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Diese datenbankbasierte computergestützte Studie umfasst weder menschliche Teilnehmer, Tierversuche noch klinische Proben. Nach Artikel 32 der chinesischen Maßnahmen zur ethischen Überprüfung der Lebenswissenschaften und medizinischer Forschung mit menschlichen Probanden sind Studien, die rechtmäßig öffentlich zugängliche Daten verwenden, den Menschen keinen Schaden zufügen, keine sensiblen persönlichen Informationen enthalten und keine kommerziellen Interessen haben, für eine Ausnahme von der ethischen Überprüfung berechtigt. Daher ist für diese Studie keine ethische Genehmigung erforderlich.
Das experimentelle Design und der analytische Ablauf dieser Studie sind im Flussdiagramm (Abbildung 1) dargestellt.
Abbildung 1: Gesamtablauf der Studie. Das Flussdiagramm veranschaulicht den sequentiellen Arbeitsablauf der Netzwerkpharmakologie und molekularen Andockungsanalysen, einschließlich der Erfassung aktiver Komponenten und Ziele von Sishen Decoction (SSD), Sammlung gicht-bezogener Ziele, Identifikation überlappender Ziele, Aufbau des Netzwerks Arzneimittel-Komponent–Ziel-Krankheit und des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI), Gene Ontology (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen, und molekulare Andocksimulationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Erwerb aktiver Komponenten und Zielproteine von SSD
Am 2. Januar 2026 wurden die aktiven chemischen Bestandteile der fünf Kräuter, aus denen SSD besteht, nämlich Huangqi, Yuanzhi, Huainiuxi, Shihu und Jinyinhua, aus der Datenbank21 der Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) abgerufen. Screening-Kriterien basierend auf pharmakokinetischen Eigenschaften wurden angewendet: orale Bioverfügbarkeit (OB) von ≥30 % und Arzneimittelähnlichkeit (DL) von ≥0,1822. Komponenten, die diese Kriterien erfüllten, wurden als potenzielle Wirkstoffe betrachtet. Entsprechende Ziele für jede Komponente wurden dann gesammelt. Da TCMSP keine vollständigen Daten für Yuanzhi und Shihu enthielt, wurden die chemischen Bestandteile dieser beiden Kräuter zusätzlich am selben Tag aus der Herb 2.0-Datenbank abgerufen. Nach der Ermittlung der Komponentennamen wurde in TCMSP eine Rückwärtssuche durchgeführt, bei der die Komponentennamen und die entsprechenden CAS-Nummern als Schlüsselwörter verwendet wurden, um Zielinformationen abzurufen. Für Verbindungen, die aus der Herb-Datenbank gewonnen wurden, wurden nur solche erhalten, die erfolgreich mit Einträgen in TCMSP durch Komponentennamen oder CAS-Nummer abgeglichen wurden. Die abgestimmten Verbindungen wurden anschließend denselben pharmakokinetischen Screening-Kriterien unterzogen (OB ≥ 30 % und DL ≥ 0,18) mithilfe von TCMSP-Daten, und Verbindungen ohne vollständige OB- oder DL-Informationen wurden ausgeschlossen. Alle abgestimmten und gefilterten Verbindungen wurden manuell mit den ursprünglichen Herb 2.0-Datensätzen überprüft, um Fehlidentifikationen zu vermeiden. Anschließend wurden die aus der Herb-Datenbank gewonnenen Zielinformationen mit denen der verbleibenden Kräuter zusammengeführt, um den vollständigen Satz der Wirkstoffziele für SSD zu erzeugen.
Alle abgerufenen Zielproteine wurden mit offiziellen Gensymbolen in der UniProt-Datenbank standardisiert. Eine Eins-zu-eins-Korrespondenz wurde hergestellt, indem nur von Menschen geprüfte (Swiss-Prot) Einträge beibehalten und ungeprüfte (TrEMBL) Einträge ausgeschlossen wurden. Wenn mehrere Isoformen demselben Gensymbol entsprachen, wurde die kanonische Isoform ausgewählt. Der standardisierte Zieldatensatz wurde für die anschließende Analyse von interparierenden Genen beibehalten.
