Diese Studie beschreibt ein In-vitro-Modell zur Bewertung der schützenden Wirkung von Sanqi Baiji San gegen ethanolinduzierte Verletzungen von Magenepithelzellen und deren Beteiligung an PI3K/AKT-bezogener Signalübertragung.
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Forschungsartikel
Diese Studie beschreibt ein In-vitro-Modell zur Bewertung der schützenden Wirkung von Sanqi Baiji San gegen ethanolinduzierte Verletzungen von Magenepithelzellen und deren Beteiligung an PI3K/AKT-bezogener Signalübertragung.
Diese Arbeit zielte darauf ab, den Schutzmechanismus von Sanqi Baiji San (SQBJ) gegen ethanolinduzierte Magenepithelzellverletzungen zu klären und dessen potenzielle Relevanz für Magengewüre (GU) zu untersuchen. Netzwerkpharmakologie wurde verwendet, um die aktiven Komponenten von SQBJ zu testen (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform [TCMSP], Oral Bioavailability [OB] ≥ 20 %, Drug-Likeness [DL] ≥ 0,1), ihre Ziele zu kartieren (Universal Protein Resource [UniProt]), GU-bezogene Ziele zu sammeln (GeneCards/OMIM/DrugBank) und überlappende Ziele mittels Gene Ontology (GO)/Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherung und molekulares Docking zu analysieren. Ethanolgeschädigte gastrische Epithelzellzellen-1 (GES-1)-Zellen wurden mit SQBJ oder dem PI3K-Inhibitor LY294002 behandelt. CCK-8 wurde verwendet, um die optimale SQBJ-Konzentration zu bestimmen. Netzwerkpharmakologische Analysen identifizierten 126 gemeinsame Ziele, die in PI3K/AKT/MAPK-bezogenen Kaskaden angereichert sind, und deuteten potenzielle Interaktionen zwischen den Hauptbestandteilen von SQBJ und PI3K/AKT-bezogenen Proteinen vor. In ethanolbelasteten Zellen linderte SQBJ die Zellverletzung, indem es die Entzündungsfreisetzung von Entzünder-Mediatoren und oxidativen Stress reduzierte, was sich an verringerten intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies und Malondialdehydspiegeln zeigte. SQBJ stellte das Potenzial der mitochondrialen Membran und den ATP-Gehalt wieder her und reduzierte apoptoseassoziierte Veränderungen im B-Zell-Lymphom-2, gespaltenen Caspase-3- und Bcl-2-assoziierten X-Protein-Spiegeln. SQBJ modulierte außerdem PI3K/AKT- und MAPK-assoziierte Signalmarker. Diese schützenden Effekte wurden durch LY294002 weitgehend abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass PI3K/AKT-bezogene Signalübertragung an der SQBJ-vermittelten Zytoprotektion beteiligt ist. Diese Ergebnisse bilden eine in-vitro-mechanistische Grundlage für die mögliche Anwendung von SQBJ in GU, obwohl eine weitere Validierung von ethanolinduzierten Magenulkus in Tiermodellen erforderlich ist.
Magenulkus (GU) ist eine weltweit sehr verbreitete gastrointestinale Erkrankung, die durch lokale Entzündungen, Erosion und Geschwüre der Magenschleimhaut gekennzeichnet ist. Laut Schätzungen der Analyse der Global Burden of Disease (GBD 2021) von 2021 stellt die Magenulkuserkrankung (PUD) weltweit weiterhin eine erhebliche klinische und wirtschaftliche Belastung für Millionen von Patienten dar. Obwohl die Gesamtprävalenz von PUD aufgrund der weit verbreiteten und umfangreichen klinischen Abhängigkeit von antiinfektiven Regimen und säureunterdrückenden Protonenpumpenhemmer (PPIs) zurückgegangen ist, hat sich dieser Abwärtstrend stabilisiert, wobei sogar in einigen Regionen1 eine Erneuerung beobachtet wurde. Bemerkenswert ist, dass der Konsum von Alkohol (Ethanol) ein kritischer pathogener Faktor ist, unabhängig von der Helicobacter pylori (H. pylori.)-Infektion und der Verwendung von nichtsteroidalen entzündungshemmenden Medikamenten (NSAID). Langfristiger übermäßiger Alkoholkonsum schädigt die Magenschleimhautbarriere, beschleunigt die Entwicklung von Magengeschwüren und erhöht sogar die Anfälligkeit für Magenkrebserkrankungen – wodurch diese Erkrankung zu einer kritischen internationalen Gesundheitskriseist. In Entwicklungsländern steigt die Häufigkeit alkoholbedingter Magenschleimhautverletzungen aufgrund mehrerer Faktoren, darunter zunehmender Alkoholkonsum und Lebensstiländerungen, was einen dringenden Bedarf an effektiven und sicheren Präventions- und Behandlungsstrategien schafft.
Der pathologische Mechanismus, der der ethanolinduzierten Magenschleimhautverletzung zugrunde liegt, ist multifaktoriell und vielschichtig. Bei direktem Kontakt mit der Magenschleimhaut zerstört Ethanol schnell die Schleim-Bicarbonat-Barriere und löst einen unkontrollierten Anstieg intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) aus. Dieser oxidative Ausbruch löst anschließend eine Lipidperoxidation aus (gekennzeichnet durch erhöhtes Malondialdehyd, MDA), verbraucht endogene Antioxidantien in der Magenschleimhaut wie Superoxiddismutase (SOD) sowie Glutathion (GSH) und induziert letztlich mitochondriale Dysfunktion3. Zunehmende Belege deuten darauf hin, dass intrazelluläres ROS, das durch Ethanol induziert wird, hauptsächlich aus Mitochondrien stammt und eng mit dem Kollaps des inneren mitochondrialen Membranpotenzials (Δψm) und der Hemmung der Adenosintriphosphatsynthese (ATP)in Verbindung steht. Gleichzeitig aktiviert oxidativer Stress die pro-inflammatorisken Kaskaden unter dem Kommando des Nuklearfaktor-Kappa B (NF-κB) weiter. Diese Aktivierung fördert anschließend die massive Freisetzung von entzündlichen Mediatoren, vor allem Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) und C-reaktivem Protein (CRP), wodurch ein Teufelskreis der "oxidativen Stress-Entzündungsreaktion" entsteht5. Auf dieser Grundlage wird die intrinsische apoptotische Kaskade, die durch Mitochondrien ausgelöst wird, was sich in einem gestörten Verhältnis von Bcl-2 zu Bax neben der sequentiellen enzymatischen proteolytischen Spaltung der cysteinylaspartatspezifischen Proteinase 3 (Caspase-3) zeigt, was schließlich zum massiven Absterben der magenschleimhautepitalen Zellen und zur Bildung von Geschwüren6 führt. Dementsprechend stellt die gleichzeitige Zielsetzung der drei zentralen pathologischen Verbindungen oxidativen Stress, entzündliche Reaktion und Apoptose eine Schlüsselstrategie für die wirksame Intervention der alkoholischen Magenschleimhautverletzung dar.
