Methodenartikel

Messung der Auswirkungen pharmakologischer Verbindungen auf die mitochondriale Morphologie in Mausalterungsmodellen

DOI:

10.3791/71930

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4. August 2026

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1Division of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2MicRoN Core, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Messung der Wirkung von Medikamenten, die über implantierbare osmotische Minipumpen auf die mitochondriale Morphologie in alternden Mausmodellen verabreicht werden. Es wird eine dreidimensionale (3D) superauflösende konfokale Bildgebung von Mauslebern durchgeführt und eine Pipeline für unvoreingenommene Segmentierung, Klassifikation und quantitative Analyse mitochondrialer Strukturen entwickelt.

Zusammenfassung

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Altersbedingte molekulare Schädenansammlung kann zu Veränderungen der mitochondrialen Morphologie und metabolischen Dysfunktion beitragen, insbesondere in Geweben mit hohem Energieverbrauch. Pharmakologische Verbindungen, die metabolische Dysfunktionen lindern und gesunde, 'junge' mitochondriale Morphologien wiederherstellen, können daher wirksame Methoden darstellen, um die Gesundheitsspanne (d. h. den Teil der Lebenserwartung, der frei von der Belastung altersbedingter chronischer Erkrankungen ist) bei Säugetieren zu verlängern. Darin werden Methoden zur Durchführung von subkutanen osmotischen Pumpenimplantationen bei gealterten Mäusen zur stabilen Abgabe hydrophober pharmakologischer Verbindungen beschrieben. Anschließend werden Gewebe fixiert, kryosektioniert, gefärbt und mittels Superauflösungs-Konfokallichtmikroskopie abgebildet. Abschließend wird eine automatisierte Pipeline für die dreidimensionale Segmentierung, Klassifikation und quantitative Messung mitochondrialer Strukturen präsentiert. Daher können diese Methoden nützlich sein, um Veränderungen der mitochondrialen dreidimensionalen Struktur in verschiedenen Geweben im Laufe der Lebensdauer der Maus quantitativ zu bewerten. Darüber hinaus können diese Techniken bei der reproduzierbaren Identifikation von kleinmolekularen Medikamenten helfen, die altersbedingte Stoffwechselstörungen lindern.

Einleitung

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Mitochondrien sind doppelt membrangebundene Organellen, die räumlich und zeitlich organisiert sind, um den aktuellen Stoffwechselbedarf ihrer Wirtszelle und ihres Gewebesgerecht zu werden. Invaginationen in der inneren Membran, sogenannte Cristae, werden durch eine dynamische Koordination zwischen nicht-doppelschichtigen inneren Membranphospholipiden wie Cardiolipin und Phosphatidylethanolamin, Reihen von ATP-Synthasedimeren an den Cristae-Spitzen, Cardiolipin-bindenden Oligomeren der dynaminähnlichen GTPase Optic Atrophy 1 (OPA1) an der Spitze der Cristae sowie Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System (MICOS)-Komplexen an den Cristae-Übergängen1 gebildet und organisiert. Diese inneren Membranstrukturen subkompartimentieren Mitochondrien in einzelne funktionelle Einheiten2 und bieten eine größere Oberfläche, auf der sich die mitochondrialen transmembranen, potenzialproduzierenden Atemkomplexe zusammensetzen können1. Als dynamische Organellen mit sekundären zellulären Funktionen, die mit der apoptotischen Signalgebung3, Ca2+ und der Homöostase der reaktiven Sauerstoffspezies3 sowie der Lipidbiosynthese4 zusammenhängen, sind mitochondriale morphologische Strukturen hochempfindlich gegenüber Umweltveränderungen wie verminderter Sauerstoffverfügbarkeit5 und erhöhter Ca2+ Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum 6,7.

Die Ansammlung von molekularen Schäden trägt im Alter von8 Jahren zu Veränderungen der mitochondrialen Struktur und Funktion bei. Bahnbrechende Kryo-Elektronen-Tomographie-(Kryo-ET)-Studien der Kühlbrandt-Gruppe an mehreren Modellorganismen haben eine klare Korrelation zwischen Kristalldichte und Atmungskapazität sowie eine altersabhängige Abnahme der Kristalldichte und den damit verbundenen Verlust der ATP-Synthase-Dimeren 9,10 gezeigt. Darüber hinaus können Veränderungen im mitochondrialen Volumen durch eine beeinträchtigte Mitochondrienspaltung und -fusionsdynamik11, erhöhte Lipidansammlung12 und erhöhte Schwellung13 entstehen. In der Skelettmuskulatur kann VO2 max, ein starker Prädiktor für die Lebenserwartung14,15, anhand des Ausmaßes der intermyofibrillaren mitochondrialen Fragmentierung und der Kristalldichte16 genau vorhergesagt werden.

Wenig überraschend können altersbedingte strukturelle und funktionelle Veränderungen in Mitochondrien zur Entstehung mehrerer chronischer Krankheiten beitragen 17,18,19,20. Eine verstärkte mitochondriale Fragmentierung und Veränderungen in der mitochondrialen Biogenese und Morphologie sind sowohl mit Alzheimer als auch Parkinson assoziiert20. Diese Veränderungen führen zu Störungen der oxidativen Phosphorylierungskomplexe, was die Erzeugung der Protonenantriebskraft beeinträchtigt und zu einer übermäßigen Produktion reaktiver Sauerstoffspeziesführt. Bei altersbedingten Herzfunktionsstörungen und Herzinsuffizienz tragen erhöhte mitochondriale Fragmentierung, Schwellungen, Vakuolisierung und Verlust der Kristalldichte zu einer verminderten ATP-Produktionbei 23,24. Diese strukturellen Veränderungen könnten teilweise mit veränderter mitochondrialer Ca2+-Handhabung und erhöhter Aktivität der mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangspore 6,7,13,25 zusammenhängen. Als mutmaßlicher Regulator der Mitophagie kann eine übermäßige Öffnung der Permeabilitäts-Übergangspore während des Alterns stattdessen zerstörerisch sein und zu unkontrolliertemZelltod führen. Schließlich ist bekannt, dass altersbedingte Defizite im mitochondrialen Lipidstoffwechsel und in der Mitophagie ebenfalls zur Entwicklung der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankungbeitragen können. Insbesondere wurde gezeigt, dass hepatische Steatose von erhöhtem oxidativem Stress und verstärkter Bildung donutartiger mitochondrialer Strukturenbegleitet wird 3,27.

Daher besteht großes Interesse an der Entwicklung von Therapeutika, die altersbedingte Rückgänge der mitochondrialen Funktion ansprechen, um die Lebensqualität von Menschen mit bestimmten chronischen Erkrankungen zu verbessern. Forzinity (Elamipretid), ein lipid-interaktives Peptid, das das innere Membranoberflächenpotential28 abschwächt und die mitochondriale ATP-Generierung29,30 erhöht, wurde kürzlich das erste von der FDA zugelassene, mitochondrienziele Medikament zur Behandlung des Barth-Syndroms. Das Barth-Syndrom ist eine X-chromosomale Erkrankung, bei der Defekte bei der Cardiolipin-Remodellierung zur Kardiomyopathie, Schwäche der Skelettmuskulatur und zur vorzeitigen Sterblichkeitbeitragen. Obwohl die kurzfristige Behandlung keine nachweisbaren Veränderungen des biologischen Muskelalters bei gealterten Mäusen32 bewirkte, zeigte die Elamipretid-Behandlung wiederholte Verbesserungen der funktionellen Altersparameter, wie etwa kardiale Auswurffraktion und globale Longitudinaldehnung32,33, Muskelermüdung und Krafterzeugung 33,34,35 sowie Gebrechlichkeit32. Urolithin A, ein aus dem Darm gewonnenes Ellagitannin, das Mitophagie36 induziert, zeigte ebenfalls klinische Verbesserungen bei der aeroben Muskelausdauer und -kraft37,38 sowie positive Effekte auf Herzstörungen bei gealterten Mäusen und Rattenmodellen der induzierten Herzinsuffizienz39. Metformin, ein Antidiabetikum, das nachweislich mit Komplex I40 wechselwirkt, wird ebenfalls als partielles Mimetium der Kalorienrestriktion 41,42 vorgeschlagen. Während die Metforminbehandlung in früheren epidemiologischen Daten 43,44 mit einem verringerten Krebsrisiko und verzögertem kognitiven Abbauin Verbindung gebracht wurde, bleibt ihre Auswirkungen auf Gesundheit und Lebenserwartung bei nicht-diabetischen Patienten weiterhin eine offene Frage45. Schließlich kann die Behandlung mit Nikotinamid-Ribosid, einem NAD+-Vorläufer, die mitochondriale Biogenese und die mitochondriale Unfolded Protein-Antwort hochregulieren, um die Energieerzeugung zu verbessern 46,47,48,49, aber die Langzeitbehandlung bei UM-HET3-Mäusen hatte keinen signifikanten Einfluss auf den Median der Maus oder die Lebensspanne im 90. Perzentil (50).

Darin werden Methoden zur Herstellung von Geweben alter Mäuse beschrieben, die mit pharmakologischen Verbindungen behandelt wurden, für eine superauflösende konfokale Bildgebung der mitochondrialen Morphologie. Eine erfolgreiche Implantation osmotischer Minipumpen für eine nachhaltige Arzneimittelabgabe bei Mäusen wird nachgewiesen, und die Lebern werden auf die Wirkung der Behandlung auf die äußere Membranstruktur analysiert. Abschließend wird eine Analysepipeline für unvoreingenommene, reproduzierbare quantitative Messungen von mitochondrialem, Oberfläche und Sphärizität sowie zur Klassifikation der Mitochondrien in verschiedene Strukturen präsentiert. Daher sind diese Methoden sowohl für die Untersuchung von Veränderungen der mitochondrialen Morphologie im Laufe der Lebensspanne des Säugetiers als auch für die Identifizierung pharmakologischer Verbindungen, die altersbedingte Rückgänge der metabolischen Gesundheit abmildern können, anwendbar.

