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Multimodale Bewertung der Elektroakupunkturbehandlung bei Knieosteoarthritis in Mäusen

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DOI:

10.3791/71901

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6. Oktober 2026

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1Department of Acupuncture and Moxibustion, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Science and Technology for Brain-Inspired Intelligence, Fudan University, 4Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie kombiniert Verhaltens- und Bildgebungstechniken zur multimodalen, longitudinalen Beurteilung von Mäusen mit Osteoarthritis nach Elektroakupunktur, einschließlich Knorpelfärbung und OARSI-Score (Osteoarthritis Research Society International).

Zusammenfassung

Arthrose ist eine chronische degenerative Gelenkerkrankung, die häufig das Kniegelenk betrifft und Schmerzen, Schwellungen, Steifheit und funktionelle Einschränkungen verursacht. Synovialentzündungen und Veränderungen der periartikulären Muskulatur tragen zur Entstehung und Progression der Erkrankung bei. Klinische Befunde deuten darauf hin, dass Elektroakupunktur lokale Entzündungen lindern und den Knorpelstoffwechsel modulieren kann. In dieser Studie wurde bei Mäusen eine Kniegelenksarthrose durch chirurgische Destabilisierung des medialen Meniskus induziert. Die Ergebnisse wurden mittels eines multimodalen Protokolls bewertet, das den Rotarod-Test, Ultraschall, Infrarot-Thermographie, Magnetresonanztomographie und histologische Färbungen umfasste. Das Gelenkhohlraumvolumen und die Hauttemperatur wurden longitudinal überwacht, und abschließende Magnetresonanztomographie sowie Safranin-O-Fast-Green-Färbung dienten der Beurteilung von Signalveränderungen in der periartikulären Muskulatur und der Knorpelpathologie. Die Elektroakupunktur war mit verbesserter motorischer Leistung, reduzierter Gelenkschwellung, höherer lokaler Hauttemperatur, weniger ausgeprägten Signalveränderungen der periartikulären Muskulatur in den Magnetresonanzbildern und niedrigeren Knorpeldegenerationsscores assoziiert. Diese Ergebnisse untermauern die Anwendung dieses multimodalen Protokolls zur Bewertung elektroakupunkturbedingter Effekte in einem präklinischen Mausmodell.

Einleitung

Kniegelenksarthrose (KOA) ist weltweit die häufigste osteoartikuläre Erkrankung und betrifft geschätzte 250 Millionen Menschen1. Zu ihren pathologischen Kennzeichen gehören eine fortschreitende Knorpeldegeneration und eine Synovialproliferation; klinisch manifestiert sie sich durch Schmerzen, Schwellungen und funktionelle Einschränkungen2,3.

Arthrose (OA) galt lange Zeit als nichtentzündliche Gelenkstörung, wird aber mittlerweile als Erkrankung mit entzündlicher Komponente anerkannt, wobei bei den meisten Patienten eine Synovitis nachweisbar ist. Proinflammatorische Zytokine wie Interleukin (IL)-1β und IL-18 sowie reaktive Sauerstoffspezies und biomechanischer Stress tragen vermutlich zum pathologischen Prozess bei4. Entzündungen gehen häufig mit einer erhöhten lokalen Durchblutung einher, die klinisch als Rötung, Wärme und Schwellung in Erscheinung tritt5. Neben der Beschleunigung des Knorpelabbaus und des funktionellen Leistungsabfalls könnte die Entzündung insbesondere in den frühen Krankheitsstadien besonders aktiv sein. Daher könnte die zeitliche Überwachung des entzündlichen Status Behandlungsstrategien unterstützen, die auf den zugrundeliegenden Mechanismus abzielen, und eine stadiengerechte Therapie ermöglichen6,7. Frühere Studien, in denen Ultraschalluntersuchungen (US) an Mausknien durchgeführt wurden, identifizierten einen dreieckigen Bereich zwischen den tibialen und femoralen Kondylen. Histologische Analysen bestätigten, dass dieser Bereich Weichgewebe enthält, darunter Synovialmembran, Meniskus und Fettgewebe, sowie von synovialer Flüssigkeit gefüllte Räume. Dieser ultraschallbasiert nachweisbare Bereich wird als interartikuläres Volumen definiert und umfasst die oben genannten Weichgewebeareale8.

Darüber hinaus ist die Temperatur ein entscheidender physikalischer Parameter, der den Fortschritt einer Gelenkentzündung direkt widerspiegelt. Eine erhöhte lokale Temperatur ist eines der vier Hauptmerkmale einer Entzündung, und die thermografische Bildgebung ermöglicht die präzise Erfassung und Quantifizierung dieser thermischen Veränderungen9. Ein kürzlich erschienener systematischer Review unterstrich die Korrelation zwischen der Hauttemperatur an der Oberfläche und entzündlichen sowie degenerativen Gelenkerkrankungen10 und bestätigt damit weiter die Nützlichkeit der Infrarotthermografie (IRT) in der Arthritisforschung und klinischen Versorgung11. Zudem liefert die IRT eine indirekte Messgröße, die mit der Gewebedurchblutung und metabolischen Aktivität assoziiert ist, und könnte zur Überwachung therapeutischer Ansprechen nützlich sein.

In dieser Studie kombinierten wir den Rotarod-Test, Ultraschall (US), die Infrarotthermografie (IRT) und die Magnetresonanztomographie (MRI), um die Wirkungen der Elektroakupunktur (EA) in einem Mausmodell der Arthrose (OA) zu bewerten. Dieser multimodale Ansatz ermöglichte die gleichzeitige Beurteilung der motorischen Leistung, der Gelenkmorphologie, thermischer Veränderungen und der Weichteilentzündung – Parameter, die allein aus der Histologie nicht erhältlich sind. Wichtig ist, dass das Verfahren ergänzende Informationen auf mehreren biologischen Ebenen liefert, mit minimalem zusätzlichem Aufwand oder Kosten. Daher eignet es sich besonders gut für präklinische Studien, die eine wiederholte, nichtinvasive Überwachung über die Zeit erfordern, insbesondere wenn erwartet wird, dass die untersuchte Intervention nur geringe Effekte hervorruft oder wenn der zeitliche Verlauf der Reaktion ungewiss ist. Soweit bekannt, ist dies die erste Studie, die diese spezifische Kombination von Techniken – einschließlich Gelenkhohlraumvolumen, Muskulaturinflammation und lokaler Temperatur – zur Verfolgung der therapeutischen Antwort auf Elektroakupunktur bei Arthrose einsetzt. Der hier beschriebene Protokollansatz ist praktikabel und reproduzierbar, und wir sind der Ansicht, dass er als nützliche Referenz für zukünftige longitudinale, echtzeitnahe Wirksamkeitsbewertungen in ähnlichen experimentellen Settings dienen kann.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von dem Ausschuss für Tierversuche der Wuchuang Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. geprüft und genehmigt (Ethische Genehmigungsnummer: WTPZ20260209001). Alle in dieser Studie verwendeten Tiere waren 8 Wochen alte C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von etwa 20 g, die von einem kommerziellen Zulieferer bezogen wurden (siehe Tabelle der Materialien). Die Versuche umfassten 24 Mäuse. Nach einer Eingewöhnungsphase von einer Woche wurden die Tiere zufällig auf vier experimentelle Bedingungen verteilt, wobei jeweils sechs Mäuse je Bedingung zugewiesen wurden. Diese Bedingungen umfassten eine Scheinoperation, eine Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM), eine Scheinakupunktur (SA) und eine Elektroakupunktur (EA). Die Anzahl der verwendeten Tiere wurde ohne vorherige Stichprobengrößenberechnung festgelegt; stattdessen wurde die Gruppengröße anhand früherer Elektroakupunkturstudien mit vergleichbaren Osteoarthritis-Modellen und Endpunkten sowie im Einklang mit dem 3R-Prinzip gewählt.

