Ethische Erklärung
Die Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von dem Medizinischen Ethikkomitee des Krankenhauses für Traditionelle Chinesische Medizin Ganzhou genehmigt (Genehmigungsnummer: GZSZYYKYLL20240092, Datum: 2024-12-20).
Alle in diesem Protokoll verwendeten Materialien, Reagenzien, Testkits und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
Studienaufbau
Diese retrospektive Fall-Kontroll-Studie umfasste 62 Patientinnen mit PCOS, die zwischen Juni 2024 und August 2025 in der gynäkologischen Ambulanz des Krankenhauses für Traditionelle Chinesische Medizin in Ganzhou diagnostiziert wurden, sowie 71 gesunde Frauen im gebärfähigen Alter, die im gleichen Zeitraum im Gesundheitsmanagementzentrum des Krankenhauses untersucht wurden. Die Kontrollgruppe wurde hinsichtlich des Alters auf Gruppenebene vergleichbar ausgewählt; der BMI wurde nicht als Matchingsvariable verwendet und stattdessen als Basischarakteristikum bewertet.
Studienteilnehmer
Einschlusskriterien: Die Einschlusskriterien für die PCOS-Gruppe waren wie folgt: (1) Alter >18 Jahre; (2) Diagnose eines PCOS gemäß den modifizierten Rotterdam-Kriterien, wie sie in der internationalen, evidenzbasierten Leitlinie von 2023 empfohlen werden, wozu mindestens zwei der folgenden drei Merkmale nach Ausschluss verwandter Erkrankungen erforderlich sind: Oligoovulation oder Anovulation, definiert als Menstruationszyklen länger als 35 Tage oder weniger als acht Zyklen pro Jahr; klinische Hyperandrogenie und/oder biochemische Hyperandrogenie, wobei letztere als Konzentration von serumgebundenem Gesamttestosteron oberhalb der assay-spezifischen oberen Referenzgrenze definiert ist; sowie polyzystische Ovarmorphologie, definiert als mindestens 20 Follikel in einem Ovar oder ein Ovarvolumen von mindestens 10 mL, wenn eine vollständige Follikelzählung nicht möglich war14; (3) vollständige elektronische Patientenakten; (4) keine Hormonersatztherapie, keine blutzuckersenkenden Wirkstoffe oder Immunsuppressiva in den letzten drei Monaten vor der Studie; und (5) Vorhandensein einer nüchternen Serumprobe, die bei der Einschreibung entnommen und in der institutionellen Biobank eingelagert wurde.
Die Einchlusskriterien für die Kontrollgruppe waren wie folgt: (1) Teilnahme an einer Gesundheitsuntersuchung im gleichen Zeitraum; (2) regelmäßige Menstruationszyklen; (3) normale ovarielle Morphologie in der transvaginalen Sonographie; (4) keine Vorgeschichte endokriner Störungen, gynäkologischer Erkrankungen, Unfruchtbarkeit oder klinisch bedeutsamer hepatischer oder renaler Funktionsstörungen; und (5) Verfügbarkeit einer nüchternen Serumprobe, die am Tag der Untersuchung entnommen und in der institutionellen Biobank aufbewahrt wurde.
