Anreicherung der Schilddrüse der Maushypophyse durch Hypothyreosemäuse mittels CD90-basierter, fluoreszenzaktivierter Zellsortierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung von Thyrotropen aus den hypothyreoideafarbenen Hypophysen erwachsener Maus mittels enzymatischer Dissoziation und CD90-basierter fluoreszenzaktivierter Zellsortierung, was nachgelagerte molekulare Analysen und kurzfristige Primärkulturen einer thyrotrop-angereicherten Zellpopulation ermöglicht.

Zusammenfassung

Thyrotrope sind spezialisierte endokrine Zellen in der vorderen Hypophyse, die das schilddrüsenstimulierende Hormon (TSH) ausschütten und die Schilddrüsenaktivität regulieren. Die TSH-Sekretion wird positiv durch das hypothalamische thyrotropinfreisetzende Hormon reguliert und durch zirkulierende Schilddrüsenhormone negativ. Thyrotrope machen nur einen kleinen Bruchteil der Hypophysenzellen aus (~5 %), was die Isolierung und Untersuchung ihrer Physiologie erschwert. Hier beschreiben wir einen verbesserten Ansatz zur Isolierung von Thyreotropen bei erwachsenen Mäusen bei unterschilddrüsen. Hypothyreose wurde induziert, um die Thyrotropepopulation vor der enzymatischen Dissoziation der vorderen Hypophyse und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung mittels CD90.2-Oberflächenantigens zu erweitern. Die Verarbeitung der vorderen Hypophysendrüsen von zwölf Mäusen ergab etwa 1,5 × 10⁶ CD90.2-positive Zellen, die für die Expression von Tshb-Boten-RNA angereichert wurden. CD90.2-positive Zellen machten etwa 25 % der vorderen Hypophysenzellen aus und zeigten eine etwa fünffach höhere Tshb-Expression im Vergleich zu CD90.2-negativen Zellen, was auf eine erhebliche Thyrotrope-Anreicherung hindeutet. Isolierte Zellen blieben in kurzfristiger Kultur lebensfähig und behielten die Reaktion auf die Triiodothyronin-Behandlung. Dieses Protokoll ermöglicht die Anreicherung und Kultur von Mausthyrotropen für nachgeschaltete molekulare, transkriptomische, epigenomische und physiologische Analysen.

Einleitung

Die Hypophyse ist ein endokrines Organ, das sich an der Basis des Gehirns befindet und hierarchische Kontrolle über die hormonelle Homöostase ausübt. Seine Aktivität wird durch hypothalamische Signale reguliert, die die Produktion von Hypophysenhormonen stimulieren oder hemmen, welche wiederum die Funktion peripherer endokriner Organe steuern. Die Drüse enthält eine heterogene und dynamische Zellpopulation, darunter Stamm-/Vorläuferzellen und differenzierte hormonproduzierende Zellen¹. Als Reaktion auf physiologischen Stress oder Verletzungen können Hypophysenstamm-/Vorläuferzellen sich aktivieren, sich selbst erneuern und sich in mehrere hormonsekretierende Linien differenzieren ^2,3. Strukturell ist die Hypophyse in zwei Hauptlappen gegliedert: den hinteren Lappen (PL), der aus Hypophycyten und neurosekretorischen Endpunkten besteht, die Oxytocin und Vasopressin freisetzen, und den vorderen Lappen (AL), der spezialisierte endokrine Zelltypen enthält, die Wachstumshormon, Prolaktin, Schilddrüsenstimulierendes Hormon (TSH), Adrenokortikotropes sowie die Gonadotropine, follikelstimulierende Hormone (FSH) und luteinisierende Hormone (LH) produzieren. Die vordere Hypophyse beherbergt außerdem nicht-hormonelle Zelltypen wie S100B-positive Follikulostellatzellen, Endothelzellen und Perizyten, die die endokrine Funktion^{unterstützen.} Nagetiere enthalten außerdem Melanotrophen im Zwischenlappen der Hypophyse ^7,8.

Das Interesse an der Funktion, Differenzierung und Entwicklung der Hypophyse hat die Entwicklung mehrerer Protokolle vorangetrieben, die darauf abzielen, adulte Hypophysenstamm- und Vorläuferzellen in Nagetiermodellen zu isolieren. Ratten werden häufig in der Forschung zur Hypophysenphysiologie eingesetzt, da ihre größeren Hypophysendrüsen zu einer größeren Zellzahl führen und die Genesung während der Gewebeverarbeitung verbessern ^4,9. Im Gegensatz dazu bleibt die Isolierung von Hypophysenzellen aus Mäusen technisch herausfordernd, und standardisierte Protokolle sind begrenzt. Neuere Protokolle, die adulte Hypophysenstamm-/Vorläuferzellaggregate verwenden, bieten nützliche Werkzeuge zur Modellierung der Entwicklung und Funktion der Hypophyse¹⁰; Diese Systeme erlauben jedoch noch keine direkte Isolierung spezifischer endokriner Zellpopulationen. Unter den hormonproduzierenden Zelltypen der vorderen Hypophyse sind die Thyrotrope die Hauptregulatoren der Achse Hypothalamus–Hypophyse–Schilddrüse (HPT) und steuern die Synthese und Sekretion des Schilddrüsenhormons (TH) bei Säugetieren. Das von Thyrotropen erzeugte TSH ist ein heterodimeres Glykoprotein, das aus einer gemeinsamen α-Untereinheit (codiert von Cga und geteilt mit FSH und LH) und einer β-Untereinheit (codiert durch Tshb) besteht, die Rezeptor-Spezifität verleiht. Diese Zellen sind hochempfindlich gegenüber zirkulierenden Triiodothyronin- (T3)- und Thyroxin-(T4)-Spiegeln. Die Thyrotrope-Population wächst, wenn die T3- und T4-Werte während der Schilddrüsenunterfunktion niedrig sind, und zieht sich während der Hyperthyreose durch einen klassischen negativen Rückkopplungsmechanismus^zusammen 11,12,13.

Trotz ihrer wesentlichen physiologischen Rolle bleiben Thyrotrope schwer zu untersuchen, da sie nur einen kleinen Bruchteil der vorderen Hypophysenzellen (etwa 5 %) ausmachen und phänotypische Merkmale mit anderen endokrinen Populationen teilen. Diese Knappheit, zusammen mit dem Fehlen robuster in-vitro-Modelle, hat mechanistische Untersuchungen zur Thyrotroperegulation und der HPT-Achsenkontrolle eingeschränkt. Die TαT1-Tumorzelllinie stellt ein häufig verwendetes, thyrotropeartiges Modell¹⁴ dar, spiegelt jedoch nicht vollständig physiologische Reaktionen wider; insbesondere ist die T3-abhängige Repression von Tshb oft schwer zu beurteilen, da das sehr niedrige basale Transkriptionsniveau¹⁵ liegt. Daher stützen sich viele Studien auf nicht-thyrotrope Zelllinien wie HEK293, COS, CV1, GH3 oder JEG3, die verschiedene Tshb-Konstrukte ¹⁵ exprimieren. Dies sind jedoch heterologe Systeme, die nicht-physiologische regulatorische Artefakte einführen können, einschließlich Effekte, die durch Plasmid-Rückgrate und nicht endogene transkriptionelle Mechanismen angetrieben werden.