1. Präoperative Versorgung und Modellierung

HINWEIS: Ein erfahrener chirurgischer Techniker führte alle Modellierungsverfahren durch. Tiere erst dann wieder in ihre Käfige zurückbringen, wenn sie auf einer Heizplatte das Bewusstsein wiedererlangt haben.

  1. Die Mäuse mindestens 7 Tage lang an die Versuchsumgebung gewöhnen, bevor der Versuch beginnt.
  2. Alle chirurgischen Instrumente vor der Operation sterilisieren. Den Operationsbereich gründlich desinfizieren.
  3. Die Gasanästhesieausrüstung einschalten. Die Maus in die Induktionskammer geben und eine Vollnarkose mit 2–3 % Isofluran für 5 Minuten einleiten.
  4. Nach Abschluss der Anästhesieinduktion die Maus auf den Operationsplatz übertragen. Die Anästhesie durch kontinuierliche Zufuhr von 1–1,5 % Isofluran über eine Anästhesiemaske aufrechterhalten, bis der chirurgische Eingriff abgeschlossen ist.
  5. Die Maus in Rückenlage positionieren, wobei das Kniegelenk nach oben zeigt. Sicherstellen, dass die Position stabil ist und die Operationsstelle vollständig freigelegt ist. Mit DMM ein Modell am rechten Hinterbein erstellen12. Bei der Sham-Gruppe einen Schnitt an derselben Stelle setzen und anschließend vernähen.
    1. DMM-chirurgischer Ablauf
      1. Einen 1 cm langen longitudinalen medialen parapatellaren Schnitt setzen, um das Kniegelenk freizulegen.
      2. Durch den in Schritt 1.5.1.1 angelegten medialen parapatellaren Schnitt eine longitudinale Öffnung in der Gelenkkapsel erstellen. Mit einer Pinzette die Kapsel ausreichend vom umgebenden Gewebe lösen. Danach die distale Hinterpfote mit der linken Hand stützen, ohne übermäßigen Druck auszuüben, und mit der Pinzette die Kniescheibe und das patellare Ligament lateral verschieben, um so das Kniegelenk freizulegen. Die Pfote während des gesamten Vorgangs vorsichtig behandeln, um Verletzungen zu vermeiden.
        HINWEIS: Eine ausreichende Freilegung der Gelenkkapsel ermöglicht es, die Kniescheibe mit minimalem Kraftaufwand zu verschieben.
      3. Während des Eingriffs sterile Kochsalzlösung auf die Oberfläche des Gelenkknorpels tropfen lassen, um Austrocknung zu verhindern.
      4. Das mediale Meniskusgewebe im Raum zwischen dem medialen Femurkondylus und dem medialen Tibiakondylus lokalisieren. Von seiner lateralen Seite aus das mediale Meniskotibial-Ligament bis zu seiner Ansatzstelle an der tibialen interkondylären Eminenz verfolgen. Die Hinterpfote vorsichtig mit der Hand stabilisieren und das Ligament mit einer chirurgischen Klinge Nr. 10 durchtrennen, wobei darauf geachtet werden muss, den unterliegenden Knorpel des medialen Meniskus nicht zu verletzen. HINWEIS: Sicherstellen, dass der Gelenkknorpel und andere Bänder nicht beschädigt werden. In vielen Fällen muss das überliegende Fettgewebe zurückgeklappt, aber nicht entfernt werden, um das Ligament zu identifizieren.
      5. Die Ränder der Gelenkkapsel annähern und mit resorbierbarem Nahtmaterial der Stärke 6-0 fixieren.
      6. Die Haut mit einer 6-0-Seidennaht verschließen12.
  6. Zur postoperativen Versorgung einen Tropfen 0,25 % Bupivacain an der Operationsstelle applizieren, um eine lokale Analgesie zu gewährleisten, und die Tiere mit freiem Zugang zu Futter und Wasser versorgen.
    HINWEIS: Während der Anästhesie die Sauerstoffflussrate im Bereich von 0,5–1 NL/min aufrechterhalten. Der erfolgreiche Eintritt der Anästhesie wurde durch den Verlust des Aufrechtesreflexes, das Fehlen von Wegzugsreaktionen auf Zehenquetschung sowie eine stabile, regelmäßige Atmung bestätigt. Während der Operation sterile, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) als Spüllösung verwenden, um die Hydratation des Knorpels aufrechtzuerhalten. Die genauen Größen und Spezifikationen des resorbierbaren Nahtmaterials für den Verschluss der Gelenkkapsel sowie der Seidennaht für den Hautverschluss sind in der Tabelle der Materialien angegeben.

2. Elektroakupunkturbehandlung

HINWEIS: Die Interventionen in den SA- und EA-Gruppen begannen eine Woche nach der Modellerstellung (Abbildung 1A). Beide Gruppen erhielten alle zwei Tage, dreimal pro Woche, über einen Zeitraum von 4 Wochen jeweils 15 Minuten lang eine Behandlung. Die Sham- und DMM-Gruppen unterzogen sich zum gleichen Zeitplan denselben Anästhesie- und Immobilisierungsverfahren, ohne Akupunktur oder elektrische Stimulation. Alle Versuchspersonen erhielten vor dem Experiment eine Schulung, um Konsistenz bei der Auswahl der Akupunkturpunkte, dem Einstichwinkel und der Eindringtiefe sicherzustellen.

