Forschungsartikel

Die N6-Methyladenosin-Modifikation von Rab27A fördert die Osteoporose, indem sie die Osteoklastendifferenzierung im ovariektomisierten Mausmodell beeinflusst

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DOI:

10.3791/71964

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11. August 2026

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1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

YTHDC1 fördert den zytoplasmatischen Export des m6A-modifizierten Rab27A, während IGF2BP2 Rab27A im Zytoplasma stabilisiert, wodurch die Osteoklastendifferenzierung verbessert und zur Osteoporose beiträgt.

Zusammenfassung

Die Entwicklung neuartiger Therapien für Osteoporose hat zunehmend Aufmerksamkeit erregt. Rab27A wird während der Osteoklast-Differenzierung hochreguliert, und die N6-Methyladenosin-(m6A)-Modifikation hat sich als wichtiger epigenetischer Regulator bei orthopädischen Erkrankungen etabliert. Bioinformatische Analysen sagten voraus, dass Rab27A mehrere m6A-Modifikationsstellen enthält und mit mehreren m6A-assoziierten Proteinen interagiert. Knockdown-Experimente wurden durchgeführt, um die Rolle von Rab27A bei der Osteoklast-Differenzierung und Osteoporose mit einem ovariektomierten (OVX) Mausmodell zu bewerten. Der Depletion von Rab27A schwächte die Osteoporose ab und erhöhte den Knochenbildungsprozentsatz von 14,73 % auf 28,13 % (P < 0,05) bei OVX-Mäusen. Western-Blotting und quantitative PCR zeigten, dass Rab27A-Knockdown die Protein- und mRNA-Expression der Osteoklastenmarker TRAP, NFATc1 und c-FOS reduzierte und damit die Osteoklastendifferenzierung von Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMMs), die durch den makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (M-CSF) und den Rezeptoraktivator des nuklearen Faktor-κB-Ligands (RANKL) induziert wurden, unterdrückte. Die TRAP-Färbung zeigte zudem, dass die Rab27A-Depletion die TRAP-Aktivität nach M-CSF- und RANKL-Induktion signifikant von 24,1 % auf 12,9 % reduzierte (P < 0,01). RNA-Immunpräzipitationstests bestätigten Wechselwirkungen zwischen Rab27A und den m6A-Leserproteinen YTHDC1 und IGF2BP2. Die nukleare und zytoplasmatische Fraktionierung zeigte, dass YTHDC1 den zytoplasmatischen Export von m6A-modifiziertem Rab27A erleichtert. Darüber hinaus zeigten q-PCR- und Western-Blot-Analysen, dass der Knockdown von entweder YTHDC1 oder IGF2BP2 die Rab27A-Expression reduzierte und die Expression von TRAP, NFATc1 und c-FOS verringerte, wodurch die durch M-CSF und RANKL induzierte Osteoklastendifferenzierung unterdrückt wurde. Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass YTHDC1-vermittelter zytoplasmatischer Export und IGF2BP2-vermittelter Stabilisierung von m6A-modifizierten Rab27A die Osteoklastendifferenzierung fördern und zum Knochenverlust im OVX-Mausmodell beitragen.

Einleitung

Osteoporose (OP) ist eine häufige Skeletterkrankung, die durch eine Verschlechterung der Knochenmikrostruktur und eine verminderte Knochenmineraldichte gekennzeichnet ist, was weltweit zu einem erhöhten Frakturenrisiko führt 1,2,3. Osteoporotische Brüche treten am häufigsten am Unterarm, Oberarm, Hüfte und Wirbelsäule auf und sind besonders häufig bei älteren Erwachsenen. Diese Brüche beeinträchtigen die Lebensqualität erheblich und verursachen erhebliche physische, psychische und sozioökonomische Belastungen für Patienten, ihre Familien und Gesundheitssysteme3. Daher bleiben die Prävention, das Management und die Behandlung der Osteoporose zentrale klinische und öffentliche Gesundheitsprioritäten.

Es wurden verschiedene therapeutische Strategien für Osteoporose entwickelt und lassen sich im Allgemeinen in zwei Kategorien einteilen: knochenbildende Mittel und antiresorptive Therapien 4,5. Zu den traditionellen Antiresorptiven zählen Bisphosphonate, Ralexifen und Strontiumranelat, während neuere Wirkstoffe Denosumab, Odanacatib und Saracatinib umfassen. Knochenbildende Therapien umfassen das Nebenschilddrüsenhormon (PTH 1–84), während mehrere weitere Kandidaten wie MK-5442, AMG 785 und BHQ 880 sich in klinischer Entwicklungbefinden. Obwohl diese Behandlungen wirksam sein können, sind viele mit erheblichen Nebenwirkungen, begrenzter langfristiger Wirksamkeit oder Einschränkungen bei längerer Anwendung verbunden 4,6,7,8,9. Beispielsweise kann die langfristige Verabreichung von Aminobisphosphonaten und Denosumab die normale Knochenumbildungbeeinträchtigen. Daher bleibt die Identifizierung sicherer und wirksamerer therapeutischer Ziele ein wichtiges Ziel in der Osteoporoseforschung.

Rab-Proteine sind Schlüsselregulatoren des intrazellulären Vesikeltransports und der Zellsignalübertragung und sind an vielfältigen biologischen Prozessen beteiligt, darunter Virusinfektionen, Autophagie und zytoskelettale Organisation10. In den letzten Jahren richtete sich zunehmend die Aufmerksamkeit auf die Rolle der Rab-Familienproteine im Knochenstoffwechsel und bei der Osteoporose. Es wurde berichtet, dass Rab44 die Osteoklastendifferenzierung reguliert, indem es die intrazelluläreCa-2⁺-Signalübertragung moduliert und den nuklearen Faktor aktivierter T-Zellen 1 (NFATc1) im Rezeptoraktivator der mit dem Nuklearfaktor κB-Liganden (RANKL) behandelten Makrophagen11 aktiviert. Osteoklasten sind multinukleäre Zellen, die von Vorläufern der Makrophagenlinie abgeleitet sind, und spielen eine wesentliche Rolle bei der Knochenresorption und der skelettalen Homöostase 12,13,14,15,16,17,18,19. Daher ist das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Osteoklastendifferenzierung steuern, entscheidend für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Ansätze für Osteoporose.