Protokoll

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Alle Verfahren mit Versuchstieren wurden gemäß institutionellen Richtlinien für die Verwendung von Labortieren durchgeführt und von den Komitees für Tierpflege und -nutzung des Brigham and Women's Hospital sowie der Harvard Medical School gemäß Protokoll Nr. 2016N000368 genehmigt. Forscher, die dieses Protokoll in anderen Ländern anwenden möchten, sollten ihre lokalen institutionellen und regulatorischen Behörden konsultieren, um die Einhaltung der geltenden Tierschutzvorschriften sicherzustellen.

1. Implantation der subkutanen osmotischen Pumpe

HINWEIS: Tieroperationen sollten nur von erfahrenem, geschultem Personal durchgeführt werden, und es ist große Sorgfalt geboten, um Tierstress und/oder Leid zu minimieren. Führen Sie Verfahren mit Versuchstieren ausschließlich wie in genehmigten Tierprotokollen genau beschrieben durch. Alle Forschungen zum Einsatz von Tieren sollten strikt den 3Rs – Ersatz, Reduktion und Verfeinerung – folgen. Dieses Protokoll beschreibt die Implantation einer subkutanen osmotischen Pumpe, die als kleinerer chirurgischer Eingriff klassifiziert wird. Intraperitoneal-osmotische Pumpenimplantationen können ebenfalls durchgeführt werden, aber dies ist ein komplizierterer Eingriff, der als großer chirurgischer Eingriff eingestuft wird. Daher wird empfohlen, das subkutane Verfahren durchzuführen, es sei denn, es gibt eine starke wissenschaftliche Begründung für eine intraperitoneale Einnistung.

  1. Befüllung osmotischer Pumpen
    HINWEIS: Die Herstellung von Arzneimittellösungen und das Befüllen von osmotischen Pumpen sollten in einem Biosicherheitsschrank mit steriler Technik durchgeführt werden. Pumpenmodelle sollten basierend auf dem gewünschten Reservoirvolumen und der Länge der Behandlungsabgabe ausgewählt werden. Für diese Studie wurde das Modell 2004 verwendet (~200 μL Reservoirvolumen, Behandlungsgabe über 4 Wochen).
    1. Bereiten Sie die Arzneimittellösung in einem Lösungsmittel vor, das mit den osmotischen Pumpen kompatibel ist. Siehe https://alzet.com/formulating-the-solution/. Verwenden Sie die auf der Charge der bestellten osmotische Pumpen angegebene Durchflussrate (μL/h), um die benötigte Arzneimittelkonzentration für die angestrebte Tagesdosierung zu bestimmen.
      HINWEIS: Eine Lösung aus 50 % v/v DMSO und 50 % v/v PEG300 löst hydrophobe Verbindungen stabil und ist mit den osmotischen Pumpen kompatibel. Alle Verbindungen und Lösungsmittel sollten, wenn möglich, pharmazeutischer Qualität sein.
    2. Filtersterilisieren Sie die Arzneimittellösung mit einem 0,22-μm-Spritzenfilter und halten Sie sie bei Raumtemperatur.
    3. Setze einen Durchflussmoderator in eine Pumpe und drücke ihn nach unten, bis er in ein Mikrofugerohr passt. Drücke den Flussmoderator nicht ganz nach unten.
    4. Zählen Sie eine Analysewaage an einem leeren Mikrofugrohr und zeichnen Sie dann das Gewicht der osmotischen Pumpe auf.
    5. Schließen Sie das Füllrohr an eine 1-mL Spritze an und ziehen Sie mindestens das 1,5-fache des Reservoirvolumens der Pumpe auf. Entferne Luftblasen, indem du den Kolben nach unten ziehst, die Spritze schnippst und sie nach oben drückst, bis sich Flüssigkeit am oberen Ende des Füllrohrs bildet.
    6. Entferne den Durchflussmoderator, während du die Pumpe aufrecht hältst.
    7. Führe das Füllrohr durch die Öffnung oben an der Pumpe, bis es nicht mehr weitergeht.
    8. Drücke den Kolben langsam nach unten, während du die Pumpe aufrecht hältst. Füllen Sie weiter, bis die Lösung am Ausgang erscheint. Dann entfernen Sie das Füllrohr und wischen Sie die überschüssige Lösung mit einem vorsichtigen Arbeitstuch ab.
    9. Setzen Sie den Durchflussmoderator ein, bis der Deckel bündig mit der Oberseite der Pumpe ist.
    10. Setze die gefüllte Pumpe zurück in ein Mikrofugerohr und wiege. Bestimmen Sie das Gewicht der Lösung und überprüfen Sie, dass das Füllvolumen mindestens 90 % des Reservoirvolumens beträgt (Gewichtsunterschied in Milligramm ≈ Volumen in Mikrolitern).
    11. Füllen Sie ein 15 ml konisches Rohr mit 5 ml steriler 1× phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie die vorgefüllte Pumpe hinzu. Versiegeln Sie mit Paraffinfilm und bereiten Sie die Pumpe(n) durch Inkubation bei 37 °C für die vom Modell der osmotische Pumpen benötigte Zeit auf. Für das Modell 2004 ist das 40 H.
  2. Zubereitung von Meloxicam
    HINWEIS: Dies sollte in einem Biosicherheitsschrank mit steriler Technik durchgeführt werden. Meloxicam, ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament (NSAID), ist keine kontrollierte Substanz, erfordert jedoch möglicherweise eine Lizenz für kontrollierte Substanzen.
    1. Mit einer 27-G-Nadel und einer 3 mL Luer-lok-Spritze verdünnen Sie den 5 mg/ml Meloxicam-Fond auf 1 mg/mL mit sterilem PBS in einem 5-mL sterilen Glasfläschchen. Bereiten Sie sie am Tag des Tages vor und lagern Sie sie bei Zimmertemperatur.
  3. Vorbereitung der Operationsstelle
    HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, eine Implantation der osmotischen Pumpe in einem Biosicherheitsschrank durchzuführen, noch ist es möglich, die Sterilität während chirurgischer Eingriffe aufrechtzuerhalten. Die Operationsstelle sollte jedoch weiterhin strenge Sauberkeitsstandards und aseptische Praxis einhalten. Der Praxisstandort sollte sauber, frei von Unordnung und wenig Besucherzahlen haben. Idealerweise gibt es sowohl eine Vorbereitungsstelle (also zum Rasieren und Schrubben) als auch eine Operationsstelle (also zur Durchführung der Pumpenimplantation).
    1. Desinfiziere den OP-Bereich vollständig mit 70 % Ethanol und wische ihn mit Küchenpapier trocken.
    2. Schalten Sie den Glasperlensterilisator ein und stellen Sie ihn auf 250 °C ein. Lassen Sie es 15–30 Minuten aufwärmen.
    3. Schalte den Verdampfer ein und stelle das Heizkissen auf 65%. Stellen Sie das Körpergewicht des Tieres ein und stellen Sie den Isofluranprozentsatz auf 3,2 %.
    4. Klebe eine der Temperatursonden auf die Oberfläche des Heizpads. Lassen Sie das Heizkissen auf 35–37 °C erwärmen.
    5. Entfernen Sie die Verdampferspritze. Drücke die grüne Lasche ganz hinein und fülle sie mit Isofluran, indem du sie an eine Flasche Isofluran anschließt und am Pümpel zurückziehst.
    6. Die Spritze wieder am Verdampfer befestigen und die Spritze aufbereiten.
    7. Stellen Sie ein zweites Wärmekissen unter einen sauberen Tierkäfig zur Erholung. Stellen Sie den Käfig halb drauf, halb vom Heizkissen.
  4. Pumpenimplantation
    HINWEIS: Alle chirurgischen Werkzeuge sollten im Voraus gereinigt und autoklaviert werden. Zur Sterilisation von chirurgischen Instrumenten zwischen Tieren kann ein Glasperlensterilisator verwendet werden. Dies kann nur für Chargen von bis zu 5 Tieren verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass Sie einen Autoklav-Indikatorstreifen beilegen, um sicherzustellen, dass die Sterilisationsparameter erfüllt sind. Die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA) umfasst einen sauberen Laborkittel, eine chirurgische Maske, sterile chirurgische Handschuhe und eine Haarbedeckung. Tiere, die sich einer Operation unterziehen, sollten nicht im Blick anderer Tiere sein.
    1. Greifen Sie die Maus am Schwanzansatz und legen Sie sie in die Anästhesiekammer. Öffne die Röhren und lasse den Isofluranfluss (3,2 %) zur Kammer ein. Legen Sie zwei sterilisierte Decken auf das Heizkissen.
    2. Warte, bis die Maus sich auf die Seite dreht, und überwache ihre Atmung. Wenn die Atmung langsamer und entspannter wird, stoppen Sie den Isofluranfluss zur Kammer. Die Röhren an der Kammer befestigen und die Röhren vom Nasenkegel lösen. Beginnen Sie mit dem Fluss von Isofluran (2 %) zum Nasenkegel.
    3. Holen Sie die Maus aus der Kammer und stecken Sie ihre Nase in den Nasenkegel auf dem Heizkissen. Gib beiden Augen eine Augensalbe auf.
    4. Wiegen Sie die Maus auf einer Waage und kehren Sie dann zum Nasenkegel zurück. Bestimmen Sie das Volumen von 1 mg/ml Meloxicam, das verabreicht werden soll. Bei einer Dosierung von 5 mg/kg multiplizieren Sie das Gewicht der Maus in Gramm mit 5, um die Mikroliter Meloxicam zu erhalten.
    5. Besprühen Sie den Deckel des Fläschchens mit 1 mg/mL Meloxicam mit 70 % Ethanol und wischen Sie es mit einem vorsichtigen Arbeitstuch trocken. Dann entnehmen Sie mit einer 0,3-ml-Insulinspritze das richtige Volumen Meloxicam. Entferne alle Luftblasen aus der Spritze.
    6. Nackenstoppel/fixiere die Maus mit einer Hand, wobei der Kopf nach unten geneigt ist. Führe die Nadel im Winkel von 30°–45° im unteren rechten Bauchbereich mit nach oben gerichtetem Abschrägen ein. Aspirieren Sie, um die richtige Platzierung der Nadel zu bestätigen.
    7. Wenn kein Aspiration festgestellt wird, drücken Sie den Kolben sanft ab und injizieren Sie Meloxicam intraperitoneal.
    8. Bring die Maus zurück in den Nasenkegel und das Heizkissen. Reinigen Sie 150 % des Bereichs rund um die Einnistungsstelle (mittlerer bis oberer Rücken) mit chirurgischem Haarschneider vollständig ab. Sobald das fertig ist, sauge und bürste vorsichtig das Haar vom Tier und entsorge das erste Decken.
      HINWEIS: Eine saubere Rasur ist notwendig, um eine aseptische Operation durchzuführen. Mindestens muss jeder Schnitt vollständig frei von Tierhaaren sein.
    9. Positioniere die Maus so, dass ihr Kopf zum Chirurgen zeigt. Führen Sie abwechselnd eine Schrubbung mit Povidon-Jod und 70 % Ethanol mit Baumwollspitzen-Applikatoren durch, insgesamt 3 Anwendungen. Beginnen Sie unbedingt in der Mitte des geplanten Schnitts und spiralen Sie mit den Baumwollspitzenapplikatoren nach außen.
    10. Decken Sie das Tier mit sterilen, fenestratierten chirurgischen Vorhängen und verwenden Sie die richtige aseptische Technik, um chirurgische Handschuhe anzuziehen.
    11. Bevor Sie Schnitte machen, sollten Sie die Pedalreflexe gründlich überprüfen, indem Sie beide Füße mit einer Gewebezange fest zusammenkneifen. Fahren Sie erst nach mehreren Pressen fort, da keine Bewegung stattfindet. Dies bestätigt eine chirurgische Ebene der Anästhesie.
    12. Stellen Sie die mittlere Schulterblatthaut mit einer Gewebepinzette hoch und machen Sie mit einer kleinen Iris-Operationsschere einen 1 cm langen Schnitt senkrecht zur Wirbelsäule. Um einen geraden Schnitt zu machen, schneide mit der Iris-chirurgischen Schere im 90°-Winkel zur Maus.
    13. Verwenden Sie kleine hämostatische Pinzetten im Schnitt, um das subkutane Gewebe zu verteilen und eine Tasche für die Pumpe zu schaffen. Stellen Sie sicher, dass die Tasche für die Pumpe von vorne des Tieres entfernt und leicht zur Seite des Tieres angebracht ist. Verwenden Sie die hämostatische Pinzette, um die Haut auf allen Seiten des Schnitts zu lockern.
    14. Öffnen Sie den Schnitt mit der Gewebepinzette und führen Sie die Pumpe mit der hämostatischen Zangelei ein. Führe zuerst die Pumpe mit dem Durchflussmoderator ein.
      VORSICHT: Die Pumpe sollte so eingesetzt werden, dass sie ausreichend vom Schnitt entfernt ist, also so, dass die Haut um den Schnitt herum nicht unter Spannung steht. Wenn sie nicht richtig positioniert ist, kann dies zu Wundentweichung führen. Die Pumpe kann während der Erholung des Tieres auch die Position wechseln.
    15. Mit der Gewebezange zieht die Haut vorsichtig an und zieht beide Seiten des Schnitts gleichmäßig aneinander. Beginnend an einem Ende des Schnitts verwendet man den Clip-Applier, um 7-mm-Wickelklammern entlang des gesamten Schnitts zu platzieren (es können 2–4 Klammern benötigt werden).
    16. Für Lücken im Schnitt, die zu klein sind, um mit einer anderen Wundklemme gesichert zu werden, tragen Sie mit dem sterilen Applikator eine kleine Menge Gewebekleber auf. Kneif mit der Gewebepinzette zu.
    17. Ziehen und dehnen Sie vorsichtig die Haut um den Schnitt, um sicherzustellen, dass die Wunde geschlossen ist. Dann wird der Isofluranfluss zum Nasenkegel abgeschaltet und die entsprechenden Röhren geclippt. Stelle die Mäuse in den Erholungskäfig auf das Heizkissen.
    18. Überwachen Sie die Maus vollständig, bis sie erwacht und gemohwendig ist. Überwachen Sie die Tiere häufig auf Anzeichen von Stress oder Schmerz und halten Sie sie von anderen Mäusen isoliert, bis sie sich erholt haben.
    19. Nach 24 Stunden erneut 5 mg/kg Meloxicam per intraperitonealer Injektion verabreichen. (Optional) Um die Tiergenesung zu unterstützen, geben Sie Elektro-Gel-Präparate und/oder legen Sie das Futter auf den Boden des Käfigs.
    20. Nach 10–14 Tagen wird die Tiere erneut mit Isofluran betäubt, eine Augensalbe aufgetragen und die Klammern mit dem Klammerentferner entfernt.
      HINWEIS: Die Klammern müssen bis zu diesem Zeitraum entfernt werden, um Haarnachwuchs über den Wundklammern zu vermeiden. Außerdem haben alle osmotischen Pumpen eine definierte Dauer. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pumpen entweder entfernen oder die Tiere bis zum Ende ihrer Dauer einschläfern. Für längere Behandlungsperioden können mehrere Pumpenimplantationen direkt hintereinander am selben Tier durchgeführt werden.

