Ein dreidimensionales Angiogenese-Modell auf Basis von Mikroträgerperlen unter Verwendung menschlicher Nabelvenendothelzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein dreidimensionales, mikroträgerbasiertes Angiogenesemodell unter Verwendung menschlicher Nabelvenendothelzellen. Der Assay ermöglicht eine direkte Visualisierung des Endothel-Sprießens und der Bildung von lumenartigen Strukturen und kann auf Studien angiogener Mechanismen und therapeutischer Interventionen angewendet werden.

Zusammenfassung

Angiogenese ist ein mehrstufiger biologischer Prozess, der Aktivierung von Endothelzellen, Migration, Verlängerung, Lumenbildung, Verzweigung und Anastomose umfasst. Konventionelle zweidimensionale Kultursysteme sind nützlich für die vorläufige Bewertung von Medikamenten, Genen oder Kulturbedingungen, stellen jedoch nicht ausreichend die räumliche Organisation der endothelialen Morphogenese innerhalb einer dreidimensionalen extrazellulären Matrix dar. Das vorliegende Protokoll beschreibt einen dreidimensionalen Angiogenese-Test auf Basis von Mikroträgerperlen, der menschliche Nabelvenendothelzellen (HUVECs) verwendet. Die HUVECs werden zunächst auf Mikroträgerperlen mit chemisch gekoppeltem, säuredenaturiertem Schweinekollagen vom Typ I ausgesät und anschließend in eine Basalmembranmatrix eingebettet. Orale mukosale Fibroblasten werden anschließend auf dem Gel ausgesaat, um parakrine Unterstützung für endotheliale Keimungen und die Bildung von gefäßähnlichen Strukturen zu bieten. Das Kulturmedium wird alle 2 Tage ersetzt, und das Keimverhalten sowie die angiogenen Phänotypen werden mittels invertierter Mikroskopie überwacht. Unter geeigneten Kulturbedingungen entstehen innerhalb weniger Tage endotheliale Sprossen, gefolgt von der Bildung von lumenartigen Strukturen und Verbindungen zwischen den Keimungen. Diese Methode bietet eine bequeme und reproduzierbare Plattform für In-vitro-Studien zur endothelialen Morphogenese und kann auch für Untersuchungen zur Genmanipulation, pharmakologischen Interventionen und Krankheitsmodellierung eingesetzt werden.

Einleitung

Die Endothelsprossung ist ein Schlüsselereignis der Angiogenese und umfasst das Entstehen, die Migration, Proliferation und Ausrichtung von Endothelzellen aus bereits vorhandenen Gefäßstrukturen, gefolgt von der Lumenbildung und der Bildung miteinander verbundener gefäßähnlicher Netzwerke ^1,2. Obwohl herkömmliche zweidimensionale Kultursysteme und gelbasierte Röhrenbildungstests technisch unkompliziert sind, sind sie in ihrer Fähigkeit, die räumliche Umgestaltung von Endothelzellen innerhalb einer dreidimensionalen ^{Mikroumgebung} nachzubilden, ^begrenzt. Der klassische, auf Mikroträgerperlen basierende dreidimensionale Keimungstest reproduziert mehrere Stadien der Angiogenese in vitro, darunter Endothelkeimung, Verlängerung, Lumenbildung und Netzwerkassemblierung, und ist daher zu einer weit verbreiteten Methode für die Angiogeneseforschung geworden.