Hier präsentieren wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung der Thyrotrope aus der erwachsenen Maus-Hypophyse, adaptiert von einer zuvor etablierten Methode bei Ratten⁹ und optimiert für die kleinere Größe und den geringeren Thyrotropegehalt der Maushypophyse. Mehrere wichtige Modifikationen wurden eingeführt, um die Ausbeute von Tshb-exprimierenden Zellen zu verbessern und eine zuverlässige Downstream-Analyse sicherzustellen. Das Protokoll nutzt die Expression des Oberflächenantigens CD90, eines Oberflächenmarkers, der in Thyrotropen angereichert ist. CD90 (auch bekannt als THY1) ist ein glykosylphosphatidylinositol-verankertes Membranprotein^16,17, das die juxtacrine Signalübertragung durch heterotypische Wechselwirkungen mit dem Integrin-β2-Liganden (ITGB2) vermittelt. Obwohl CD90 häufig mit Immun- und Neuralzellpopulationen assoziiert wird, identifizierten frühere transkriptomische Studien die Thy1-Anreicherung in Thyrotropen. THY1-abhängige Kontaktsignalübertragung findet in verschiedenen Zelltypen statt, darunter hämatopoetische Zellen, T-Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen und Neuronen, wo sie Adhäsion, Migration, Apoptose, Tumorsuppression und Fibrose^reguliert.

Wichtig ist, dass eine einzelzellige transkriptomische Profilierung der vorderen Hypophyse der Ratten Thy1 als eines der am stärksten exprimierten adhäsionsbezogenen Gene in Thyrotropen⁵ identifizierte, was darauf hindeutet, dass THY1 ein Oberflächenmarker ist, der in Thyrotropen angereichert ist. Darüber hinaus zeigen öffentlich zugängliche Datensätze zur Sequenzierung der Maushypophyse, dass die Expression von Thy1/CD90 in Thyrotropen^22,23 angereichert ist. Seine Expression ist jedoch nicht vollständig auf diese Linie beschränkt, da eine nachweisbare Expression in Teilmengen von PIT1-Linienzellen, einschließlich Somatotropen und Laktotropen sowie in progenitorähnlichen Populationen. Einzelzell-Transkriptomstudien haben erhebliche transkriptionelle Überschneidungen zwischen PIT1-Linien-Hypophysenzellen gezeigt, einschließlich der Identifikation einer gemeinsamen PIT1-Vorläuferpopulation, die in der Lage ist, Somatotrope, Laktotrope und Thyrotrope²⁴ zu erzeugen. Ähnlich identifiziert Thy1/CD90 nicht ausschließlich die Thyrotropepopulation, sondern kann zur Anreicherung von Maus-Thyrotropen verwendet werden. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen bietet der Einsatz von THY1-gezielten Antikörpern in unserer Isolationsstrategie eine effektive Methode zur Anreicherung der Thyrotrope nach einer durch Hypothyreose induzierten Expansion und ermöglicht funktionelle Studien, einschließlich der Bewertung hormoneller Reaktionen auf T3.

Das Protokoll beginnt damit, Wildtyp-Mäuse C57BL/6 mit einer iodarmen Ernährung zu versorgen und die Schilddrüsenfunktion mit Methimazol (MMI) und Kaliumperchlorat (KClO₄) im Trinkwasser²⁵ zu hemmen. Diese Behandlung induziert innerhalb einer Woche eine erhebliche Hypothyreose und erweitert die Population der Tshb-exprimierenden Thyrotrope in der vorderen Hypophyse. TSH-produzierende Zellen unter Hypothyreosebedingungen durchlaufen erhebliche physiologische und morphologische Anpassungen, darunter Hyperplasie, Hypertrophie, reichlich vakuolierte Zytoplasma, prominente zytoplasmatische Prozesse und vergrößerte Lysosomen, was die Anpassung an das Fehlen von TH-Rückkopplung^{widerspiegelt} 26,27,28. Daher kann die Induktion der Hypothyreose als Strategie genutzt werden, um die Thyrotropepopulation zu vergrößern.

Nach der Induktion der Hypothyreose werden die Mäuse mit Isofluran betäubt und einer kardialen Perfusion mit Ca^2+/Mg^2+-freier HEPES-gepufferter Kochsalzlösung unterzogen, um die Zelllebensfähigkeit während der Gewebedissoziation zu maximieren. Nach der Entnahme unterzieht die vordere Hypophyse eine sanfte enzymatische Verdauung, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen, die mit einem Phycoerythrin-Cyanin-7-konjugierten Anti-CD90.2-Antikörper inkubiert wird, um die Thyrotrope durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) anzureichern. Markierte Zellen werden anschließend entweder im Wachstumsmedium für eine kurzfristige Kultur oder in TRIzol zur RNA-Extraktion gesammelt. Zur Validierung der Anreicherungsstrategie wurde die Expression von Tshb-Boten-RNA in sortierten Populationen gemessen und in CD90-positiven Zellen stark angereichert festgestellt. Diese Methode unterstützt ein breites Spektrum von nachgelagerten Anwendungen bei Mäusen, darunter Genexpressionsprofilierung, transkriptomische und epigenomische Analysen, Hochdurchsatz-Assays und primäre Zellkultur, und bietet eine wertvolle Plattform zur Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Thyrotropefunktion und -regulation der HPT-Achse zugrunde liegen.

Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Thyrotropen aus dem AL von frisch dissektionierten Hypophysendrüsen, die von erwachsenen Mäusen nach mindestens einer Woche Hypothyreose-Induktion gewonnen wurden. Alle Tierverfahren wurden gemäß institutionellen und National Institutes of Health Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt. Das Institutional Animal Care and Use Committee der medizinischen Abteilung der University of Texas genehmigte alle Tierverfahren.

Männliche und weibliche Mäuse wurden während der Experimente zusammengefasst, da weder geschlechtsabhängige Unterschiede im Thyrotrope-Ertrag noch in den nachgelagerten Analysen festgestellt wurden. Etwa 12 Mäuse pro Experiment wurden verwendet, obwohl größere Kohorten von bis zu 20 Tieren durch proportionale Skalierung aller Reagenzienvolumina verarbeitet werden können.

Eine erfolgreiche Isolierung hängt von einer schnellen und gleichmäßigen Perfusion, minimaler Dissektionszeit, vollständiger Entfernung der PL und einer hochdichten Panzerung der Primärzellen ab. Die empfohlene maximale Verarbeitungszeit zwischen Euthanasie, Perfusion, Hypophysendissektion und Beginn der enzymatischen Verdauung betrug 6 Stunden. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 2,0–2,5 × 10⁵ Zellen pro 0,7 cm^{² Brunnen} (die Oberfläche eines Brunnens eines 8-Bohrloch-Glaskammer-Objektträgers) plattiert. Eine Mindestlebensfähigkeit von 95 % war erforderlich, um eine kurzfristige Thyrotropekultur zu unterstützen.

