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Methodenartikel

Die DNA-FISH-Metaphase breitet sich aus, um extrachromosomale DNA von homogen färbenden Regionen in menschlichen Krebszelllinien zu unterscheiden

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DOI:

10.3791/71970

⸱

4. August 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir berichten über ein DNA-FISH-Metaphasen-Spread-Protokoll, das die Locus-Kopiennummer und -Position im Genom visuell erkennt. Dieser Ansatz ermöglicht die Einzelzellauflösung von Amplifikationszuständen, insbesondere in Krebszelllinien mit extrachromosomaler DNA und homogen gefärbten Regionen.

Zusammenfassung

Die Ganzgenomsequenzierung identifiziert fokale DNA-Amplifikationen mit Basenpaar-Auflösung, kann jedoch nicht feststellen, ob sich amplifizierte Sequenzen auf extrachromosomaler DNA (ecDNA, auch bekannt als Double Minutes) oder in chromosomal integrierten homogen färbenden Regionen (HSRs) befinden. DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-Metaphasen-Spreads (DNA-FISH) bleiben der Goldstandard zur Unterscheidung dieser Amplifikationszustände bei Einzelzellauflösung. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für DNA-FISH-Metaphasenausbreitungen unter Verwendung menschlicher Krebszelllinien vor, das Zellkultur, Metaphasenstillstand, hypotonische Behandlung, Fixation, Chromosomenausbreitung, fluoreszente Sondenhybridisierung und fluoreszenzbildgebende Bildgebung umfasst. Das Protokoll beinhaltet zwischenbestehende Qualitätskontrollschritte, um die erfolgreiche Chromosomenverteilung zu überprüfen und die Ausbreitungsqualität der Metaphase zu optimieren, wodurch der Arbeitsablauf für Labore ohne spezialisierte Zytogenetik-Expertise zugänglich wird. Die Ergebnisse zeigen eine klare Visualisierung von ecDNA- und HSR-Amplifikationszuständen mit locusspezifischen Sonden und veranschaulichen häufige technische Artefakte, die die Interpretation beeinflussen können. Dieses Protokoll bietet einen robusten und reproduzierbaren Ansatz zur Untersuchung der strukturellen Organisation der Onkogenamplifikation in Krebszellen.

Einleitung

Das menschliche Genom ist nicht nur nach seiner Sequenz, sondern auch nach seiner Struktur organisiert, und Veränderungen in der Sequenz oder Struktur können zu Krebs 1,2,3,4 führen. Die Onkogen-Amplifikation ist bei etwa 40 % aller Tumore vorhanden, wo sie zur Tumorinitiation, zum Wachstum, zur Metastasierung und zur Arzneimittelresistenzbeiträgt 5. In einigen Fällen werden amplifizierte Onkogene auf extrachromosomalen DNAs (ecDNAs, auch Doppelminuten genannt) übertragen, die kreisförmige, sich selbst replizierende, doppelsträngige DNA-Elemente sind, die außerhalb der linearen Chromosomen 6,7,8,9 liegen. ecDNAs sind Hunderte von Kilobasen bis Megabasen in der Größe10,11. Aufgrund ihres Fehlens von Zentromeren segregieren sie sich während der Mitose asymmetrisch, was zu bis zu 100+ Kopien in einem einzigen Kern führt: 12,13,14,15,16,17,18. Diese ungleiche Segregation erzeugt Kopienzahlenvariabilität zwischen Tochterzellen, was eine schnelle Tumorentwicklung und schlechte Patientenergebnisse17,19 antreibt.

ecDNAs existieren in einer dynamischen Beziehung zu homogen färbenden Regionen (HSRs) (Abbildung 1A)8,18. HSRs sind fokale, intrachromosomale Amplifikationen, die durch die Reintegration von ECDNAs in einen einzigen Locus im Genom entstehen können: 8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Diese beiden Zustände, ecDNAs und HSRs, können sich gegenseitig umwandeln, was zeigt, dass die Onkogenamplifikation strukturell plastisch ist 24,25,32,33. Diese Interkonversion ist therapeutisch relevant, da ecDNAs in Anwesenheit von Medikamenten 32,33,34,35,36,37,38 in den HSR-Zustand übergehen können. Zellen, die diesen Übergang in den HSR-Zustand durchlaufen, werden dann unter therapeutischem Druck33 resistent gegen das Medikament. HSRs scheinen auch bei bösartigen Tumoren häufiger aufzutreten als bei gutartigenTumoren 39. Trotz ihrer klinischen Relevanz zielen keine von der FDA zugelassenen Strategien auf den HSR-Zustand ab, teilweise weil Methoden zur Unterscheidung dieser Amplifikationsstrukturen weiterhin untergenutzt sind.