2. Fixierung, Einbettung und Schnitt von Geweben

  1. Fixierung von Geweben
    HINWEIS: Alle Tierbehandlungen sollten von erfahrenem Personal durchgeführt werden, um Tierstress und Leid zu minimieren. Die Euthanasiekammer sollte gereinigt und zwischen jedem Tier physisch verteilt werden, um eventuelle Reste von Kohlendioxid zu entfernen. Um Stress zu minimieren, sollten Tiere, wenn möglich, in ihren Heimkäfigen eingeschläfert werden. Schließlich sollten Tiere nicht in räumlicher Nähe oder im Sichtfeld anderer Mäuse eingeschläfert werden. Saubere chirurgische Werkzeuge sind für nicht-überlebensnotwendige Eingriffe erforderlich, müssen jedoch nicht steril sein (d. h. autoklaviert).
    1. Stellen Sie die Maus in die Induktionskammer und öffnen Sie den Regler, bis der Durchflussmesser die gewünschte Durchflussrate erreicht (~40 %–70 % des Kammervolumens pro Minute).
    2. Beobachten Sie die Maus während des gesamten Vorgangs und stellen Sie sicher, dass keine Anzeichen von Belastung wie Springen auftreten. Überwachen Sie das Ende der Atemaktivität und halten Sie den CO2-Flussmindestens 2 Minuten nach Abbruch der Atemaktivität aufrecht. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtzeit derCO2-Exposition mindestens 5 Minuten beträgt.
    3. Holen Sie die Maus und führen Sie eine sekundäre Euthanasiemethode wie eine zervikale Verrenkung durch.
    4. Fixiere die Gliedmaßen des Tieres mit 23-G-Nadeln an ein Stück Polystyrolschaum, das mit Alufolie bedeckt ist. Befeuchte das Fell, indem du mit 70 % Ethanol sprühst.
    5. Mach einen kleinen Schnitt nahe der Bauchbasis und schneide die Haut bis zum Hals durch. Folgen Sie demselben Schnitt, um die Körperhöhle zu öffnen, und schneiden Sie vorsichtig durch den Brustkorb.
    6. Machen Sie U-förmige Schnitte beginnend an der Bauchbasis und stecken Sie die Haut mit 23-G-Nadeln nach oben.
    7. Sezieren Sie das betreffende Organ(e) und legen Sie es in ein 15 ml konisches Rohr, das mit 5 ml 4%-Paraformaldehyd (PFA) vorgefüllt ist. Fixe auf 24 Stunden bei 4 °C auf einem Drehspieß.
      VORSICHT: PFA-Lösung ist gefährlich. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Geeignete PSA beim Umgang umfasst einen Laborkittel, Nitrilhandschuhe und eine Schutzbrille.
      HINWEIS: Wenn Blut aus dem Gewebe perfundiert werden muss und/oder eine Perfusionsfixation gewünscht ist, führen Sie eine kardiale Perfusion wie zuvorbeschrieben 51 durch. Bei der Immersionsfixation, wie hier durchgeführt, kann es eine Weile dauern, bis das Fixativ durch das Gewebe diffundiert, besonders bei größeren Gewebestücken. Dies kann die mitochondriale Morphologie verändern; Außerdem kann eine Fixierung auf PFA dazu führen, dass das Gewebe um52 schrumpft.
    8. Nach 24 Stunden wird die Paraformaldehydlösung entfernt und das Gewebe mit 10 ml 1× PBS ausgespült. Führen Sie insgesamt dreimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einer Drehspirale durch.
    9. Entfernen Sie das PBS und tauchen Sie das Gewebe in 10 ml 30 % Saccharose für 48 Stunden bei 4 °C auf einer Drehspirale. Die Infiltration von Saccharose ist abgeschlossen, wenn das Gewebe oder die Gewebe sinken.
      HINWEIS: Um zu überprüfen, dass das Lösungsmittel dem Tier zugeführt wurde, missen Sie die verbleibende Menge in der Pumpe.
  2. Einbettung von Geweben
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Lage und Ausrichtung des Gewebes in den Formen zu verfolgen.
    1. Füllen Sie einen Polystyrolschaumbehälter mit Trockeneis und legen Sie eine Metallplatte flach darauf.
    2. Setzen Sie die Formen auf das Metallblech und füllen Sie 2/3–3/4 bis oben mit einer optimalen Schneidtemperatur-(OCT)-Masse (Gewebeeinbettmedium). Bringen Sie alle Luftblasen entweder an die Oberfläche oder an die Ecken mit einer feinen Pinzette. Um die Gefrierzeit zu beschleunigen, legen Sie einige Trockeneispellets direkt an die Formen.
    3. Legen Sie etwas Gewebeeinbettungsmedium in ein Wiegeboot und mischen Sie die Gewebe darin. Versuche, keine Saccharoselösung mitzunehmen.
    4. Sobald das Gewebeeinbettungsmedium vollständig am Boden der Form eingefroren ist (es sollte vollständig undurchsichtig sein), tauchen Sie das Gewebe im Inneren der Form so, dass es keine Seiten der Form oder die Oberfläche berührt. Platzieren Sie sie an der gewünschten Stelle.
    5. Warten Sie, bis das Gewebeeinbettmedium vollständig gefroren ist, bevor Sie die Formen in einen -80 °C Gefrierschrank überführen.
      HINWEIS: (Pausenpunkt) Die eingebetteten Gewebe können mindestens 3 Monate gelagert werden.
  3. Teilung von Geweben
    HINWEIS: Um die Schnittdicke von Charge zu Charge zu verringern, sollten alle gemeinsam zu analysierenden Gewebe in einer Sitzung geschnitten werden.
    1. Holen Sie eingebettete Gewebe aus dem -80 °C Gefrierfach und legen Sie sie in einen mit Trockeneis gefüllten Polystyrolschaumbehälter.
    2. Vorkühlen Sie die Temperatur der Kryostatkammer und den Probenhalter auf -24 °C bzw. -25 °C.
    3. Setzen Sie eine frische Mikrotom-Klinge in den Klingenhalter und setzen Sie die Antirollplatte ein. Für eine einfachere Reinigung kleide die Kryostatkammer mit Papiertüchern aus.
    4. Nehmen Sie den Probechuck aus der Kryostatkammer und erhitzen Sie ihn auf Zimmertemperatur.
    5. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um jede Ecke der Gewebeform vorsichtig zu schneiden. Hebeln Sie es vorsichtig auseinander, um den Gewebeeinbettungsblock zu entfernen.
    6. Drücke den Gewebeblock fest in den Probechuck, während du dich hin und her drehst. Sobald es fest befestigt ist, stellen Sie den Proben-Chuck für ein paar Minuten in die Kryostatkammer, damit er einfriert.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Gewebeblock in der richtigen Ausrichtung auf das Chuck gelegt wird, sodass das Gewebe in der gewünschten Richtung geschnitten wird.
    7. Sobald der Gewebeblock vollständig am Probechuck eingefroren ist, stecke den Chuck in den Chuckhalter und ziehe ihn fest. Bewegen Sie die Kryostatklinge so, dass sie direkt vor dem Gewebeblock liegt, ohne ihn zu berühren.
    8. Stellen Sie die Trimmeinstellung auf 50 μm ein und beginnen Sie mit dem Trimmen, bis ein vollständiger Querschnitt des Gewebes freiliegt.
    9. Deaktivieren Sie die Trimmeinstellung und stellen Sie die Schnittdicke auf 20 μm ein. Schneide ein paar Scheiben in dieser Dicke, bevor du die Antirollplatte absenkst. Schneiden Sie langsam und geschmeidig durch ~80 % bis 90 % des Abschnitts, bevor Sie aufhören.
    10. Hebe die Wankelschutzplatte an. Holen Sie einen geladenen Glasträger heraus und drücken Sie die geladene Seite an der gewünschten Stelle auf den Gewebeschnitt.
      HINWEIS: Wenn der Gewebeschnitt nach dem Anheben der Antirollplatte nach oben rollt, verwenden Sie die feinen Pinsel zum Ausrollen.