Alle für die Erzeugung der Einzelzell-Suspension verwendeten Reagenzien wurden unter sterilen Bedingungen hergestellt. Arbeitsflächen wurden mit 70 % Ethanol sterilisiert, Dissektionsinstrumente vor der Nutzung autoklaviert, und alle Vorbereitungsschritte der Zellkulturen wurden in einem Biosicherheitsschrank mit aseptischer Technik durchgeführt. Dieses Protokoll wurde für 12 Tiere standardisiert. Skaliere alle Reagenzienvolumina proportional, wenn du eine andere Anzahl von Mäusen verwendest. Siehe die Materialtabelle für alle Reagenzien, Verbrauchsgüter und Ausrüstungen.

Während der Schilddrüsenunterfunktion wurden die Mäuse unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen bei 20°C–24°C und 40%–60% relativer Luftfeuchtigkeit mit einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus und Ad-Libitum-Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Die Tiere wurden in Gruppen (bis zu drei Mäuse pro Käfig) in einzeln belüfteten Käfigen untergebracht, die Standardeinstreu und Umweltbereicherung enthielten, einschließlich Nistmaterial und Unterschlupf. Die erfolgreiche Induction der Hypothyreose wurde durch die Messung der Expression der Leberiodothyronin-Deiodinase (Dio1) bestätigt. Eine Reduktion um mindestens 50 % der Dio1-Messenger-RNA (mRNA)-Expression im Vergleich zu Euthyroid-Kontrollmäusen wurde als Hinweis auf eine erfolgreiche Hypothyreose-Induktion angesehen.

1. Hypothyreose-Induktion bei C57BL/6-Mäusen

HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren über 7–10 Tage durch, um eine Hypothyreose in vivo durch eine jodmangelige Ernährung und chemische Hemmung der Schilddrüsenfunktion zu indlösen. Siehe Abbildung 1A für das experimentelle Design und Abbildung 1B für die Validierung der Hypothyreose-Induktion.

Abbildung 1. Induktion von Schilddrüsenunterfunktion bei C57BL/6-Mäusen. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs, der zur Induzierung von Schilddrüsenunterfunktion bei erwachsenen C57BL/6-Mäusen verwendet wird. Die Mäuse erhielten 0,05 % Methimazol (MMI) und 0,1 % Kaliumperchlorat (KClO₄) im Trinkwasser zusammen mit einer iodmangeligen Ernährung für 7 Tage, bevor die vordere Hypophysenisolierung erfolgte. (B) Reverse-Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)-Analyse der Expression von Leber-Dio1-Bobonukleinsäure (mRNA) in Mäusen mit Schilddrüse und Hypothyreoid. Cyclophilin A (CyA) wurde als Referenzgen verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert (n = 6 pro Gruppe). Die statistische Signifikanz wurde mittels des Schüler-t-Tests bestimmt. **P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Bereite MMI/KClO₄ Trinkwasser vor
   1. Lösen Sie 1 g MMI und 2 g KClO₄ in 2 L gefiltertem Wasser.
   2. Rühren Sie die Lösung bei Raumtemperatur (20°C–25°C) 1 Stunde lang um, bis sie vollständig gelöst ist.
      VORSICHT: MMI und KClO₄ sind gefährliche Chemikalien. Tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel und Augenschutz während der Vorbereitung und Handhabung.
      HINWEIS: MMI hemmt die Iodidorganisation, während KClO₄ die Iodidaufnahme über den Natrium-Jodid-Symporter²⁵ blockiert. Ersetzen Sie die Trinklösung alle 2 Tage, um die richtige Dosierung zu halten und die Kontamination durch Bettzeug, Essensreste und mikrobielles Wachstum zu minimieren. Wenn sie nicht sofort verwendet wird, lagern Sie die Lösung bis zu 14 Tage in einem dicht verschlossenen, lichtbeständigen Behälter bei 4 °C.
2. Schilddrüsenunterfunktion induzieren
   1. Huscht 8 Wochen alte männliche oder weibliche C57BL/6 Mäuse in Gruppen von bis zu drei Tieren pro Käfig unter jodfreien Unterkunftsbedingungen.
      HINWEIS: Hausmäuse unter spezifischen krankheitserregerfreien Bedingungen bei 20°C–24°C und 40%–60% relativer Luftfeuchtigkeit mit einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus und ad-libitum-Zugang zu Nahrung und Wasser. Halten Sie Tiere in individuell belüfteten Käfigen mit Standardeinstreu und Umweltbereichern, einschließlich Nistmaterial und Unterschlupf. Gewöhnen Sie die Tiere für 3 Tage, bevor Sie mit der Behandlung beginnen. Männliche und weibliche Mäuse getrennt zu Hause. Für die hier beschriebenen Experimente bestand die Schilddrüsengruppe aus sechs Männchen und sechs Weibchen, die in getrennten Käfigen untergebracht waren, und die Hypothyreoid-Gruppe aus sechs Männchen und sechs Weibchen, die in getrennten Käfigen untergebracht waren. Gruppen ALs von männlichen und weiblichen Mäusen innerhalb derselben Behandlungsgruppe während der Zellpräparation, da keine geschlechtsabhängigen Unterschiede in der Thyrotrope-Ausbeute oder nachgelagerten Analysen beobachtet wurden.
   2. Füttern Sie die Mäuse 7–10 Tage lang mit einer jodarmen Diät ad libitum.
      HINWEIS: Beginnen Sie gleichzeitig mit der iodmangelhaften Ernährung und der MMI/KClO₄-Behandlung.
   3. Trinkwasser mit 0,05 % MMI und 0,1 % KClO₄ ad libitum während des gesamten Behandlungszeitraums bereitstellen.
      HINWEIS: Die Behandlung bis zur Euthanasie aufrechterhalten. Überwachen Sie täglich das Körpergewicht, die Nahrungsaufnahme, die Wasseraufnahme und die klinischen Symptome während der Induktion der Schilddrüsenunterfunktion. Eine erfolgreiche Induktion der Schilddrüsenunterfunktion ist typischerweise mit einer verringerten Körpergewichtszunahme und klinischen Anzeichen wie verminderter Aktivität oder stumpfem Fell im Vergleich zu Euthyroid-Kontrollen verbunden. Siebentägige und zehntägige Induktionsphasen liefern eine vergleichbare Thyrotrope-Anreicherungseffizienz.

2. Herzperfusion und AL-Dissektion

HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren in etwa 15 Minuten pro Maus durch, um die Gewebelebensfähigkeit zu maximieren und die Zellintegrität während der Hypophysenisolation zu erhalten.