Der Phosphoinositid-3-Kinase/Protein-Kinase-B-Signalweg (PI3K/AKT) stellt eine zentrale regulatorische Achse dar, die die zelluläre Langlebigkeit, Vermehrung und den programmierten Tod steuert und eine entscheidende Funktion bei der Erhaltung der Magenschleimhaut-Homöostase erfüllt. Nach der Aktivierung phosphoryliert die PI3K/AKT-Signalübertragung mehrere nachgelagerte Substrate, hemmt die Aktivität des pro-apoptotischen Faktors Bad, behindert so die mitochondriale Entlassung des zellzerstörenden Cytochroms C, erhält die ΔΨm-Homöostase aufrecht und fördert das Zellüberleben7. Darüber hinaus gibt es ein komplexes antagonistisches Crosstalk zwischen den PI3K/AKT-Kaskaden- und mitogenaktivierten Proteinkinase-Netzwerken (MAPK): Die hochregulierte Aktivierung von PI3K/AKT kann die entzündliche Signaltransduktion und apoptotische Kaskadenreaktionen abschwächen, indem sie die Aktivierung von Stresskinasen hemmt, einschließlich p38, c-Jun N-terminaler Kinase (JNK) und extrazellulärer regulierter Proteinkinasen (ERK)8. Mehrere Studien haben gezeigt, dass eine verminderte Aktivität des PI3K/AKT-Weges eng mit einer verstärkten Entzündung und erhöhter Apoptose in Magenschleimhautverletzungsmodellen verbunden ist, während die Wiederherstellung der Aktivität dieses Weges die Schleimhautverletzung9 signifikant mildern kann. Derzeit fehlt jedoch eine systematische kausale experimentelle Überprüfung des genauen Regulationsmechanismus von PI3K/AKT bei ethanolinduzierter Magenschleimhautschädigung, insbesondere seiner synergistischen Beziehung zum MAPK-Weg.
Im Hinblick auf moderne Pharmakotherapie sind PPIs die erste Option für die klinische Behandlung von GU, doch ihre langfristige Verabreichung hat zunehmende Sicherheitsbedenken aufgeworfen. Sich ansammelnde Studien haben chronische PPI-Anwendung mit verschiedenen Nebenwirkungen in Verbindung gebracht, darunter Nierenerkrankungen, kardiovaskuläre Ereignisse, osteoporotische Brüche, Nährstoffmängel (Eisen, Magnesium und Vitamin B12), Clostridioides difficile-Infektion und sogar ein erhöhtes Risiko für Magenkrebs10. Darüber hinaus wurde das Phänomen der rückläufigen Magensäure-Hypersekretion nach Absetzen der PPI durch groß angelegte pharmakovigilanzbezogene Daten11 bestätigt. Diese Sicherheitsrisiken haben sowohl klinische als auch Grundlagenforschungsgemeinschaften dazu veranlasst, alternative Therapien mit multizielreichen Schutzmechanismen, minimalen Nebenwirkungen und langfristiger Eignung aktiv zu erforschen. Insbesondere natürliche Verbindungspräparate aus der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) haben aufgrund ihres ganzheitlichen therapeutischen Konzepts der Wirkung "Multi-Komponenten-, Multi-Ziel- und Multi-Pathways"-Wirkung12 große Aufmerksamkeit erregt.
Sanqi Baiji Pulver (SQBJ) ist eine klassische TCM-Zusammensetzungsformel, die aus Panax notoginseng und Bletilla striata im Massenverhältnis von 1:1 besteht. Panax notoginseng ist bekannt für seine Wirkungen zur Förderung der Blutzirkulation und zum Stoppen von Blutungen sowie zur Linderung schmerzhafter Schwellungen. Seine primären bioaktiven Bestandteile, darunter Notoginsenosid R1 sowie Ginsenoside (Rg1, Rb1), haben erhebliche entzündungshemmende, antioxidative und schleimhautreparierende Wirkungen. Bletilla striata zeichnet sich durch ihre adstringierenden Effekte aus, die Blutungen stoppen, Schwellungen reduzieren und die Regeneration beschädigter Gewebe fördern. Gleichzeitig hat Bletilla striata polysaccharid (BSP), das als primärer aktiver Extrakt dient, eine Wirksamkeit bei der Unterdrückung der JNK/p38 MAPK-Kaskade dokumentiert, wodurch die Expression von Interleukin-1β (IL-1β), TNF-α und IL-6 verringert und die antioxidative Abwehrfähigkeit der Magenschleimhaut13 verbessert wird. Gesammelte Literaturbelege haben bestätigt, dass die gemeinsame Verabreichung von Panax notoginseng. saponinen (PNS) und BSP in alkoholischen Magengeschwürmodellen14 eine synergetische Wirkung zeigt, und SQBJ-bezogene Präparate haben in präklinischen Studien zu Refluxösophagitis und Magenulkus15 signifikante schleimhautschützende Effekte gezeigt. Derzeit gibt es jedoch keine systematische in-vitro-experimentelle Überprüfung des Mechanismus des Signalwegs, der dem gastrischen schleimhautschützenden Effekt von SQBJ zugrunde liegt, insbesondere der Kernrolle des PI3K/AKT-Wegs und seiner regulatorischen Beziehung zu MAPK. Unterdessen ist die kausale Verbindung zwischen den entscheidenden Bestandteilen und den funktionellen Rezeptoren von SQBJ noch nicht vollständig geklärt.