Im vorliegenden Protokoll wird ein dreidimensionales, auf Mikroträgerperlen basierendes Keimmodell unter Verwendung normaler menschlicher Nabelvenendothelzellen etabliert. Basierend auf zuvor berichteten Endothel-Mikroträgerperlen-Assays ^5,6,7 erhält diese Methode das Grundgerüst der Endothelzellbeschichtung auf Mikroträgerperlen, Einbettung in eine dreidimensionale Matrix und Fibroblast-Überlagerungskultur, während eine Basalmembranmatrix anstelle des konventionellen Fibringels eingesetzt wird, um das Verfahren zu vereinfachen und die Routinebildgebung zu erleichtern. Die Basalmembranmatrix wurde in diesem modifizierten Protokoll aus mehreren praktischen und biologischen Gründen ausgewählt. Experimentell bietet es eine einsatzbereite dreidimensionale Matrix, die eine schnelle Gelbildung, einfache Perleneinbettung und bequeme routinemäßige mikroskopische Beobachtung ermöglicht, ohne die zusätzlichen Polymerisationsschritte, die für die Herstellung von Fibrin-Gels erforderlich sind. Biologisch enthält die Basalmembranmatrix extrazelluläre Matrixkomponenten, die die Endothelzelladhäsion, Migration, Keimungserweiterung und die Bildung von lumenartigen Strukturen unterstützen. Daher eignet sich diese Modifikation für Studien, die eine direkte Visualisierung des Endothel-Keimungsverhaltens, den Vergleich angiogener Phänotypen und die Bewertung pharmakologischer oder genetischer Interventionen in einer dreidimensionalen Kulturumgebung erfordern. Da sich die Basalmembranmatrix jedoch in Matrixzusammensetzung, mechanischen Eigenschaften, Abbaubarkeit und bioaktiven Hinweisen vom Fibringel unterscheidet, sollte der vorliegende Test als modifiziertes, auf Mikroträgerperlen basierendes Keimmodell interpretiert werden und nicht als direkter Ersatz des klassischen fibrinbasierten Tests. Diese matrixbezogenen Unterschiede können die Keimungskinetik, Lumenstabilität und Netzwerkmorphologie beeinflussen und sollten beim Vergleich der Ergebnisse verschiedener dreidimensionaler Angiogenesesysteme berücksichtigt werden. Dieses Modell eignet sich zur Beobachtung des endothelialen Sprießverhaltens in drei Dimensionen und kann weiter auf Studien zu pharmakologischen Interventionen, Genmanipulationen und angiogenen Mechanismen angewendet werden.

Protokoll

Die in diesem Protokoll verwendeten Endothelzellen der menschlichen Nabelvene wurden isoliert und aus menschlichen Nabelschnurgeweben aus der Abteilung für Geburtshilfe des First People's Hospital der Provinz Yunnan kultiviert. Vor der Probenentnahme wurde von allen Spendern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt. Alle Verfahren mit menschlich hergestellten Materialien wurden vom Medizinischen Ethikausschuss des Ersten Volkskrankenhauses der Provinz Yunnan genehmigt (Genehmigungsnummer KHLL2023-KY198). Humane orale mukosale Fibroblasten (HOMFs) wurden freundlicherweise von der Forschungsgruppe von Dr. Jiemei Zhai am angeschlossenen Stomatologischen Krankenhaus der Kunming Medical University bereitgestellt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellvorbereitung

1. Humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) im Endothelzellwachstumsmedium kultivieren, ergänzt mit zusätzlichem fetalem Rinderserum (FBS) bis zu einer Endkonzentration von 10 % bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂. Die für den Test verwendeten Zellen sollten frei von Kontaminationen sein, stabiles Wachstum zeigen und sich in der logarithmischen Wachstumsphase befinden. Verwenden Sie Zellen an den Abschnitten 4–6.
2. Humane orale Fibroblasten (HOMFs) werden in einem hochglukosereichen Basalmedium kultiviert, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂. Verwenden Sie Zellen an den Abschnitten 4–6.
3. Vor der Beschichtung der Mikroträgerperlen sollten Sie sicherstellen, dass beide Zelltypen an einer geeigneten Zusammenflussfläche liegen. Vermeiden Sie Überkonfluente Kulturen oder eine übermäßige enzymatische Verdauung, da diese das spätere Keimen nachteilig beeinflussen können.

2. Herstellung von Mikroträgerperlen

1. Hydrieren Sie 0,5 g trockene Mikroträgerperlen in 50 ml PBS für mindestens 3 Stunden. Nach dem Waschen werden die Perlen in 50 ml PBS neu suspendiert, um eine 10 mg/ml-Mikroträgerperlensuspension zu erhalten, was etwa 3 × 10⁴ Perlen/ml entspricht.
2. Übertragen Sie die Suspension in eine silikonisierte Glasflasche, sterilisieren Sie sie durch Autoklavierung bei 115 °C für 15 Minuten und lagern sie bis zur Anwendung bei 4 °C.
3. Vor der Endothelzellbeschichtung wird die Speicherlösung entnommen und die Perlen mit sterilem PBS gewaschen. Gleiche die Kugeln im Endothelzellwachstumsmedium bei 37 °C für mindestens 30 Minuten aus.
4. Lassen Sie die ausgeglichenen Perlen unmittelbar vor der Verwendung vorsichtig wieder aufhängen, um Sedimentation und Perlenaggregation zu vermeiden.
5. Vor der Zellbeschichtung untersuchen Sie einen kleinen Aliquot der Perlensuspension unter einem umgekehrten Mikroskop. Fahren Sie nur vor, wenn die Perlen vollständig hydriert, gleichmäßig schwebend und frei von sichtbaren Aggregaten oder fragmentierten Partikeln sind.