1. Bereite Perfusions- und Sammellösungen vor
   1. Bereite HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBSS) ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ her
      1. Kombiniert man 667 ml 0,9 % NaCl, 20 ml 1 M HEPES, und 313 ml doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O), um 1 Liter maßgefertigtes HBSS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ herzustellen.
      2. Die Lösung mit Autoklaven und bis zur Anwendung bei 4°C lagern.
   2. Bereite heparinisiertes HBSS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ vor.
      1. Fügen Sie 27 μL Enoxaparin-Natrium (100 mg/mL Fondlösung) zu 50 ml maßgefertigtem HBSS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ hinzu.
   3. Sammelmedium vorbereiten (CM)
      1. Kombiniert man 440 ml Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, 50 ml hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS), 4 mM L-Glutamin und 10 ml 1 M HEPES zu einem Endvolumen von 500 ml.
      2. Filtersterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter und lagern Sie sie bis zu einem Monat bei 4 °C.
         HINWEIS: Bereiten Sie vor der Lagerung 50 ml Aliquots unter einem Biosicherheitsschrank vor, um die Verunreinigung zu minimieren.
      3. Erwärmen Sie das CM vor der Anwendung auf 20°C–25°C.
   4. Sterilisieren Sie Sezierungsinstrumente
      1. Sterilisieren Sie vor der Anwendung Schere, Pinzette, Pinzette, Nadelhalter, Iris-Pinzette, chirurgische Löffel und stumpfe Sonden mit 75 % Ethanol.
         HINWEIS: Lassen Sie die Instrumente nach der Ethanolsterilisation vor Gewebekontakt vollständig an der Luft trocknen.
2. Durchführung einer Herzperfusion
   1. Tief betäuben Sie die Maus mit Isofluran, das zu 100 % Sauerstoff geliefert wird. Anästhesie in einer Kammer mit 5 % Isofluran induzieren und die Anästhesie durch einen Nasenkegel bei 3 % Isofluran aufrechterhalten, mit kontinuierlicher Überwachung und Abgasabscheidung.
      VORSICHT: Führen Sie Isofluran-Anästhesieverfahren gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien durch und verwenden Sie geeignete Plünderungssysteme, um die Einatmungsexposition zu minimieren.
   2. Vollständige Anästhesie bestätigen, indem Sie das Fehlen des Pedalrückzugsreflexes mit einem Zehenkneif überprüfen.
   3. Besprühen Sie das Tier mit 75 % Ethanol und legen Sie es auf die Perfusionsstufe im Sammelbecken.
   4. Stecken Sie die Gliedmaßen an, um den Peritonealbereich freizulegen.
   5. Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig, um Schäden an wichtigen Organen und Blutgefäßen zu vermeiden.
   6. Schneiden Sie entlang der Rippen, um eine Brustflasche zu bilden, falten Sie die Klappe über den Kopf und sichern Sie sie mit einem Hämostat.
   7. Stabilisieren Sie das Herz mit einer Klemme und führen Sie eine 23-Gauge-Nadel in die Spitze des linken Ventrikels.
   8. Verbinden Sie die Nadel mit einer Peristaltiepumpe mit Silikonschlauch.
   9. Beginnen Sie mit der Perfusion mit heparinisiertem HBSS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ bei Raumtemperatur.
   10. Schneiden Sie das rechte Vorhof unmittelbar nach Beginn der Perfusion ein, um die Entwässerung zu ermöglichen.
   11. Perfundieren Sie das Tier 5 Minuten lang mit einer Durchflussrate von 3 mL/min.
       HINWEIS: Bestätigen Sie die erfolgreiche Infusion, indem Sie eine sichtbare Blassbildung der Leber beobachten.
3. Isoliere die AL
   1. Köpfe die Maus sofort nach der Perfusion.
   2. Entfernen Sie die Kopfhaut und die Schädelknochen mit feinen Sektionsscheren und Pinzetten, um das Gehirn freizulegen.
   3. Führe einen chirurgischen Löffel zwischen Gehirn und Schädel.
   4. Heben Sie das Gehirn vorsichtig an und schneiden Sie das Sehkreuz durch.
   5. Entfernen Sie die dünne meningeale Membran (Dura Mater), die die Hypophyse bedeckt, unter einem Stereomikroskop mit einer feinen Pinzette.
   6. Sezieren und verwerfen Sie das PL sorgfältig, wie in Abbildung 2A gezeigt.
      HINWEIS: Identifizieren Sie die AL als das größere rosa Gewebe, das sich rostral befindet. Identifizieren Sie das PL als das kleinere weiße, durchscheinende Gewebe, das dorsal liegt.
   7. Schneiden Sie das umliegende Bindegewebe und die restlichen Meningealmembranen mit einer stumpfen Sonde ab, um den Zugang zum AL zu verbessern.
   8. Greifen Sie das AL mit einer stumpfen Pinzette und übertragen Sie es in ein 15-mL Polypropylenrohr mit 1,8 mL CM.
      HINWEIS: Kombinieren Sie ALs von 12 Tieren in dasselbe Sammelrohr.
   9. Bewahren Sie die Probe bei Raumtemperatur auf, bis alle Sektionen abgeschlossen sind.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 3 Stunden zwischen Gewebeentnahme und Beginn der enzymatischen Verdauung, um den Verlust der Zelllebensfähigkeit zu minimieren.
4. Bestätigen Sie die Schilddrüsenunterfunktion
   1. Nehmen Sie von jeder Maus eine kleine Leberprobe (etwa 50 mg).
   2. Quantifizieren Sie die hepatische Dio1-mRNA-Expression durch eine Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion und vergleichen Sie sie mit unbehandelten Euthyroid-Kontrollen (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Definieren Sie eine erfolgreiche Hypothyreose-Induktion als eine Reduktion der Leber-Dio1-Expression um mindestens 50 % im Vergleich zu Euthyroid-Kontrollen. Die Dio1-Expression korreliert positiv mit zirkulierenden TH-Werten²⁹; daher bestätigt eine reduzierte Dio1-Expression eine erfolgreiche Hypothyreose-Induktion.
5. Wiederholte Gewebeentnahme
   1. Wiederholen Sie die Schritte 2.2–2.4. bis ALs von 12 Mäusen gesammelt wurden.
   2. Gehen Sie sofort zu Schritt 3 fort.

Abbildung 2. Herstellung einer Einzelzell-Suspension aus der vorderen Maushypophyse. (A) Arbeitsablauf zur Illustration der Dissektion des vorderen Lappens (AL), enzymatischer Dissoziation und Herstellung einer Einzelzellsuspension für fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Der Arbeitsablauf umfasst die Entfernung des hinteren Lappens, die Verdauung von Kollagenase, die Verdauung von Trypsin–Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und die Filtration vor der FACS-Analyse. (B) Repräsentative Bilder der Viability-Farbstofffärbung und automatisierter Zellzählung dissozieller vorderer Hypophysenzellen von Euthyroid- und Hypothyreoidmäusen. Die Gesamtzellausbeute und die Konzentration der lebensfähigen Zellen sind angezeigt. Skalenbar = 200 μm. (C) Verteilung der vorderen Hypophysenzelldurchmesser nach Gewebedissoziation und Vorbereitung für die nachgelagerte FACS-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen. 

3. Herstellung einer Einzelzell-Suspension aus Maus-AL

HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren in etwa 60 Minuten durch, um eine Einzelzell-Suspension aus dem vorderen Hypophysengewebe zu erzeugen.