  1. Legen Sie die Mäuse in die Induktionskammer und nehmen Sie sie nach der Anästhesieinduktion mit Isofluran heraus.
  2. Halten Sie die Mäuse während der gesamten Elektroakupunktur-Sitzung in Rückenlage unter kontinuierlicher Inhalationsanästhesie mit Isofluran (1,5–2,0 % in 100 % O₂), um einen ruhigen und stabilen Zustand sicherzustellen.
  3. Bestimmen Sie die Akupunkturpunkte an den Mäusen genau. Führen Sie zwei sterile Einwegnadeln (0,16 mm × 25 mm) in die Akupunkturpunkte ST36 (Zusanli) und SP10 (Xuehai) an den Hintergliedmaßen bis zu einer Tiefe von 5 mm unter die Haut ein13 (Abbildung 1B).
    ​HINWEIS: ST36 liegt 1 mm lateral zum vorderen Tuberkel der Tibia, 3 mm unterhalb des Fibulakopfs und direkt unterhalb des Kniegelenks. SP10 befindet sich an der medialen Oberschenkelregion, 3 mm oberhalb des superomedialen Patellarands am medialen Vorsprung des Quadrizepsmuskels, wenn das Knie gebeugt ist.
    1. Bei der SA-Gruppe werden die Nadeln oberflächlich, bis zu einer Tiefe von etwa 1 mm, in benachbarte Nicht-Akupunkturpunkte statt in ST36 oder SP10 eingeführt und mit dem EA-Gerät verbunden, ohne dass ein Stromfluss erfolgt14.
      HINWEIS: Die SA-Gruppe unterscheidet sich somit von der EA-Gruppe hinsichtlich der Nadelplatzierung, der Eindringtiefe und dem Fehlen elektrischer Stimulation, ist aber hinsichtlich aller anderen prozeduralen Parameter vergleichbar. Im Vergleich zur DMM-Gruppe erhält die SA-Gruppe eine oberflächliche Nadelung an Nicht-Akupunkturpunkten sowie eine Geräteverbindung ohne Strom, während die DMM-Gruppe lediglich Anästhesie und Immobilisierung erhält.
  4. Verbinden Sie die Nadeln mit dem elektronischen Akupunkturgerät und geben Sie eine Stimulation mit 2/100 Hz und 2 mA ab, um leichte Muskelzuckungen hervorzurufen. Beginnen Sie die EA-Stimulation 7 Tage nach der Modellierung dreimal wöchentlich für jeweils 15 Minuten und setzen Sie dies über einen Zeitraum von 4 Wochen fort.
  5. Platzieren Sie die Maus nach der Behandlung auf einer Heizplatte und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück, sobald sie das Bewusstsein wiedererlangt hat.

3. Dynamische Bewertung der Wirksamkeit von EA

HINWEIS: Alle Bewertungen (Rotarod-Test, US, IRT, MRT und OARSI-Score) wurden von Untersuchern durchgeführt, die bezüglich der Gruppenzuordnung verblindet waren, wobei die Gruppenidentitäten erst nach Abschluss aller Datenanalysen offengelegt wurden. Die Bildaufnahme und Datenanalyse wurden von verschiedenen Personen vorgenommen, und die histologische Auswertung wurde unabhängig voneinander von zwei Pathologen durchgeführt, die bezüglich der Behandlungsgruppen verblindet waren. Keiner der Beurteiler war an der Tierzuordnung oder an der Elektroakupunktur-Intervention beteiligt.