3. Beschichtung von Endothelzellen auf Mikroträger-Perlen

1. Lösen Sie HUVECs mit Trypsin ab und suspendieren Sie die Zellen im Endothelzellwachstumsmedium.
2. Schichten Sie die Mikroträger-Perlen mit einer Dichte von 1.500 Zellen pro Perle. Mischen Sie 3 × 10 6 HUVECs mit 2.000 Mikroträgerperlen in 1,5 ml Endothelzellwachstumsmedium.
3. Die Zell-Perlen-Mischung wird in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen und 12 Stunden lang in einem Zellkulturinkubator inkubiert. Während der gesamten 12-stündigen Inkubationszeit wird das Röhrchen alle 20 Minuten sanft umgekehrt, um einen ausreichenden Kontakt zwischen Zellen und Perlen zu erhalten und eine gleichmäßige Anhaftung der Endothelzellen zu fördern.
4. Nach 12 Stunden werden die beschichteten Perlen in eine 25 cm große, 2-Zell-Kulturkolbe mit 4 ml Endothelzellwachstumsmedium übertragen und über Nacht weiter inkubiert, um eine feste Anhaftung der Endothelzellen an der Mikroträgerperloberfläche zu ermöglichen.
5. Untersuchen Sie vor dem Einbetten repräsentative beschichtete Perlen unter einem umgekehrten Mikroskop. Die Matrixeinbettung wird nur durchgeführt, wenn mehr als 80 % der untersuchten Perlen eine kontinuierliche und relativ gleichmäßige Endothelzellschicht auf der Perlenoberfläche zeigen, mit minimalen frei schwebenden Zellen, ohne offensichtliche Zellklumpen und ohne starke Aggregation. Perlen mit ungleichmäßiger Beschichtung, großen Zellclustern oder umfangreicher Aggregation sollten nicht zum Einbetten verwendet werden.
6. Wenn die Perlen am Boden der Flasche haften, schütteln Sie die Flasche sanft, um sie freizugeben. Vermeiden Sie intensives Pipetieren, da dies zu Perlenaggregation oder Zellablösung führen kann.

4. Einbetten der beschichteten Perlen in eine dreidimensionale Matrix

1. Übertragen Sie die mit Endothelzellen beschichteten Mikroträgerkugeln in ein 15-mL-Zentrifugenrohr und lassen Sie die Perlen durch die Schwerkraft absinken. Entferne das überschüssige Medium und gib ein passendes Volumen frisches Medium hinzu.
2. Mischen Sie die Mikroträger-Perlensuspension mit einer vorgekühlten Basalmembranmatrix im Verhältnis 1:1 (v/v), um eine Endkonzentration von 500 Perlen/ml zu erhalten.
3. Fügen Sie 100 μL der Matrizenperlensuspension in die Mitte jedes Brunnens einer 24-Bohrloch-Platte hinzu, sodass das Gemisch einen einzelnen kuppelförmigen Geltropfen bilden kann, ohne die Wand des Bohrlochs zu berühren. Rühren Sie die Suspension unmittelbar vor dem Abgeben vorsichtig und vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen.
4. Lassen Sie die 24-Well-Platte 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die erste Gelierung und Stabilisierung des Geltropfens zu ermöglichen. Anschließend inkubieren Sie die Platte aufrecht bei 37 °C in 5 % CO₂ für 15 Minuten, gefolgt von einer weiteren 15-minütigen Inkubation in umgekehrter Position, um vollständige Gelation und ordnungsgemäße Gelbildung sicherzustellen.
5. Nachdem das Gel vollständig gefestigt ist, wird sofort mit einer Fibroblast-Überlagerungskultur begonnen.