Rab27A ist ein wichtiges Mitglied der Rab-GTPase-Familie und wird weit verbreitet in sekretorischen und Immunzellen exprimiert. Sie spielt eine entscheidende Rolle beim Transport von Vesikeln, Exozytose und intrazellulärer Signalübertragung20,21,22,23,24,25,26,27. Frühere Studien haben gezeigt, dass Rab27A die Eosinophil-Degranulation während der Atemwegsentzündung reguliert und die vesikuläre Mobilisation steuert, die mit der NADPH-Oxidase-Aktivität in aktivierten Makrophagen20.23 assoziiert ist. Bemerkenswert ist, dass sich die zunehmenden Belege darauf hindeuten, dass die Rab27A-Expression während der Osteoklastendifferenzierung signifikant hochreguliert wird. Shimada-Sugawara et al. berichteten, dass die Expression von Rab27A während der Differenzierung von Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMMs) zu Osteoklasten zunimmt, was auf eine mögliche Rolle bei der Osteoklastogenese28 hindeutet. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Rab27A die Bildung und Funktion von Osteoklasten beeinflussen kann, indem es den vesikularen Transport und intrazelluläre Signalwege reguliert28,29.

N6-Methyladenosin (m6A) ist die am häufigsten vorkommende interne RNA-Modifikation in eukaryotischen und nicht-kodierenden RNAs und dient als entscheidender Regulator des RNA-Stoffwechsels und der Genexpression. Als erste identifizierte mRNA-Modifikation bei Säugetieren wurde m6A an zahlreichen biologischen Prozessen beteiligt, darunter RNA-Stabilität, Spleißen, Transport und Translation. Wang et al. zeigten, dass m6A-Modifikationen, die häufig in konservierten Sequenzmotiven auftreten, von YTH-domänenhaltigen Proteinen erkannt werden und zur Regulation der mRNA-Stabilität und des Stoffwechsels30 beitragen. Darüber hinaus wurde die m6A-Modifikation mit verschiedenen biologischen Funktionen in Verbindung gebracht, darunter Genomstabilität, transkriptionelle Regulation, Chromatinorganisation, Krebsprogression und Immunantworten31. Neuere Studien haben zudem wichtige Rollen der m6A-Signalübertragung bei knochenbedingten Erkrankungen und Osteoporose32 hervorgehoben.

Unter den m6A-Reader-Proteinen fungiert YTHDC1 als Kernleser, der die RNA-Verarbeitung und den Kernexport reguliert, während das insulinähnliche mRNA-bindende Protein 2 (IGF2BP2) m6A-modifizierte Transkripte im Zytoplasma stabilisiert. Chen et al. zeigten, dass YTHDC1 den nuklearen Export von m6A-modifizierten circNSUN2 fördert, die anschließend mit IGF2BP2 interagiert, um HMGA2-mRNA zu stabilisieren und die Kolorektalkrebsmetastase33 zu fördern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die koordinierte Regulation durch YTHDC1 und IGF2BP2 einen allgemeinen Mechanismus darstellen könnte, der das Schicksal von m6A-modifizierten Transkripten steuert.

Die vorliegende Studie untersuchte vorhergesagte m6A-Modifikationsstellen in Rab27A-mRNA und untersuchte deren Wechselwirkungen mit YTHDC1 und IGF2BP2. Es wurde festgestellt, dass YTHDC1 den nuklearen Export von m6A-modifizierten Rab27A-Transkripten erleichtert, während IGF2BP2 mit Rab27A im Zytoplasma interagierte und dessen Stabilität verbesserte. Durch diesen regulatorischen Mechanismus förderte Rab27A die Osteoklastendifferenzierung und trug zum Fortschreiten der Osteoporose bei. Zusammen identifizieren die Ergebnisse einen bisher nicht anerkannten, m6A-abhängigen regulatorischen Weg, der YTHDC1, IGF2BP2 und Rab27A in der Osteoklastendifferenzierung umfasst. Diese Ergebnisse liefern neue Einblicke in die molekulare Pathogenese der Osteoporose und könnten die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien fördern, die auf die m6A-vermittelte Regulation von Rab27A abzielen.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Ausschuss für Tierschutz und -nutzung des angeschlossenen Krankenhauses der Southwest Medical University genehmigt (Genehmigungsnummer 2024-Ethics-042). Alle Experimente wurden gemäß den ARRIVE-Leitlinien, dem britischen Animals (Scientific Procedures) Act 1986 und den damit verbundenen Leitlinien, der EU-Richtlinie 2010/63/EU sowie dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Nutzung von Labortieren (NIH Publication Nr. 8023, überarbeitet 1978) durchgeführt. Die Mäuse wurden zufällig experimentellen Gruppen zugeteilt, und die Zuteilungssequenz wurde vor dem Prüfer verborgen. Alle Datenerhebungen und -analysen, einschließlich histologischer Bewertung, Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) Bildanalyse und statistischer Analysen, wurden von Forschern durchgeführt, die für die Gruppenzuweisung blind waren. Keine Tiere oder Proben wurden von den Analysen ausgeschlossen. Alle Reagenzien, Geräte, Software und andere in diesem Protokoll verwendeten Ressourcen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Konstruktion des Ovariektomie-(OVX)-Modells

Vierundzwanzig weibliche Wildtyp-C57BL/6 Mäuse im Alter von 8 Wochen wurden verwendet, um ein Osteoporosemodell zu etablieren. Nach einer einwöchigen Akklimatisierungsphase wurden die Mäuse zufällig entweder der Sham- oder OVX-Gruppe zugeordnet. Das OVX-Modell wurde durch eine bilaterale Ovariektomie etabliert, wie zuvorbeschrieben 34,35. Sham-operierte Mäuse unterzogen sich einer operativen Exposition der Eierstöcke ohne Entfernung.