  1. Rotarod-Ermüdungstest
    1. Prätrainieren Sie die Mäuse, um sie mit der Versuchsapparatur vor den eigentlichen Tests vertraut zu machen.
    2. Während des formalen Tests wird jede Maus einzeln auf das Rotarod platziert, das sich mit einer Geschwindigkeit von 4 Umdrehungen pro Minute beschleunigt, bis die Maus herunterfällt.
    3. Notieren Sie unverzüglich die Dauer, die jede Maus auf der Stange verbleibt. Legen Sie zwischen den Versuchen für jede Maus eine Pause von 30 Minuten ein und berechnen Sie den Mittelwert aus drei Wiederholungen.
      HINWEIS: Verwenden Sie den Rotarod-Test zur Beurteilung der motorischen Koordination vor der Erstellung des OA-Modells und nach Abschluss der EA-Behandlung. Um postoperative Schmerzen zu minimieren, reduzieren Sie die Erhebung der Rotarod-Daten in der ersten Woche nach der Operation.
  2. Untersuchung der Ultraschalluntersuchung an Kleintieren
    ​HINWEIS: Das schrittweise Verfahren zur Ultraschallbildgebung und zur Abgrenzung der Gelenkhöhle ist dargestellt in Abbildung 2.
    1. Bevor die eigentliche Datenaufnahme beginnt, wird die Maus in eine Anästhesiekammer gebracht, bis sie ihre motorische Funktion verliert, und anschließend wird mit einer Enthaarungscreme das Fell vom rechten Kniegelenk entfernt. Beim Entfernen des Fells der Maus sollte so schonend wie möglich vorgegangen werden; zur Minimierung von Reizungen wird sie vorsichtig mit warmem Wasser abgewischt.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Verblindung während der Analyse, indem Sie nur Tiercodes und Zeitpunkte anzeigen, bis alle Volumenmessungen abgeschlossen sind und die Gruppenzugehörigkeit für die statistische Analyse offengelegt wird.
    2. Schalten Sie das Ultraschallsystem ein, installieren Sie den Ultraschallwandler für Kleintiere und richten Sie das entsprechende Untersuchungsprotokoll für Mäuse ein. Gleichzeitig wird die Maus in einen Behälter für kontinuierliche Anästhesie gebracht.
    3. Sobald die Anästhesie abgeschlossen ist, überführen Sie die Maus auf die Kontrollplattform und verabreichen Sie die Inhalationsanästhesie mit Isofluran über eine Nasenmaske. Positionieren Sie die Maus so, dass ihr Kopf vom Bediener weg und ihr Schwanz zum Bediener hin gerichtet ist.
    4. Beugen Sie das Kniegelenk, fixieren Sie die Maus und tragen Sie das Ultraschall-Kopplungsmittel auf die Haut über das patellare Ligament auf.
    5. Stellen Sie die Sonde ein und positionieren Sie sie parallel zum Kniegelenk.
    6. Setzen Sie Abtastabstand zu 4 mm und das Schrittweite zu 0,04 mm. Lokalisieren Sie die Gelenkhöhle auf dem Bild anhand ihrer anatomischen Position. Bewegen Sie das Tier während des Probenscans nicht.
    7. Bilder aufnehmen. Den Gelenkspalt identifizieren: ein dreieckförmiger Bereich mit deutlichen Grenzen zwischen Femur, Tibia sowie der daraufliegenden Haut und Muskulatur.
    8. Benennen und speichern Sie die Scan-Ergebnisse, und exportieren Sie sie anschließend auf den Analysecomputer, wobei die ursprüngliche Ordnerstruktur beibehalten wird.
    9. Analysieren Sie das Volumen der Kniegelenkhöhle mithilfe einer Software. Geben Sie die Studie Modul und klicken Sie auf die Import Funktion.
    10. Durchsuchen und auswählen des Datenordners, Überprüfen der zu importierenden Datendateien und Doppelklick zum Öffnen.
    11. In Anzeige Modus, auswählen Bildverarbeitung | In 3D laden | Querschnittsansicht | Volumenmessung | Start nacheinander
    12. Verwenden Sie das Mausrad oder den Schieberegler für die Schnitte, um von proximal nach distal durch die Schnitte zu blättern, und suchen Sie den Schnitt, in dem die Gelenkhöhle erstmals erscheint (typischerweise als dreieckige Region mit klaren Grenzen zwischen Femur, Tibia sowie darüberliegendem Haut- und Muskelgewebe).
    13. Beginnen Sie mit der Konturverfolgung an der Schnittebene, an der der Gelenkspalt erstmals erscheint. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Kontur zu zeichnen.
    14. Verfolgen Sie punktweise den Rand der Gelenkhöhle, um eine geschlossene Kontur zu zeichnen, bis die Gelenkhöhle vollständig verschwunden ist.
    15. Klicken Sie Fertigstellen; das System erzeugt ein 3D-segmentiertes Volumen und gibt die Ergebnisse der Volumenmessung aus.
    16. Wählen Sie den gewünschten Dateityp aus, um das Bild als TIFF-Format-Bilddatei (.tif) zu exportieren.
  3. Infrarot-Thermographie an Kleintieren
    ​HINWEIS: Die Messungen wurden 1 Tag vor der Operation, 7 Tage nach der Operation und am Ende der Behandlung bei Mäusen mit OA durchgeführt. Führen Sie die IRT 6 h nach der Behandlung in einem temperaturgeregelten Raum (22–24 °C), wobei die Mäuse vor der Bildgebung 30 min akklimatisiert wurden.
    1. Legen Sie das Tier in Rückenlage mit ausgestreckten Hintergliedmaßen auf die Unterlage und befestigen Sie alle Gliedmaßen mit Klebeband, um eine gleichmäßige Exposition des Knies zu gewährleisten. Stellen Sie die Maus in eine Narkosekammer und führen Sie kontinuierlich Isofluran zu, bis eine vollständige Anästhesie eingetreten ist.
    2. Fixieren Sie die anästhetisierte Maus in Rückenlage auf dem Operationstisch und halten Sie eine konstante Umgebungstemperatur aufrecht.
    3. Fassen Sie das Hinterbein der Maus vorsichtig an, um das rechte Kniegelenk zu strecken, und erfassen Sie anschließend mit einem Infrarot-Wärmebildgerät Bilder und messen Sie die Temperaturen in diesem Bereich.
    4. Verwenden Sie die standardmäßige Hautemissivität (0,98). Nehmen Sie die Bilder 3 min nach tiefer Anästhesie auf. Definieren Sie den Knie-Bereich von Interesse (ROI) als die mediale Gelenklinie an der femorotibialen Gelenkstelle und den Knöchel-ROI als die dorsale Fläche des tibiotalaren Gelenks. Begrenzen Sie alle ROIs manuell durch einen einzigen geschulten Bearbeiter basierend auf diesen anatomischen Markern.
    5. Analysieren Sie die Bilder mithilfe der mitgelieferten Software des Geräts, um Temperaturdaten aus dem Kniegelenk und der umgebenden Haut abzulesen, und setzen Sie Messkontrollpunkte an den Gelenken von Knöchel und Knie, an denen die Temperaturgradienten abnehmen.
  4. MRT an Kleintieren
    ​HINWEIS: Nach der EA-Behandlung wurde eine MRT an Kleintieren verwendet, um die lokale Entzündung in den Kniegelenken der Mäuse in jeder Gruppe zu beurteilen.
    1. Stellen Sie die Maus zur Anästhesie in eine Anästhesiekammer. Sobald die motorische Funktion verloren ist, tragen Sie Haarentfernungscreme auf beide Kniegelenke auf.
    2. Nach 1 Minute die Enthaarungscreme mit einem mit warmem Wasser angefeuchteten Mulltuch abwischen, um die Enthaarung an beiden Kniegelenken abzuschließen.
      ​HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass möglichst viel Fell des Mäuses entfernt wird, und führen Sie die Gewinnung unter Anästhesie durch.
    3. Richten Sie das geeignete Protokoll unter Verwendung einer für Mäuse geeigneten Gantry ein.
      1. Stellen Sie sicher, dass das Positionierungsgerät eine dreiebenen-schnelle Gradientenecho-Sequenz verwendet (TR/TE = 50/3 ms, Bildfeld (FOV) = 30 × 30 mm, Schichtdicke 1 mm), um das Kniegelenk im Bild zu zentrieren; verwenden Sie eine T2-gewichtete schnelle Spin-Echo-Sequenz (T2-WI), um das Kniegelenk der Maus zu scannen.
      2. Verwenden Sie die folgenden Scanparameter: Wiederholungszeit (TR) von 2.500 ms, Echotime (TE) von 8 ms, Gesichtsfeld (FOV) von 20 × 20 mm, Matrix von 256 × 256, Schichtdicke von 0,5 mm, keine Zwischenraum zwischen den Schichten und 10 aufeinanderfolgende Schichten, die den Bereich vom Femurkondylus bis zum Tibiakondyl abdecken; die Dauer einer einzelnen Aufnahme beträgt etwa 8 Minuten und 20 Sekunden.
      3. Untersuchen die erhaltenen T2-gewichteten Bilder, um morphologische Veränderungen im Knorpel, Synovium, Gelenkhohlraum und umgebenden Weichteilen des Knies zu beobachten, und evaluieren Gelenkerguss, synoviale Verdickung und lokale Entzündung.
    4. Stellen Sie die Maus auf die Gantry, induzieren Sie eine Inhalationsanästhesie mit Isofluran über eine Maske und fixieren Sie die Gliedmaßen mit medizinischem Klebeband, um eine gleichmäßige Aufwärtspositionierung der Knie zu gewährleisten.
    5. Schieben Sie die Gantry in den MRT-Scanner zur Bildgebung.
      1. Auf dem Dreiebenen-Localizer überprüfen, ob der Kniegelenkspalt parallel zur koronalen Ebene liegt, das Slab-Zentrum mit dem Gelenkspalt übereinstimmt und Darmanteile oder Luftansammlungen aus dem Messfeld ausgeschlossen sind, um Suszeptibilitätsartefakte zu vermeiden; falls die Positionierung nicht korrekt ist, erneut localisieren und neu scannen.
    6. Exportieren Sie die erfassten Multi-Echo-T2-gewichteten Bilder im DICOM- oder NIfTI-Format zur qualitativen Beurteilung.
    7. Bewerten Sie die MR-Bilder, indem Sie die Signalintensität und Verteilung hyperintenser Bereiche im Kniegelenk und in den periartikulären Weichteilen visuell untersuchen, und vergleichen Sie die entzündlichen Signale zwischen den Gruppen anhand dieser exportierten Bilder.