Obwohl ecDNA- und HSR-Zustände unterschiedliche klinische Folgen haben, können aktuelle Sequenzierungsmethoden sie nicht zuverlässig unterscheiden. Die Whole-Genome Sequencing (WGS) identifiziert nun amplifizierte Regionen mit Basenpaar-Auflösung40. WGS war wertvoll bei der Definition der Sequenzzusammensetzung von ecDNAs und HSRs, allerdings auf Kosten der räumlichen Auflösung. Im Gegensatz zu traditionellen zytogenetischen Ansätzen kann WGS allein nicht bestimmen, ob eine amplifizierte Sequenz auf ecDNAs liegt oder als HSR 41,42,43 in ein Chromosom integriert ist. Daher bleiben Methoden, die den räumlichen Kontext der Verstärkung bewahren, unerlässlich, um die Biologie dieser unterschiedlichen Zustände zu verstehen.

In den letzten 40 Jahren dienen DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-Metaphasen-Spreads (DNA-FISH) als Goldstandard zur Identifizierung und Unterscheidung von ecDNA- und HSR-Amplifikationszuständen 42,44,45,46. Tatsächlich wurden ecDNAs und HSRs erstmals durch metaphasenbasierte zytogenetische Analysen 7,47 identifiziert und charakterisiert. Vor dem weitverbreiteten Einsatz von fluoreszierenden Sonden wurde die Hybridisierung in situ mit radiomarkierten DNA-Sonden durchgeführt, die auch zur Visualisierung von ecDNAs und HSRs 48,49 verwendet wurden. Mit der zunehmenden Beliebtheit von WGS wurden DNA-FISH-Metaphasen-Spreads seltener. Viele Aspekte des Arbeitsablaufs sind über die zytogenetische Literatur verteilt, und optimierte Protokolle werden typischerweise innerhalb einzelner Forschungsgruppen oder zytogenetiker Labore beibehalten, die die Methode als proprietäre50,51 behandeln. Hier beschreiben wir ein DNA-FISH-Metaphasen-Spread-Protokoll, um den Amplifikationszustand auf Einzelzellebene visuell zu erkennen.

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Protokoll

Alle humanen Zellkulturverfahren wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt.

1. Zellarrest in der Metaphase mit Colcemid (N-methyl-N-deacetyl-colchicin)

  1. Beginnen Sie mit etwa 2,0 × 106–2,0 × 107 Krebszellen oder anderen kultivierten Zellen. Zu wenige Zellen führen zu weniger Metaphasenausbreitungen, während zu viele Zellen zu einer unzureichenden Fixierung führen können.
  2. Bestimmen Sie die geeignete Colcemid-Inkubationszeit für das experimentelle System. Die Inkubationszeit beeinflusst die Anzahl der erreichten Metaphasenausbreitungen und die Chromosomenlänge, und optimale Bedingungen variieren je nach Zelltyp.
    HINWEIS: Kürzere Inkubationszeiten führen dazu, dass weniger Zellen zum Zeitpunkt der Entnahme in der Metaphase gestoppt sind. Längere Inkubationszeiten erzeugen mehr kondensierte Chromosomen mit kürzeren Armen, was die Analyse erschwert. Für Krebszelllinien mit einer ungefähren Verdopplungszeit von 24 Stunden führen Inkubationszeiten von 45 Minuten bis über Nacht zu geeigneten Metaphasenausbreitungen. Optimieren Sie die Inkubationszeit für Zellen mit langsameren Verdopplungszeiten. Eine 2-stündige Inkubation reicht in der Regel aus, um eine ausreichende Anzahl von Metaphasenausbreitungen mit für die Analyse geeigneten Chromosomenlängen zu erzeugen.
  3. Berechnen Sie die benötigte Menge an Colcemid, um eine Endkonzentration von 10 μL/mL im geeigneten Zellkulturmedium zu erreichen.
    HINWEIS: Halten Sie die Zellen im logarithmischen Wachstum aufrecht, indem Sie sie mindestens 24 Stunden vor dem Metaphasenstopp durchgeben oder aussäen. Behandeln Sie die Zellen mit Colcemid, wenn die Kulturen eine Konfluenz von 70 % bis 90 % erreichen.
  4. Verdünnen Sie die Colcemid-Schaftlösung 1:1 mit sterilem ultrareinem Wasser. Fügen Sie der Kultur das passende Volumen hinzu und bebrüten Sie sie 45 Minuten bis über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator.