1. Enzymatische Verdauungslösungen bereiten
   1. Bereite eine 2%ige Kollagenase-Lösung vor
      1. Lösen Sie 100 mg Kollagenase aus Clostridium histolyticum (>125 Kollagenase-Verdauseinheiten/mg Feststoff) in 4,9 mL ddH₂O.
      2. Fügen Sie 100 μL 1 M HEPES hinzu, um ein Endvolumen von 5 ml zu erhalten.
      3. Sterilisiere die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter.
      4. Aliquot die Lösung in 200 μL Volumina und bis zu 2 Monate bei −30°C lagern.
         HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen. Verwenden Sie keine aufgetauten Kollagenase-Aliquoten.
   2. Bereiten Sie 0,25 % Trypsin–Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) her.
      1. Mischen Sie 1 ml 0,5 % Trypsin–EDTA mit 1 ml HBSS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺.
      2. Die Lösung bis zur Anwendung bei 4°C aufbewahren.
         HINWEIS: Verwenden Sie am Tag der Zubereitung die verdünnte Trypsin-EDTA-Lösung. Speichern oder wiederverwenden Sie nicht verdünntes Trypsin–EDTA.
2. Kollagenase-Verdauung durchführen
   1. Fügen Sie 200 μL 2%ige Kollagenase-Lösung zu den gesammelten AL-Geweben hinzu.
   2. Mischen Sie das Gewebe vorsichtig durch Pipettieren mit einer P1000-Mikropipette mit Spitzen mit wenig festhaltenden Spitzen.
   3. Inkubieren Sie die Suspension 15 Minuten lang in einem 37°C Wasserbad.
      HINWEIS: Halten Sie den Schlauchdeckel während der Inkubation geschlossen, um eine Kontamination zu minimieren.
   4. Klopfen Sie während der Inkubation alle 5 Minuten sanft auf die Sonde.
3. Durchführung der Deoxyribonuklease-I (DNase-I)-Verdauung
   1. Fügen Sie 5 μL DNase I (1 U/μL) direkt zur Aufhängung hinzu, ohne das Überleitungsmittel zu entfernen.
   2. Klopfen Sie die Tube 10 Mal sanft an, um die Lösung zu mischen.
   3. Die Suspension bei 37°C 5 Minuten inkubieren.
4. Pellet das Gewebe
   1. Zentrifugiere die Suspension bei 100 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   2. Entfernen Sie das Supernatant vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette.
      HINWEIS: Lassen Sie während der Entfernung des Supernatanten etwa 50 μL Restflüssigkeit über dem Pellet zurück, um den Zellverlust zu minimieren.
5. Führen Sie eine Trypsinverdauung durch
   1. Fügen Sie dem Pellet 2 ml 0,25 % Trypsin–EDTA hinzu.
   2. Inkubieren Sie die Suspension bei 37°C für 10–15 Minuten, bis keine sichtbaren intakten Gewebefragmente mehr übrig sind.
      HINWEIS: Überschreiten Sie 15 Minuten nicht, um eine übermäßige Gewebeverdauung und eine verminderte Zelllebensfähigkeit zu vermeiden.
6. Die enzymatische Verdauung stoppen und das Gewebe dissoziieren
   1. Füge 2 ml CM hinzu, um die Trypsinisierung zu stoppen.
   2. Pipettieren Sie die Suspension vorsichtig 10–20 Mal auf und ab mit einer auf 1 mL eingestellten Mikropipetten, bis keine sichtbaren Gewebefragmente mehr übrig sind.
      HINWEIS: Verwenden Sie während der mechanischen Dissoziation Pipettenspitzen mit niedriger Retention. Eine akzeptable Einzelzellensuspension ist eine gleichmäßige, niedrigviskose Suspension, die überwiegend einzelne Zellen mit minimalen sichtbaren Aggregaten oder Ablagerungen enthält (≤5%–10% Klumpen bei mikroskopischer Inspektion unter Verwendung von Trypan Blue-Ausschluss).
7. Sammeln Sie die Einzelzell-Suspension
   1. Zentrifugiere die Suspension bei 100 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   2. Entferne das Supernatant vorsichtig.
   3. Gehen Sie sofort mit Schritt 4 fort.
      HINWEIS: Beginnen Sie mit der Färbung innerhalb von 15 Minuten nach der Vorbereitung der Einzelzellsuspension und schließen Sie die Zellsortierung innerhalb von 1 Stunde ab, wenn möglich. Halten Sie die Zellen während dieses Zeitraums auf Eis, um den Vitalitätsverlust zu minimieren.

4. Färbung zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung

HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren in etwa 60 Minuten durch, um dissoziierte vordere Hypophysenzellen auf FACS von CD90-positiven Zellen zu färben.

1. Bereite die Zellsuspension vor
   1. Fügen Sie dem Zellpellet 350 μL Färbungspuffer aus phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungszustand (PBS, 1×) mit 2 % FBS und 0,09 % Natriumazid hinzu.
   2. Lassen Sie das Pellet vorsichtig wieder auf- und abhängen, indem Sie 10 Mal mit einer P1000-Mikropipette mit Spitzen mit niedriger Retention pipettieren, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.
   3. Die Suspension wird in ein 1,5 mL niedrigbindendes Mikrozentrifugenrohr übertragen.
2. Bestimmung der Zellkonzentration und -lebensfähigkeit
   1. Entferne ein 5 μL Aliquot aus der Suspension für die Zellzählung.
   2. Mische den Aliquot mit 5-μL-Viability-Farbstoff.
   3. Laden Sie 10 μL des Gemisch in einen automatischen Zellzähler.
      HINWEIS: Fahren Sie mit FACS über, wenn die Zelllebensfähigkeit ≥85 % beträgt, bestimmt durch den Ausschluss von Lebensfähigkeitsstoff, und wenn minimale Ablagerungen und Zellaggregate festgestellt werden.
   4. Bestätigen Sie, dass die Gesamtzellkonzentration etwa 1 × 10^{7 Zellen} /ml für Schilddrüsenproben und 2 × 10^{7 Zellen} /ml für Hypothyreoseproben beträgt (Abbildung 2B). Die Zellgrößenverteilung nach Dissoziation ist in Abbildung 2C dargestellt.
3. Entschädigungskontrollen bereiten
   1. Übertrage 50 μL der Zellsuspension in einen 300 μL Färbepuffer.
   2. Teile die Suspension in drei 100-μL-Aliquots in separaten 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhren.
   3. Bereiten Sie folgende Kontrollen vor: (i) ungefärbte Kontrolle, (ii) Propidiumiodid (PI)-reine Kontrolle und (iii) Phycoerythrin-Cyanin 7 (PE-Cy7) CD90.2-reine Kontrolle.
4. Färbe die Zellen
   1. Fügen Sie 3 μL PE-Cy7-konjugierten Anti-CD90.2-Antikörper zur 300-μL-Zellsuspension hinzu.
      HINWEIS: Die Antikörperkonzentration wurde durch frühere Titrationsexperimente bestimmt. Eine endgültige Verdünnung von 1:100 ermöglichte eine optimale Trennung zwischen positiven und negativen Populationen und minimierte gleichzeitig die Hintergrundfärbung.
   2. Fügen Sie der CD90.2-Kompensationskontrolle 1 μL-Antikörper hinzu, um eine Endverdünnung von 1:100 zu erhalten.
   3. Inkubiere alle Proben im Dunkeln im Dunkeln auf Eis.
      HINWEIS: Proben während der Inkubation alle 10 Minuten vorsichtig mischen, um eine homogene Färbung zu erhalten.
5. Wasche die gefärbten Zellen
   1. Fügen Sie jedem Rohr 1 ml Kaltfärbepuffer hinzu.
   2. Zentrifugiere die Proben bei 210 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Falls vorhanden, deaktivieren Sie die Zentrifugenbremse, um eine Störung des Zellpellets während der Abbremsung zu minimieren.
   3. Entfernen und entsorgen Sie das Überdachungsmittel vorsichtig.
6. Die gefärbten Zellen wieder aufhängen lassen
   1. Die Hauptzellensuspension in einem 300-μL-Färbepuffer wieder suspendieren.
      HINWEIS: Fügen Sie Pi unmittelbar vor der Sortierung auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml hinzu.
   2. Jede Kompensationsregelung in einem 100 μL Färbepuffer wieder suspendieren.
7. Filtern Sie die Zellsuspension
   1. Filtern Sie die Zellsuspension unmittelbar vor der Sortierung durch ein Flusszytometrierohr, das mit einem 35-μm-Zellsieb versehen ist.
8. Zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung übergehen
   1. Gehen Sie sofort mit Schritt 5 fort und sortieren Sie die gefärbten Zellen mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer.