    11. Nimm das Chuck aus dem Chuckhalter. Nimm das Chuck aus dem Kryostat und erhitze es auf Zimmertemperatur. Zieh den Gewebeblock aus dem Chuck und setze ihn zurück in die Form.
    12. Wickle sie in Alufolie, damit der Gewebeblock nicht aus der Form fällt, und setze sie in den -80 °C Gefrierfach.
    13. Platziere die montierten Gewebeschnitte bei -20 °C.
      HINWEIS: (Pausepunkt) Gewebeschnitte können sicher bei -20 °C unbegrenzt gelagert werden.

3. Immunfluoreszenzfärbung

  1. Holen Sie die Kryosektionen heraus und lassen Sie sie 10 Minuten bei 37 °C in einem Inkubator trocknen.
  2. Waschen Sie die Objektträger, um überschüssiges Gewebeeinbettungsmedium zu entfernen.
    1. Bereiten Sie 1 Liter 1× PBS mit 0,1 % V/V Triton X-100 (PBS-T) vor.
    2. Fülle 3 Färbegläser mit PBS-T.
    3. Stelle die Folien in das Slide-Rack. Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten in ein Färbeglas. Wiederhole das insgesamt dreimal.
  3. Blockieren Sie das Gewebe wegen Verfärbungen.
    1. Klopfen Sie vorsichtig auf jedem Objektträger mit einem empfindlichen Arbeitstuch zum Trocknen. Legen Sie die Objektträger auf, aufgehängt in einer Objektträgerbox, wobei das Gewebe nach oben zeigt.
    2. Bereiten Sie eine 20 ml Blocklösung mit 1× PBS, 0,3 % v/v Triton X-100 und 5 % mit Rinderserumalbumin (BSA) vor.
    3. Pipette 1 ml Blocklösung auf jeden Objektträger und achte darauf, dass das Gewebe vollständig bedeckt ist.
    4. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
  4. Inkubieren Sie das Gewebe mit dem primären Antikörper.
    1. Klopfen Sie vorsichtig auf jedem Objektträger mit einem empfindlichen Arbeitstuch zum Trocknen. Verwenden Sie ein weiteres vorsichtiges Reinigungstuch, um die restliche Flüssigkeit vorsichtig zwischen den Gewebebereichen abzuleiten.
    2. Bereiten Sie eine 1:200-Verdünnung des Tom20-Kaninchen-α-Maus-Antikörpers in Blockierungslösung vor (200 μL pro Objektträger)
    3. Am Boden der Folienbox legen Sie Papiertücher und befeuchten Sie sie vollständig mit Wasser.
    4. Lege die Objektträger nach unten und hänge in der Folienbox mit dem Gewebe nach oben. Pipette 200 μL verdünnten primären Antikörper auf jeden Objektträger, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig bedeckt ist.
    5. Schneiden Sie Paraffinfilmstücke ungefähr in der Größe der zu verwendenden Deckfolien. Schneiden Sie für jede Folie ein Stück Paraffinfilm.
    6. Lege jedes Stück Paraffinfilm auf jeden Objektträger, um die Antikörperverdünnung über die Gewebeabschnitte zu verteilen. Schließe die Folienbox und brüte über Nacht bei 4 °C.
  5. Waschen Sie die Objektträger nach der Inkubation mit dem primären Antikörper.
    1. Fülle 3 Färbegläser mit PBS-T. Nehmen Sie Objektträger heraus und entfernen Sie Paraffinfilmstücke.
    2. Stelle die Folien in das Slide-Rack. Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten in ein Färbeglas. Wiederhole das insgesamt dreimal.
  6. Inkubieren Sie die Objektträger im sekundären Antikörper.
    HINWEIS: Um die spezifische Markierung der Mitochondrien zu bestätigen, wird aus jeder Gruppe mindestens ein Objektträger vorbereitet, der nur mit dem sekundären Antikörper gefärbt ist.
    1. Klopfen Sie vorsichtig auf jedem Objektträger mit einem empfindlichen Arbeitstuch zum Trocknen. Verwenden Sie ein weiteres vorsichtiges Reinigungstuch, um die restliche Flüssigkeit vorsichtig zwischen den Gewebebereichen abzuleiten.
    2. Bereiten Sie eine 1:200-Verdünnung des Ziegen-α-Kaninchen-Alexa-Fluor-568-Antikörpers und 5 μg/mL 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) in Blocklösung (200 μL pro Objektträger) vor.
    3. Lege die Objektträger nach unten und hänge in der Folienbox mit dem Gewebe nach oben. Pipette 200 μL verdünnten sekundären Antikörper auf jeden Objektträger, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig bedeckt ist.
    4. Schneiden Sie Paraffinfilmstücke ungefähr in der Größe der zu verwendenden Deckfolien. Schneiden Sie für jede Folie ein Stück Paraffinfilm.
    5. Legen Sie auf jedes Objektträger ein Stück Parafilm, um die Antikörperverdünnung über die Gewebeabschnitte zu verteilen. Schließe die Dosenbox und brüte sie 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C aus.
  7. Wasche die Deckbriefe.
    HINWEIS: Verwenden Sie Kunststoffpinzette, um Deckfolien aufzuheben und zu handhaben
    1. Legen Sie Überdeckfolien einzeln in einen Becher, der mit heißem Leitungswasser und einem Waschmittel für Glasgeräte gefüllt ist, wie zum Beispiel Contrad 70. Decken Sie es mit einem Stück Paraffinfilm ab.
    2. Sonikate 30 Minuten lang in einem Bade-Sonikator.
    3. Spülen Sie mehrmals mit heißem Leitungswasser. Dann noch mehrmals in doppelt destilliertem Wasser spülen. Sonicate für 15 Minuten bei der letzten doppelt destillierten Wasserspülung.
    4. Deckpapier in 70 % Ethanol platzieren und aufbewahren. Wenn Sie Deckfolien montieren möchten, entfernen Sie sie aus dem 70%igen Ethanol und lassen Sie sie in einer Abzugshaube an der Luft trocknen.
  8. Waschen Sie die Objektträger nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper.
    1. Fülle 3 Färbegläser mit PBS-T. Nehmen Sie Objektträger heraus und entfernen Sie Paraffinfilmstücke.
    2. Stelle die Folien in das Slide-Rack. Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten in ein Färbeglas. Wiederhole das insgesamt dreimal.
    3. Klopfen Sie vorsichtig auf jedem Objektträger mit einem empfindlichen Arbeitstuch zum Trocknen. Verwenden Sie ein weiteres vorsichtiges Reinigungstuch, um die restliche Flüssigkeit vorsichtig zwischen den Gewebebereichen abzuleiten.
  9. Befestigen Sie die Deckblätter.
    1. Fügen Sie 2–3 gleichmäßig verteilte Tropfen Antifade-Montagemittel auf einen Schlitten hinzu.
    2. Um Luftblasen zu vermeiden, nehmen Sie einen gereinigten #1,5-Deckschart und halten Sie ihn in einem 45° Winkel zum Schlitten entlang der langen Achse. Lenke vorsichtig und langsam den Deckdeckel auf die Rutsche. Wiederholen Sie das für alle Folien.
    3. Lassen Sie die Objektträger 18–60 Stunden bei Raumtemperatur aushärten, während sie vor Licht geschützt sind.
    4. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C vor Licht geschützt.
      HINWEIS: (Pausepunkt) Dias können entweder unmittelbar nach der Aushärtungsphase oder bis zu einem Monat bei 4 °C abgebildet werden. Es ist nicht nötig, die Kanten abzudichten. Achten Sie darauf, #1,5- oder #1,5H-Deckfolien zu verwenden, da andere Dicken kugelförmige Aberrrationen verursachen und die Bildqualität verringern können. Verwenden Sie keine Montagemedien mit DAPI, da DAPI breite Anregungs- und Emissionsspektren aufweist. Die Aushärtungszeit hängt von der Probendicke ab; Hier, 48 Stunden.