2. Entnahmezellen

  1. Bereiten Sie frisches Carnoy's Fixativ (3:1 Methanol: Essigsäure) vor. Halten Sie das Fixativ während des gesamten Fixierungsprozesses auf Eis.
  2. Bereiten Sie eine frische 0,075 m KCl-Lösung vor und erwärmen Sie sie in einem 37 °C Wasserbad.
  3. Sammeln Sie die Zellen als Pellet und zeichnen Sie die Zellzahl auf. Verwenden Sie diesen Wert, um das endgültige Aufhängungsvolumen zu berechnen.
    HINWEIS: Lösen Sie adhärente Zellen durch Trypsinisierung. Übertragen Sie die Suspensionszellen direkt in 15-mL Zentrifugenröhren. Entsorgen Sie Colcemid und Colcemid-haltige Medien gemäß den institutionellen Richtlinien für gefährliche Abfälle.
  4. Wasche die Zellen mit PBS.
  5. Lassen Sie die Zellen vorsichtig in 10 mL warmem 0,075 M KCl wieder suspendieren und mischen Sie sie sanft invertiert. Diese hypotonische Behandlung schwillt die Zellen an, sodass sie während der Dosenpräparation platzen und die Chromosomen verteilen können.
  6. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C Wasserbad für 30 Minuten.
  7. Fügen Sie langsam 2 ml eiskaltes Carnoy-Fixativ hinzu und mischen Sie die Suspension sanft durch Inversion.
  8. Lass die Zellen 5 Minuten stehen.
  9. Zentrifugiere bei 500 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
  10. Atmen Sie vorsichtig das Überdachungsmittel ab oder entfernen Sie es mit einer Pipette.
  11. Fügen Sie langsam 10 ml eiskaltes Carnoy-Fixativ in 0,5 ml-Schritten hinzu, während Sie nach jeder Zugabe vorsichtig mischen.
  12. Lass die Zellen 10 Minuten bei RT stehen.
  13. Zentrifugiere mit 650 × g für 5 Minuten bei RT.
  14. Wiederhole die Schritte 2.10–2.13 zweimal
  15. Während der letzten Wäsche lassen Sie die Zellen in Carnoys Fixativ hängen.
    PAUSE: Lagern Sie die feste Zellsuspension bei −20 °C oder gehen Sie sofort zu Abschnitt 3.
    HINWEIS: Bei Proben mit weniger als etwa 3 × 106 Zellen wird die Fixierung in 1,5-mL Mikrozentrifugenröhren statt größeren konischen Röhren durchgeführt. Reduziere das Volumen von 0,075 M KCl und Carnoys Fixativ um das Zehnfache, während alle Inkubationszeiten, Temperaturen und Zentrifugationsbedingungen erhalten bleiben.