Die Ausschlusskriterien waren wie folgt: (1) Endometriose, Uterusmyome, Ovarialtumore, Beckenentzündung oder andere gynäkologische Erkrankungen; (2) Schilddrüsenfunktionsstörung, Cushing-Syndrom, Hyperprolaktinämie, congenitale Nebennierenrindenhyperplasie oder andere endokrine Erkrankungen, die eine ovulatorische Dysfunktion oder Hyperandrogenie erklären könnten; (3) schwere kardiale, hepatische, renale oder pulmonale Funktionsstörungen, maligne Tumore, Autoimmunerkrankungen oder hämatologische Erkrankungen; (4) Schwangerschaft, Entbindung oder Abtreibung innerhalb der letzten 6 Monate; (5) Einnahme von Glukokortikoiden, oralen Kontrazeptiva oder anderen Medikamenten, die den Glukose- oder Lipidstoffwechsel beeinflussen, innerhalb der letzten 3 Monate; (6) psychiatrische Erkrankungen oder kognitive Beeinträchtigungen; (7) fehlende wesentliche klinische Angaben; und (8) schwere Serumhämolyse, definiert als Hämoglobinkonzentration >2,0 g/L, Lipämie, Ikterus, mehr als ein Gefrier-Tau-Zyklus oder unterbrochene Probenaufbewahrung. Eine Schilddrüsenfunktionsstörung, Hyperprolaktinämie und eine nicht-klassische congenitale Nebennierenrindenhyperplasie wurden mithilfe der Messung von Thyreotropin, Serumprolaktin bzw. 17-Hydroxyprogesteron ausgeschlossen; follikelstimulierendes Hormon wurde gegebenenfalls überprüft, während bei klinischer Indikation ein Cushing-Syndrom oder ein Nebennierentumor abgeklärt wurde. Auf alle klinischen Proben wurde dasselbe präanalytische Verfahren angewandt, und keine Probe, die in die primäre Analyse einging, wurde mehr als einmal gefroren und aufgetaut.
Sammlung und Lagerung von Serumproben
Nüchternes venöses Blut (10 mL) wurde morgens in rohrförmige Behältnisse ohne Antikoagulans gegeben, 30 min bei Raumtemperatur gerinnen lassen und anschließend 15 min bei 4 °C mit 1.505 x g zentrifugiert. Das Serum wurde in Aliquots zu je 200 µL portioniert und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert. Bei allen klinischen Proben wurde dasselbe präanalytische Verfahren angewandt, und keine Probe, die in die primäre Analyse eingeschlossen wurde, wurde mehr als einmal aufgetaut und erneut eingefroren.
Vorbereitung der Proben zur methodischen Validierung
Zehn gepoolte Serumproben von gesunden Probanden wurden verwendet, um die Auswirkungen der Zentrifugationsgeschwindigkeit (1.505, 3.000 und 4.000 × g für 15 min), der Einfrier- und Auftauhäufigkeit (0, 1, 3 und 5 Zyklen), der Lagertemperatur (4 °C, −20 °C und −80 °C für 7 Tage), der Lagerdauer (1, 3, 6 und 12 Monate bei −80 °C) sowie der Hämolyse (<0,1, 0,1–0,5 und 0,5–2,0 g/L Hämoglobin) zu bewerten.
Laboruntersuchung
Alle Laboranalysen wurden von derselben geschulten Technikerin unter standardisierten Umweltbedingungen und gemäß vorgegebenen Arbeitsanweisungen durchgeführt. Serum-miRNAs wurden mittels qRT-PCR quantifiziert; ADPN, LEP und RBP4 wurden mittels Sandwich-ELISA bestimmt; T und IL-6 wurden mittels chemilumineszenzbasierter Immunoassays gemessen; und die Parameter des Glukosestoffwechsels wurden mit routinemäßigen automatisierten Laborverfahren ermittelt.