Um diese Lücken zu schließen, verfolgte die vorliegende Studie eine integrierte Forschungsstrategie, die Netzwerkpharmakologie und in-vitro-experimentelle Verifizierung kombiniert und die ethanol-herausgeforderte GES-1-Zelllinie als experimentelle Plattform nutzt, um den potenziellen molekularen Mechanismus der gastrischen epithelialen Schutzwirkungen von SQBJ zu untersuchen, mit Schwerpunkt auf oxidativem Stress, entzündlichen Reaktionen, apoptotischen Prozessen und PI3K/AKT-bezogener Signalübertragung. und MAPK-assoziierte Änderungen. Zunächst nutzten wir den PI3K-Inhibitor LY294002, um vorläufig die Beteiligung der PI3K/AKT-Signalübertragung zu bewerten und stellten fest, dass die Hemmung dieses Weges die schützende Wirkung von SQBJ abschwächte, was darauf hindeutet, dass PI3K/AKT-bezogene Signalübertragung zur SQBJ-vermittelten Zytoprotektion beiträgt. Zweitens untersuchten wir den Zusammenhang zwischen PI3K/AKT-bezogenen Veränderungen und der Regulierung des MAPK-Weges und lieferten vorläufige Hinweise darauf, dass Änderungen der MAPK-Signalübertragung mit der SQBJ-Modulation der funktionellen Antwort der PI3K/AKT-Achse zusammenhängen könnten. Zusammenfassend etabliert diese Arbeit einen invitro molekularen Rahmen zur Bewertung, wie SQBJ ethanolbedingte Magenepithelschäden mindert, und liefert vorläufige Belege für weitere Untersuchungen von TCM-Verbindungsformeln bei alkoholischen Magenschleimhautschäden. Tierversuche sind jedoch weiterhin erforderlich, um zu bestätigen, ob diese zellulären Schutzeffekte in in vivo übersetzt werden können. Therapeutische Wirksamkeit in experimentellen Modellen alkoholbedingter Magenulzeration (Ergänzende Abbildung S1).
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Diese Studie umfasste weder menschliche Teilnehmer, menschliche Gewebeproben, klinische Proben noch Tierversuche. Für die Analyse der Netzwerkpharmakologie wurden öffentlich verfügbare und anonymisierte Datenbankressourcen genutzt, und kommerziell verfügbare GES-1-Zellen wurden für In-vitro-Experimente verwendet. Daher waren keine formale ethische Genehmigung und informierte Zustimmung erforderlich. Detaillierte Informationen zu den wichtigsten Reagenzien, Antikörpern, Testkits, Instrumenten, Herstellern, Katalognummern und Research Resource Identifiers (RRIDs), wo zutreffend, sind in der Materialtabelle zusammengefasst.
Herstellung und Qualitätskontrolle des wässrigen SQBJ-Extrakts
Kräutermaterialien
Die Rohstoffe von Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (Wurzel und Rhizom) und Bletilla striata.(Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (Knollen) wurden von einem kommerziellen Lieferanten traditioneller chinesischer Medizin bezogen und anschließend von einem leitenden TCM-Apotheker nach der Chinesischen Artiker-Pharmakopoei (Ausgabe 2025) authentifiziert. Gutscheinproben (Nr. SQBJ-20240301, Nr. PN-20240301, Nr. BS-20240301) wurden im Herbarium unserer Institution deponiert. Die beiden Kräuter wurden zerdrückt und mit einem Massenverhältnis von 1:1 vermischt, um SQBJ-Pulver herzustellen.
Herstellung des wässrigen SQBJ-Extrakts
Das SQBJ-Pulver wurde zwei aufeinanderfolgende Refluxextraktionen mit deionisiertem Wasser im Feststoff-Flüssigkeits-Verhältnis von 1:10 (g/mL) für jeweils 1 Stunde pro Sitzung durchgeführt. Anschließend wurden die gesammelten Extrakte kombiniert und durch vier Schichten medizinischer Gaze geführt, um Restmaterial zu entfernen. Das resultierende Filtrat wurde unter reduziertem Druck bei 60 °C konzentriert, bis eine relative Dichte von 1,05–1,10 erreicht wurde, gefolgt von Vakuumgefriertrocknung, um das wässrige SQBJ-Extraktpulver zu erhalten, mit einer Endextrakterträge von 18,2 % ± 0,6 %. Das Extraktpulver wurde versiegelt und bei −20 °C gelagert, in serumfreiem DMEM-Medium gelöst und anschließend durch einen 0,22 μm Membranfilter zur Sterilisation vor Zellexperimenten geleitet.
Qualitätskontrolle des wässrigen SQBJ-Extrakts
Um die Konsistenz und Standardisierung des wässrigen SQBJ-Extrakts von Charge zu Batch zu bewerten, führten wir eine quantitative Bestimmung parallel zur High-Performance-Liquid Chromatography (HPLC)-Fingerabdruckprofilierung durch. Die Materialübersicht listet die umfassenden technischen Parameter des HPLC-Systems auf. Basierend auf den chemischen Profilen beider Bestandteile haben wir vier repräsentative Marker gezielt: Notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Rb1 und Militarin. Diese auf HPLC basierende Qualitätskontrollstrategie spiegelte jedoch hauptsächlich mehrere repräsentative Interessengruppen wider und bot kein umfassendes chemisches Profil aller Wirkstoffe in SQBJ.
Die chromatographische Trennung erfolgte über eine Umgekehrtphasen-C18-Säule (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). Der Betrieb wurde bei einer Säulentemperatur von 30 °C aufrechterhalten, mit einer Durchflussrate von 1,0 mL/min, einem Injektionsvolumen von 10 μL und einer Detektionswellenlänge von 203 nm. Die Zusammensetzung der mobilen Phase bestand aus Acetonitril (A) und 0,1 % phosphorsäurehaltiger wässriger Lösung (B), wobei folgender Gradienten-Elutionslauf verwendet wurde: 0–15 Min, 19 % A; 15–35 Min, 19%–35% A; 35–55 Min, 35%–55% A; und 55–60 Min, 55%–19% A. Detaillierte Informationen zu Instrumenten und Säulen finden sich in der Materialtabelle.
Referenzstoffherstellung
Um quantitative Analysen durchzuführen, haben wir kommerzielle Standards für Notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Rb1 und Militarin erworben, alle mit einer Reinheit ≥ 98 %. Die einzelnen Referenzchemikalien wurden präzise gemessen und in einem einzigen Methanolbestand gelöst, um eine einheitliche gemischte Referenzlösung mit einer Endkonzentration von 50 μg/mL für jede Komponente zu erreichen.
Probenvorbereitung:
Das trockene Pulver aus wässrigem Extrakt (50 mg) von SQBJ wurde präzise gemessen, gefolgt von der Auflösung mit 25 ml analytischem Methanol. Diese Mischung wurde 30 Minuten lang mit einem Ultraschallbad unter kontrollierten Instrumentenparametern (Leistung: 250 W; Frequenz: 40 kHz) behandelt. Nach der Rückkehr zur Raumtemperatur wurde die Flüssigkeit durch eine 0,22 μm große organische Filtermembran geleitet, um die endgültige analytische Testlösung zu erhalten.