3. Tischabfall

  1. Entnommen Sie die Probe bei −20 °C und tauten Sie sie auf RT auf.
  2. Zentrifugiere bei 800 × g für 7 Minuten bei RT.
  3. Beschrifte die Glasscheiben und lege sie auf Eis.
  4. Mit der vor der Fixierung erzielten Zellanzahl berechnen Sie das Volumen des Carnoy-Fixativs, das benötigt wird, um das Pellet bei einer Endkonzentration von etwa 5 × 106 Zellen /ml wieder aufzuhängen. Nach der Zentrifugation wird das Überlagermittel vorsichtig mit einer Pipette entfernt, wobei das berechnete Volumen des Fixativs über dem Pellet bleibt.
  5. Die fixierten Zellen in Carnoys Fixativ mit einer P1000-Pipette wieder aufhängen.
  6. Transferiere etwa 300 μL der festzelligen Suspension in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr.
  7. Suspendieren Sie die Probe gründlich mit einer P200-Pipette, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.
  8. Aspiratieren Sie 60 μL der resuspendierten Zellen mit einer P200-Pipette.
  9. Halten Sie die Pipettenspitze etwa 1 m über dem Glasschlitten auf dem Eis und zielen Sie auf die Mitte des Schlittens.
  10. Gib langsam einen Tropfen der Zellsuspension auf den Schlitten.
    HINWEIS: Markieren Sie die Abwurfstelle am Rand des Schlittens mit einem ethanolresistenten Marker, um die Identifizierung in den folgenden Schritten zu erleichtern.
  11. Lass die Zellen 10 Minuten auf Eis trocknen.
  12. Stelle die Objektträger für 10 Minuten auf einen Inkubator bei 80 °C.
  13. Nehmen Sie die Objektträger mit einer Zange heraus und lassen Sie sie abkühlen.
  14. Untersuchen Sie die Objektträger mit einem Phasenkontrastmikroskop mit einem Objektiv von 10× oder 20×. Bestätigen Sie das Vorhandensein mehrerer gut verteilter Metaphasen-Spreads ohne übermäßige Überlappung.

4. Vorbehandlung des Objektträgers

  1. Bereite Coplin-Gläser für die Waschschritte vor.
    1. Bereiten Sie jedes Reagenz frisch vor: 70 % Essigsäure (40 ml), PBS (40 mL), PBS (45 mL), 70 % Ethanol (40 mL), 85 % Ethanol (40 ml) und 100 % Ethanol (40 mL).
  2. Legen Sie die Glasscheiben für 2 Minuten in 70 % Essigsäure.
  3. Geben Sie die Glasträger 30 Sekunden lang in 40 mL PBS.
  4. Geben Sie die Glas-Objektträger 5 Minuten lang in 45 ml PBS.
  5. Die Glasscheiben nacheinander in 70 %, 85 % und 100 % Ethanol für jeweils 1 Minute dehydrieren.
  6. Lassen Sie die Folien bei RT 10 Minuten an der Luft trocknen.

5. Bereite die Sonde vor.

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet kommerziell erhältliche, locus-spezifische DNA-FISH-Sonden, die sich an eine genomische Region von Interesse hybridisieren.

  1. Wählen Sie eine Sonde, die auf den verstärkten Locus abzielt, der untersucht werden soll. Tauen Sie die Sonde und den Hybridisierungspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers auf. Lass die Sonde vor der Nutzung RT erreichen.
  2. Bereiten Sie für jeden Glasträger eine Sondenmischung vor, die 1 μL Sonde und 4 μL Hybridisierungspuffer enthält.
    HINWEIS: Die optimale Sondenkonzentration kann vom Hersteller und der Sonde abhängen. Die hier angegebene Konzentration wurde gemäß den in dieser Studie verwendeten Sonden optimiert. Optimieren Sie jedoch die Sondenkonzentration für jeden neuen Locus.
  3. Tragen Sie 5 μL des Sonden-/Hybridisierungspuffer-Gemisch auf die Mitte jeder Tropfenstelle auf dem Glasträger auf.
    HINWEIS: Sonden sind lichtempfindlich. Minimieren Sie die Lichteinsetzung während des verbleibenden Verfahrens, indem Sie die Objektträger zwischen den Schritten und während der Verarbeitung anderer Objektträger in einer dunklen Schublade aufbewahren.
  4. Legen Sie vorsichtig einen Deckmantel über die Probe.
  5. Versiegeln Sie die Ränder des Deckmantels mit Gummikleber.
  6. Platzieren Sie die Glasscheiben in eine feuchte Kammer.
  7. Hybridisieren Sie die Sonde gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die Hybridisierung über Nacht (12–18 Stunden) stattfinden lassen.