Für die intrafemorale Genabgabe wurden lentivirale Vektoren, die sh-Rab27A oder sh-NC exprimieren, 7 Tage nach der OVX-Operation injiziert, wie zuvor berichtet36,37. Kurz gesagt wurden konzentrierte lentivirale Partikel (1 × 106 Transduziereinheiten/mL) unter Narkose über den Patellarweg mit einer 22-Gauge-Nadel in den Oberschenkelknochen injiziert. Jede Maus erhielt 20 μL lentivirale Suspension. Der Schnitt wurde anschließend genäht und die Tiere während der gesamten Genesung überwacht.

Alle Tierversuche wurden unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen durchgeführt. Oberschenkelproben wurden 8 Wochen nach der Operation entnommen. Mindestens sechs Mäuse pro Gruppe wurden für histologische Analysen und RNA- oder Proteinextraktion verwendet.

2. In-vivo Mikro-CT-Bildgebung

Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) wurde durchgeführt, um die Morphologie der Trabekulären Knochen zu untersuchen. Das rechte Schienbein jeder Maus wurde vor der OVX-Operation im Alter von 14 Wochen in vivo gescannt. Folgeuntersuchungen wurden wöchentlich bis zum Alter von 22 Wochen durchgeführt. Mindestens sechs Mäuse pro Gruppe wurden in die Mikro-CT-Analyse einbezogen.

Die Mäuse wurden mit intraperitonealem Natriumpentobarbital (50 mg/kg Körpergewicht) betäubt. Eine adäquate Anästhesie wurde durch das Fehlen des Zehenkneifreflexes und durch kontinuierliche Überwachung der Atemfrequenz bestätigt, die während des gesamten Bildgebenden Verfahrens aufrechterhalten wurde. Alle Euthanasieverfahren wurden gemäß dem genehmigten Tierprotokoll, den institutionellen Tierschutzrichtlinien und den nationalen Vorschriften für die Euthanasie von Labortieren durchgeführt.

Im Alter von 24 Wochen wurden die Mäuse durch eine zervikale Verrenkung nach Tiefanästhesie eingeschläfert, und beide Tibia wurden mit demselben Bildgebungsprotokoll für ex-vivo-Scans entnommen. Zu den Scanningsparametern gehörten eine Voxelgröße von 10,4 μm, eine Spannung von 55 kV, ein Strom von 145 μA, ein Sichtfeld von 32 mm, 1500/750 Proben pro Projektion und eine Integrationszeit von 100 ms.

Die Bilder wurden mit einem Beam-Hardening-Korrekturalgorithmus dritter Ordnung erstellt, der gegen ein 1200 mg HA/cm 3-Phantom kalibriert wurde. Die Knochenvolumenfraktion (BV/TV), die Trabekulardicke (Tb.Th) und die Trabekularzahl (Tb.N) wurden in der distalen Femurmetaphyse quantifiziert, die sich 1,0 mm proximal zur Wachstumsplatte befindet.

3. Plasmidtransfektion

sh-Rab27A- und sh-NC-Plasmide wurden erzeugt und zur Lentivirusproduktion verwendet. Lentivirale Verpackungsplasmide und shRNA-Konstrukte wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers ko-transfiziert in HEK293T Zellen. Virale Titer wurden vor intrafemoraler Verabreichung bestimmt, wie zuvor beschrieben36. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt.

4. Färbung von Hämatoxylin und Eosin (HE)

Femurproben wurden 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, 4 Wochen lang in 10 % EDTA entkalkt, in 30 % Saccharose/PBS kryogeschützt, in Paraffin eingebettet und mit einer Dicke von 5 μm durchschnitten. Gewebeschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und mit einem Lichtmikroskop untersucht. Mindestens sechs Mäuse pro Gruppe wurden analysiert.

5. Tartratresistente Säurephosphatase (TRAP)-Färbung

Die TRAP-Färbung der Oberschenkelschnitte erfolgte gemäß den Herstelleranweisungen38. Die TRAP-Aktivität in Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMMs) wurde mittels eines TRAP-Färbungstests untersucht. Reife Osteoklasten wurden als TRAP-positive multinukleierte Zellen definiert, die mindestens drei Kerne enthalten. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt, jeweils mit drei technischen Replikaten.

6. q-PCR

Die Gesamt-RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit TRIzol-Reagenz isoliert. Komplementäre DNA wurde mittels Reverse-Transkriptase synthetisiert und einer quantitativen Echtzeit-PCR mit SYBR-Green-Chemie unterzogen. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt, jeweils mit drei technischen Replikaten.

Die Primer-Sequenzen waren wie folgt:

Rab27A: F, TTCCTGCTTCTGTTCGACCT; R, GGCAGCACTGGTTTTTCAAAAT

FALLE: F, TGTTGACAGCGGTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTGTCTGGCCATAACT; R, GCGGAAAGGTGGTATCTCAA

C-FOS: F, TACTACCATTCCCCAGCCGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-Aktin: F, GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. Western-Blotting

Zellen oder Gewebe wurden mittels RIPA-Puffer, ergänzt mit Protaseinhibitoren, lysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels eines Bradford-Tests bestimmt. Gleiche Mengen Protein (20 μg) wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) oder Nitrocellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden 1 Stunde lang mit 5 % fettfreier Milch bei Zimmertemperatur blockiert und über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 oder β-Actin inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen mit den entsprechenden sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteinbänder wurden mit standardisierten Nachweisverfahren visualisiert. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt.