5. FACS-Gating- und Sortierstrategie

HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren in etwa 60 Minuten durch, um lebensfähige CD90.2-positive Thyrotrope mittels FACS zu isolieren.

1. Konfigurieren Sie den Zellsortierer
   1. Installiere eine 100-μm-Düse am Zellsortierer.
   2. Stellen Sie den Manteldruck auf 20 psi ein.
      HINWEIS: Verwenden Sie sterile, PBS-basierte Scheidenflüssigkeit, die bei Raumtemperatur aufbewahrt wird.
2. Instrumentenqualitätskontrolle durchführen
   1. Führen Sie Qualitätskontrollverfahren für Instrumente gemäß den Anweisungen des Herstellers vor der Probenentnahme durch.
      HINWEIS: Gleichwertige, vom Hersteller empfohlene Qualitätskontroll-Workflows können bei alternativen Zellsortierern verwendet werden.
   2. Überprüfen Sie die Abwurfverzögerung und die Flussstabilität mit Kalibrierungskugeln.
3. Durchführung von Fluoreszenzkompensation
   1. Erwarb einfarbige Kompensationssteuerungen.
   2. Führen Sie vor dem Gating und Sortieren eine Fluoreszenzkompensation durch.
      HINWEIS: Berechnen Sie die Entschädigung mit unverfärbten und einzeln gefärbten Kontrollen. Verifiziere und passe die Kompensationsmatrizen manuell an, bevor du sie sortierst, wenn nötig.
4. Definiere die Gating-Strategie
   1. Ausschließen Sie Trümmer unter Verwendung von Vorwärtsstreu- und Seitenstreuparametern (Abbildung 3A,B).
   2. Gate-Einzelzellen verwenden Vorwärtsstreuhöhe versus Vorwärtsstreufläche und Seitenstreuhöhe versus Seitenstreufläche (Abbildung 3A,B).
   3. Ausschließen Sie tote Zellen durch das Gating von PI-negativen Zellen.
   4. Gate CD90.2-positive Zellen zur Thyrotrope-Anreicherung.
      HINWEIS: CD90.2-positive Zellen definieren Sie als Ereignisse mit einer Fluoreszenzintensität größer als 10³ im CD90-Detektionskanal (Abbildung 3C–F).
5. Bereite Sammelröhren vor.
   1. Bereiten Sie die Sammelrohre entsprechend der vorgesehenen nachgelagerten Anwendung vor.
      HINWEIS: Vorfüllen Sie Aufnahmeröhrchen mit niedriger Retention entweder mit 1 mL QIAzol-Lysereagenz zur RNA-Isolierung oder Medium 199, ergänzt mit 10 % kohlegestreiftem fetalem Rinderserum für Zellkulturanwendungen.
6. Sortiere CD90.2-positive Thyrotrope
   1. CD90.2-positive Einzelzellen in Sammelröhrchen sortieren.
   2. Zellen für RNA-Analyse sammeln
      1. Sammeln Sie die Zellen direkt in 1 ml Lysereagenz.
      2. Die Röhrchen für 1 Minute vortexen, um die Zellen zu lysieren.
      3. Frieren Sie die Proben sofort auf Trockeneis ein.
      4. Lagern Sie die Proben bei −80°C bis zur RNA-Extraktion.
   3. Zellen für die Primärkultur sammeln
      1. Sammeln Sie Zellen in einem Kulturmedium, das mit 10 % kohlegestreiftem fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wird.
      2. Säen Sie die Zellen in 8-Well-Glaskammer-Objektträger mit einer Dichte von mindestens 2 × 10⁵ Zellen pro Brunnen in einem Endvolumen von 200 μL.
      3. Kultivieren Sie die Zellen bis zu 72 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
         HINWEIS: Die akzeptable Kulturleistung wird durch sichtbare Zellanhaftung innerhalb von 24 Stunden, etwa 60–80% Bindungseffizienz und ≥70%–80% Lebensfähigkeit nach 72 Stunden angezeigt.
      4. Gib bei Bedarf 100 nM T3 zum Kulturmedium hinzu.
         HINWEIS: Beginnen Sie die T3-Behandlung nach der Zellanhaftung, typischerweise 24 Stunden nach dem Anrichten, und halten Sie die Behandlung bis zur Probenentnahme bei 72 Stunden aufrecht. Bereiten Sie T3-Serienlösung in 40 mM NaOH vor und beziehen Sie die mit dem Vehikel behandelten Kontrollen bei derselben Endlösungsmittelkonzentration ein.
         HINWEIS: Kohlegestreiftes Serum erhält eine TH-depleierte Kulturumgebung und verbessert den Nachweis der experimentell induzierten T3-abhängigen Unterdrückung der Tshb-Expression .

Abbildung 3. FACS-Gating-Strategie und Validierung der Thyrotrope-Anreicherung. (A,B) Sequentielle Gating-Strategie zur Isolierung lebensfähiger einzelner vorderer Hypophysenzellen. Gates umfassen den Ausschluss von Trümmern mittels Vorwärtsstreufläche (FSC-A) und Seitenstreufläche (SSC-A), Singlet-Diskriminierung mit Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) gegenüber FSC-A und Seitenstreuhöhe (SSC-H) gegenüber SSC-A sowie Ausschluss von Propidiumiodid-(PI)-positiven toten Zellen. (C–F) Repräsentative FACS-Diagramme zeigen die Identifizierung und Anreicherung von CD90.2-positiven und CD90.2-negativen Zellpopulationen mit einem phycoerythrin-cyanin-7 (PE-Cy7)-konjugierten Anti-CD90.2-Antikörper. (G–I) Reverse-Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) Validierung der Thyrotrope-Anreicherung in sortierten Zellpopulationen. Abkürzungen: FSC-A, Vorwärtsstreubereich; SSC-A, Seitenstreubereich; FSC-H, Vorwärtsstreu-Höhe; SSC-H, Seitenstreuhöhe; PI, Propidiumiodid; PE-Cy7, Phycoerythrin–Cyanin 7; NT, unbehandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Genexpressionsanalyse von Tshb-mRNA in CD90-positiven versus CD90-negativen Zellen mittels Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion

HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren in etwa 5 Stunden durch, um die Expression von Tshb mRNA in sortierten Zellpopulationen zu quantifizieren.