6. Post-Hybridisierungswashes, Gegenfärbung, Montage und Bildgebung

  1. Bereite Coplin-Gläser für die Waschschritte vor.
    1. Bereiten Sie jedes Reagenz frisch vor: 2× SSC (40 mL), 0,4× SSC (40 mL), 70 % Ethanol (40 ml), 85 % Ethanol (40 ml), 100 % Ethanol (40 mL) und PBS (45 ml).
    2. Bereiten Sie SSC als 20× Fondlösung vor und lagern Sie sie (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0). Zur Herstellung von 1 L lösen Sie 175,3 g NaCl und 88,2 g Natriumcitrat in 1 Liter ultrareines Wasser. Verdünnen Sie den Bestand, um bei Bedarf 2× SSC und 0,4× SSC Arbeitslösungen herzustellen.
  2. Erwärmen Sie die 0,4 × SSC-Lösung in einem Wasserbad auf 72 °C.
  3. Entferne die Glasschlitten aus der feuchten Kammer und entferne vorsichtig den Gummikleber.
  4. Leg die Glasscheiben in 2× SSC für 2 Minuten bei RT. Entferne vorsichtig die Überdeckfolien.
  5. Stellen Sie die Glasscheiben für 2 Minuten in vorgewärmte 0,4× SSC bei 72 °C.
  6. Leg die Glas-Objektträger in 2× SSC für 1 Minute bei RT.
  7. Die Glasscheiben nacheinander in 70 %, 85 % und 100 % Ethanol für jeweils 1 Minute dehydrieren.
  8. Die Folien bei RT 10 Minuten im Dunkeln an der Luft trocknen.
  9. Verdünnen Sie 1 mg/mL DAPI 1:1000 in PBS auf ein Endvolumen von 1 mL.
    HINWEIS: Dieser Aliquot kann bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
  10. Pipettieren Sie 10 μL des verdünnten DAPI auf jeden Glasträger an der markierten Abwurfstelle.
  11. Legen Sie vorsichtig einen Deckdeckel über die Probe, um sicherzustellen, dass die DAPI-Lösung gleichmäßig verteilt wird.
  12. Die Objektträger im Dunkeln 5–10 Minuten ausbrüten.
  13. Leg die Glasfolien 30 Sekunden lang in PBS.
  14. Entfernen Sie die Deckblätter.
  15. Leg die Glasfolien für 2 Minuten in PBS auf.
  16. Dehydrieren Sie die Glasscheiben, indem Sie sie kurz in 70 %, 85 % und 100 % Ethanol für jeweils etwa 10 Sekunden tauchen.
  17. Die Folien bei RT 10 Minuten im Dunkeln an der Luft trocknen.
  18. Fügen Sie jedem Glasträger 15 μL Montagemedium hinzu und legen Sie dann einen Deckmantel darauf.
  19. Lassen Sie das Montagemedium gleichmäßig verteilt und tupfen Sie dann vorsichtig überschüssiges Material ab.
  20. Versiegeln Sie die Ränder des Deckzettels mit Nagellack.
  21. Lass den Nagellack 15 Minuten bei RT im Dunkeln trocknen.
    PAUSE: Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C für die Langzeitlagerung.
  22. Stell dir die Dias vor.
    HINWEIS: Die Bilder wurden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einem 60× Ölimmersionsobjektiv aufgenommen.
  23. Sammeln Sie mehrere Z-Stacks für jeden Fluoreszenzkanal, um das Signal über die gesamte Tiefe der Metaphasenverteilung zu erfassen.
  24. Dekonvimplizieren Sie die Bildstapel mithilfe eines Maximum-Likelihood-Schätzungsalgorithmus, um die Signalschärfe zu verbessern und unscharfe Fluoreszenz zu reduzieren.
  25. Verarbeiten und analysieren Sie die endgültigen Bilder in ImageJ und wählen Sie die optimale Brennebene für jede Metaphasenverteilung aus, bevor die nachgelagerte Analyse erfolgt.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll (Abbildung 1B) liefert saubere, gut dispersierte, intakte Metaphasenchromosomen, die für zytogenetische Analysen geeignet sind, wobei Chromosomen und DNA-FISH-Signale durch die Fluoreszenzmikroskopie deutlich sichtbar sind. Die Verwendung eines Hellfeld-/Phasenkontrastmikroskops bei niedriger Vergrößerung (10× oder 20× ist ein wichtiger Qualitätskontrollschritt, um zu überprüfen, ob die Kerne geplatzt sind und die Chromosomen sich verteilt h...