4. Pathologische und morphologische Beobachtungen

  1. Fixierung und Schnitt von Mausknien
    1. Fixieren Sie beide Knieproben von Mäusen 48 Stunden lang in 10 % Paraformaldehyd. Danach spülen Sie die Proben 30 Minuten lang in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und waschen sie ab.
    2. Nach dem Abtupfen überschüssiger Feuchtigkeit überführen Sie die Proben unverzüglich in frisch zubereitete Entkalkungslösung (pH 7,2–7,4) und wechseln die Lösung alle 3 Tage;
    3. Führen Sie die Entkalkung 2 Wochen lang fort, spülen Sie die Proben unter fließendem Wasser ab und tauchen Sie sie anschließend 2 Stunden lang in 75 %igen Ethanol ein.
    4. Führen Sie eine automatisierte Gradienten-Dehydrierung in einem Gewebeprozessor über 18 Stunden durch.
    5. Nach der Dehydrierung tauchen Sie die Probe 2 Stunden lang in vorgewärmtes Paraffinwachs in einer Paraffineinbettungsmaschine ein und führen anschließend die Einbettung durch;
    6. Bei der sagittalen Einbettung des Kniegelenks positionieren Sie die mediale Gelenkfläche nach unten, sodass diese Fläche zuerst geschnitten wird.
    7. Befestigen Sie den Gewebeklotz am Mikrotom und führen Sie kontinuierliche Schnitte mit einer Dicke von 4 µm durch. Sobald die Mitte der Meniskusseparation erreicht ist, sammeln Sie 21 aufeinanderfolgende Schnitte.
    8. Entfalten Sie die Schnitte auf einem Schnittentfalter. Trennen Sie die Proben mit einer Pinzette an der Wasseroberfläche und heben Sie sie mit Deckgläsern ab, wobei Sie zwei Proben pro Deckglas sammeln;
    9. Legen Sie die Objektträger flach in einen Trockner für mindestens 1 Stunde, um eine vollständige Verdunstung der Feuchtigkeit sicherzustellen. Legen Sie die Objektträger in eine Probenschachtel und entparaffinieren Sie sie 8 Stunden lang im Ofen bei 60 °C. Bewahren Sie sie für die spätere Verwendung auf.
      ​HINWEIS: Alle Paraformaldehyd-Fixiermittel, Entkalkungslösungen und Ethanol-Waschungen müssen als gefährlicher Abfall gesammelt und gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgt werden.
  2. Safranin-O-Fast-Green-Färbung
    1. Legen Sie ungefärbte Schnitte auf einen Färbergestell und erhitzen Sie sie 5 Minuten lang im Ofen. Bereiten Sie währenddessen die Färbelösung in einem Abzug vor.
    2. Lassen Sie die Schnitte auf Raumtemperatur zurückkehren und entparaffinieren Sie sie routinemäßig bis ins Wasser.
    3. Überführen Sie die Schnitte in eine feuchte Kammer und färben Sie sie 5 Minuten lang mit frischer Weigert-Lösung (Teil A + Teil B).
    4. Spülen Sie mit Wasser 3 × 1 Sekunde lang.
    5. Differenzieren Sie mit 1 %iger Salzsäure in Ethanol 15 Sekunden lang, danach spülen Sie 10 Minuten lang mit destilliertem Wasser.
    6. Färben Sie mit Fast-Green-Lösung 4 Minuten und 55 Sekunden lang.
    7. Waschen Sie die Schnitte kurz mit 1 %iger Essigsäurelösung 10–15 Sekunden lang, um überschüssiges Fast Green zu entfernen, und lassen Sie sie anschließend an der Luft trocknen.
    8. Tauchen Sie in Safranin O-Farbstoff 4 Minuten und 35 Sekunden lang ein.
    9. Dehydrieren Sie die Schnitte schnell mit 95 %igem Ethanol 3–5 Sekunden lang, gefolgt von zwei Spülgängen mit absolutem Ethanol je 1 Minute.
    10. Entfetten Sie mit Xylol, decken Sie mit neutralem Harz ab und stellen Sie im Abzug 4 Stunden lang zur Verdunstung des Xylols.
    11. Überprüfen und scannen Sie den Schnitt mit einem Ganzschnitt-Scanner.
      HINWEIS: Xylol, Säurealkohol, Essigsäure, Paraformaldehyd und die in dieser Studie verwendeten Färbelösungen, einschließlich Weigert-Lösung, Fast Green und Safranin O, sind gefährliche Stoffe. Alle Arbeiten müssen im Abzug unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille, durchgeführt werden. Gefährlicher Abfall, einschließlich verwendeter Reagenzien und Waschungen, muss getrennt werden, wobei Xylolabfall getrennt von wässrigem Abfall gesammelt, in dafür vorgesehenen Behältern aufbewahrt und gemäß den institutionellen Vorschriften entsorgt werden muss.

5. Statistische Analyse

  1. Geben Sie kontinuierliche Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) an, sofern nicht anders angegeben; OARSI-Scores werden als Median (P25, P75) angegeben.
  2. Für Ergebnisse, die als Mittelwert ± SD berichtet werden, führen Sie Vergleiche zwischen mehreren Gruppen mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) durch, gefolgt von Tukey-Post-hoc-Tests. Die OARSI-Scores wurden mittels des Kruskal-Wallis-Tests analysiert, gefolgt von post hoc-Tests mit dem einseitigen Mann-Whitney-Test für paarweise Vergleiche zwischen den beiden Gruppen15.
  3. Werte von P < 0,05 werden als statistisch signifikant angesehen ("ns" weist auf keinen signifikanten Unterschied hin).

Ergebnisse

Der Rotarod-Test zeigte eine längere Fall-Latenz in der EA-Gruppe im Vergleich zur DMM-Gruppe (P < 0,05), während die SA-Gruppe sich nicht signifikant von der DMM-Gruppe unterschied (Abbildung 1C und Tabelle 1). Vor der Modellierung zeigten longitudinale Ultraschalluntersuchungen des Kniegelenks (Abstand der Scans: 4 mm; Schrittweite: 0,04 mm) keine signifikanten Unterschiede im Gelenkhöhlenvolumen zwischen den Gruppen (Abbildung 3A,B und Tabelle 2). Eine Woche nach der Modellierung zeigte die dreidimensionale Rekonstruktion ein signifikant größeres Gelenkhöhlenvolumen in den DMM-, SA- und EA-Gruppen im Vergleich zur Sham-Gruppe (P < 0,05), ohne signifikante Unterschiede zwischen den DMM-, SA- und EA-Gruppen (P > 0,05) (Abbildung 3A,C). Nach vierwöchiger EA-Behandlung war das Gelenkhöhlenvolumen in der EA-Gruppe signifikant niedriger als in der DMM-Gruppe (P < 0,05) (Abbildung 3A,D), was einer verminderten Schwellung der Gelenkhöhle entspricht.

Die IRT ist eine Technik zur Erfassung von Temperaturinformationen in der Fokalebene innerhalb eines Sichtfeldes und zur Darstellung von Oberflächentemperaturverteilungen im Pseudofarbenformat16. Vor der Modellierung oder eine Woche danach zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Hautoberflächentemperatur zwischen den Gruppen (Abbildung 4A-C und Tabelle 3). Nach der EA-Behandlung war die Hautoberflächentemperatur in der DMM-Gruppe jedoch signifikant niedriger als in der Sham-Gruppe. Im Gegensatz dazu war die Hautoberflächentemperatur in der EA-Gruppe signifikant höher als in der DMM-Gruppe (Abbildung 4A,D), was zeigt, dass die EA-Behandlung mit einer höheren lokalen Hautoberflächentemperatur verbunden war als DMM, während SA dies nicht war.