1. Sortierte Zellen zur RNA-Extraktion sammeln
   1. Gleiche Anzahl von CD90-positiven und CD90-negativen Zellen (2,5 × 10⁵ Zellen) in separaten 1,5-mL-Röhren mit 1 mL Lysereagenz sammeln.
2. Lyse die Zellen
   1. Die Proben energisch 1 Minute lang vorversetzen, um die Zellen vollständig zu lysieren, und die Proben auf Eis legen.
      HINWEIS: Lagern Sie lysierte Proben bei −80°C vor der RNA-Extraktion bei Bedarf auf.
3. Extraktion der Gesamt-RNA
   1. Extrahieren Sie die gesamte RNA gemäß den Herstelleranweisungen, die dem RNA-Extraktionskit beiliegen.
      HINWEIS: Führen Sie die DNase-Verdauung während der Reinigung mit RNase-freier DNase I gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um vor der Eluation die restliche genomische Desoxyribonukleinsäure (DNA) zu entfernen.
   2. Missen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer.
      HINWEIS: Verwenden Sie Proben mit einem A260/A280-Verhältnis von etwa 1,8–2,1 und einem A260/A230-Verhältnis von mehr als 1,8 für die komplementäre DNA-(cDNA)-Synthese.
4. cDNA synthetisieren
   1. Synthetisieren Sie cDNA aus 100 ng Gesamt-RNA gemäß den Herstelleranweisungen, die dem Erststrang-cDNA-Synthesekit beiliegen.
      HINWEIS: Verwenden Sie Oligo(dT)-Primer während der cDNA-Synthese.
   2. Bereiten Sie die Vorlagen-Primer-Mischung gemäß Tabelle 1 vor.
   3. Die Reagenzien vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.
   4. Denaturieren Sie die Vorlagen-Grunder-Mischung bei 65 °C für 10 Minuten.
   5. Kühlen Sie die Proben sofort auf dem Eis ab.
   6. Bereiten Sie das Reverse-Transkriptions-Reaktionsgemisch gemäß Tabelle 2 vor, um ein Endvolumen von 20 μL zu erhalten.
      HINWEIS: Bereiten Sie eine Mastermischung vor, indem Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Reagenzvolumina mit der Gesamtzahl der Proben multiplizieren und zusätzlich 10 % überschüssiges Volumen hinzufügen, um die Pipettenvariabilität zu berücksichtigen.
   7. Die Reaktion vorsichtig ohne Vortex mischen und kurz zentrifugieren.
   8. Die Reaktion 60 Minuten bei 50 °C inkubieren.
   9. Inaktiviere die Reaktion bei 85°C für 5 Minuten.
   10. Kühlen Sie die Proben auf Eis.
   11. Fahren Sie direkt mit der Reverse-Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) fort oder lagern Sie die cDNA bei −30°C bis zur Nutzung.
       HINWEIS: cDNA kann unter nukleasefreien Bedingungen bis zu 6 Monate bei −30°C gelagert werden. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
       HINWEIS: Führen Sie cDNA-Syntheseschritte in einem Thermocycler durch, der mit einem beheizten Deckel ausgestattet ist, um die Verdunstung zu minimieren.
5. Bereite die RT-qPCR-Reaktionsmischung vor
   1. Bereiten Sie das RT-qPCR-Reaktionsgemisch gemäß Tabelle 3 vor.
6. Laden Sie die RT-qPCR-Platte
   1. Fügen Sie 9 μL RT-qPCR-Reaktionsgemisch zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu.
   2. Fügen Sie 1 μL cDNA-Vorlage hinzu, die dem umgekehrt transkribierten Produkt entspricht, das aus 5 ng Gesamt-RNA erzeugt wird.
   3. Mischen Sie die Proben vorsichtig und zentrifugieren Sie kurz.
7. RT-qPCR durchführen
   1. Führen Sie RT-qPCR gemäß den Herstelleranweisungen aus, die mit dem SYBR Green Master-Mix mitgeliefert werden.
      HINWEIS: Verwenden Sie einen ersten Denaturierungsschritt von 95°C für 2 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit 95°C für 5 Sekunden und 60 °C für 30 Sekunden. Erfassen Sie am Ende jedes Erweiterungsschritts Fluoreszenz. Führen Sie eine Schmelzkurvenanalyse von 65°C bis 95°C in 0,5°C-Schritten durch, um die Verstärkung eines Einzelprodukts zu überprüfen.
8. Normalisiere den Tshb-Ausdruck
   1. Normalisieren Sie die Tshb-Expression mit der ΔCt-Methode zur Cyclophilin A (CyA)-Expression.
      HINWEIS: Validieren Sie die CyA-Stabilität vor der Analyse durch minimale CT-Variation zwischen experimentellen Gruppen.
9. Berechnung der relativen Genexpression
   1. Berechnen Sie die relative Tshb-Expression in CD90-positiven Zellen relativ zu CD90-negativen Zellen mit der 2^{−ΔΔCT-Methode} .
      HINWEIS: Führen Sie eine RT-qPCR-Analyse mit acht biologischen Proben durch, die jeweils in technischen Duplikatreaktionen analysiert werden (Abbildung 3G–I).

Reagenz	Band	Endmenge/Konzentration
Gesamt-RNA	Variable	100 ng
Verankerter Oligo(dT)18-Primer (50 pmol/μL)	1 μL	2,5 μM
PCR-fähiges Wasser	Variable	Stellen Sie auf 13 μL Gesamtvolumen ein
Gesamt	13 μL	—

Tabelle 1: Vorlage-Primer-Mischungsvorbereitung für komplementäre Desoxyribonukleinsäure-Synthese. Reagenzien, Volumina und Endmengen zur Herstellung der Vorlage-Primer-Mischung für die komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA)-Synthese verwendet werden. Jede Reaktion enthielt insgesamt 100 ng Ribonukleinsäure (RNA), einen verankerten Oligo(dT)18-Primer und Wasser der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Qualität, angepasst auf ein Endvolumen von 13 μL. Die gemeldete Konzentration von 2,5 μM bezieht sich auf die Primerkonzentration in der 13 μL Template–Primer-Mischung vor der Zugabe der Komponenten der Reverse-Transkriptionsreaktion.

Reagenz	Band	Endmenge/Konzentration
Reverse-Transkriptase-Reaktionspuffer des Transkriptors (5×)	4 μL	1×
Protektor-RNase-Inhibitor (40 U/μL)	0,5 μL	20 U
Desoxynukleotidmischung (je 10 mM)	2 μL	Je 1 mM
Transkriptor-Reverse-Transkriptase (20 U/μL)	0,5 μL	10 U
Vorlage-Primer-Gemisch (Tabelle 1)	13 μL	—
Gesamt	20 μL	—

Tabelle 2: Umkehr-Transkriptions-Reaktionsmischung zur komplementären Desoxyribonukleinsäuresynthese. Reagenzien, Volumina und Endkonzentrationen, die für die Synthese der komplementären Desoxyribonukleinsäure (cDNA) im ersten Strang verwendet werden. Das Endreaktionsvolumen betrug 20 μL. Die gemeldeten Deoxynukleotid-Triphosphatkonzentrationen (jeweils 1 mM) beziehen sich auf die Endkonzentrationen in der vollständigen Reaktionsmischung.