Sammlung gichtbedingter Ziele
Am 2. Januar 2026 wurden systematische Suchen in der GeneCards-Datenbank und der OMIM-Datenbank durchgeführt, wobei "Gicht" als Krankheitsstichwort verwendet wurde, um gichtbezogene Krankheitsziele zu ermitteln. Die aus den beiden Datenbanken gewonnenen Ziele wurden in WPS Spreadsheets (Version 12.1.0) exportiert. Die Gensymbol-Spalte von OMIM wurde neben der Gen-Symbol-Spalte von GeneCards positioniert, und doppelte Ziele wurden mit der Funktion "Duplikate entfernen" basierend auf exakten Übereinstimmungen mit offiziellen Gensymbolen in einer groß- und kleinschreibungsunempfindlichen Weise entfernt. Die Ziele aus den beiden Datenbanken wurden dann zusammengeführt, um einen umfassenden Satz von gichtbedingten Krankheitszielen zu erstellen.
Identifikation von sich überlappenden Zielen zwischen Arzneimitteln und Krankheiten
Der Arzneimittelzielsatz, der durch den aktiven Komponenten-Screening erhalten wurde, und der Gicht-bedingte Krankheits-Zielsatz wurden im selben Projektordner (D:\Venn) platziert. Die R-Software (Version 4.4.0) wurde gestartet, und das readxl-Paket wurde verwendet, um Excel-Dateien (.xlsx) mit den Ziellisten zu importieren. Das dplyr-Paket wurde für die Datenmanipulation verwendet, einschließlich Filterung und Umbenennung von Spalten vor der Schnittanalyse. Die beiden Zielsätze wurden dann in Zeichenvektoren umgewandelt, und überlappende Ziele wurden mit der Funktion calculate.overlap() aus dem VennDiagram-Paket identifiziert. Das VennDiagram-Paket wurde von CRAN mit dem Befehl install.packages("VennDiagram") installiert und im Standardpfad der R-Bibliothek gespeichert. Wenn eine Meldung erschien, die darauf hindeutete, dass das Paket bereits installiert war, galt die Installation als erfolgreich. Das Arbeitsverzeichnis wurde mit dem Befehl setwd("D:\\Venn") gesetzt, der den Ordner mit den Eingabedateien angab und als Ausgabeverzeichnis diente. Das R-Rezept wurde dann ausgeführt, um die Schnittmenge zwischen dem Arzneimittelzielsatz und dem Gicht-bedingten Krankheitszielsatz zu berechnen. Die daraus resultierenden überlappenden Ziele wurden als potenzielle therapeutische Ziele von SSD zur Behandlung von Gicht definiert.
Aufbau des Netzwerks "Drug-Component-Target-Disease"
Die sich schneidenden Gene, die aus der Überlappung zwischen SSD-Zielen und gout-bezogenen Zielen identifiziert wurden, wurden als overlapping_targets.txt-Datei gespeichert, und die aktiven Komponenten der SSD als drug_components.txt-Datei . Beide Dateien wurden im Projektordner (D:\Network) abgelegt, der als Arbeitsverzeichnis für die Analyse diente. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, wurde diese Analyse mit R durchgeführt. Datenlesen, Filtern und Zusammenführen wurden mit einer Kombination von Basisfunktionen R durchgeführt, darunter read.table(), write.table() und merge(), zusammen mit dem dplyr-Paket für die Datenrahmenmanipulation. Der Befehl setwd("D:\Network") wurde ausgeführt, um das Arbeitsverzeichnis explizit zu definieren.
Die graph_from_data_frame()- Funktion wurde als Kernintegrationsfunktion verwendet. Jede Reihe von drug_components.txt verknüpfte eine aktive Komponente mit ihrem entsprechenden Zielgen mithilfe offizieller Gensymbole. Nur in overlapping_targets.txt vorhandene Ziele wurden beibehalten, und es wurde keine zusätzliche Filterung über die Schnittvorgabe hinaus angewendet. Der resultierende Netzwerkdatensatz wurde als network.txt im Edge-List-Format exportiert. Jede Zeile enthielt zwei Spalten (Knoten1 und Knoten2), wobei Knoten1 entweder die SSD-Formel oder eine aktive Komponente darstellte und Knoten2 entweder eine aktive Komponente oder ein Zielgen. Der Krankheitsknoten ("Gicht") war als separate Kante mit der SSD-Formel verbunden. Kantengewichtungen wurden nicht zugewiesen, und alle Kanten wurden gleich behandelt (Kantenbreite = 0,8).