5. Fibroblast-Überlagerungskultur

1. Suspendiere 3 × 10⁴ humane orale mukosale Fibroblasten (HOMFs) in 1 ml Endothelzellwachstumsmedium und gib die Zellsuspension vorsichtig entlang der Wand jedes Brunnens auf, sodass die Zellen sich über die Geloberfläche verteilen können, ohne die Gelkuppel direkt zu stören.
2. Die Inkubation in einem Endothelzellwachstumsmedium bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ fortsetzen. Humane orale mukosale Fibroblasten werden als Stützzellen eingesetzt, da sie stromal-abgeleitete parakrine Signale liefern, die die Extensjon, Stabilisierung des endothelialen Keims und eine vaskuläre Umgestaltung im dreidimensionalen Kultursystem fördern.

6. Kulturpflege und mikroskopische Beobachtung

1. Ersetze das Kulturmedium alle zwei Tage. Während des Mediumwechsels wird das verbrauchte Medium langsam abgesaugt und frisches Kulturmedium entlang der Wand des Bohrlochs hinzugefügt, um eine Störung des Gels zu vermeiden.
2. Beobachten Sie die Kulturen täglich oder jeden zweiten Tag unter einem umgekehrten Mikroskop im Hellfeld- oder Phasenkontrastmodus. Für die longitudinale quantitative Analyse wählen Sie an Tag 7 mehrere Sichtfelder in jedem Brunnen aus und fotografieren Sie dieselben vordefinierten Felder an den Tagen 9 und 11.
3. Unter optimalen Kulturbedingungen wird typischerweise an den Tagen 4–6 ein offensichtliches Endotheltrieb beobachtet, an den Tagen 5–7 treten lumenähnliche Strukturen auf, und nach Tag 7 bilden sich allmählich miteinander verbundene mikrovaskuläre Netzwerke.
4. Definieren Sie erfolgreiches Keimen als das Vorhandensein mehrerer endothelialer Erweiterungen, die radial von der Perlenoberfläche in die umgebende dreidimensionale Matrix hineinwachsen. Ein Sprossen sollte nur gezählt werden, wenn er deutlich über die Perlenoberfläche hinausragt und mit der perlenassoziierten Endothelzellschicht verbunden bleibt.
5. Definieren Sie die Bildung von lumenartigen Strukturen als das Auftreten von verlängerten Endothelstrukturen mit sichtbarem zentralem klarem Raum oder röhrenartiger Morphologie. Zwischen den Keimungen werden als direkte Kontakte oder kontinuierliche Strukturen definiert, die zwischen benachbarten Keimungen gebildet werden.
6. Kulturen mit umfangreichem Zelltod, starker Perlenaggregation, gestörter Gelstruktur, reichlich vorhandenen Blasen, Matrixkollaps oder nur kurzen, unregelmäßigen Zellvorsprüngen sollten als suboptimal betrachtet und von der quantitativen Analyse ausgeschlossen werden.

7. Bildaufnahme und quantitative Analyse

1. Wählen Sie an Tag 7 mehrere Sichtfelder in jedem Brunnen aus und nehmen Sie Bilder aus denselben vordefinierten Feldern an den Tagen 9 und 11 auf. Bilder sollten zu allen Zeitpunkten mit identischer Vergrößerung, Belichtungseinstellungen und Bildbedingungen aufgenommen werden.
2. Quantifizieren Sie die Anzahl der Keimungen pro Mikroträgerperle und den vaskularisierten Bereich.
   1. Für die Messung der vaskularisierten Fläche verwenden Sie Open-Source-Bildanalysesoftware. Öffnen Sie das aufgenommene Bild und markieren Sie manuell die Grenze des vaskularisierten Interessebereichs (ROI) mit dem Polygon- oder Freihandauswahlwerkzeug. Füge den ausgewählten ROI dem ROI-Manager hinzu.
   2. Für die Visualisierung verwenden Sie ein Regional-of-Interest-Visualisierungs-Plugin, um den umrissenen ROI anzuzeigen. Aktivieren Sie die Flächenmessung in den Messeinstellungen und messen Sie den gewählten ROI, um die vaskularisierte Fläche zu erhalten. Wende die gleichen Analyseeinstellungen auf alle Bilder an.
   3. Für die Analyse der angiogenen Rate verwenden Sie den vaskularisierten Bereich am Tag 7 als Ausgangspunkt und berechnen Sie die relative Veränderung der vaskularisierten Fläche an den Tagen 9 und 11.
3. Zählen Sie die Anzahl der einzelnen Keimungen unabhängig von drei Beobachtern und verwenden Sie den Durchschnittswert für die Analyse.