Inhaltsbestimmungsergebnisse:
Der durchschnittliche Gehalt der charakteristischen Kernkomponenten in drei aufeinanderfolgenden Chargen des wässrigen SQBJ-Extrakts war wie folgt: Notoginsenosid R1 3,12 ± 0,11 mg/g, Ginsenosid Rg1 8,45 ± 0,23 mg/g, Ginsenosid Rb1 5,26 ± 0,18 mg/g und Militarosin 2,78 ± 0,09 mg/g, wobei der RSD jeder Komponente zwischen den Chargen 5 % <, was die gute Konsistenz des Extrakts von Charge zu Charge bestätigt.
Ethik- und Compliance-Erklärung
Weder Tierversuche noch die Einbeziehung von klinischen Proben am Menschen, Gewebebiopsien und lebenden Probanden waren während der gesamten Studie beteiligt. Die Analyse der Netzwerkpharmakologie wurde mit öffentlich zugänglichen Datenbanken durchgeführt, darunter TCMSP, UniProt, GeneCards, OMIM, DrugBank, STRING, Metascape, PubChem und RCSB PDB. Alle aus diesen Datenbanken abgerufenen Daten waren öffentlich zugänglich und anonymisiert; Daher war das Bioinformatik-Profiling vollständig von der Forderung nach formaler informierter Einwilligung oder zusätzlicher ethischer Aufsicht ausgenommen.
Die gegenwärtigen In-vitro-Experimente wurden mit der kommerziell erhältlichen humanen Magenschleimhautopithelzelllinie GES-1 durchgeführt. Es wurden keine primären menschlichen Stellen oder von Patienten abgeleitete biologische Materialien verwendet. Die Zelllinie wurde aus einem authentifizierten Zellarchiv gewonnen und gemäß institutionellen Biosicherheits- und Zellkulturrichtlinien behandelt. Da diese Studie nur etablierte Zelllinien und öffentlich zugängliche Datenbanken umfasste, war sie von der formellen Genehmigung eines institutionellen Ethikausschusses ausgenommen. Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den relevanten institutionellen Laborsicherheits- und Forschungsanforderungen durchgeführt.
Netzwerkpharmakologische Studien
Identifizierung und Screening der Wirkstoffziele
Die aktiven Bestandteile von Panax notoginseng und Bletilla striata., den beiden Bestandteilen von SQBJ, wurden aus öffentlich zugänglichen Datenbanken abgerufen. Alle datenbankbezogenen Informationen, die in dieser Studie verwendet wurden, waren öffentlich zugänglich und enthielten keine identifizierbaren personenbezogenen Daten. Anhand botanischer Namen als Abfragen identifizierten wir potenzielle Pflanzenstoffe aus der Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). Zur Identifizierung geeigneter bioaktiver Moleküle verwendete das Screening-Protokoll Schwellenwerte für orale Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 20 % und Arzneimittelähnlichkeit (DL) ≥ 0,1. Anschließend identifizierten wir die potenziellen nachgelagerten Genziele, die mit diesen Kandidatenkomponenten assoziiert sind, und ließen dabei alle Bestandteile ohne passende gültige Genziele aus. Alle Zielgene wurden über die Universal Protein Resource (UniProt) annotiert und standardisiert, wobei die Suche in der Referenzdatenbank ausschließlich auf Homo sapiens beschränkt wurde und so die endgültige Zielgenliste für die funktionellen aktiven SQBJ-Komponenten erstellt wurde.
Abruf pathologiebezogener Ziele
Um Gene zu sammeln, die mit der Erkrankung verbunden sind, haben wir drei öffentliche Datenbanken abgefragt: GeneCards, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) und DrugBank, wobei "Magenulkus" als Suchbegriff dient. Der plattformübergreifende Datensatz wurde anschließend zusammengeführt, gefolgt von der Eliminierung redundanter Einträge, um eine standardisierte Liste der Magenulkus-assoziierten Zielgene zu erstellen.
Netzwerkkonstruktion für Zutaten, Ziele und Krankheiten
Wir bestimmten die überlappenden Zielgene zwischen den aktiven SQBJ-Komponenten und dem Magenulkus. Anschließend wurde ein mehrschichtiges Interaktionsnetzwerk mit Netzwerkvisualisierungssoftware aufgebaut. Zur Bewertung der Knotenwichtigkeit berechnete der integrierte topologische Bewertungsalgorithmus die topologischen Parameter jedes Knotens, einschließlich Grad und Zwischenzentralität. Basierend auf diesen berechneten Werten identifizierten wir die aktiven Komponenten und wichtigsten funktionellen Ziele von SQBJ bei der Behandlung eines Magenulkus.
Abbildung von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI)
Die identifizierten Konsensziele, die zwischen SQBJ und Magengeschwür geteilt wurden, wurden mit der STRING-Datenbank abgeglichen. Unsere Anfrage spezifizierte die Multi-Protein-Analyse-Vorlage, während der analytische Hintergrund auf Homo sapiens beschränkt wurde. PPIs wurden mit einer minimalen Interaktionskonfidenzschwelle von mittlerer Konfidenz (> 0,4) gefiltert.
Die resultierenden funktionalen Konnektivitätsdatensätze wurden als TSV-Datei exportiert, die anschließend in eine dedizierte Netzwerkvisualisierungssoftware für die PPI-Analyse integriert wurde. Basierend auf der berechneten Verbindungstopografie haben wir die Kernfunktionsknoten im Netzwerk bewertet, indem wir den spezifischen Gradwert jedes Knotens bewertet haben.
Downstream-funktionale Annotation und Wegabbildung
Um die biologischen Rollen der gemeinsamen Schnittknoten zu erläutern, führten wir eine Analyse der funktionellen Anreicherung der Genontologie (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalweganreicherungsanalyse mit einem webzugänglichen bioinformatischen Annotationstool durch. Die funktionelle Klassifikation teilt Gene in drei klassische Kategorien ein: biologischer Prozess (BP), zelluläre Komponente (CC) und molekulare Funktion (MF). Blasendiagramme und Balkendiagramme für Anreicherungsergebnisse wurden mit einer Online-Bioinformatik-Plotplattform erstellt, um die primären biologischen Prozesse und Signalwege zu kartieren, die mit der therapeutischen Wirkung von SQBJ auf Magengeschwüre verbunden sind.