8. Zellkultur

Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMMs) wurden isoliert, wie zuvor beschrieben39. Knochenmarkzellen, die von Maus-Oberschenkelknochen entnommen wurden, wurden über Nacht in α-minimalem essentiellen Medium kultiviert, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, 30 ng/mL makrophagen-koloniestimulierendem Faktor (M-CSF) und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂. Nicht-adhärente Zellen wurden gesammelt und in einem stromalzellfreien System mit 30 ng/mL M-CSF kultiviert. Nach 3 Tagen wurden adhärente Zellen als BMMs entnommen und anschließend in Anwesenheit von 30 ng/mL M-CSF und 50 ng/mL Rezeptoraktivator des nuklearen Faktor-κB-Ligands (RANKL) für 72 Stunden kultiviert, um die Osteoklastendifferenzierung zu induzieren.

9. RNA-Interferenz (RNAi)

Kleine interferierende RNAs (siRNAs) wurden synthetisiert und mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 2 × 104 Zellen pro Bohrloch in sechs-Well-Platten vor der Transfektion ausgesaat. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt.

Die Zielsequenzen waren wie folgt:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. Immunfluoreszenz

Die Zellen wurden 20 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und 10 Minuten mit 0,1 % Triton X-100 permeabilisiert. Nach 30 Minuten Blockierung mit 5 % Rinderserumalbumin wurden die Zellen über Nacht mit primären Antikörpern bei 4 °C inkubiert.

Nach dem Waschen wurden fluorophor-konjugierte sekundäre Antikörper für 30 Minuten bei Zimmertemperatur aufgetragen. Die Kerne wurden mit DAPI gegenfärbt, und Bilder wurden mittels Konfokalmikroskopie aufgenommen. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt.

11. Kern- und zytoplasmatische Trennung

Kern- und zytoplasmatische Fraktionen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die Zellen wurden 10 Minuten auf Eis lysiert und bei 500 × g für 3 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Supernatant mit zytoplasmatischen Komponenten wurde gesammelt, während der Pellet mit den Kernen separat gewaschen und verarbeitet wurde.

12. RNA-bindende Protein-Immunpräzipitation (RIP)

RNA-Immunpräzipitationstests (RIP) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurzzeitig wurden die Zellen 30 Minuten lang auf Eis gelistet. Nach der Zentrifugation wurden die Supernatanten über Nacht mit Antikörpern und Protein-A/G-Agaroseperlen inkubiert. Nach dem Waschen wurden immunpräzipitierte Proteine mittels Western Blotting analysiert, und co-immunpräzipitierte RNA wurde mittels quantitativer Echtzeit-PCR analysiert. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt.

13. Rab27A mRNA-Stabilitätstest

Nach IGF2BP2 Knockdown wurde die gesamte RNA zu den angegebenen Zeitpunkten extrahiert. Anschließend wurden Reverse-Transkription und quantitative Echtzeit-PCR durchgeführt. Die Rab27A-mRNA-Spiegel wurden bei 0 H auf die entsprechende si-NC-Gruppe normalisiert. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt.

14. Statistische Analyse

Alle Experimente wurden unabhängig voneinander mit mindestens drei biologischen Replikaten durchgeführt. Für q-PCR, RNA-Interferenz, TRAP-Färbung, Western Blotting und andere zellbasierte Tests umfasste jede biologische Replikat drei technische Replikate, sofern nicht anders angegeben. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism Version 9.0 und SPSS-Software durchgeführt. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit einem zweiseitigen Schüler-t-Test durchgeführt. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden mittels zweiseitiger Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichs-Post-hoc-Test zur Anpassung an mehrere Vergleiche. Ein P-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Knockdown von Rab27A reduzierte die Osteoporose in vivo.

Um die Rolle von Rab27A bei Osteoporose zu untersuchen, wurde Rab27A Knockdown in einem ovariektomierten (OVX) Mausmodell durchgeführt, das mit zuvor berichteten Methoden34,40 erstellt wurde. Das Gesamtstudiendesign ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Die Mikro-Computertomographie zeigte, dass Knochenmineraldichte, Knochenvolumenfraktion (BV/TV), Trabekulardicke (Tb.Th) und Trabekularzahl (Tb.N) bei OVX-Mäusen im Vergleich zu Sham-Kontrollen signifikant reduziert waren (Abbildung 2A). Diese Ergebnisse bestätigten die erfolgreiche Etablierung des Osteoporosemodells. Rab27A Knockdown stellte signifikant alle gemessenen Knochenstrukturparameter wieder, was auf eine Abschwächung des OVX-induzierten Knochenverlusts und mikroarchitektonischen Verschlechterungs hinweist (Abbildung 2A).

Die histologische Untersuchung bestätigte diese Ergebnisse weiter. Die Färbung von Hämatoxylin und Eosin zeigte einen deutlichen trabekulären Knochenverlust und eine Störung der trabekulären Architektur bei OVX-Mäusen im Vergleich zur Sham-Gruppe (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu linderte der Rab27A-Depletion die Trabekularverschlechterung und stellte die Knochenmorphologie teilweise wieder her (Abbildung 2B). Da Rab27A mit der Osteoklast-Differenzierung28 in Verbindung gebracht wird, wurde die Osteoklastenaktivität mittels Tartratresistenter Säurephosphatase-(TRAP)-Färbung untersucht. Die TRAP-Aktivität war bei OVX-Mäusen im Vergleich zu Sham-Kontrollen deutlich erhöht und nach dem Rab27A-Knockdown signifikant reduziert (Abbildung 2C).