Ergebnisse

Angiogenese im dreidimensionalen HUVEC-Modell

In erfolgreich etablierten Kulturen sind die Endothelzellen gleichmäßig auf der Oberfläche der Mikroträgerkugeln verteilt, und es ist keine offensichtliche Aggregation der Perlen zu beobachten. Dynamische Beobachtungen zeigten an den Tagen 7, 9 und 11 eine fortschreitende Endothelsprossung und die Bildung von mikrovaskulären Netzwerken (Abbildung 1A). Quantitative Anal...

Diskussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein modifiziertes dreidimensionales Endothel-Keimungsmodell, das auf Mikroträgerkugeln basiert. Abbildung 3 gibt einen schematischen Überblick über den experimentellen Arbeitsablauf. Das Protokoll wurde aus dem klassischen Angiogenese-Test von Nakatsu und Hughes angepasst und optimiert, um die Ziele der vorliegenden Studie^zu erfüllen ^8,9. Im klassischen Sy...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Beyotime	FTUB306	Klar, nukleasenfrei
15 mL Zentrifugenröhrchen	Haier	311005	Konischer Boden, steril, in Beuteln verpackt
24-Well Zellkulturplatte	Haier	612003	Flacher Boden, gewebekulturbehandelt, einzeln verpackt, für adhäsive Zellkultur
Automatisches Zellzählungs-Objektträger	Countstar	12-0005-50	Einweg-Objektträger für automatischen Zellzähler, 50 Objektträger/Box
CO2-Zellkulturinkubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Verwendet für Zellkultur bei 37 °C mit 5% CO2
Cytodex 3 Mikrocarrier	Cytiva	17048503	Trockenpulver; kollagenbeschichtete Dextran-Mikroträger-Perlen
Gepunktete Linie-Plugin	N/A	N/A	Region-of-interest-Visualisierungs-Plugin zur Anzeige von umrissenen vaskularisierten Bereichen
Dulbecco’s Modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), hohe Glukose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM-Basis (1×), enthält 4,5 g/L D-Glukose, L-Glutamin und 110 mg/L Natriumpyruvat, 500 ml
Endothelzell-Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Endothelzellkulturmedium, ergänzt mit zusätzlichem FBS auf eine Endkonzentration von 10% vor Gebrauch
Fötales bovines Serum (FBS)	Gibco	10099141C	Qualifiziert, Einweg-Format, australischer Ursprung, 500 ml
Humane orale Mukosa-Fibroblasten (HOMFs)	Jiemei Zhai Forschungsgruppe, Das angeschlossene stomatologische Krankenhaus der Medizinischen Universität Kunming	N/A	Primäre Fibroblasten, isoliert aus menschlicher oraler Mukosa; freundlicherweise von einem anderen Labor bereitgestellt
Humane umbilikale Venen-Endothelzellen (HUVECs)	Eigenherstellung	N/A	Primäre Endothelzellen, isoliert aus menschlichen Nabelvenen; keine Katalognummer
ImageJ-Software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Open-Source-Software; Version 1.54p
Invertiertes Mikroskop	Olympus, Japan	N/A	Für Hellfeld-, Phasenkontrast- und Fluoreszenz-Bildgebung
Laser-Scanning-Konfokalmikroskop	Nikon, Japan	N/A	Für konfokale Bildgebung; Modell nicht spezifiziert
Matrigel-Basalmembranmatrix	Corning	354262	Hohe Konzentration (HC), phenolrotfrei, LDEV-frei, 10 ml
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Penicillin-Streptomycin-Lösung für Zellkultur, 100×, 100 ml
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, steril, 500 ml
T25 Zellkulturflasche	ABCBIO	ABC707008	T25, belüfteter Deckel, gewebekulturbehandelt, für adhäsive Zellkultur
Trypsin-EDTA (0,25%)	Gibco	25200-056	0,25% Trypsin-EDTA-Lösung, 100 ml