Die network.txt-Datei wurde in die Netzwerkvisualisierungssoftware Cytoscape (Version 3.7.2) importiert. Das integrierte NetworkAnalyzer-Tool wurde über Tools → Network Analysis → Analyze Network aufgerufen, um die grundlegende Netzwerkstruktur zu erhalten, und "Degree Distribution" wurde als analytisches Framework ausgewählt. Knotenformen und -farben wurden nach Knotentypen zugeordnet: Blaue Diamanten stellten die SSD-Formel dar, blaue Rechtecke repräsentierten aktive Komponenten, orangefarbene Ellipsen die Zielgene der Krankheit und rote Oktagone stellten die Gicht-Entität dar. Die Knotengröße wurde proportional zum Knotengrad gesetzt (Knotengröße = 30 + Grad × 5, maximale Größe = 100).
Aufbau des Protein-Protein-Interaktions-(PPI)-Netzwerks
Der gefilterte Satz der sich schneidenden Zielgene wurde am 2. Januar 2026 in die STRING-Datenbank (Version 12.0) importiert. Die Spezies war auf Homo sapiens beschränkt, die minimale Interaktionskonfidenzschwelle wurde auf hohe Konfidenz (0,700) gesetzt, getrennte Proteine wurden verborgen, die Interaktionsquellen enthielten alle verfügbaren Beweiskanäle, und alle anderen Parameter wurden auf ihren Standardeinstellungen beibehalten, um bekannte und vorhergesagte Protein-Protein-Interaktionen zu erhalten. Die resultierenden Netzwerkdaten wurden im tab-separated values (TSV)-Format mit den Standard-Exportoptionen exportiert.
Das exportierte Netzwerk wurde zur Visualisierung und topologischen Analyse in die Netzwerkvisualisierungssoftware importiert. Netzwerkeigenschaften wurden mit dem integrierten NetworkAnalyzer-Tool berechnet (Tools → Network Analysis → Analyze Network). Die berechneten Kennzahlen umfassten Grad, Zwischenheitszentralität und Nähezentralität. Knotengrößen wurden mit einer kontinuierlichen Abbildungsfunktion auf Gradwerte abgebildet (Knotengröße = 20 + Grad × 3, maximale Größe = 80).
Hub-Ziele wurden identifiziert, indem alle Knoten nach Gradwerten in absteigender Reihenfolge geordnet wurden. Knoten mit höheren Gradwerten galten als zentraler im Netzwerk. Isolierte Knoten (Grad = 0) wurden von der Visualisierung ausgeschlossen. Das Netzwerklayout wurde in konzentrischen Kreisen vom Zentrum nach außen entsprechend der Knotenkonnektivität angeordnet, und die Knotenfarben wurden mit einem blau-zu-cyan-Gradienten abgebildet, der den steigenden Gradwerten entspricht. Das resultierende Netzwerk wurde verwendet, um die Kernziele des Hubs zu identifizieren, die an den potenziellen therapeutischen Wirkungen von SSD gegen Gicht beteiligt sind.
Genontologie (GO) Anreicherungsanalyse
Basierend auf den identifizierten sich überlappenden Zielgenen wurde die GO-funktionale Anreicherungsanalyse mit R durchgeführt. Erforderliche Bioconductor-Pakete wurden im Standardpfad der R-Bibliothek installiert und in die Analyseumgebung geladen. Die sich schneidende Gen-Datei wurde im Projektverzeichnis (D:\GO) gespeichert, und das Arbeitsverzeichnis wurde mit der Funktion setwd() definiert.
Die Konvertierung und Annotation von Genidentifikatoren wurden mit dem Bioconductor-Paket org durchgeführt. Hs.eg.db (Version 3.20.0). Offizielle Gensymbole wurden mit der Bitr()-Funktion im clusterProfiler-Anreicherungsanalysepaket (Version 4.21.0) in Entrez-Gen-IDs umgewandelt. Für nachgelagerte Analysen wurden nur Gene mit eindeutigen Eins-zu-eins-Kartierungen beibehalten, während mehrdeutige oder nicht kartierte Einträge ausgeschlossen wurden.
Die GO-Anreicherungsanalyse wurde mit dem Anreicherungsanalysepaket durchgeführt. Die EnrichGO()-Funktion wurde mit den Ontologiekategorien Biological Process (BP), Cellular Component (CC) und Molecular Function (MF) verwendet. Die statistische Signifikans wurde mit der Benjamini–Hochberg-Mehrfachtest-Korrekturmethode bestimmt, wobei ein adjustierter P-Wert < 0,05 als signifikant angesehen wurde.