4. Superauflösende Bildgebung

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet einen ZEISS Airyscan2 Punkt-Scanning LSM 980 Konfokal, der um einen ZEISS Axio Observer Z1 herum aufgebaut ist und mit zwei Multi-Alkali-Photomultiplierröhren (PMTs) sowie einem GaASP 32-Kanal-Spektraldetektor, einem Umweltgehäuse und einem Plan Apo 63×/1.4 Öl-Differential-Interferenzkontrast (DIC) III-Objektiv ausgestattet ist.

  1. Richte die Übernahme ein.
    1. Fügen Sie eine einzelne Airyscan SR-Schiene hinzu und wählen Sie das passende Fluorophor aus.
    2. Wählen Sie die 10"-Platte und die entsprechenden Emissionsbandpassfilter.
      HINWEIS: Die 10"-Platte ist spezifisch für dieses Mikroskop, da sie ebenfalls mit Infrarotdetektoren (IR) ausgestattet ist.
    3. Wählen Sie den passenden Laser aus. Setzen Sie die Nyquist-Abtastkriterien auf 2 , indem Sie auf SR klicken (die Pixelgröße sollte auf 0,05 μm angepasst werden).
    4. Klicken Sie live und richten Sie den Airyscan-Detektor aus (wählen Sie die Live-Ausrichtungsfunktion). Klicken Sie auf Stopp , sobald die Intensität im Zentrum des Detektorsymbols und wenn der Detektor grün ist.
      HINWEIS: Wenn alles korrekt eingerichtet ist, sollte auf der linken Seite der Software eine Meldung erscheinen, dass "Airyscan-Einstellungen erfolgreich optimiert" sind.
    5. Geh nochmal live und passe die Laserintensität so an, dass ein ordentliches Signal, aber keine gesättigten Pixel vorhanden sind (klicke auf die Reichweitenanzeige). Klicke auf Stopp, sobald du optimiert bist.
      1. (Optional) Um das Signal zu erhöhen, ohne die Laserleistung anzupassen, erhöhen Sie die Verstärkung.
  2. Führen Sie Datenerfassung durch.
    1. Klicken Sie auf z-stack und überprüfen Sie, ob die Schrittlänge auf 0,1 μm eingestellt ist (anpassen, falls nicht).
    2. Klicken Sie live und setzen Sie die unteren und oberen Grenzen des Z-Stacks.
    3. Klicken Sie auf Start Experiment.
    4. Sobald der Z-Stack gesammelt wurde, gehe zum Airyscan-Tab unter dem Bild und klicke auf 3D verarbeiten. Halten Sie die hier verwendeten Denoising-Weiner-Filterparameter über verschiedene Replikate und Behandlungsgruppen hinweg konsistent.
    5. Speichern Sie den bearbeiteten Airyscan Z-Stack.
      HINWEIS: Wenn zwei Airyscan SR-Spuren verwendet werden, stelle sicher, dass das Mikroskop bei jedem Bild die Spuren wechselt.

5. Erstellung einer automatisierten Pipeline zur Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung einer automatisierten Bildanalyse-Pipeline zur 3D-Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie mit ZEISS arivis Pro Software 4.1.2.