Computergestützte molekulare Andocksimulation
Die räumlichen Geometrie-Dateien der aktiven Kernkomponenten von SQBJ wurden aus öffentlichen Datenbanken des Compounds heruntergeladen und anschließend als MOL2-Dateien mit Dateiverarbeitungssoftware gespeichert. Wir erhielten außerdem die dreidimensionalen Kristallstrukturen der Kern-Zielproteine durch Abfrage der Protein Data Bank. Diese makromolekularen Strukturen wurden vorverarbeitet, indem ursprüngliche Liganden und Wassermoleküle entfernt wurden, und die daraus resultierenden sauberen Modelle wurden im PDB-Format gespeichert. Zur Simulation von Rezeptor-Liganden-bindenden Energien wurde die Andockverifikation mit aktiven Kernkomponenten und Zielproteinen mittels standardisierter computergestützter molekularer Andocksoftware durchgeführt. Die Andockergebnisse wurden optimiert und mit molekularer Visualisierungssoftware gerendert.
Zellkultur
GES-1-abgeleitete gastrische Epithelzellen wurden mit RPMI-1640-Medium kultiviert, das mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin–Streptomycin bei 37 °C unter einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ integriert ist. Wir identifizierten die Quellkultur als etablierte Zelllinie, wobei wir den Anfangsbestand aus einem authentifizierten Zellarchiv bezogen haben. Bei einer beobachteten Konfluenz von 80–90 % wurden die Monoschichten zweimal mit PBS gespült, gefolgt von einer Abtrennung mit 0,25 % Trypsin-EDTA für 2 Minuten bei 37 °C. Um die enzymatische Spaltungsreaktion zu beenden, brachten wir ein gleiches Volumen vollständigen Mediums ein. Die resultierende zelluläre Suspension wurde bei 1.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert, danach wurde das Pellet in frischem vollständigem Medium wieder suspendiert und mit entsprechender Dichte neu ausgesät. Kulturen wurden unter identische Brutbedingungen zurückgebracht. Während der gesamten Vermehrungsphase wurde ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zelle, die Morphologie und den Wachstumsstatus zu bewerten, und Zellen in ihrer logarithmischen Wachstumsphase wurden routinemäßig für nachgelagerte Analysen gesammelt.
Etablierung und Behandlung des ethanolinduzierten GES-1-Zellverletzungsmodells
GES-1-Zellen der logarithmischen Phase wurden bei 5 × 105 Zellen/Bohrloch in 6-Bohrloch-Platten oder 1 × 104-Zellen /Brunnen in 96-Bohrloch-Platten ausgesat und über Nacht inkubiert, um anzuhaften. Die durch Ethanol verursachte Schädigung wurde durch die Exposition von Zellen mit 500 mmol/L Ethanol in unsupplementiertem RPMI-1640 für 4 Stunden festgestellt. Diese Bedingung wurde auf Grundlage von vorläufigen Konzentrations- und Zeitantwortexperimenten ausgewählt. Im vorläufigen Test verursachte 250 mmol/L Ethanol für 4 Stunden nur eine leichte Schädigung, wobei die Zelllebensfähigkeit bei etwa 78,6 ± 5,4 % blieb, während 750 mmol/L Ethanol die Lebensfähigkeit auf 32,8 ± 4,7 % reduzierten, was auf eine übermäßige Zytotoxizität hinweist. Die Exposition gegenüber 500 mmol/L Ethanol für 4 Stunden verringerte die Zelllebensfähigkeit auf 54,7 ± 4,9 %, was zu reproduzierbaren moderaten bis schweren Schäden führte, während genügend lebensfähige Zellen für nachfolgende Interventionen und mechanistische Tests erhalten blieben. Daher wurde für die Modellentwicklung 500 mmol/L Ethanol für 4 Stunden ausgewählt. Diese Erkrankung wurde verwendet, um akute ethanolinduzierte Epithelverletzungen in vitro zu simulieren, und reproduziert nicht vollständig das physiologische Expositionsmuster der Magenschleimhaut in vivo.
Für die pharmakologische Intervention wurden drei Konzentrationen des wässrigen SQBJ-Extrakts (5, 10 und 50 μg/mL) ausgewählt und unmittelbar nach der Ethanol-Challenge verabreicht. Im PI3K-Hemmungsarm wurden die Zellen mit 20 μmol/L LY294002 für 30 Minuten vorinkuiert, bevor sie mit Ethanol und der optimalen SQBJ-Konzentration kombiniert wurden. Eine positive Kontrollkohorte erhielt unmittelbar nach der Ethanolexposition 20 μmol/L Omeprazol. Omeprazol wurde als Referenz-Magen-Schutzmittel und nicht als dosisäquivalenter Vergleichsmittel verwendet. Die Konzentration wurde auf Grundlage einer vorläufigen Zytotoxizitätsbewertung und auf häufig verwendeten In-vitro-Interventionsbereichen ausgewählt und sollte als pharmakologischer Bezugspunkt für den zellulären Schutz dienen. Die Kontrollzellen wurden in einem vollständigen Medium ohne Ethanol oder zusätzliche Mittel aufrechterhalten. Alle Inkubationen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 °C durchgeführt. Jede experimentelle Gruppe bestand aus mindestens drei Replikationsbrunnen, und das gesamte Protokoll wurde dreimal unabhängig ausgeführt.
Bestimmung der optimalen SQBJ-Konzentration mittels CCK-8-Methode
Logphasen-HGE/GES-1-Elemente wurden in 96-Bohrloch-Vektoren mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/Brunnen verschichtet und über Nacht in vollständigem RPMI-1640-Medium unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO₂) inkubiert, um die Einhaltung sicherzustellen. Die Kulturen wurden in vier Gruppen randomisiert: Vehicle-Kontrolle (nur vollständiges Medium), niedrig-dosierte SQBJ-Intervention (5 μg/mL), mittlere Dosis SQBJ-Intervention (10 μg/mL) und hochdosierte SQBJ-Intervention (50 μg/mL); diese drei Konzentrationen wurden für therapeutisches Screening verwendet und durch Auflösung von SQBJ in PBS vorbereitet. Alle Bedingungen wurden in mindestens drei parallelen Bohrlöchern untersucht, und das gesamte Protokoll wurde in drei verschiedenen experimentellen Chargen wiederholt. Nach der festgelegten Behandlungsphase erhielt jeder Brunnen 10 μL CCK-8-Reagenz, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubationszeit bei 37 °C. Die optische Dichte (OD) bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenleser gemessen. Der Zellviabilitätsprozentsatz wurde mit (absorbance_treatment / absorbance_control) × 100 % berechnet, was die effektivste SQBJ-Konzentration für spätere Experimente ermöglichte.