Die Expression von osteoklastassoziierten Markern wurde anschließend untersucht. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass Rab27A-, TRAP-, NFATc1- und c-FOS-Proteinwerte bei OVX-Mäusen signifikant erhöht und nach Rab27A-Depletion reduziert wurden (Abbildung 2D). Konsistente Ergebnisse wurden auf Transkriptionsebene erzielt, wobei quantitative Echtzeit-PCR (q-PCR) ähnliche Expressionsmuster für Rab27A, TRAP, NFATc1 und c-FOS mRNA-Expression zeigte (Abbildung 2E).

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Abbildung 1: Schematischer Überblick über das experimentelle Design und den vorgeschlagenen regulatorischen Mechanismus, der der YTHDC1- und IGF2BP2-vermittelten Regulation von m6A-modifiziertem Rab27A während der Osteoklast-Differenzierung und des Osteoporoseprogressions zugrunde liegt. Ein ovariektomiertes (OVX) Mausmodell und ein Rezeptoraktivator des nukleären Faktor-κB-Liganden (RANKL)/makrophagen-koloniestimulierenden Faktors (M-CSF)-induzierten Osteoklastendifferenzierungsmodells wurden verwendet, um die Rolle von Rab27A bei der Osteoklastogenese zu untersuchen. Rab27A-Knockdown-, nukleäre und zytoplasmatische Fraktionierung sowie RNA-Immunpräzipitationstests wurden durchgeführt, um Osteoklasten-Differenzierungsmarker (TRAP, NFATc1 und c-FOS), Rab27A-Expression und subzelluläre Lokalisation zu bewerten. YTHDC1 erleichterte den zytoplasmatischen Export von m6A-modifiziertem Rab27A, während IGF2BP2 Rab27A im Zytoplasma stabilisierte. Gemeinsam förderten diese koordinierten regulatorischen Mechanismen die Osteoklastendifferenzierung und trugen im OVX-Modell zum Knochenverlust bei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Knockdown von Rab27A reduzierte die Osteoporose in vivo. (A) Trabekuläre Knochenmorphometrie-Analyse. Knochenmineraldichte, Knochenvolumenfraktion (BV/TV), Trabekulardicke (Tb.Th) und Trabekularzahl (Tb.N) wurden quantifiziert. **P < 0,01, ***P < 0,001. (B) Histologische Begutachtung des Femurtrabekelknochens nach Rab27A-Depletion. Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbungen wurden durchgeführt, um strukturelle Veränderungen im distalen Oberschenkelknochen zu bewerten. OVX und OVX + sh-NC Gruppen dienten als Kontrollen. Skala = 50 μm. ***P < 0,001. (C) TRAP-Färbung der Oberschenkelschnitte. Die TRAP-Aktivität wurde untersucht, um die Osteoklastaktivität zu bewerten. OVX und OVX + sh-NC Gruppen dienten als Kontrollen. Skala = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Expression von Rab27A, TRAP, NFATc1 und c-FOS nach Rab27A-Depletion. Die Proteinexpression wurde durch Western Blotting (D) bestimmt, und die mRNA-Expression durch q-PCR (E). β-Actin diente als Ladekontrolle. **P < 0,01, ***P < 0,001. Die Sham-Gruppe unterzog sich einer chirurgischen Exposition der Eierstöcke ohne Ovariektomie, während die OVX-Gruppe eine bilaterale Ovariektomie erhielt. sh-NC, Kurzhaarnadel-RNA mit negativer Kontrolle. In jeder Versuchsgruppe wurden sechs Mäuse einbezogen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Knockdown der durch M-CSF und RANKL induzierten Osteoklast-Differenzierung von BMMs durch Rab27A-Suppression

Um die Rolle von Rab27A während der Osteoklastogenese weiter zu evaluieren, wurden Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMMs) mit dem makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (M-CSF) und dem Rezeptoraktivator des Nuklearfaktor-κB-Ligands (RANKL) stimuliert, um die Osteoklastendifferenzierung28 zu induzieren.

Quantitative Echtzeit-PCR- und West-Blot-Analysen zeigten, dass die M-CSF- und RANKL-Stimulation die Rab27A-mRNA- und Proteinexpression signifikant erhöhte, während Transfektion mit si-Rab27A die Rab27A-Expression effektiv reduzierte (Abbildung 3A, B). Die TRAP-Färbung zeigte eine deutliche Zunahme der Osteoklastenaktivität nach M-CSF- und RANKL-Behandlung. Rab27A-Knockdown reduzierte die TRAP-Aktivität signifikant im Vergleich zur induzierten Gruppe (Abbildung 3C).

Die Expression von Osteoklasten-Differenzierungsmarkern wurde anschließend untersucht. Quantitative Echtzeit-PCR-Analysen zeigten, dass die mRNA-Spiegel von TRAP, NFATc1 und c-FOS nach der Osteoklasteninduktion signifikant erhöht und durch Rab27A-Depletion reduziert wurden (Abbildung 3D). Ähnliche Ergebnisse wurden auf Proteinebene durch Western-Blotting beobachtet (Abbildung 3E).

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Abbildung 3: Knockdown der durch M-CSF und RANKL induzierten Osteoclast-Differenzierung von von Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMMs) von Rab27A. (A–B) Expression von Rab27A nach Osteoklasteninduktion. Rab27A mRNA (A) und Protein (B) Spiegel wurden jeweils mittels q-PCR und Western Blotting bestimmt. β-Actin diente als Ladekontrolle. P < 0,001. (C) TRAP-Färbung von BMM-abgeleiteten Osteoklasten. Die durch M-CSF und RANKL induzierte TRAP-Aktivität wurde nach dem Knockdown von Rab27A unterdrückt. Skala = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Expression von Osteoklasten-Differenzierungsmarkern nach Rab27A-Depletion. Die mRNA-Spiegel von TRAP, NFATc1 und c-FOS wurden durch q-PCR (D) bestimmt, und die Proteinwerte durch Western Blotting (E). β-Actin diente als Ladekontrolle. **P < 0,01, ***P < 0,001. Kontrolle, unbehandelte Zellen; si-NC, negative Kontrolle siRNA. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Der zytoplasmatische Export von m6A-modifiziertem Rab27A wurde durch YTHDC1 erleichtert

Um die mögliche Beteiligung der m6A-Modifikation an der Rab27A-Regulation zu untersuchen, wurden bioinformatische Analysen durchgeführt. Mehrere vorhergesagte m6A-Modifikationsstellen wurden im Rab27A-Transkript identifiziert (Abbildung 4A). Darüber hinaus deutete die Interaktionsprognoseanalyse auf potenzielle Assoziationen zwischen Rab27A und den m6A-Leseproteinen YTHDC1 und IGF2BP2 hin (Abbildung 4B).