  1. Konvertiere Airyscan-verarbeitete .czi-Dateien mit dem arivis-Konvertierungstool in das .sis-Format.
    HINWEIS: Wenn das vollständige Bild groß ist und die Verarbeitungszeit während der Parameteroptimierung zu lang ist, schneiden Sie einen kleinen, repräsentativen Teilbereich des Bildes zu, um ihn als Arbeitsreferenz zur Optimierung der Einstellungen zu verwenden. Dieses zugeschnittene Bild sollte sowohl gut isolierte Mitochondrien als auch Regionen mit höherer Dichte enthalten, sodass es das gesamte Bildfeld genau darstellt. Sobald eine zufriedenstellende Segmentierung des zugeschnittenen Bildes erreicht ist, kann die optimierte Pipeline auf das vollständige Bildset angewendet werden. Dieser Ansatz spart erheblich Zeit und erleichtert die Anpassung aller Parameter, ohne die Qualität der Pipeline zu beeinträchtigen.
  2. Richten Sie die Pipeline ein und optimieren Sie.
    1. Öffnen Sie ein repräsentatives Bild (z. B. aus der Kontrollgruppe) in der Software.
    2. Wählen Sie den Tom20-Immunfluoreszenzkanal als Eingabe für die Analyse aus.
    3. Wenden Sie vor der Segmentierung einen Enttäuschungsschritt an. Hier wurde der Partikelverbesserungsalgorithmus verwendet, mit einem Durchmesser von 5,42 und einer Festigkeit von 0,5.
      HINWEIS: Der Partikelverbesserungsfilter ist ein strukturerhaltender Entspannungsalgorithmus, der dazu entwickelt wurde, kompakte, grob kugelförmige oder verlängerte Objekte zu verstärken und dabei Hintergrundrauschen zu unterdrücken. Sie wirkt, indem sie die lokale Intensität auf einer bestimmten räumlichen Skala (Durchmesser) erhöht, was sie besonders gut für Mitochondrien geeignet macht, die als helle, isolierte Partikel oder Tubuli vor dunklem Hintergrund erscheinen. Wenn der Wert des Durchmesserparameters zu klein eingestellt ist, verstärkt er das Rauschen, während ein zu großer Wert benachbarte Objekte verschwimmen lässt. Der Stärkeparameter steuert den Grad der Verstärkung, wobei hohe Werte die Signalverstärkung erhöhen, aber bei zu hoher Einstellung Artefakte verursachen können. Beginnen Sie mit den Standardwerten und passen Sie an, während Sie die Ausgabe in einem repräsentativen Interessengebiet visuell inspizieren. In arivis Pro sind mehrere Enttäuschungsmethoden verfügbar. Gaußsches Glätten ist eine einfache, schnelle Option, die hochfrequentes Rauschen gleichmäßig reduziert, aber feine strukturelle Details verwischen kann. Das Medianfiltern schützt scharfe Kanten besser und entfernt Salz-und-Pfeffer-Rauschen. Partikelverstärkung (hier verwendet) ist bevorzugt, wenn das Ziel ist, diskrete fluoreszierende Objekte zu erkennen, da sie selektiv das Signal von Strukturen verstärkt, die dem angegebenen Größenbereich entsprechen. Für Bilder mit geringem Signal-Rausch-Verhältnis oder signifikanter Hintergrundheterogenität kann ein stärkerer Rauschdurchlauf erforderlich sein. Es wird empfohlen, zwei oder drei Methoden an demselben repräsentativen Bild zu testen und die nachgelagerte Segmentierungsqualität zu vergleichen.
    4. Segmentieren Sie einzelne Mitochondrien mit dem Blob Finder-Algorithmus, der Objekte im 3D-Raum erkennt.
    5. Anpassung der Segmentierungsparameter, einschließlich Objektgröße und Empfindlichkeitsschwelle, und visuelle Inspektion der Überlappung zwischen den erkannten Objekten und dem entrauschten Bild, um eine genaue Segmentierung sicherzustellen. Hier wurden folgende Parameter verwendet: ein Durchmesser von 0,244 μm, eine Wahrscheinlichkeitsschwelle von 25 % und eine geteilte Empfindlichkeit von 22,22 %, wobei die Normalisierung auf den ersten Startpunkt gesetzt ist.
      HINWEIS: Die Segmentierungsparameter hängen von der Bildauflösung und der Voxelgröße ab. In dieser Studie betrugen die Bilddimensionen 1354 × 1354 Pixel mit einer XY-Pixelgröße von 0,049 μm und einer Voxelgröße von 0,049 × 0,049 × 0,100 μm3.
  3. Führen Sie Merkmalsextraktion und Qualitätskontrolle durch.
    1. Für jedes detektierte Objekt werden morphologische Parameter extrahiert, einschließlich Volumen (μm3), Oberfläche (μm2) und Sphärizität (Oberfläche einer Kugel mit gleichem Volumen/Oberfläche der Mitochondrien).
    2. Exportiere segmentierte Objekte als TIFF-Dateien zur visuellen Validierung.
    3. Öffnen Sie exportierte Dateien in FIJI oder Arivis und überlagern Sie sie mit dem Originalbild, um die Segmentierungsgenauigkeit visuell zu überprüfen.
    4. Exportieren Sie quantitative Messungen als individuelle Tabellenkalkulationsdateien für jede Probe.
  4. Wenden Sie die Pipeline an.
    1. Speichere die optimierte Pipeline. Ein Beispiel für eine Pipeline ist in Supplementary File 1 zu finden.
    2. Wenden Sie die Pipeline auf zusätzliche Bilder aller experimentellen Gruppen der Studie an.
    3. Verfeinern Sie bei Bedarf iterativ die Segmentierungsparameter, um eine konsistente Leistung über alle experimentellen Gruppen hinweg zu gewährleisten.
    4. Nach Abschluss wenden Sie die Pipeline im Batch-Modus auf alle Bilder in der Studie an.
  5. Datenanalyse durchführen
    1. Importiere die exportierten Daten in RStudio (Version 4.3.2) zur statistischen Analyse.
    2. Wenn nicht installiert, installiere die Pakete: readxl, dplyr, tidyr, purrr, ggplot2, ggpubr, patchwork, scales, randomForest, caret, umap, factoextra, RColorBrewer, mclust, outliers und tidyverse.
    3. Laden Sie das Skript (Ergänzungsdatei 2) hoch, um alle Datensätze zusammenzuführen, die Daten zu filtern (siehe unten), Volumen-, Flächen- und Sphärizitätswerte zu zeichnen und die segmentierten Mitochondrien auf die Probenprobe-Subtyp-Verhältnisse zu analysieren.
    4. (Optional) Segmentierte Mitochondrien basierend auf dem Volumen, um Segmentierungsartefakte und Rauschen auszuschließen.
      1. Um geeignete Filter zu bestimmen, sollten Sie die Volumenverteilungen visuell inspizieren.
        HINWEIS: Alle Proben zeigten einen ausgeprägten Anstieg bei sehr kleinen Volumina (unter 0,0003 μm3), was mit Segmentierungsrauschen und nicht mit echten Mitochondrien übereinstimmt.
      2. Um die untere Schranke zu identifizieren, wird die Partikelretention über Kandidatenschwellenwerte (0,0009, 0,003, 0,005, 0,007 und 0,01 μm3) bewertet. Der steilste Rückgang der Partikelanzahl trat unter 0,003 μm3 auf, was darauf hindeutet, dass die meisten Rauschteilchen in diesem Bereich liegen. Die visuelle Inspektion bestätigte, dass 0,003 μm3 dem rechten Rand des Rauschpeaks entsprach.
      3. Für die obere Schranke verjüngten sich die Verteilungen natürlich deutlich unter 10 μm3; setzen Sie dieses Limit so, dass große Artefaktobjekte wie übersegmentierte mitochondriale Netzwerke ausgeschlossen werden. Endgültige Filterung behaltene Partikel mit Volumina zwischen 0,003 und 10 μm3.
        HINWEIS: Dieses Skript berechnet die Medianwerte pro Stichprobe über alle nachgewiesenen Mitochondrien und verwendet diese als Analyseeinheit. Dieser Ansatz erklärt die Nicht-Unabhängigkeit einzelner Mitochondrien innerhalb derselben biologischen Probe.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das oben beschriebene Protokoll wurde (Abbildung 1) an 20 Monate alten männlichen UM-HET3-Mäusen durchgeführt. Die Mäuse wurden entweder mit Vehicle (Control) oder einem chemischen Umprogrammierungscocktail (behandelt) mit dem Modell 2004 osmotischen Minipumpen53 verabreicht. Die Lebern wurden anschließend mit einem Airyscan2-Konfokalmikroskop abgebildet und abgebildet, bevor die Z-Stacks mittels der Analysepipeline verarbeitet wurden.

Die 3D-Fluoreszenzbilder wurden mit ZEISS arivis Pro Software 4.1.2 verarbeitet und analysiert. Vor der Segmentierung der Mitochondrien wurde der Partikelverbesserungsalgorithmus angewendet, um die Bilder zu entrauschen und Hintergrundlicht, unscharfes Licht, Autofluoreszenz und/oder Fluoreszenz, die aus unspezifischer Bindung entstehen, zu entfernen. Die Partikelverstärkung verstärkt das Signal selektiv aus einem gegebenen Durchmesser. Nach der Entspannung wurden einzelne Mitochondrien in 3D mit dem Blob Finder-Algorithmus segmentiert, der Objekte anhand lokaler Intensitätsmaxima innerhalb eines definierten Größenbereichs erkennt. Schließlich reduziert die Objektsegmentierung jeden 2D-Schnitt auf ein Binärbild.

Zur Veranschaulichung des Segmentierungsworkflows zeigt Abbildung 2 repräsentative optische Schnitte in jeder Phase der Verarbeitungspipeline für Kontroll- und Behandelte Proben. Das rohe Fluoreszenzbild zeigt das unverarbeitete Tom20-Signal, das eine Mischung aus spezifischer mitochondrialer Fluoreszenz und unerwünschtem Hintergrund, unscharfem Licht und Autofluoreszenz enthält. Nach der Anwendung der Partikelverstärkungs-Denoisierung wurde das Hintergrundsignal erheblich reduziert, und die verbleibende Fluoreszenz beschränkt sich auf diskrete, wohldefinierte Strukturen (Abbildung 2). Dies führt zu einer klareren Darstellung der mitochondrialen Grenzen, die eine genaue Segmentierung ermöglicht.

Die Ausgabe der Blob Finder-Segmentierung ist grün dargestellt. Um sicherzustellen, dass die z-Stacks genau segmentiert sind, wurden die entrauschten 2D-Schnitte mit den zugehörigen segmentierten Binärbildern überlagert (Abbildung 2). Wenn der Segmentierungsprozess ausreichend optimiert ist, sollte eine starke und konsistente Kolokalisation der mitochondrialen Fluoreszenz mit den binären Objekten beobachtet werden. Wenn der Segmentierungsprozess eine Übersegmentierung (d. h. Aufspaltung einzelner Mitochondrien in mehrere Objekte) oder eine Untersegmentierung (d. h. das Zusammenführen mehrerer Mitochondrien zu einer) ist, passen Sie die Segmentierungsparameter an. Die visuelle Inspektion der Einsätze bestätigt eine hochwertige Segmentierung: Erkannte Objekte kolokalisieren präzise mit dem entrauschten Tom20-Fluoreszenzsignal, ohne Hinweise auf Übersegmentierung, Objektüberdimensionierung, ungeeignetes Verschmelzen räumlich benachbarter Mitochondrien zu einzelnen Objekten oder die Erzeugung von Scheinobjekten in Regionen ohne Tom20-Signal. Dieses Maß an Segmentierungstreue wurde sowohl bei Kontroll- als auch in behandelten Proben konstant erreicht, was zeigt, dass die in der ZEISS-Arivis-Software optimierten Pipeline-Parameter robust und verallgemeinerbar über die experimentellen Gruppen hinweg sind. Zusammen validieren diese Ergebnisse den Segmentierungsansatz und unterstützen die Zuverlässigkeit der daraus abgeleiteten morphologischen Messungen.

Die segmentierten Objekte können auf mitochondriale Parameter wie Volumen, Sphärizität und Oberfläche gemessen werden (Abbildung 3). Um die große Anzahl der pro biologischen Probe nachgewiesenen Mitochondrien und die Nicht-Unabhängigkeit einzelner Organellen innerhalb einer Zelle zu berücksichtigen, wurden Medianwerte pro Probe berechnet und als Einheit für den statistischen Vergleich verwendet. Gruppenunterschiede wurden mit dem Wilcoxon-Test bewertet. Behandelte Proben zeigten im Vergleich zu Kontrollen deutlich größeres mitochondriales Volumen und eine höhere Oberfläche, was darauf hindeutet, dass chemische Umprogrammierung eine erhebliche Umgestaltung der mitochondrialen Morphologie induziert.