Quantifizierung von serumgebundenen miRNAs mittels qRT-PCR
Gesamt-RNA wurde aus 200 µL Serum unter Verwendung des TRIzol-Reagenz extrahiert. Spektrophotometrische Daten zur RNA-Konzentration und zur Reinheit (A260/A280) lagen für die archivierten serumgebundenen RNA-Präparationen nicht vor. Die Akzeptanz des qRT-PCR-Assays wurde daher anhand eines einzelnen, spezifischen Schmelzkurven-Peaks sowie der Übereinstimmung zwischen drei technischen Wiederholungen beurteilt. Nach Phasentrennung mittels Chloroform, Isopropanolpräzipitation und zwei Waschschritten mit 75 %igem Ethanol wurde das RNA-Pellet in enzymfreiem Wasser resuspendiert. Das 20 µL große Reaktionsgemisch enthielt 4 µL 5x-Puffer, 1 µL Reverse Transkriptase, 1 µL 10 µM Stamm-Schleife-Primer und 5 µL RNA-Template. Die Reaktionsbedingungen betrugen 16 °C für 30 min, 42 °C für 30 min und 85 °C für 5 s. Die revers transkribierten Produkte wurden bei −20 °C gelagert. Die quantitative PCR wurde mit dem TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II Kit durchgeführt. Jede 20 µL große Reaktion enthielt 10 µL 2× SYBR-Mastermix, jeweils 0,8 µL Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 µM) sowie 2 µL cDNA-Template. Die Amplifikation erfolgte auf einem Applied Biosystems 7500 Echtzeit-PCR-System unter folgenden Bedingungen: Vor-Denaturierung bei 95 °C für 30 s; 40 Zyklen mit 95 °C für 5 s und 60 °C für 30 s; anschließend wurde eine Schmelzkurvenanalyse zur Bestätigung der Amplifikationsspezifität durchgeführt. U6 snRNA diente als interner Referenzgen, und die relativen Expressionsniveaus von miR-146a, miR-642a und miR-2861 wurden nach der 2-ΔΔCt-Methode berechnet. Jede Probe wurde dreifach getestet. Die Sequenzen aller in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Nachweis von Serumproteinkennzeichen
Die Konzentrationen von ADPN, LEP und RBP4 im Serum wurden mittels Doppelantikörper-Sandwich-ELISA unter Verwendung des Human Total ADPN/Acrp30 Quantikine ELISA Kit (analytische Empfindlichkeit: 0,891 ng/mL; Messbereich: 3,9–250 ng/mL), des Human Leptin Quantikine ELISA Kit (analytische Empfindlichkeit: 7,8 pg/mL; Messbereich: 15,6–1.000 pg/mL) bzw. des Human RBP4 Quantikine ELISA Kit (analytische Empfindlichkeit: 0,628 ng/mL; Messbereich: 1,56–100 ng/mL) bestimmt. Jeder Assay war spezifisch für das entsprechende humane Analyt, und die Serumproben wurden gemäß den Herstelleranweisungen verdünnt. Die Extinktion wurde bei 450 nm gemessen, und die Konzentrationen wurden anhand von Standardkurven mit vierparametrischer logistischer Regression berechnet. Die Variationskoeffizienten innerhalb oder zwischen den Assays betrugen für ADPN 2,5 % bzw. 3,2 %, für LEP 2,7 % bzw. 3,4 % und für RBP4 2,6 % bzw. 3,3 %.
T-Messung
Das serumseitige T wurde mittels Elektrochemilumineszenz-Immunoassay unter Verwendung eines automatisierten Immunoassay-Analysators Roche Cobas e601 gemessen.
Glukosemetabolische und entzündliche Messungen
Werte für nüchternes Plasma-Glukose, nüchternes Insulin und HbA1c wurden aus klinischen Routine-Laborbefunden desselben Tages entnommen, nicht aus den archivierten Serumaliquote, die für die miRNA- und metabolischen Proteinanalysen verwendet wurden. Die Konzentration von nüchternem Plasma-Glukose wurde mittels der Glukose-Oxidase-Methode bestimmt, nüchternes Insulin durch Immuntrübungsmessung und HbA1c durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie. Der HOMA-IR-Wert wurde berechnet als [nüchternes Plasma-Glukose (mmol/L) × nüchternes Insulin (mIU/L)]/22,5. Serum-IL-6 wurde mittels chemilumineszenzbasiertem Immunoassay gemessen.