Für jede Ontologiekategorie wurden signifikant angereicherte Begriffe nach dem Anreicherungsfaktor eingestuft:
EF = (Genanzahl / Gesamt-Hintergrundgene) ÷ (Termgröße / Gesamt-Genom-Gene)
Die Top 10 Begriffe wurden für eine detaillierte Analyse ausgewählt. Wenn identische Anreicherungsfaktoren auftraten, wurden Terme mit niedrigeren angepassten P-Werten höher eingestuft.
Die Anreicherungsergebnisse wurden mit ggplot2 (Version 3.5.1) und Enrichplot (Version 1.24.0) visualisiert. Blasendiagramme und Balkendiagramme wurden mit den Funktionen Dotplot() und Barplot() erstellt. Die Blasengröße stellte die Anzahl der angereicherten Gene dar, während die Farbe mit der Beschäftigungssignifikanz entsprach, ausgedrückt als −log10 (angepasster P-Wert). Standard-Plottparameter wurden durchgehend verwendet.
KEGG-Signalweganreicherungsanalyse
Die KEGG-Anreicherungsanalyse der sich schneidenden Ziele von SSD und Gicht wurde mit R und dem zuvor beschriebenen Anreicherungsanalysepaket durchgeführt. Gensymbole wurden mithilfe der bitr()-Funktion des Anreicherungsanalysepakets in KEGG-kompatible Identifikatoren umgewandelt, wobei KEGG als Annotationsressource diente. Die Signalweganreicherungsanalyse wurde mit der EnrichKEGG()-Funktion auf Basis des hypergeometrischen Tests durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde mit der Benjamini–Hochberg (BH) Mehrfachtest-Korrekturmethode bestimmt, und Wege mit einem angepassten P-Wert < 0,05 wurden als signifikant angereichert angesehen.
Die Anreicherungsergebnisse wurden mit dem Openxlsx-Paket (Version 4.2.8.1) und der Funktion write.xlsx() in Microsoft Excel-kompatible Arbeitsbuchdateien exportiert, um anschließend zu überprüfen und Figuren zu erstellen.
Ein mehrstufiges Ziel-Weg-Interaktionsnetzwerk wurde anschließend mit der Netzwerkvisualisierungssoftware aufgebaut. Netzwerkdaten wurden über File → Import → Network from File importiert. Die Knoten bestanden aus Zielgenknoten und signifikant angereicherten KEGG-Signalwegknoten (BH-adjustierter P-Wert < 0,05), während die Ränder dokumentierte Assoziationen zwischen Zielgenen und angereicherten Signalwegen darstellten, die während der Anreicherungsanalyse identifiziert wurden. Die Netzwerkvisualisierung erfolgte mit dem Style-Panel der Netzwerkvisualisierungssoftware, wobei Zielgene als graue Ellipsen und Signalwege als cyanfarbene Rechtecke dargestellt wurden. Es wurden keine zusätzlichen Plugins verwendet. Das Netzwerk wurde manuell aus der Anreicherungsausgabetabelle generiert, um die Beziehungen zwischen Kernzielen und deutlich angereicherten Pfaden zu visualisieren.
Molekulare Andockvalidierung
Die 3D-Strukturdateien (MOL2-Format) der zehn wichtigsten aktiven Komponenten, geordnet nach Zielkonnektivität im "Arzneimittel-Komponente-Ziel-Krankheit"-Netzwerk, wurden aus der TCMSP-Datenbank heruntergeladen. Zielkonnektivität wurde als Knotengrad definiert (d. h. die Anzahl der direkten Verbindungen zwischen einer aktiven Komponente und Zielgenen im Netzwerk). Aktive Komponenten wurden in absteigender Reihenfolge nach Gradwerten eingestuft, und die Top 10 Komponenten wurden für die molekulare Andockanalyse ausgewählt.