qPCR
Logphasen-GES-1-Elemente wurden in 6-Well-Platten (5 × 105 Zellen pro Brunnen) kultiviert und über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ gehalten, um die Haftung zu gewährleisten. Anschließend wurden die Zellen der vorgegebenen optimalen SQBJ-Konzentration ausgesetzt und am Ausgangspunkt (0 H) sowie nach 6, 12, 24 und 48 Stunden nach der Behandlung entnommen, um die dynamische Antwort der Signalmoleküle zu bestimmen. Basierend auf den Zeitverlaufsergebnissen wurde das 24-Stunden-Intervall für nachfolgende mechanistische Tests gewählt, da es die stärkste Signalantwort zeigte und gleichzeitig die stabile Zelllebensfähigkeit aufrechterhielt. Jeder Zeitpunkt wurde durch drei dreifache Bohrungen dargestellt, und das gesamte Experiment wurde unabhängig dreimal unabhängig wiederholt.
Wir isolierten die gesamte RNA mit einem spezialisierten Extraktionsreagenz, wobei wir die Konzentration und Qualität des Ertrags mit einem Spektrophotometer bewerteten. Alle Proben wiesen ein A₂₆₀/A₂₈₀ Absorptionsverhältnis im Bereich von 1,8 bis 2,0 auf. Ein Reverse-Transkriptionskit mit gDNA-Wiper wurde verwendet, um cDNA aus 1 μg Gesamt-RNA rückwärts zu transkribieren. Die Echtzeit-PCR-Analyse wurde mittels eines quantitativen PCR-Systems mit Primern für PI3K, AKT, p38, JNK, ERK und das Referenzgen GAPDH durchgeführt. Details zum PCR-System, zu den Reagenzien und zum Primer-Synthesedienst finden sich in der Materialtabelle. Primer wurden für bestimmte Regionen der entsprechenden menschlichen Gene entwickelt. qPCR-Protokoll: Warmstart-Aktivierung bei 95 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 5 Sekunden und Glühen/Verlängerung bei 60 °C für 30 Sekunden. Die Berechnung der Zielgen-mRNA-Expression basierte auf der relativen quantitativen PCR-Methode mit der 2-ΔΔCt-Methode .
ELISA
Supernatanten wurden geerntet und durch Zentrifugation bei 1.200 × g für 10 Minuten bei 4 °C zur Entfernung von Zellmüll entfernt. Die Werte von entzündlichen Mediatoren (CRP, IL-6, TNF-α) und oxidativen Stressindizes (SOD, MDA, GSH) wurden mit kommerziellen ELISA-Kits unter Einhaltung der spezifischen Anweisungen des Herstellers bewertet. Die Konzentrationsprofile dieser Ziele wurden mit kommerziellen Assay-Formulierungen gemäß den Anweisungen der Lieferanten überprüft. Jede Versuchsgruppe bestand aus drei Replikationsbrunnen, und das Verfahren wurde über drei separate Zellkulturchargen durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der experimentellen Daten zu bestätigen. Kurz gesagt wurden 100 μL entweder Standard- oder geklärter Supernatanten in vorbeschichtete Reaktionsplatten gegeben und bei 37 °C für 90 Minuten inkubiert. Nach drei aufeinanderfolgenden Waschzyklen erhielt jede Kavität 100 μL des spezifischen Detektionsantikörpers für eine 60-minütige Inkubation bei 37 °C, gefolgt von weiteren drei Waschzyklen. Anschließend wurde eine Substratlösung (100 μL) eingebracht, und die Proben wurden 15 Minuten lang vor Licht geschützt, bevor die enzymatische Reaktion mit 50 μL Stoplösung blockiert wurde. Die optische Dichte bei 450 nm wurde über einen Mikroplattenleser erfasst. Die Konzentrationen wurden aus den entsprechenden Standardkurven interpoliert. Um eine Verzerrung durch Unterschiede in der Zellanzahl oder behandlungsinduzierte Veränderungen der Zelllebensfähigkeit zu minimieren, wurden MDA-, SOD-, GSH-, CRP-, TNF-α- und IL-6-Profile anhand der Proteingehalt jeder analytischen Probe kalibriert, wie sie durch den BCA-Test bestimmt wurden, und als relative Werte im Vergleich zur Kontrollgruppe ausgedrückt.
Nachweis von intrazellulärem ROS in GES-1-Zellen mittels DCFH-DA Fluoreszenzsonde
Zur Quantifizierung der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verwendeten wir den membrandurchlässigen fluorogenen Indikator DCFH-DA. Die entnommenen Zellen wurden in nicht ergänztem RPMI-1640 mit 10 μmol/L DCFH-da neu suspendiert und 20 Minuten unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO₂) im Dunkeln gelagert. Nach drei aufeinanderfolgenden Waschen mit serumfreiem Medium zur Clear-ungebundenen Sonde wurde die Fluoreszenzintensität mittels Durchflusszytometrie mit 488 nm Anregung und 525 nm Emission überwacht. Relative ROS-Werte wurden als mittlere Fluoreszenzintensität für jede Behandlungsgruppe angegeben, normalisiert auf die lebensfähige Zellzahl, die in parallelen Brunnen mittels CCK-8-Assay bestimmt wurde, und relativ zur entsprechenden Kontrollgruppe ausgedrückt.
Bestimmung des mitochondrialen Membranpotenzials (ΔΨm)
Wir bewerteten Veränderungen des mitochondrialen Membranpotenzials (ΔΨm) mit einem kommerziellen JC-1-Assay-Kit. Kurz gesagt, wurden die entnommenen Zellen in einer frisch zubereiteten JC-1-Arbeitslösung – einer gleichvolumigen Mischung aus JC-1-Farbstoff und Färbepuffer, geliefert vom Set – auf eine Endzellkonzentration von 1 × 106 Zellen /ml resuspendiert. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % CO₂, die vor Licht geschützt war, um Bleichen zu vermeiden, wurde die Probe durch Zentrifugation (800 × g, 5 min) entnommen und einmal mit 1 ml gekühltem JC-1-Färbepuffer abgespült. Die Fluoreszenz wurde anschließend durch Durchflusszytometrie erworben.