Methodologische Validierung
Die Vergleiche mit alternativen Methoden wurden durchgeführt, um zu ermitteln, ob die primären Messungen gegenüber der verwendeten Testplattform robust waren, und dienten nicht der Erzeugung der wesentlichen Ergebnisse zwischen den Gruppen. Die Expressionslevel der drei miRNAs und der fünf biochemischen Marker wurden unter den oben beschriebenen unterschiedlichen Aufarbeitungsbedingungen bestimmt, und der Variationskoeffizient für jeden Indikator wurde berechnet als CV = (Standardabweichung/Mittelwert) × 100 %. Eine CV <15 % wurden als akzeptabel angesehen, um die Stabilität der Testergebnisse unter verschiedenen Bedingungen der Probenverarbeitung und -lagerung zu bewerten. Die Präzision innerhalb eines Tages wurde durch zehnfache Wiederholungsmessung derselben gepoolten Serumprobe an einem einzigen Tag ermittelt, während die Präzision zwischen den Tagen anhand von einmal täglich durchgeführten Messungen über fünf aufeinanderfolgende Tage bestimmt wurde. Für jeden Parameter wurden der Mittelwert, die Standardabweichung und der entsprechende Variationskoeffizient (CV) berechnet. Zur Überprüfung der analytischen Übereinstimmung wurden fünf biochemische Analyten – ADPN, LEP, RBP4, IL-6 und T – in den Validierungsproben mittels des primären Assays und einer Roche-Chemilumineszenz-basierten Immunoassay-Plattform gemessen. Zur Berechnung der Übereinstimmungsgrenzen mit 95 % wurde die Bland-Altman-Analyse verwendet. Der primäre qRT-PCR-Assay wurde für alle klinischen miRNA-Messungen eingesetzt, während das miScript SYBR Green PCR Kit lediglich als orthogonale Methode im analytischen Übereinstimmungsexperiment verwendet wurde; zwischen den beiden qRT-PCR-Systemen wurden Pearson-Korrelationskoeffizienten berechnet.
Statistische Analyse
Die Datenanalyse wurde mit statistischer Software durchgeführt. Alle stetigen Variablen wurden zunächst mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung überprüft. Normalverteilte Daten werden als Mittelwert angegeben ± Standardabweichung. Der Vergleich zwischen zwei Gruppen erfolgte mittels des t-Tests für unabhängige Stichproben, während der Vergleich mehrerer Gruppen mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt wurde, gefolgt vom LSD-t-Test für paarweise Vergleiche. Daten, die keiner Normalverteilung folgten, werden als Median (Interquartilbereich) [M (P25, P75)] angegeben. Der Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde dann mit dem Mann-Whitney-U-Test und der Vergleich mehrerer Gruppen mit dem Kruskal-Wallis-H-Test durchgeführt. Kategoriale Daten wurden als Häufigkeiten und Prozentangaben dargestellt. Wir verwendeten den χ2 Test oder Fishers exakter Test zum Vergleich der Gruppen. Die Korrelationen zwischen den Variablen wurden je nach Datenverteilung mittels Pearson-Korrelationsanalyse oder Spearman-Rangkorrelationsanalyse untersucht. In einer explorativen Analyse wurden die Pearson-Korrelationen zwischen jedem miRNA und den sechs metabolischen Markern innerhalb der nicht adipösen (BMI <28 kg/m²2) und adipös (BMI ≥28 kg/m²2) PCOS-Subgruppen. Die Korrelationskoeffizienten wurden mittels Fishers r-zu-z-Transformation verglichen, und die sich ergebenden Unterschiede zwischen den Subgruppen p Die Werte wurden mithilfe des Benjamini-Hochberg-Verfahrens zur Kontrolle der falschen Entdeckungsrate angepasst. Die diagnostische Aussagekraft wurde anhand von Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurven und der Fläche unter der Kurve (AUC) bewertet. Zusätzlich wurde die kombinierte Detektion mittels eines logistischen Regressionsmodells analysiert. Alle Tests waren zweiseitig, und p < Ein Wert von 0,05 galt als statistisch signifikant.