MRT-Bilder zeigten im Sham-Gruppe keine sichtbaren periartikulären Muskel-Signalveränderungen, stärkere Signalveränderungen in der DMM-Gruppe, weniger ausgeprägte Veränderungen in der EA-Gruppe und ähnliche Veränderungen in der SA- und DMM-Gruppe (Abbildung 5A). Nach der EA-Behandlung wurden die rechten Kniegelenke entnommen, in Paraffin eingebettet und sagittal in 4 µm dicken Schnitten geschnitten. Die Schnitte wurden mit Safranin O-Fast Green gefärbt und mit dem OARSI-histopathologischen System bewertet. Im Vergleich zur Sham-Gruppe zeigte die DMM-Gruppe stärkeren Knorpelverschleiß des Gelenkknorpels und einen höheren OARSI-Score. Die EA-Gruppe wies weniger Knorpeldegeneration und einen niedrigeren OARSI-Score im Vergleich zur DMM-Gruppe auf (P < 0.05), während die SA-Gruppe sich nicht signifikant von der DMM-Gruppe unterschied (Abbildung 5B,C und Tabelle 4).

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Abbildung 1: Experimenteller Zeitplan, Akupunkturpunkt-Diagramm und Rotarod-Test bei Mäusen mit OA. (A) Experimenteller Zeitplan. (B) Diagramm der Akupunkturpunkte. (C) Rotarod-Test. n = 6 pro Gruppe. Jede Maus absolvierte drei Versuche. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. ### Sham vs. DMM, P < 0,001; ns, SA vs. DMM, P > 0,05; ** EA vs. DMM, P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Schrittweise Ultraschalluntersuchung. (A) Platzieren Sie die Maus in einer Induktionskammer zur Anästhesie. (B) Tragen Sie Enthaarungscreme auf das Hinterbein auf. (C) Nach gleichmäßiger Auftragung der Creme 1 Minute warten. (D) Überschüssige Enthaarungscreme und Haare mit Mull entfernen. (E) Untersuchen Sie das enthaarte Hinterbein. (F) Bevor die Bildaufnahme beginnt, bringen Sie die Maus zur erneuten Anästhesie in die Induktionskammer zurück. (G) Tragen Sie ein Ultraschall-Kopplungsmittel auf das Hinterbein auf und drehen Sie den Schallkopf, bis er parallel zur Längsachse des Hinterbeins liegt. (H) Nehmen Sie Ultraschallbilder auf. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-3
Abbildung 3: Repräsentative Bilder und quantitative Ergebnisse aus Ultraschalluntersuchungen an Kleintieren bei Mäusen mit OA. (A) Dreidimensionale Ultraschallrekonstruktionen des Kniegelenks vor der Operation, eine Woche nach der Operation und nach EA-Behandlung (Scanabstand, 4 mm; Schrittweite, 0,04 mm). Maßstabsbalken = 2 mm. (B) Präoperative Gelenkhöhlenvolumina (n = 6 pro Gruppe). (C) Gelenkhöhlenvolumen eine Woche nach der Operation (n = 6 pro Gruppe). (D) Gelenkhöhlenvolumen nach EA-Intervention (n = 6 pro Gruppe). ### Sham vs DMM, P < 0,001; ns, SA vs DMM, P > 0,05; *** EA vs DMM, P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-4
Abbildung 4: Repräsentative Infrarot-Thermogramme und quantitative Ergebnisse der Hauttemperatur bei Mäusen mit Arthrose (OA). (A) Thermogramme der unteren Extremität vor der Operation, eine Woche nach der Operation und nach der EA-Behandlung. Jedes Thermogramm wurde mit dem automatischen Temperaturbereich der Infrarotkamera-Software dargestellt; daher sind die Farben zwischen den einzelnen Darstellungen nicht direkt vergleichbar. Quantitative Vergleiche sollten auf den Streudiagrammen in den Panels B–D basieren. (B–D)  Quantitative Analyse der Hauttemperatur in der interessierenden Region (ROI) am Kniegelenk, definiert als die mediale Gelenklinie am Femorotibiagelenk. (B) Hauttemperatur der unteren Extremität vor der Operation (n = 6 pro Gruppe). (C) Hauttemperatur der unteren Extremität eine Woche nach der Operation (n = 6 pro Gruppe). (D) Hauttemperatur der unteren Extremität nach der EA-Intervention (n = 6 pro Gruppe). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. ### Sham vs DMM, P < 0,001; ns, SA vs DMM, P > 0,05; ** EA vs DMM, P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Repräsentative MRT-Bilder von periartikulären Muskel-signalveränderungen, histologische Schnitte des Kniegelenks und quantitative Ergebnisse bei Mäusen mit Arthrose (OA). (A) Repräsentative MRT-Bilder jeder Gruppe. (B) Repräsentative Safranin-O-Fast-Green-gefärbte Knie-Schnitte. Maßstabsbalken = 1 mm. (C) OARSI-Knorpelpathologie-Scores (n = 6 pro Gruppe). Die OARSI-Scores sind als Median (P25, P75) angegeben. ### Sham vs. DMM, P < 0,001; ns, SA vs. DMM, P > 0,05; ** EA vs. DMM, P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

GruppeNWoche 5
Scham6101,300 ± 5,416
DMM670,280 ± 3,363###
SA670,060 ± 7,796
EA684,390 ± 9,504**
Hinweis: ### Scham vs. DMM, P < 0,001; ** EA vs. DMM, P < 0,01.

Tabelle 1: Rotarod-Test (Mittelwert ± SD; n = 6 pro Gruppe). ### Sham vs. DMM, P < 0,001; ** EA vs. DMM, P < 0,01.

GruppeNWoche 0Woche 1Woche 5
Scheinoperation62,029 ± 0,0552,056 ± 0,0712,061 ± 0,079
DMM62,058 ± 0,0682,591 ± 0,056###2,926 ± 0,088###
SA62,056 ± 0,0452,592 ± 0,0762,915 ± 0,112
EA62,032 ± 0,0592,548 ± 0,0742,177 ± 0,110***
Hinweis: ### Scheinoperation im Vergleich zu DMM, P < 0,001; *** EA im Vergleich zu DMM, P < 0,001.

Tabelle 2: Volumen der Gelenkhöhle (Mittelwert ± SD; n = 6 pro Gruppe). ### Sham im Vergleich zu DMM, P < 0,001; *** EA im Vergleich zu DMM, P < 0,001.

GruppeNWoche 0Woche 1Woche 5
Scheinoperation635,517 ± 1,36635,717 ± 0,54635,650 ± 0,701
DMM635,783 ± 1,29235,033 ± 0,78132,967 ± 1,223###
SA635,583 ± 1,78035,283 ± 0,86133,267 ± 0,501
EA635,500 ± 1,51035,417 ± 0,88234,533 ± 0,929**
Hinweis: ### Scheinoperation im Vergleich zu DMM, P < 0,001; ** EA im Vergleich zu DMM, P < 0,01.

Tabelle 3: Hauttemperatur (Mittelwert ± SD; n = 6 pro Gruppe). ### Sham vs. DMM, P < 0,001; ** EA vs. DMM, P < 0,01.