Die Kristallstrukturen der zehn wichtigsten Hub-Zielproteine, die aus dem PPI-Netzwerk identifiziert wurden, wurden am 23. Januar 2026 aus der RCSB Protein Data Bank (PDB) gewonnen. Die Art war auf Homo sapiens beschränkt. Für jedes Zielprotein wurde die Struktur mit der höchsten kristallographischen Auflösung (niedrigster Å-Wert), ohne Mutationen und ko-kristallisiert mit einem nativen Liganden oder Inhibitor, bevorzugt ausgewählt. Wenn mehrere Strukturen diese Kriterien erfüllten, wurde die Struktur mit der höchsten Auflösung und vollständigsten Proteinsequenzabdeckung ausgewählt. Folgende PDB-Strukturen wurden verwendet: 1GKC (MMP9), 5WHH (BCL2), 2P33 (JUN), 1RHJ (CASP3), 1WT5 (EGFR), 7APJ (AKT1), 1DU3 (TNF), 1T4Q (IL1B), 4NI9 (IL6) und 9CKJ (TP53).
Molekulare Andocksimulationen wurden mit dem CB-Dock 2 Online-Server (Webversion, abgerufen am 23. Januar 2026) durchgeführt, der AutoDock Vina als Docking-Engine verwendet. Proteinstrukturen wurden automatisch vom Server vorverarbeitet, einschließlich der Entfernung von Heteroatomen und der Vorbereitung von Rezeptorstrukturen. Liganden wurden im MOL2-Format hochgeladen. Template-unabhängige Hohlraumdetektion wurde verwendet, wobei fünf potenzielle Bindungshöhlen für jede Proteinstruktur automatisch identifiziert wurden. Andockberechnungen wurden mit den Standardparametern des Andocktriebwerks durchgeführt: Erschöpfung = 8, Energiebereich = 4 und maximale Anzahl der Bindungsmodi = 9.
Für jedes Ziel-Verbindungspaar wurde das Andocken unabhängig innerhalb jeder der fünf detektierten Hohlräume durchgeführt. Andockposen wurden mit der Docking-Motor-Bewertungsfunktion ausgewertet, und die Pose mit der niedrigsten Bindungsenergie in jeder Kavität wurde als repräsentative Konformation für diese Kavität beibehalten. Unter den fünf repräsentativen Konformationen wurde die Andockpose mit der weltweit niedrigsten Bindungsenergie als endgültiges Andockergebnis für dieses Ziel-Verbindungspaar ausgewählt und für weitere Analysen verwendet.
Der niedrigste Bindungsenergiewert für jedes Andockergebnis wurde in einer Tabelle erfasst und in die Online-Plotterplattform Weishengxin (abgerufen am 23. Januar 2026) importiert, um eine Heatmap mit Standardparametern zu erstellen. Die Heatmap verwendete einen gelb-roten Farbgradienten, eine hierarchische Clustering mit vollständiger Verbindung und euklidische Distanz als Cluster-Metrik.
Wasserstoffbrücken-Interaktionen wurden automatisch vom Docking-Server-Analysemodul anhand geometrischer Kriterien identifiziert. Eine Wasserstoffbrücke wurde definiert als eine Wechselwirkung mit einem Donor-Akzeptor-Abstand ≤ 3,5 Å und einem Donor-Wasserstoff-Akzeptor-Winkel ≥ 120°. Wasserstoffbrücken wurden sowohl in zweidimensionalen als auch in dreidimensionalen Wechselwirkungsdiagrammen als gestrichelte Linien dargestellt. Das Ziel-Protein-Aktiv-Komponentenpaar mit der weltweit niedrigsten Bindungsenergie aller Andockkombinationen wurde für eine detaillierte Interaktionsanalyse ausgewählt. Diese Auswahl basierte auf einem einzelnen Ziel-Verbindungspaar und nicht auf einer einzelnen Andockpose und sollte die stärkste vorhergesagte Interaktion im Netzwerk identifizieren. Die abschließende repräsentative Andockpose, die diesem Ziel-Verbindungspaar entspricht, wurde für Visualisierung und Interaktionsanalyse verwendet.
Dreidimensionale und zweidimensionale Wechselwirkungsdiagramme wurden mit ChimeraX Version 1.5 bzw. LigPlot+ Version 2.2 erstellt. In ChimeraX wurden Proteine mit der Standard-Cartoon-Darstellung dargestellt, Liganden im Stick-Modus, Wasserstoffbrücken als gestrichelte Linien und das Standardfarbschema angewandt. In LigPlot+ wurde die Wasserstoffbrückenidentifikation mit dem HBPLUS-Algorithmus durchgeführt, mit einem Donor-Akzeptor-Abstandsschwellenwert von 3,9 Å und einem Winkelschwellenwert von 90°. Alle anderen Visualisierungsparameter wurden auf ihren Standardeinstellungen beibehalten.