Um die Wechselwirkung zwischen YTHDC1 und Rab27A mRNA zu validieren, wurden RNA-Immunpräzipitationstests (RIP) durchgeführt. Rab27A-mRNA war signifikant angereichert in Komplexen, die mit dem Anti-YTHDC1-Antikörper immunpräzipitiert waren, im Vergleich zur Immunglobulin-G-(IgG)-Kontrolle (Abbildung 4C).

Da YTHDC1 als nukleärer m6A-Leser fungiert, der am RNA-Export41 beteiligt ist, wurden nukleare und zytoplasmatische Fraktionierungstests durchgeführt. Der YTHDC1-Knockdown erhöhte signifikant die Kernretention von Rab27A-mRNA und reduzierte deren zytoplasmatische Häufigkeit (Abbildung 4D).

Die Wirkung von YTHDC1 auf die Expression von Rab27A wurde weiter untersucht. Eine quantitative Echtzeit-PCR-Analyse zeigte, dass die Erschöpfung von YTHDC1 die Rab27A-mRNA-Expression reduzierte (Abbildung 4E). Konsequent zeigte die Western-Blot-Analyse eine verringerte Rab27A-Proteinexpression nach dem YTHDC1-Knockdown (Abbildung 4F).

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Abbildung 4: Der zytoplasmatische Export von m6A-modifiziertem Rab27A wurde durch YTHDC1 erleichtert. (A) Vorhergesagte m6A-Modifikationsstellen innerhalb von Rab27A, identifiziert mit dem SRAMP-Vorhersagewerkzeug. (B) Vorhergesagte Wechselwirkungen zwischen Rab27A und den m6A-Leseproteinen YTHDC1 und IGF2BP2 mit StarBase identifiziert. (C) RNA-Immunpräzipitations-(RIP)-Test, der die Wechselwirkung zwischen YTHDC1 und Rab27A-mRNA demonstriert. **P < 0,01. IgG diente als Negativkontrolle. Die Rab27A-Anreicherung wurde auf den prozentualen Input normalisiert. Das YTHDC1-Immunblotband spiegelt die Effizienz der Immunpräzipitation wider. (D) Kern- und zytoplasmatische Fraktionierungsanalyse, die eine erhöhte Kernretention von Rab27A nach YTHDC1-Knockdown zeigt. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E–F) Ausdruck von YTHDC1 und Rab27A nach dem YTHDC1-Knockdown. die mRNA-Expression wurde durch q-PCR (E) bestimmt, und die Proteinexpression durch Western Blotting (F). β-Actin diente als Ladekontrolle. **P < 0,01. si-NC, negative Kontrolle siRNA. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Stabilisierung von Rab27A durch Wechselwirkung mit IGF2BP2

Die Wechselwirkung zwischen IGF2BP2 und Rab27A wurde mittels RIP-Assays untersucht. Rab27A-mRNA war signifikant angereichert in Komplexen, die mit Anti-IGF2BP2-Antikörpern ausgefällt waren, im Vergleich zur IgG-Kontrolle, was auf eine Assoziation zwischen IGF2BP2 und Rab27A-mRNA hinweist (Abbildung 5A).

Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte eine Kolokalisierung von IGF2BP2 und Rab27A überwiegend im Zytoplasma (Abbildung 5B). Um den funktionellen Effekt von IGF2BP2 auf die Rab27A-Expression zu bestimmen, wurde IGF2BP2 mittels siRNA zum Schweigen gebracht. Eine quantitative Echtzeit-PCR-Analyse zeigte eine signifikante Reduktion der Rab27A-mRNA-Spiegel nach IGF2BP2 Depletion (Abbildung 5C). Im Einklang mit diesen Ergebnissen zeigte die Western-Blot-Analyse eine verminderte Rab27A-Proteinexpression nach IGF2BP2 Knockdown (Abbildung 5D).

Die Wirkung von IGF2BP2 auf die Stabilität der Rab27A-mRNA wurde anschließend bewertet. IGF2BP2 Depletion verkürzte signifikant die Halbwertszeit von Rab27A-mRNA und verringerte die Transkriptstabilität (Abbildung 5E).

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Abbildung 5: Stabilisierung von Rab27A durch Wechselwirkung mit IGF2BP2. (A) RNA-Immunpräzipitations-Assay, der die Assoziation zwischen IGF2BP2 und Rab27A-mRNA zeigt. IgG diente als Negativkontrolle. Die Rab27A-Anreicherung wurde auf den prozentualen Input normalisiert. P < 0,001. (B) Immunfluoreszenzanalyse zeigt die Kolokalisierung von Rab27A und IGF2BP2 im Zytoplasma. Die Kerne wurden mit DAPI kontrafärbt. Skalenleiste = 20 μm. (C–D) Abregulierung von Rab27A nach IGF2BP2 Erschöpfung. Die Rab27A-mRNA-Werte wurden durch q-PCR (C) bestimmt, und die Proteinwerte durch Western Blotting (D). β-Actin diente als Ladekontrolle. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Rab27A mRNA-Stabilität nach IGF2BP2 Knockdown. Die Rab27A-mRNA-Spiegel wurden bei 0 H auf die entsprechende si-NC-Gruppe normalisiert. **P < 0,01. si-NC, negative Kontrolle siRNA. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Stilllegung von YTHDC1 oder IGF2BP2 suppressierte Osteoklast-Differenzierung von BMMs, induziert durch M-CSF und RANKL

Um die funktionelle Beziehung zwischen YTHDC1, IGF2BP2 und Rab27A während der Osteoklast-Differenzierung weiter zu untersuchen, wurden Knockdown-Experimente in BMMs durchgeführt.