GruppeNWoche 5Median
Scheinoperation60,000 (0,000; 0,250)0
DMM64,000 (3,000; 4,250)###4
SA64,000 (3,000; 4,250)4
EA62,500 (1,750; 3,000)**2,5
Hinweis: ### Scheinoperation im Vergleich zu DMM, P < 0,001; ** EA im Vergleich zu DMM, P < 0,01.

Tabelle 4: OARSI-Score [Median (P25, P75); n = 6 pro Gruppe]. ### Sham im Vergleich zu DMM, P < 0,001; ** EA im Vergleich zu DMM, P < 0,01.

Diskussion

Kniegelenksarthrose (KOA) ist eine fortschreitende degenerative Erkrankung, und aktuelle therapeutische Maßnahmen zeigen nur eine begrenzte Wirksamkeit bei der Hemmung ihres zugrundeliegenden Fortschreitens17. Beeinträchtigte Muskel­funktion und verminderte körperliche Leistungsfähigkeit sind klinisch signifikante Prädiktoren der Symptom­schwere. Daher ist das gezielte Management beeinflussbarer Risikofaktoren entscheidend, um das Fortschreiten der KOA zu verzögern18. Mithilfe eines multimodalen Evaluierungssystems zeigte diese Studie, dass EA mit verbesserter motorischer Leistung, reduziertem Gelenkhohlraumvolumen, höherer lokaler Hauttemperatur, weniger ausgeprägten MRT-Signalveränderungen in den periartikulären Muskeln und niedrigeren OARSI-Scores bei Mäusen mit Arthrose assoziiert war.

Die IRT-Ergebnisse unterstützen diese integrierte Sichtweise weiter. Eine Woche nach der Operation unterschieden sich die Hauttemperaturen zwischen den Gruppen nicht, einschließlich der Sham-Gruppe, was wahrscheinlich auf eine einheitliche Reaktion auf das chirurgische Trauma zurückzuführen ist, gekennzeichnet durch vorübergehende Vasokonstriktion und oberflächliches Ödem, die die Wärmeabstrahlung von der Hautoberfläche vorübergehend verringerten. Im Gegensatz dazu deutet die signifikante thermische Divergenz nach der Behandlung darauf hin, dass die antiinflammatorischen und mikrozirkulatorischen Wirkungen der EA kumulativ und nicht unmittelbar sind und sich erst nach wiederholten Sitzungen bemerkbar machen. Diese Outcome-Parameter könnten miteinander verknüpft sein. Eine Schwellung des Gelenkspalts spiegelt in der Regel das Ausmaß der Synovialentzündung und -ergüsse wider, während der lokale mikrozirkulatorische Zustand eng mit Veränderungen der vaskulären Permeabilität während der Entzündung verbunden ist19. In unseren Experimenten ging die Verringerung des Gelenkvolumens nach Gabe von EA mit einer Erhöhung der lokalen Temperatur einher. Obwohl die IRT keinen direkten Blutfluss misst, legen die gleichzeitigen Veränderungen nahe, dass eine verbesserte lokale Durchblutung die Clearance entzündungsfördernder Mediatoren unterstützen könnte, wodurch die entzündliche Infiltration in der Synovialmembran und den umgebenden Muskeln reduziert wird. Die anschließende Verbesserung der motorischen Funktion könnte aus der Kombination der verringerten Schwellung und abgeschwächten Entzündung resultieren. Insgesamt scheinen die beobachteten Veränderungen über diese Parameter hinweg miteinander verbundene Reaktionen und keine isolierten Ereignisse zu sein. Dieses Muster legt nahe, dass EA möglicherweise mehrere pathologische Prozesse integriert moduliert, anstatt über einen einzelnen Wirkmechanismus zu wirken20.

Im Vergleich zu herkömmlichen Endpunkt-Methoden der histologischen Beurteilung bietet das in dieser Studie verwendete multimodale dynamische Überwachungssystem deutliche praktische Vorteile. Die Ultraschalluntersuchung an Kleintieren ermöglicht eine nichtinvasive, longitudinale Verlaufsbeobachtung von Gelenkergüssen ohne Strahlenbelastung und umgeht so die zwischen einzelnen Tieren bestehende Variabilität, die bei der Gewinnung von Endpunkt-Gewebeproben unvermeidlich ist21. Die MRT an Kleintieren ergänzt den Ultraschall, indem sie eine detaillierte Darstellung von Signalveränderungen in den umgebenden Gelenkmuskeln ermöglicht. Dadurch wird eine qualitative Beurteilung von Muskelentzündungen ermöglicht, die allein mittels Ultraschall möglicherweise nicht vollständig erfasst werden könnte. In Kombination mit der Infrarthermografie (IRT) zur Echtzeit-Messung der lokalen Hauttemperatur liefert dieser Ansatz einen indirekten Hinweis auf die Rückbildung der Entzündung. Die Verfügbarkeit dieser bildgebenden Verfahren macht wiederholte Messungen während des gesamten Behandlungsverlaufs praktikabel. Über die Einhaltung der 3R-Prinzipien hinaus erlaubt dieses longitudinale Design wiederholte Beobachtungen an denselben Tieren, wodurch der Einfluss individueller Unterschiede minimiert wird. Soweit bekannt, hat bisher keine tierexperimentelle Studie zur Bewertung der Akupunktur bei Arthrose Ultraschall, MRT, Thermografie, Verhaltensanalysen und Histopathologie in einem einzigen experimentellen Ansatz kombiniert. Dieser mehrstufige Ansatz liefert ergänzende Daten aus funktionellen, morphologischen und histologischen Bereichen und ermöglicht dadurch eine umfassendere Beurteilung, als es ein einzelner Endpunkt je leisten könnte.

Mehrere Einschränkungen sollten berücksichtigt werden. Erstens basiert diese Arbeit auf Beobachtungsdaten aus Tierversuchen und weist einen Mangel an mechanistischen Belegen aus In-vitro-Studien auf. Es ist weiterhin unklar, ob die EA den Signalweg über die NOD-ähnliche Rezeptorfamilie mit Pyrin-Domäne 3 (NLRP3)/Caspase-1/IL-1β aktiviert. IL-1β und IL-18 sind zentrale Mediatoren der synovialen und muskulären Entzündung, und ihre Reifung erfordert die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms22. Außerdem können wir nicht bestimmen, ob die beobachteten Verbesserungen der Durchblutung mit Veränderungen in der Expression von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) oder endothelialer Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) korrelieren23. Zweitens verwendeten wir einen einzelnen EA-Parameter (2/100 Hz) an zwei Akupunkturpunkten (ST36 und SP10). Ob unterschiedliche Einstellungen oder alternative Kombinationen von Akupunkturpunkten bessere Ergebnisse liefern könnten, bedarf weiterer Untersuchungen24. Drittens erfasste ein einziger Untersucher alle Bilddaten. Obwohl dieser Ansatz technische Konsistenz gewährleistete, wurde die Zuverlässigkeit zwischen verschiedenen Beobachtern nicht bewertet, was die Verallgemeinerbarkeit der bildgebenden Befunde möglicherweise einschränkt. Viertens verzichteten wir auf eine Kontrollgruppe, die lediglich einer Fixierung unterzogen wurde, wodurch es schwierig ist, die Effekte von Anästhesie, Immobilisierung und Handling vollständig von den therapeutischen Wirkungen der EA zu trennen. Fünftens wurde die SA-Prozedur als minimale Kontrolle konzipiert, um effektspezifische Einflüsse der Akupunkturpunkte, tiefer Gewebe und elektrischer Stimulation zu reduzieren. Der Unterschied in der Nadeleindringtiefe zwischen der echten und der Placebo-Intervention verhindert jedoch, dass der alleinige Einfluss der Tiefe isoliert werden kann. Folglich sollten unsere Ergebnisse als Vergleich zwischen dem vollständigen EA-Protokoll und einer minimalen Placebo-Prozedur interpretiert werden, nicht jedoch als strikte Bewertung der elektrischen Stimulation allein. Sechstens wurden Abstand der Kamera, Aufnahmewinkel und absolute ROI-Fläche nicht systematisch dokumentiert, was eine technische Einschränkung darstellt. Eine letzte Limitation ist die Anwendung separater ANOVAs für jeden Zeitpunkt, wodurch wiederholte Messungen, Korrelationen und Zeit-Gruppen-Interaktionen vernachlässigt werden und somit die Empfindlichkeit gegenüber dynamischen Veränderungen verringert wird.