Schließlich können die segmentierten Mitochondrien in verschiedene Untertypen54,55 eingeteilt werden (Abbildung 4). Die Ellbogenmethode56 wurde verwendet, um die optimale Anzahl der Cluster für k-Means Clustering 57,58 zu bestimmen (Abbildung 4A). Anschließend wurden unter Verwendung von k = 4 Clustern zufällige Teilstichproben der Mitochondrien für Kontroll- und Behandelte Gruppen mittels einheitlicher Mannigfaltigkeitsnäherung und Projektion (UMAP) Dimensionsreduktion (Abbildung 4B) dargestellt (Abbildung 4B), gefärbt sowohl nach mitochondrialem Subtyp (links) als auch nach Behandlungsgruppe (rechts). Abschließend wurden die Anteile jedes mitochondrialen Subtyps (Abbildung 4C) für die Kontroll- und Behandelte Gruppen dargestellt. In der Behandlungsgruppe gab es weniger fragmentierte Mitochondrien, aber keine signifikante Veränderung des Anteils vernetzter oder verlängerter Mitochondrien.

figure-results-1
Abbildung 1: Überblick über das Protokoll. Mäuse werden bis zu 6 Wochen lang mit Medikamenten oder einem Fahrzeug behandelt, wobei eine subkutane osmotische Minipumpenimplantation verwendet wird (1). Nach der Behandlung werden das Mausgewebe fixiert, mit Saccharose infiltriert, in die OCT-Substanz eingebettet und kryo-geschnitten (2). Die Gewebeschnitte werden anschließend mit Antikörpern gegen Tom20 gefärbt und mit sekundären Antikörpern, die mit Alexa Fluor 568 (3) gekennzeichnet sind. Superauflösende Z-Stacks werden auf einem Airyscan2-Punkt-Scanning-Konfokalmikroskop (4) gesammelt, und die entrauschten, verarbeiteten Z-Stacks werden in Arivis segmentiert, um die mitochondriale Morphologie zu quantifizieren (5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-2
Abbildung 2: Automatisierte Pipeline für mitochondriale Segmentierung und Morphologieanalyse.
Repräsentative einzelne optische Schnitte aus Kontroll- (obere Panels) und behandelten (unteren Panels) Proben. Das Tom20-Immunfluoreszenzsignal ist in Grau (links) dargestellt. Dasselbe Bild nach der Enttäuschung wird grau dargestellt, gefolgt von der Segmentierungsausgabe, die erkannte mitochondriale Objekte grün hervorhebt. Das zusammengeführte Bild zeigt die Überlappung zwischen dem entrauschten Signal und den segmentierten Objekten. Insets zeigen höhere Vergrößerungsansichten der angezeigten Regionen, was die Auswirkungen der Raubschärfe und die Genauigkeit der Segmentierung veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-3
Abbildung 3: Mitochondriale Morphologie in den Kontroll- und Behandelten Gruppen. Boxdiagramme zeigen den Median- ± Interquartilbereich der Medianwerte pro Stichprobe (n = 10 pro Gruppe). Jeder Punkt stellt eine biologische Probe dar, zusammengefasst als Median aller in dieser Probe nachgewiesenen Mitochondrien. Volumen und Oberfläche werden auf einerLog-10-Skala dargestellt. Die Gruppen wurden mit Wilcoxon-Rangsummentests verglichen. Signifikanzniveau: ns p ≥ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Unüberwachte morphometrische Klassifikation mitochondrialer Subtypen. (A) Ellbogendiagramm, das die Gesamtsumme der Quadrate innerhalb des Clusters (WSS) als Funktion der Anzahl der Cluster (k) zeigt, berechnet auf einer zufälligen Teilstichprobe von 10.000 Mitochondrien. Der Wendepunkt bei k = 4 wurde als optimale Anzahl von Clustern für die nachgelagerte Analyse ausgewählt. (B) (Links) UMAP-Dimensionsreduktion mitochondrialer morphometrischer Merkmale (n = 20.000 zufällig ausgewählte Mitochondrien), gefärbt nach zugewiesenem Subtyp. Es wurden vier morphologisch unterschiedliche Untertypen identifiziert: fragmentiert (klein, hohe Kugel), verlängert (lang, niedrige Sphäre), vernetzt (groß, unregelmäßig) und intermediär. (Rechts) UMAP-Projektion, gefärbt nach experimenteller Gruppe (Kontroll- vs. Behandelt), die die Verteilung jeder Gruppe über den morphologischen Raum zeigt. (C) Propro-Probe-Anteile jedes mitochondrialen Subtyps in jeder Versuchsgruppe. Jeder Datenpunkt repräsentiert eine biologische Probe (n = 10 pro Gruppe). Boxdiagramme zeigen den Interquartilbereich und Median, wobei Schnurrhaare bis zum 1,5-fachen des Interquartils reichen. Subtypanteile wurden zwischen den Gruppen mit dem Wilcoxon-Rangsummentest verglichen, und p-Werte wurden für Mehrfachvergleiche mit der Benjamini-Hochberg-Methode korrigiert. NS P ≥ 0,05, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Datei 1: Beispiel für eine arivis-Pipeline. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: R-Skript zur Quantifizierung mitochondrialer Morphologie und Subtyppopulationen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die zwei wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Durchführung dieses Protokolls sind (i) das Schließen des Schnitts während der Implantation der osmotischen Pumpe und (ii) die genaue Segmentierung. Bei Ersterem sollte man besonders darauf achten, eine subkutane Tasche zu schaffen, die groß genug für die Pumpe ist, aber nicht so groß, dass die Pumpe an der Flanke des Tieres hinunterrutscht. Wenn der Schnitt geschlossen ist, sollte die Pumpe weit genug entfernt platziert werden, um keine Spannung auf der umliegenden Haut zu erzeugen, was zu einer Dehiszenz führen kann. Ziehen Sie unbedingt in alle Richtungen an der Haut rund um den geschlossenen Schnitt, um sicherzustellen, dass die Wunde ausreichend geschlossen ist, bevor Sie mit der Tiergewinnung beginnen. Wickelklammern sind vorteilhaft, da sie schnell anzubringen und zu entfernen sind. Sollten jedoch Probleme auftreten, weil die Schnitte nicht richtig geschlossen werden können, können stattdessen unterbrochene Nähte verwendet werden. Für Letzteres erfordert eine genaue Segmentierung, dass man die Segmentierungsergebnisse ständig mit den entrauschungslosen Bildern vergleicht, bis eine ausreichende Bildähnlichkeit besteht. Z-Stacks von Kontroll- und behandelten Tieren müssen mit denselben Sammelparametern und vorzugsweise während derselben Bildgebungssitzung gesammelt werden. Ebenso müssen alle Verarbeitungsschritte auf alle Bilder mit exakt denselben Parametern angewendet werden. Der Durchmessersegmentierungsparameter definiert die erwartete Größe der zu detektierenden Objekte. Ein guter Ausgangspunkt ist die gemessene durchschnittliche mitochondriale Breite einiger manuell inspizierter Objekte mit einem optischen Schnitt. Die Wahrscheinlichkeitsschwelle bestimmt die minimale Erkennungskonfidenz, die für die Akzeptanz eines Objekts erforderlich ist. Niedrigere Werte erhöhen die Empfindlichkeit und erkennen mehr Objekte, aber einige dieser Objekte können falsch sein. Umgekehrt erhöhen höhere Werte die Spezifität, können aber dazu führen, dass Objekte mit geringerem Signal verloren gehen. Ein empfohlener Anfangsbereich liegt bei 25 % bis 30 %. Schließlich bestimmt die geteilte Empfindlichkeit, wie aggressiv berührende oder überlappende Objekte in einzelne Objekte getrennt werden. Eine geringe Spaltempfindlichkeit führt dazu, dass gruppierte Mitochondrien zu einzelnen verschmolzenen Objekten werden. Eine hohe Spaltempfindlichkeit hingegen kann zu einer Überspaltung von verlängerten oder verzweigten Mitochondrien in Fragmente führen. Werte zwischen 15 % und 30 % sind für typische mitochondriale morphologische Studien angemessen. Wenn eine genaue Segmentierung weiterhin schwierig ist, kann die Segmentierung mit dem Mitochondria Analyzer59 in FIJI60 durchgeführt werden. Eine halbautomatisierte Pipeline zur Quantifizierung mitochondrialer Morphologien sowohl in Zellen als auch in Geweben mit Huygens Professional Software und einem eigenen Python-Skript wurde ebenfallskürzlich beschrieben.

Eine Einschränkung ist die Auflösungsgrenze des Airyscan2-Konfokalmikroskops, die ~150 nm in XY und ~350 nm in der Z-Ebene beträgt. Dies verhindert eine hochauflösende Bildgebung der mitochondrialen Cristae, da die Abstände zwischen den einzelnen Cristae ~40–120 nm 62,63,64 betragen. Im Gegensatz dazu kann stimulierte Emissionsdepletion (STED) seitlich Auflösungsgrenzen von ~20–50 nm erreichen und einzelne mitochondriale Cristaeklar unterscheiden. Mehrere STED-Farbstoffe wurden kürzlich entwickelt, die eine effektive Färbung und Bildgebung der mitochondrialen inneren Membran in lebenden und fixierten Zellenermöglichen. Da die Analyse von Cristae-Morphologien Einblicke in die bioenergetische Gesundheit der Mitochondriengeben könnte, sind solche Daten daher wünschenswert. Die mitochondriale Morphologie unterscheidet sich jedoch stark zwischen Säugetiergeweben und Zellkulturen (weiter unten ausführlich erläutert), und es gibt derzeit keine Methode, um die innere Membran von Geweben für STED-Bildgebung und Analyse von Cristae-Strukturen zu färben.