JC-1-Aggregate (was auf intakte ΔΨm hinweist) wurden über den FL2-Kanal mit 488 nm-Anregung und 590 nm Emissionswellenlängen überwacht, während JC-1-Monomere (indikativ für die ΔΨm-Dissipation) über den FL1-Kanal mit 488 nm Anregung und 525 nm Emissionseinstellungen verfolgt wurden. Das ΔΨm wurde als Verhältnis von rot zu grünem Fluoreszenzsignal angegeben; sinkende Werte deuten auf mitochondriale Depolarisation hin.
Bestimmung des intrazellulären ATP-Spiegels
Die mitochondriale Funktionalität wurde mittels intrazellulärer ATP-Quantifizierung mittels eines ATP-Assay-Kits bewertet. Eine Luciferin–Luziferase-biolumineszente Reaktion wurde verwendet, um den ATP-Gehalt zu bestimmen, der direkt proportional zur mitochondrialen Aktivität ist. Kurzzeitig wurden die entnommenen Zellen in einem eiskalten ATP-Lysepuffer wieder suspendiert und für ein 5-minütiges Lysefenster auf Eis aufbewahrt. Die Zentrifugation erfolgte dann bei 12.000 × g für 5 Minuten bei 4 °C, danach wurden 20 μL des gewonnenen freigegebenen Supernatants auf 96-Well-weiße, undurchsichtige Mikroplatten übertragen. Anschließend wurden 100 μL frisch vorbereitete ATP-Detektionsarbeitslösung – eine Mischung aus Luciferase-Reagenz und Luciferin-Substrat, die nach dem vorgegebenen Protokoll hergestellt wurde – in jede Höhle eingebracht. Das resultierende Lumineszenzsignal wurde umgehend mit einem Lumineszenz-Mikroplattenleser aufgenommen. Um relative ATP-Werte zu ermitteln, wurden die rohen Lumineszenzwerte auf die einzelnen Supernatanten mit einem kommerziellen BCA-Protein-Testkit quantifiziert und so Variationen in der Zellanzahl korrigiert.
Nachweis der Zellapoptose durch Annexin V/PI Doppelfärbung
Apoptotische Zelldetektion erfolgte mit einer kommerziellen Annexin V-FITC/PI-Zelltods-Assay-Konfiguration, wie vom Hersteller beschrieben. Nach dem Waschen wurden die Pellets in einem Annexin V-FITC-Bindungspuffer auf eine Zelldichte von 1 × 106 Zellen/mL (195 μL pro Probe) wieder suspendiert. Anschließend erhielt jedes unabhängige Rohr 5 μL Annexin V-FITC, gefolgt von 10 μL PI-Färbelösung. Die Probe wurde sanft vortexiert und 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach diesem Prozess wurden apoptotische Zellen mittels eines Durchflusszytometers überwacht. Die jeweiligen fluoreszierenden Kanäle erleichterten die Differenzierung zwischen lebensfähigen Zellen (Annexin V⁻/PI⁻), frühen apoptotischen Zellen (Annexin V⁺/PI⁻) und späten apoptotischen/nekrotischen Zellen (Annexin V⁺/PI⁺). Der Prozentsatz der apoptotischen Zellen in jeder Gruppe wurde anhand dieser Gating-Parameter quantifiziert.
Westlicher Blot
Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Bcl-2, Bax, gespaltene Caspase-3, AKT, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 und GAPDH inkubiert. Antikörper wurden anhand von Validierungsinformationen für menschliche Proben und Western-Blot-Anwendungen ausgewählt. RRIDs wurden für alle Antikörper mit verfügbaren Einträgen im Antikörperregister oder RRID-Portal hinzugefügt. Die Zielproteinwerte wurden auf GAPDH normalisiert. Nach den üblichen Waschprotokollen wurden die Flecken 1 Stunde lang bei Raumtemperatur HRP-konjugierten sekundären Antikörpern ausgesetzt. Die Bänder wurden mit einer ECL-Substratlösung nachgewiesen. Western-Blot-Bandgrauwerte wurden mit digitaler Bildanalysesoftware ausgewertet.
Immunfluoreszenzfärbung
GES-1-Monoschichten wurden auf Glasdeckschichten innerhalb von 24-Bohrlochplatten vor den angezeigten Behandlungen etabliert. Nach der Behandlung wurde die Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, gefolgt von Membranpermeabilisierung mit 0,3 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten und Blockierung mit 5 % Rinderserumalbumin für 30 Minuten bei 37 °C. Coverslips wurden dann für die nächtliche Inkubation bei 4 °C mit primären Antikörpern auf AKT, p38, JNK und ERK abgegeben. Nach drei aufeinanderfolgenden PBS-Waschen wurden die Proben 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem fluoreszenzkonjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper inkubiert, der vor Licht geschützt war. Die DAPI-Gegenfärbung wurde 5 Minuten lang angewendet, um Kerne sichtbar zu machen. Deckfolien wurden anschließend mit Anti-Fade-Reagenz montiert, und die Datenerhebung nutzte ein konfokales Laserscanningmikroskop, um die subzelluläre Verteilung der Zielproteine zu bestimmen. Alle Immunfluoreszenzbilder wurden unter denselben Bildparametern mit einer 20×-Objektivlinse aufgenommen. Skalenbalken, die 50 μm entsprechen, wurden allen repräsentativen Immunfluoreszenzbildern hinzugefügt.
Statistische Analyse
Quantitative Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt, die aus mindestens drei unabhängigen Versuchsläufen stammen, wobei jede Probe dreifach verifiziert wurde. Statistische Analysen wurden mit spezialisierten numerischen Analysewerkzeugen durchgeführt. Um unterschiedliche Variationen zwischen mehreren Kohorten zu bestimmen, verwendeten wir eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) zusammen mit Tukeys Post-hoc-Test für Gruppenvergleiche. Eine zweiseitige Schwelle von P < 0,05 bezeichnete statistische Signifikanz.
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Bioinformatische Dissektion von SQBJ-vermittelten Mechanismen im Magengeschwür
Um zu untersuchen, wie SQBJ seine pharmakologischen Wirkungen auf GU ausüben könnte, haben wir zunächst die Ziele seiner primären bioaktiven Bestandteile vorhergesagt. Mit R-Programmierung extrahierten und entfernten wir überflüssige Einträge zwischen diesen bioaktiven Komponenten, was letztlich 411 Kandidatenziele ergab. Anschließend wurden GU-verknüpfte pathologische Ziele durch Abfragen ...