Reagenz	Band	Endmenge/Konzentration
PowerTrack SYBR Green Master Mix (2×)	5 μL	1×
Tshb Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotidprimer (siehe Materialtabelle)	0,5 μL	400 nM
PCR-fähiges Wasser	3,5 μL	Anpassung auf 9 μL Reaktionsvolumen
Subtotales Reaktionsvolumen	9 μL	—
cDNA-Vorlage	1 μL	5 ng
Endreaktionsvolumen	10 μL	—

Tabelle 3: Reverse-Transkription-quantitative Polymerase-Kettenreaktionsmischungsvorbereitung. Reagenzien, Volumina und Endkonzentrationen, die für die Amplifikation der Umkehrtranskription der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) der Tshb-Bobotensäure (mRNA) verwendet werden. Das Reaktionsmischungsvolumen vor der Zugabe der Vorlage betrug 9 μL. Fügen Sie unmittelbar vor der Amplifikation 1 μL komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA)-Vorlage hinzu, um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 10 μL zu erhalten.

Ergebnisse

Zwölf 8 Wochen alte C57BL/6 Mäuse (6 Männchen und 6 Weibchen) wurden mit MMI und KClO₄ in Trinkwasser zusammen mit einer jodmangeligen Ernährung behandelt, um eine Hypothyreose auszulösen (Abbildung 1A). Die Expression von Lebertyp 1 Dio1 mRNA wurde bei Mäusen in Euthyroid- und Hypothyreoidmäusen quantifiziert, um eine erfolgreiche Hypothyreose-Induktion^{zu bestätigen 29}. Hypothyreosemäuse zeigten eine etwa 60%ige Reduktion de...

Diskussion

Das hier beschriebene CD90-basierte FACS-Protokoll bietet eine reproduzierbare Methode, um primäre Thyrotrope aus adultem Maus-Hypophysengewebe zu bereichern und gleichzeitig die hormonelle Reaktion zu erhalten. Diese Methode adressiert eine langjährige technische Einschränkung in der Untersuchung der Thyrotropebiologie und der Regulation der HPT-Achsen. Historisch gesehen stützten sich Untersuchungen zur Thyrotrope-Regulation stark auf die TαT1-Zelllinie; allerdings zeigen TαT1-Zellen e...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 µm-Filter	Corning	430769	Zur Sterilisation des Sammelmediums
0,22 µm-Spritzenfilter	Pall Life Sciences	PN4602	Zur Sterilisation von Collagenase
0,5% Trypsin–EDTA	Gibco	15400-054	Zur Zelldissoziation
1,5-ml-Mikrozentrifugenrohre mit niedriger Bindungsfähigkeit	Invitrogen	AM12450	Zur FACS-Färbung
15-ml-Polypropylenröhrchen	Falcon	352097	Zur Sammlung des anterioren Lappens und Zelldissoziation
23-Gauge-Nadel	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	Für die kardiale Perfusion
8-Well-Glaskammer-Schieber	Millipore	PEZGS0816	Für die Post-FACS-Kultur
Accudrop-Kugeln	BD Biosciences	345249	Zur Tropfenverzögerungskalibrierung während FACS
Anti-Maus PE-Cy7-Anti-CD90.2-Antikörper	Invitrogen	25-0902-82	Zur FACS-Färbung
Automatischer Zellzähler	DeNovix	s-10700	Zur Zellzählung
Charcoal-extrahiertes fetales Kälberserum	Gibco	12676029	Zur Post-FACS-Thyrotropenkultur
Collagenase aus Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9263	Zur Zelldissoziation
Sammelwanne	Standard Labordissektionsschale	N/A	Für die kardiale Perfusion
Benutzerdefinierte HEPES-gepufferte Salzlösung (HBSS) ohne Ca2+ und Mg2+	N/A	N/A	Zur Perfusion und Zelldissoziation
Cyclophilin A (CyA) Oligonukleotid-Primer vorwärts	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	Für RT-qPCR
Cyclophilin A (CyA) Oligonukleotid-Primer rückwärts	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	Für RT-qPCR
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	Zum Sammelmedium
DNase I-Lösung	Promega	M6101	Zur Zelldissoziation
Enoxaparin-Natrium-Injektion	Sandoz	0781-3119-64	Zur Perfusion
Fetales Kälberserum (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	Zum Sammelmedium
Flow-Zytometrie-Färbepuffer	Invitrogen	00-4222-26	Zur FACS-Färbung
Hämostat	Fine Science Tools	13008-12	Zur Stabilisierung der Brusthöhle
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	Zum Sammelmedium
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	Zur HBSS-Zubereitung
Jodarme Diät	Envigo	TD.95007	Zur Induktion von Hypothyreose in vivo
Iris-Pinzette	Fine Science Tools	11065-07	Zur Hypophysensektion
Isofluran	Piramal Critical Care	66794-017-25	Zur Anästhesie
L-Glutamin	Gibco	35050-061	Zum Sammelmedium
Medium 199	Gibco	11150-059	Zur Post-FACS-Kultur
Methimazol (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	Zur Induktion von Hypothyreose in vivo
MicroAmp Fast 96-Well-Reaktionsplatte	Applied Biosystems	4346907	Für RT-qPCR
Penicillin–Streptomycin	Gibco	15140122	Zur Post-FACS-Kultur
Peristaltische Pumpe	Fisher Scientific	GP1000	Für die kardiale Perfusion
Kaliumperchlorat (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	Zur Induktion von Hypothyreose in vivo
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	Für RT-qPCR
Propidiumiodid	eBioscience	00-6990-50	Zur Lebensfähigkeitsfärbung während FACS
QIAzol Lysis-Reagenz	Qiagen	79306	Zur RNA-Extraktion
Silikonschlauch	Cole-Parmer	EW-96410-13	Für die kardiale Perfusion
Stereomikroskop	Nikon	SMZ-745T	Zur Hypophysendissektion
StepOnePlus Echtzeit-PCR-System	Applied Biosystems	4376600	Für RT-qPCR
Chirurgischer Löffel	Fine Science Tools	10090-13	Zum Anheben des Gehirns während der Hypophysenexposition
Transcriptor First Strand cDNA-Synthese-Kit	Roche	4379012001	Zur cDNA-Vorbereitung
Trypanblau	Thermo Fisher Scientific	T10282	Zur Zellzählung
Tshb Oligonukleotid-Primer vorwärts	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3′	Für RT-qPCR
Tshb Oligonukleotid-Primer rückwärts	Integrated DNA Technologies	5′-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3′	Für RT-qPCR
Wasserbad	Fisher Scientific Isotemp Wasserbad	15-462-5Q	Für enzymatische Verdauung