Die Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie im intakten Gewebe stellt im Vergleich zu Zellkultursystemen besondere Herausforderungen dar. In kultivierten Zellen sind Mitochondrien typischerweise in gut getrennten Netzwerken im Zytoplasma verteilt, mit minimaler Überlappung zwischen den Zellen. Bei Gewebeschnitten oder Ganzmontagevorbereitungen sind die Zellen jedoch dicht gepackt, und ihre Grenzen sind nicht klar definiert. Wenn eine Analyse auf Zellebene erforderlich ist, sollte ein zusätzliches fluoreszierendes Etikett zur Plasmamembran oder einem zelltypspezifischen Marker zusammen mit einem entsprechenden Segmentierungsschritt in der Bildanalysepipeline integriert werden, um einzelne Zellgrenzen vor der Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie zu definieren. Ein weiterer wichtiger Unterschied besteht darin, dass in kultivierten Zellen Mitochondrien oft kontinuierliche, miteinander verbundene retikuläre Netzwerke bilden, die leicht sichtbar und interpretierbar sind. In Geweben wird dieses Muster selten beobachtet. Mitochondrien von Leberschnitten zeigen beispielsweise ein Muster von Punkten, Stäben und Bündeln, das das gesamte Zytosol66 einnimmt. Hepatozyten in Kultur zeigen jedoch röhrenförmige Morphologien mit klaren Netzwerkbildungen66. Ebenso werden beim Vergleich von Mitochondrien aus glattem Gewebe mit denen glatter Muskelzellen in Kultur deutliche Unterschiede in deren Morphologien und Netzwerkmusternfestgestellt 67. Die dreidimensionale Architektur, kombiniert mit zelltypspezifischen Unterschieden in der mitochondrialen Verteilung, führt dazu, dass Mitochondrien in diesen Geweben als diskrete, dicht gepackte Puncta oder kurze Fragmente erscheinen, anstatt als verlängerte Netzwerke. Daher ist eine vorsichtige Interpretation der Daten beim Vergleich morphologischer Merkmale zwischen Geweben und Zellkulturen angebracht, da Unterschiede zwischen beiden teilweise auf den Bildkontext und nicht auf echte biologische Variationen zurückzuführen sein können.

Ein Höhepunkt dieses Protokolls ist die Möglichkeit, mitochondriale Strukturen in Geweben mittels Lichtmikroskopie quantitativ zu messen. Obwohl es andere Methoden zur Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie anhand von Superauflösungs-Lichtmikroskopiebildern gibt, sind viele davon nur für Kulturzellen geeignet. Darüber hinaus ist die hier vorgestellte Pipeline im Gegensatz zu anderen Analysemethoden vollständig automatisiert, quantifiziert sowohl mitochondriale Dimensionen als auch Subtypproportionen und erfordert wenig Programmiererfahrung, um erfolgreich ausgeführt zu werden. Raster-/Transmissionselektronenmikroskopie (SEM/TEM) und Kryo-ET wurden zuvor verwendet, um mitochondriale Strukturen in Geweben in 2D und 3D10, 68, 69 abzubilden. Für Ersteres gibt es jedoch Bedenken hinsichtlich der Erhaltung einheimischer Strukturen nach Probenfixierung, Dehydrierung und Einbettung70,71. Darüber hinaus ist die manuelle Messung mitochondrialer Parameter in FIJI60 manchmal die bevorzugte Analysemethode für TEM-Bilder72, was erhebliche Arbeit erfordert und zu einer Stichprobenverzerrung führen kann. Deep-Learning-Methoden zur automatisierten Quantifizierung mitochondrialer Morphologien anhand von TEM-Bildern wurden jedoch kürzlichbeschrieben 73,74. Ein Vorteil des vorgestellten Ansatzes besteht darin, dass sie, sobald die Analysepipeline etabliert ist, Bilder mit wenig bis gar keiner Benutzereingabe im Batch verarbeiten kann. Bei letzterem kann Hochdruckgefrieren Gewebestrukturen unter nahezu natürlichen Bedingungenerhalten 75. Allerdings erfordern das Einfrieren, Sektionieren, Fräsen, Datenerhebung und Datenverarbeitung von Cryo-ET umfangreiche Schulungen und hochmoderne Ausrüstung. Im Gegensatz dazu ist die Superauflösungs-Konfokalmikroskopie relativ zugänglicher und erfordert weniger Ausbildung und Ressourcen zur erfolgreichen Durchführung.

Implantationen der osmotischen Pumpe können sicher bei gealterten Mäusen durchgeführt werden, um die Auswirkungen verschiedener pharmakologischer Verbindungen auf altersbedingte Rückgänge der physiologischen Funktion zu bewerten. Zusätzlich sind die hier beschriebenen Methoden auf viele verschiedene Organe verallgemeinerbar. Es ist gut charakterisiert, dass altersbedingte Rückgänge der Stoffwechselfunktion zur Krankheit beitragen und aus mitochondrialer Dysfunktion entstehen, einem der umgangssprachlichen Merkmale des76-jährigen Alters. Außerdem ist bekannt, dass mitochondriale Strukturen die bioenergetische Kapazität und den metabolischen Status der mitochondrienbeeinflussen 77,78. Daher kann die quantitative Bewertung von Verbindungen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die mitochondriale Struktur während des Mausalterns mit den hier beschriebenen Methoden bei der Identifizierung von Therapeutika helfen, die die menschliche Gesundheitsspanne verlängern können.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu deklarieren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten die Microscopy Resources on the North Quad (MicRoN) Core an der Harvard Medical School für den Zugang und die Ausbildung zu den konfokalen Mikroskopen und Rechenressourcen dieser Studie anerkennen. Diese Forschung wurde durch NIA-Förderungen an VNG finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Airyscan2 point scanning confocal microscopeZEISSLSM 980 with Airyscan2ZEISS point scanning LSM 980 confocal built around a ZEISS Axio Observer Z1 and equipped with two multi-alkali PMTs and a GaASP 32 channel spectral detector, an environmental enclosure, and a Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III objective. The microscope used in this study is also equipped with two external NIR detectors, as well as the following laser lines: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639, and 730 nm. 
AluminiumfolieEssendantBWK7112
AnalysenwaageMettler ToledoMR204
Anti-Roll-GlasplatteGel CompanyLGI70
Arivis Pro SoftwareZEISSVersion 4.1.2
UltraschallbadBranson Ultrasonics71020-MT
RinderserumalbuminResearch Products InternationalA30075
Zentrifugenrohr, 15 mlCELLTREAT229411
Ladungsmikroskop-ObjektträgerGlobe Scientific1358W
KlammerentfernerAlzet0009976
CO2AirgasCD 50
Contrad 70Decon Labs1003
WattestäbchenPuritan Medical25-8061WC
KryostatLeica BiosystemsCM3050 S
KryostatklingenSakura Finetek USA Inc4689
DAPISigma-AldrichD9542Auf 5 mg/ml in ddH2O vorbereiten, portionieren und bei -20 °C vor Licht geschützt lagern
DimethylsulfoxidSigma-AldrichD2650
EasyDip-Objektträger-FärbesystemElectron Microscopy Services71388-01
Electro-GelBio-ServEGS-1
Einbettungsformen, 22 mm ´ 22 mm ´ 20 mmPolysciences18646A-1
Ethanol, 200 ProofDecon LabsV1001
FenstertuchDukal20001
FeinpinzetteFine Science Tools11445-12
Glasperlen-SterilisatorVWR75999-324
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568InvitrogenA-11036
WärmekissenCVS215313
Hämostatische PinzetteWorld Precision Instruments501705
Immersiol 518 F EintauchölZEISS433802-9010-000
InduktionskammerWorld Precision InstrumentsEZ178
Insulinspritze, 0,3 mlBD328431
Iris-chirurgische SchereSklar Surgical Instruments47-1135
IsofluranPatterson Veterinary07-890-8115
KimwipesKimberly-Clark34120
Luer-Lok 1 ml SpritzenBD309628
Luer-Lok 3 ml SpritzenBD309657
Luer-Lok 50 ml SpritzenBD309653
Meloxivet (Meloxicam)Patterson Veterinary07-894-8524
Mikrozentrifugenrohr, 1,5 mlCELLTREAT229443
ObjektträgerboxHeathrow Scientific15994E
Deckgläser für Objektträger, Nr. 1,5, 22 mm ´ 50 mmElectron Microscopy Services72204-04
CO2-freier InkubatorBenchmark ScientificH2200-H
Nicht-FenstertuchDukal20-002
OCT CompoundSakura Finetek USA Inc4583
AugensalbePatterson Veterinary07-888-2572
Osmotische MinipumpenAlzet2004
ParafilmBemisPM999
Paraformaldehyd, 4% w/vSanta-Cruz Biotechnologysc-281692
PBS, 1´Thermo Scientific10010023
PEG300Sigma-Aldrich90878
PES-Spritzenfilter, 0,22 μmCELLTREAT229747
Povidon-Jod 10% USP TupferMedlineMDS093901ZZ
ProLong Glass AntifadeInvitrogenP36980
Rabbit anti-Tom20-AntikörperNovus BiologicalsNBP2-67501
Rasierklingen, 0,22 mmVWR55411-050
Rotator/SpiesseLabnetH5500
RStudioThe R Project for Statistical Computingversion 4.3.2
WaageFisher ScientificS72422
SomnoSuite Low-Flow-AnästhesiesystemKent ScientificSS-01
DampfsterilisationsindikatorstreifenCrosstexSIS-250
Sterile Glasfläschchen, 5 mlThermo ScientificST5
Sterile Nadeln, 0,5", 23 GBD305145
Sterile Nadeln, 0,5", 27 GBD305109
SterilisierbeutelCardinal Health92510
SaccharoseSigma-AldrichS9378Eine Lösung von 30% w/v in 1´ PBS vorbereiten
Chirurgische Schere3M9680
Chirurgische HandschuheCardinal Health2D73DP75
GewebezangeSklar Surgical Instruments47-1447
OberflächenwaageCole

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BiologieAusgabe 234Ausgabe 234Leerer WertAusgabeMitochondrienSuper Resolution MikroskopieSegmentierung
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