Die M-CSF- und RANKL-Stimulation erhöhten signifikant die mRNA-Expression von Rab27A, YTHDC1 und IGF2BP2 (Abbildung 6A). Entsprechend war auch die Proteinexpression dieser Moleküle nach der Osteoklasteninduktion erhöht (Abbildung 6B). Das Abschalten von entweder YTHDC1 oder IGF2BP2 reduzierte die Expression von Rab27A signifikant, während das Knockdown eines Regulators die Expression des anderen nicht wesentlich beeinflusste.

Die TRAP-Färbung zeigte, dass der Depletion von YTHDC1 oder IGF2BP2 die durch M-CSF und RANKL induzierte Osteoklastenaktivität signifikant unterdrückte (Abbildung 6C). Darüber hinaus zeigte die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse eine reduzierte Expression von TRAP, NFATc1 und c-FOS nach YTHDC1 oder IGF2BP2 Knockdown (Abbildung 6D). Die Western-Blot-Analyse bestätigte entsprechende Reduktionen auf Proteinebene (Abbildung 6E).

Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass YTHDC1 und IGF2BP2 die Osteoklast-Differenzierung durch die Regulation der Rab27A-Expression fördern.

figure-results-6
Abbildung 6: Abschaltung von YTHDC1 oder IGF2BP2 unterdrückte Osteoklastendifferenzierung von BMMs, induziert durch M-CSF und RANKL. (A–B) Expression von Rab27A nach YTHDC1 oder IGF2BP2 Knockdown. Rab27A mRNA (A) und Protein (B) Spiegel wurden jeweils mittels q-PCR und Western Blotting bestimmt. β-Actin diente als Ladekontrolle. P < 0,001. (C) TRAP-Färbung, die eine Unterdrückung der Osteoklastenaktivität nach YTHDC1 oder IGF2BP2 Depletion zeigt. Skala = 50 μm. **P < 0,01, ***P < 0,001. (D–E) Expression von Osteoklast-Differenzierungsmarkern nach YTHDC1 oder IGF2BP2 Depletion. Die mRNA-Spiegel von TRAP, NFATc1 und c-FOS wurden durch q-PCR (D) bestimmt, und die Proteinwerte durch Western Blotting (E). β-Actin diente als Ladekontrolle. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Kontrolle, unbehandelte Zellen; si-NC, negative Kontrolle siRNA. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

DATENVERFÜGBARKEIT:

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze (einschließlich Western Blot-Daten, Bilddatensätze, quantitative Analysen und Quelldateien) wurden in Supplementary File 1 bereitgestellt.

Ergänzende Datei 1: Die Datensätze und Rohdaten dieser Studie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Osteoklast-Differenzierung spielt eine wesentliche Rolle bei der Knochenremodellierung, Knochenresorption, Frakturreparatur und der skelettalen Homöostase12˒15˒17˒18˒42˒43. Übermäßige Osteoklastenaktivität ist ein wesentlicher Faktor für die Osteoporose, weshalb die Identifizierung regulatorischer Signalwege, die die Osteoklastendifferenzierung steuern, ein wichtiges Forschungsziel ist. Mehrere antiresorptive Therapien, die auf die Osteoklastfunktion abzielen, haben eine klinische Wirksamkeit 6,44,45 gezeigt. Beispielsweise wurde Denosumab mit einer verringerten Frakturinzidenz und einem günstigen Sicherheitsprofil6 assoziiert, während der Cathepsin-K-Inhibitor ONO-5334 positive Effekte auf Knochenmineraldichte und Knochenstärke bei ovariektomierten nicht-menschlichen Primaten44 gezeigt hat. Die vorliegende Studie identifizierte einen bisher unbekannten m6A-abhängigen Regulationsmechanismus, der YTHDC1, Rab27A und IGF2BP2 umfasst und die Osteoklastendifferenzierung und das Fortschreiten der Osteoporose fördert. Diese Erkenntnisse liefern neue Einblicke in die molekulare Regulation der Osteoklastogenese und deuten auf potenzielle therapeutische Ziele für Osteoporose hin.

Rab27A wurde zuvor an der Osteoklast-Differenzierung und Knochenresorption durch Regulierung des vesikulären Traffickings und intrazellulärer Signalübertragung in Verbindung gebracht und könnte auch RANKL-induzierte Signalkaskaden durch endosomales Recycling wichtiger Rezeptorenbeeinflussen 28,29. Im Einklang mit diesen Berichten war die Expression von Rab27A während der Osteoklast-Differenzierung deutlich erhöht, während Rab27A-Depletion die Osteoklast-Differenzierung in vitro unterdrückte und den osteoporoseassoziierten Knochenverlust in vivo linderte. Diese Ergebnisse stützen eine entscheidende Rolle von Rab27A in der Osteoklastenbiologie und erweitern frühere Beobachtungen, indem sie zeigen, dass die Aktivität von Rab27A durch m6A-abhängige Mechanismen reguliert wird. Zusammen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass m6A-modifiziertes Rab27A diese Prozesse auf posttranskriptionaler Ebene regulieren und folglich die knochenresorptive Aktivität beeinflussen kann.

