwicklung bei zerfallenden faserigen Substraten haben. Der Einsatz von Escherichia-coli-inokulierten Agarplatten könnte einen praktischen Ansatz für die Überwachung nach der Injektion bieten und es Forschern ermöglichen, die embryonale Entwicklung, Larvenmorphologie, Markerexpression, Schlüpfraten und die Gesamterholung zu bewerten. Die Anpassung der bakteriellen Komponente des Mediums an die Biologie der Zielart kann die Nützlichkeit dieses Ansatzes zur Entwicklung und Optimierung von Transgenese-Protokollen weiter erhöhen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Flasche mit Gummistopfen (Trocknungskammer)	VWR	214-1134	Trocknungskammer
Bacto Agar	Difco	281230	Agar für schwarze Agarplatten
Schwarze Kissenbezüge	Aisawate	3.45496E+11	Schwarzes Baumwolltuch für Eiersammelbecher und Dichtungsring für Larvenzuchtbehälter
Calciumsulfat-Trocknungsmittel	Drierite	21001	Trocknungsmittel für Trocknungskammer
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	Bulk-Larvenmedium
Compoundmikroskop	Leica Microsystems	DM750M	Injektionsmikroskop
Getrocknete Eigelbe	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Nährstoffquelle für schwarze Agarplatten
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Bakterien, die auf schwarzen Agarplatten verwendet werden
Femtojet 4i Mikroinjektionsdruckversorgung	Eppendorf	5252000021	Mikroinjektionsdruckversorgung
Feinspitze Nylon-Malerbürste	Transon	7.42298E+11	Übertragen von Embryonen
Feuerpolierte Quarzkapillaren mit Filament, AD 1,0 mm, ID 0,70 mm, 10 cm Länge	World Precision Instruments	QF100-70-10	Kapillaren zum Ziehen von Nadeln
Pinzette	Fine Science tools	11251-20	Stichprobenhandhabung
Vollhöhensieb, 3” Durchmesser, Nr. 140 ASTM-E11 Standard-Testsieb (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Hält Embryonen während der Dechorionen
Germizides Ultra-Bleichmittel (6% Natriumhypochlorit)	Pure Bright	59647-21014	Bleichlösung zum Entfernen des Chorions
GladWare Family Size Lebensmittel-Aufbewahrungsbehälter, XL 104 oz	Glad	012587701294	Behälter für Bulk-Larvenmedium
Grad 8613, 9 cm schwarze qualitative Filterpapiere	Ahlstrom	8613-0550	Sammeln von Embryonen
LB-Bouillon	BD Difco	DF0446-17-3	LB-Bouillon für E.coli-Kultur
M60 Zoom Stereo-Dissektionsmikroskop mit Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Mikroskop zum Bewegen und Ausrichten von Embryonen
Microloader-Tipps 0,5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Zum Beladen der Injektionsmischung in Nadeln
Mikromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Mikromanipulator für Injektionen
Millex Spritzenfilter, hydrophiles PTFE, 0,2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Zum Filtern der Injektionsmischung
Nukleasenfreies Wasser	Corning	46-000-CM	Injektionspuffer
Organisches Kokosnuss-Aktivkohlepulver	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Pigment für schwarze Agarplatten
P-2000 Laserbasierter Pipettenzieher	Sutter Instruments	P-2000/G	Gerät zum Ziehen von Nadeln aus Kapillaren
PBS, pH 7,4	Gibco	10-010-023	Injektionspuffer
Petrischalen	VWR	391-0609	Petrischalen für Agar-Schwarz-Eier-Platten
Phenolrot, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Farbstoff für Injektionen
Gummistopfen	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Trocknungskammer-Stopfen
Weiche Weizenkleie (weiches rotes Winterweizen) 50 lb	Siemer	55600050500000	Bulk-Larvenmedium
Quadratische Glasdeckgläser, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Glasdeckgläser für Mikroinjektionen
Stereomikroskop-Fluoreszenzadapter	Nightsea	SFA-RB	Fluoreszierende Lampe und Filter zum Screening von Larven
Steriles Glasperlen	VWR	1.04016.0500	Verteilen von Bakterien auf Platten
Transferpipette Einweg 5mL	LabAid	BP1200	Waschen von Embryonen während der Dechorionen
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Dechorionen Embryonen
Waschflasche	Safetyware	Z423335	Waschen von Embryonen von Oberflächen