Zusammenfassend war EA in einem Mausmodell der DMM-induzierten KOA mit entzündungshemmenden und funktionellen Ergebnissen assoziiert. Trotz Einschränkungen wie variabler Auflösung zwischen den Modalitäten, der Abhängigkeit der US- und IRT-Ergebnisse vom Untersucher, hoher MRI-Kosten und potenziellem Stress durch wiederholte Messungen bleibt das Protokoll eine machbare Plattform für longitudinelle multimodale Beurteilung. Das integrierte System bietet einen Rahmen für die präklinische Evaluation. Künftige Arbeiten sollten die elektrischen Parameter optimieren und Organoid-, Organ-auf-Chip- sowie KI-Plattformen nutzen, um die Wirkmechanismen aufzuklären und individualisierte Therapien zu entwickeln25,26. Verbesserte Placebokontrollen, standardisierte Protokolle und längere Nachbeobachtungszeiträume sind ebenfalls erforderlich, um die klinische Übertragbarkeit zu verbessern.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch den Science and Technology Innovation Action Plan in Shanghai (23YF1447900 an JMC) und die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (U23A20508 an LQY, 82575196 an HSC und U24A6013 an HX) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1%ige EssigsäurelösungSolarbioCat# G1371Differenzierungs-/Waschlösung für die Färbung
1%ige Salzsäure in EthanolSolarbioCat# G1371Säure-Alkohol-Differenzierungslösung
7T Kleintier-MRTShanghai Chenguang7T MRI NOVALKleintier-Magnetresonanztomographie-System
Akupunkturnadeln (0,16 mm × 25 mm)Wuxi Jiajian Medical Instrument, Wuxi, ChinaLos-Nr. 491226Sterile Akupunkturnadeln
Haftende ObjektträgerJiangsu ShitaiMH0662Objektträger für Gewebeschnitte
Wasserfreies EthanolShanghai Titan Technology Co., Ltd.64-17-5Ethanol zur Dehydrierung
C57BL/6-MäuseShanghai Silaike Laboratory Animal Co., Ltd.https://www.slaccas.com/Experimentelle Tiere
DeckgläserJiangsu ShitaiNicht angegebenSammlung und Einbettung von Gewebeschnitten
EntkalkungslösungSerivebioG1105-500mlReagenz zur Entkalkung von Knochen und Gelenken, pH 7,2–7,4
ElektrotherapiegerätSuzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd.SD-ZElektroakupunkturstimulator
EthylenediamintetraessigsäureShanghai Titan Technology Co., Ltd.60-00-4Chelatbildendes Reagenz
Fiji (ImageJ)National Institutes of Health (NIH)ImageJ gebündelt mit 64-Bit-Java 8Bildanalyse-Software
GazeWeizhe MedicalTyp A1: Standard-Gazetupfer (steril)Material zur Haarentfernung und Reinigung
HaarentfernungscremeVEETNicht angegebenEnthaarungscreme
Infrarot-Bildanalyse-SoftwareFLIRVersion nicht angegebenVon der Infrarot-Wärmebildkamera mitgelieferte Software
Infrarot-WärmebildkameraFLIR435-0007-03 (frühe Charge)Infrarot-Thermographiesystem
Inhalationsnarkosesystem für KleintiereMatrx07149Gasnarkosesystem für Kleintiere
Isofluran (Inhalationsanästhetikum)RWD217140901Inhalationsanästhetikum
Naisikang Medizinisches wasserdichtes elastisches Klebeband (3,81 cm × 4,57 m)Naisikang™732Material zur Fixierung der Gliedmaßen für die MRT
Modifiziertes Safranin-O- und Fast-Green-Färbekit (für Knochen)SolarbioCat# G1371Färbekit für Knorpel und Knochen
NadelhalterRWDF21001-12Intraoperative Klemm- und Nahttechnik
Neutrales Harz-Einbettungsmediumbiosharp23338664Historisches Einbettungsmedium
SauerstoffNicht angegebenNicht angegebenTrägergas für die Inhalationsnarkose
ParaffineinbettungsgerätLEICAEG1150CParaffineinbettungssystem
Paraffin-MikrotomLEICARM2235Drehmikrotom
Paraffinwachsepredia151534Einbettungsmedium
ParaformaldehydSinopharm Reagents Co., Ltd.80096618Gewebefixiermittel
PBSServicebioG0002Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Rotarod-VorrichtungPanlabLE8205Rotarod-Ermüdungstestsystem
Kleintier-UltraschallbildgebungsplattformFujiVevo 3100Kleintier-Ultraschallsystem
NatriumhydroxidShanghai Titan Technology Co., Ltd.G19852HLaborreagenz
StereomikroskopOlympusSZ61Präparationsmikroskop
Nahtnadeln mit Faden (6-0 resorbierbare Naht und 6-0 Seidennaht)Ningbo Medical Suture Co., Ltd.Kosmetische Nadeln 1/2 4X12 40Postoperative Naht
Chirurgische Klingen (10#)Hangzhou Nuoyang Biotechnology Co., Ltd.20090120Inzision des medialen Meniskusbandes
GewebedehydratorLEICATP1020Automatischer Gewebeprozessor
GewebetrocknerLEICAHI1220Objektträgertrockner
Gewebeproben-EinbettkassettenJiangsu ShitaiREF31050102WEinbettverbrauchsmaterial
GewebestreiferLEICAHI1210Schnittausbreitungssystem
Ultraschall-Analyse-Software (Vevo Lab 3.1.0)OpticVersion 3.1.0Dreidimensionale Ultraschall-Analyse-Software
Ultraschall-KopplungsmittelHu Qingyu TangYY0299-2008Ultraschall-Kopplungsgel
Ganzschnitt-ScannerOlympusVS200Digitales Slide-Scanning-System
XylolSinopharm Reagents Co., Ltd.10023418Aufhellungsreagenz

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