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Das Hauptziel dieser Untersuchung war zu untersuchen, ob SQBJ, eine klassische TCM-Verbindungsformel, bestehend aus Panax notoginseng und Bletilla striata., zytoprotektive Wirkungen gegen ethanolbedingte Magenschleimhautopithelschäden innerhalb eines GES-1-Zellmodells besitzt, wobei PI3K/AKT-bezogene Signalübertragungen und damit verbundene Reduktionen von entzündlichen Mediatoren, oxidativen Stressindikatoren, mitochondrialer Dysfunktion und apoptotischen Ereignissen b...
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Diese Studie wurde vom Jiangsu Provincial Traditional Chinese Medicine Science and Technology Development Plan Project-General Project (2023), Projektnummer: MS2023118.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Apoptose-Assay | Annexin V-FITC/PI Apoptose-Erkennungs-Kit | Beyotime | C1062L |
| ATP-Assay | Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 |
| Puffer | PBS | Solarbio | — |
| Zellverdauungsreagenz | 0,25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 |
| Zelllinie | GES-1 humane Magenschleimhautepithelzellen | Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | SCSP-533 |
| Zellvitalitäts-Assay | CCK-8-Reagenz | — | — |
| Konfokalmikroskop | LSM 880 Konfokalmikroskop | Zeiss | LSM 880 |
| Kulturmedium | RPMI-1640 | Gibco | — |
| ELISA-Kit | Human CRP ELISA Kit | R&D Systems | DCPR00 |
| ELISA-Kit | Human IL-6 ELISA Kit | R&D Systems | DTAM00D |
| ELISA-Kit | Human TNF-α ELISA Kit | R&D Systems | — |
| Durchflusszytometer | FACSCalibur / FACSCanto II | BD Biosciences | — |
| Kräutermaterial | Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tuber) | Anguo Traditional Chinese Medicine Market | Voucher Nr. BS-20240301 |
| Kräutermaterial | Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (root und rhizome) | Anguo Traditional Chinese Medicine Market | Voucher Nr. PN-20240301 |
| Kräutermaterial | Sanqi Baiji San Pulver | In-house-Zubereitung | Voucher Nr. SQBJ-20240301 |
| HPLC-Säule | ZORBAX SB-C18-Säule | Agilent Technologies | 4,6 mm × 250 mm, 5 μm |
| HPLC-System | 1260 Infinity II HPLC-System | Agilent Technologies | 1260 Infinity II |
| IF-Sekundärantikörper | Alexa Fluor 594–konjugiertes anti-rabbit IgG | Invitrogen | A11012 |
| Invertiertes Mikroskop | CKX41 invertiertes Phasenkontrastmikroskop | Olympus | CKX41 |
| Luminometer | Infinite 200 PRO Mikroplatten-Reader | Tecan | Infinite 200 PRO |
| Membran | PVDF-Membran | Millipore | IPVH00010 |
| Mikroplatten-Reader | iMark Mikroplatten-Reader | Bio-Rad | iMark |
| Mitochondriale Membranpotenzial-Kit | JC-1 Assay Kit | Beyotime | C2006 |
| Nukleare Färbung | DAPI | Beyotime | C1002 |
| Online-Plattform | Online-Bioinformatik-Plotting-Plattform | Online-Analyse-Plattform für Bioinformatik | Online-Plattform |
| Online-Plattform | Webbasierte Anreicherungsanalyse-Plattform | Metascape | Online-Plattform |
| Oxidativer Stress-Assay | GSH Assay Kit | Beyotime | S0052 |
| Oxidativer Stress-Assay | MDA Assay Kit | Beyotime | S0131 |
| Oxidativer Stress-Assay | SOD Assay Kit | Beyotime | S0109 |
| PI3K-Inhibitor | LY294002 | MCE | S1105 |
| Positiv-Kontroll-Arzneimittel | Omeprazol | MCE | HY-B0053 |
| Primärantikörper | AKT | Cell Signaling Technology | 4691 |
| Primärantikörper | Bax | Cell Signaling Technology | 5023 |
| Primärantikörper | Bcl-2 | Cell Signaling Technology | 15071 |
| Primärantikörper | Cleaved Caspase-3 Asp175 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| Primärantikörper | ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| Primärantikörper | GAPDH | Abcam | ab8245 |
| Primärantikörper | JNK / SAPK-JNK | Cell Signaling Technology | 9252 |
| Primärantikörper | p-AKT Ser473 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| Primärantikörper | p-ERK1/2 Thr202/Tyr204 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Primärantikörper | p-JNK Thr183/Tyr185 | Cell Signaling Technology | 4668 |
| Primärantikörper | p-p38 MAPK Thr180/Tyr182 | Cell Signaling Technology | 4511 |
| Primärantikörper | p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199 | Cell Signaling Technology | 4228 |
| Primärantikörper | p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 8690 |
| Primärantikörper | PI3K p85 | Cell Signaling Technology | 4257 |
| Primer | AKT forward | — | — |
| Primer | AKT reverse | — | — |
| Primer | ERK forward | — | — |
| Primer | ERK reverse | — | — |
| Primer | GAPDH forward | — | — |
| Primer | GAPDH reverse | — | — |
| Primer | JNK forward | — | — |
| Primer | JNK reverse | — | — |
| Primer | p38 forward | — | — |
| Primer | p38 reverse | — | — |
| Primer | PI3K forward: | — | — |
| Primer | PI3K reverse | — | — |
| Protease-Inhibitor | PMSF | Beyotime | ST506 |
| Protein-Assay | BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 |
| Protein-Lysis-Puffer | RIPA-Puffer | Beyotime | P0013B |
| Öffentliche Datenbank | DrugBank | DrugBank Online | Online-Datenbank |
| Öffentliche Datenbank | GeneCards | Weizmann Institute of Science | Online-Datenbank |
| Öffentliche Datenbank | Online Mendelian Inheritance in Man | Johns Hopkins University | Online-Datenbank |
| Öffentliche Datenbank | PubChem Compound Database | National Center for Biotechnology Information | Online-Datenbank |
| Öffentliche Datenbank | RCSB Protein Data Bank | RCSB PDB | Online-Datenbank |
| Öffentliche Datenbank | STRING Protein-Interaktions-Datenbank | STRING Consortium | Online-Datenbank |
| Öffentliche Datenbank | Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform | TCMSP |