Zunehmende Evidenz deutet darauf hin, dass die m6A-Modifikation zur Entwicklung und zum Fortschreiten knochenbezogener Erkrankungen beiträgt32. Bioinformatische Analysen identifizierten mehrere mutmaßliche m6A-Modifikationsstellen innerhalb von Rab27A-mRNA (Abbildung 4A), und funktionelle Studien zeigten, dass YTHDC1 und IGF2BP2 die Expression von Rab27A und die Osteoklastendifferenzierung regulieren (Abbildungen 4–6). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die m6A-Modifikation ein wichtiger vorgelagerter Regulationsmechanismus ist, der die Funktion von Rab27A während der Osteoklastogenese steuert. Da innerhalb von Rab27A mehrere vorhergesagte m6A-Stellen identifiziert wurden, sollten zukünftige Studien bestimmen, ob einzelne Standorte oder Kombinationen von Standorten für die Rab27A-Regulation erforderlich sind. Der Bau von m6A-defizienten Rab27A-Mutanten und anschließende Rettungsexperimente lieferten direkte Beweise für die funktionelle Bedeutung der m6A-Modifikation in diesem Weg.

Mechanistisch zeigte die vorliegende Studie, dass YTHDC1 mit Rab27A-mRNA interagiert und deren nuklearen Export erleichtert. Nach der zytoplasmatischen Translokation verbindet IGF2BP2 sich direkt mit Rab27A-mRNA und verbessert die Transkriptstabilität. Folglich verringerte der Mangel an entweder YTHDC1 oder IGF2BP2 die Rab27A-Expression und unterdrückte die Osteoklastendifferenzierung. Diese Ergebnisse unterstützen ein Modell, in dem YTHDC1 und IGF2BP2 zusammenarbeiten, um die Rab27A-Expression durch Koordination des mRNA-Transports und der Stabilität aufrechtzuerhalten. Dieser regulatorische Mechanismus erweitert das aktuelle Verständnis der m6A-vermittelten Regulation der Osteoklastendifferenzierung und identifiziert mehrere Komponenten dieses Weges als potenzielle therapeutische Ziele.

Mehrere Einschränkungen sollten anerkannt werden. Erstens, obwohl gezeigt wurde, dass Rab27A die Osteoklastendifferenzierung reguliert, wurden seine potenziellen Auswirkungen auf die Osteoblastenfunktion noch nicht untersucht. Da die Knochenhomöostase vom Gleichgewicht zwischen osteoklastvermittelter Knochenresorption und osteoblast-vermittelter Knochenbildung abhängt, sollten zukünftige Studien prüfen, ob Rab27A auch die Osteoblastendifferenzierung oder -aktivität beeinflusst. Zweitens stützte sich die vorliegende Studie hauptsächlich auf Funktionsverlust-Ansätze. Komplementäre Überexpression von Rab27A, YTHDC1 und IGF2BP2 zusammen mit Rettungsexperimenten mit m6A-defizienten Rab27A-Mutanten würde das vorgeschlagene Regulierungsmodell weiter stärken. Drittens, obwohl mehrere mutmaßliche m6A-Stellen innerhalb von Rab27A-mRNA mit bioinformatischen Ansätzen vorhergesagt wurden, bleiben die spezifischen Standorte, die für die Regulierung der Rab27A-Funktion verantwortlich sind, unidentifiziert und erfordern eine experimentelle Validierung. Schließlich sind weitere Studien erforderlich, um festzustellen, ob andere m6A-Leserproteine, RNA-bindende Proteine oder Signalwege an der Rab27A-Regulation während der Osteoklastendifferenzierung beteiligt sind.

Die Immunregulation hat sich als wichtiger Bestandteil der Osteoporose-Pathogeneseerwiesen 46,47. Rab27A hat etablierte Funktionen in der Sekretion von Immunzellen, der Freisetzung zytotoxischer Granulate, der Degranulation von Neutrophilen und der Regulation der Gewebemikroumgebung 48,49,50,51,52,53,54,55. Weitere Untersuchungen der Beziehung zwischen Rab27A, Immunregulation und Knochenhomöostase könnten zusätzliche Einblicke in die Pathogenese der Osteoporose liefern.

Künftige Untersuchungen sollten mehrere Schlüsselbereiche priorisieren. Erstens ist eine systematische Mutagenese der vorhergesagten m6A-Stellen innerhalb von Rab27A erforderlich, um die funktionellen Bindungsstellen zu identifizieren, die an der YTHDC1- und IGF2BP2-vermittelten Regulation beteiligt sind. Zweitens wird die Überexpression von Rab27A, YTHDC1 und IGF2BP2 zusammen mit Rettungsexperimenten mit m6A-defizienten Rab27A-Mutanten entscheidend sein, um den direkten Beitrag der regulatorischen Achse YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 zu etablieren. Drittens wird die Validierung dieses Weges in weiteren Osteoporosemodellen und die Bewertung der Rab27A-Funktion in Osteoblasten wichtig sein, um die vorliegenden Ergebnisse weiter zu untermauern.

Abschließend identifizierte die vorliegende Studie eine neuartige YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 regulatorische Achse, die die Osteoklastendifferenzierung und das Fortschreiten der Osteoporose fördert. YTHDC1 erleichterte den nuklearen Export von m6A-modifizierter Rab27A-mRNA, während IGF2BP2 die Stabilität der Rab27A-mRNA im Zytoplasma verbesserte. Diese koordinierten regulatorischen Ereignisse erhöhten die Expression von Rab27A und förderten die Osteoklastogenese. Zusammen erweitern die Ergebnisse das aktuelle Verständnis der m6A-vermittelten Regulation der Osteoporose und bilden eine Grundlage für die Entwicklung therapeutischer Strategien, die auf den YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2-Pfad abzielen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde finanziell durch das Scientific and Technological Strategic Cooperation Project zwischen dem Pengzhou People's Hospital und der Southwest Medical University (Zuschussnummer 2023PZXNYD01) an Lian Tang unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

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Knochenmark MakrophagenTRAP F rbungWestern BlotYTHDC1IGF2BP2

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