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Diskussion

Trotz ihrer gut etablierten Vorteile sind DNA-FISH-Metaphasen-Spreads in der Ära der WGS wenig genutzt. Die physikalische Organisation der amplifizierten DNA ist funktionell bedeutsam, da sie das nachgelagerte biologische Verhalten und die therapeutischeReaktion beeinflussen kann. Fokal amplifizierte Onkogene können auf ecDNA oder innerhalb von HSRs existieren...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von NIH R00HG011467 und CPRIT RR23004 an G.S.E. unterstützt. Die Bildgebung für dieses Projekt wurde vom Integrated Microscopy Core am Baylor College of Medicine mit Finanzierung des NIH unterstützt (P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414). Die Autoren danken Dr. Pawel Stankiewicz für seinen frühen Rat. Die Autoren danken außerdem Dr. Paul Mischel (Stanford University) für die Bereitstellung der GBM39ec- und GBM39hsr-Zelllinien.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15-mL Konische Zentrifugejede QuelleN.A.Zentrifugation. 
15-mL Konische Röhrchenjede QuelleN.A.Zellsammlung.
200 Proof Ethanoljede QuelleN.A.Waschschritte. 
Eisessig, glazial, 99,7%Millipore Sigma695092Carnoys-Fixierungsmittel und Waschschritte der Folie.
Antifade-MontagemediumFisher ScientificNC9265087Folienmontage nach abgeschlossener Folienvorbereitung
Biologischer Sicherheitsschrank mit Vakuumauslassjede QuelleN.A.Chemische Lagerung.
Colcemid (N-Methyl-N-deacetyl-Colchicin)Millipore Sigma10295892001Bindet Tubulin, stoppt Zellen in der Metaphase.
Coplin-Gläserjede QuelleN.A.Waschschritte. 
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol)Millipore SigmaD8417-1MGFluoreszierende DNA-Färbung.
EGFR/CON7 FISH-Sonde Empire GenomicsEGFR-CHR07Lokusspezifische fluoreszierende Sonde. 
Elmer's Gummikleberjede QuelleN.A.Hält den Objektträger während der nächtlichen Sondenhybridisierung in Position.
Ethanolbeständiger Permanentmarkerjede QuelleN.A.Folienbeschriftung.
Fluoreszenzmikroskopjede QuelleN.A.Folienabbildung. 
Glas-Deckglas, 22 x 22mmThermoFisher50-143-780Sondenhybridisierung auf dem Objektträger.
Glas-Objektträger, vorgereinigtVWR48311-703Um Metaphase-Spreads fallen zu lassen und DNA-FISH durchzuführen.
Befeuchteter CO2-Inkubatorjede QuelleN.A.Lebendzell-Inkubation.
HybridisierungspufferEmpire GenomicsHyb-BufferPuffer, der mit der Sonde verwendet wird. 
Eiswannejede QuelleN.A.Carnoys-Fixierungsmittel kalt halten. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640GZellen vor der Fixierung anschwellen. 
Methanol, 99,9%, HPLC-QualitätMillipore Sigma1060351000Für Carnoys-Fixierungsmittel. 
Mikrozentrifugejede QuelleN.A.Zentrifugation. 
Mikrozentrifugenröhrchenjede QuelleN.A.Für Zellen während der Fixierung und für die Sondenvorbereitung. 
MYC / SE 8 SondeLeicaKI-10106Lokusspezifische fluoreszierende Sonde. 
PBS, pH 7,4Gibco10010-023Waschschritte. 
Phasenkontrastmikroskopjede QuelleN.A.Bildgebung von Metaphase-Spreads unmittelbar nach dem Ablegen
Pipettenspitzenjede QuelleN.A.Pipettieren.
NatriumchloridMillipore SigmaS9888Für SSC-Puffer.
NatriumcitratMillipore Sigma567446Für SSC-Puffer.
Steriles ultrapures Wasserjede QuelleN.A.Waschschritte. 
ThermoBrite programmierbarer Folieninkubatorjede QuelleN.A.Folieninkubation.
Zangejede QuelleN.A.Für Folienwaschschritte. 
Wasserbadjede QuelleN.A.Für KCl-Inkubation. 

Referenzen

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