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TCR-Signalstärke und -dauer bei der Aktivierung und Differenzierung primärer mausischer CD8+-T-Zellen: Ein standardisierter In-vitro-Ansatz

83 Ansichten

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DOI:

10.3791/71979

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25. August 2026

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1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine systematische Methode zur Aktivierung primärer, naiver CD8+ T-Zellen der Maus unter Verwendung eines gestuften TCR-Stimulationsansatzes, der eine umfassende Analyse der Proliferation, Aktivierung und Zytokinproduktion von CD8+ T-Zellen über verschiedene TCR-Signalintensitäten hinweg ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Intensität und Dauer des T-Zell-Rezeptor-(TCR-)Signals sind entscheidende Faktoren für die Aktivierung, Proliferation und funktionale Differenzierung von CD8⁺-T-Zellen. Standardisierte In-vitro-Modelle, die systematisch vergleichen, wie unterschiedliche TCR-Signalzusätze das Schicksal der T-Zellen beeinflussen, sind jedoch begrenzt. Diese Studie stellt eine reproduzierbare Methode zur In-vitro-Aktivierung primärer Maus-T-Zellen mithilfe von plattengebundenem Anti-CD3 und löslichem Anti-CD28, ergänzt durch Interleukin-2 (IL-2), vor und untersucht, wie die Modulation der Anti-CD3-Konzentration (Signalstärke) und der Stimulationsdauer (Signaldauer) die Aktivierungsresultate der T-Zellen beeinflusst. Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung naiver T-Zellen aus C57BL/6-Mäusen, gefolgt von einer Stimulation über einen Bereich von Anti-CD3-Konzentrationen (0,1–10 µg/mL) und Dauern (6–48 h). Wir führten eine Durchflusszytometrie-Analyse durch, um frühe, durch den TCR induzierte Signale über das intrazelluläre phosphorylierte S6-Ribosomenprotein (p-S6) als Messgröße für die Aktivität des mechanistischen Zielmoleküls von Rapamycin-Komplex 1 (mTORC1) zu bewerten, und analysierten anschließend downstream liegende Ereignisse, einschließlich Oberflächenaktivierungsmarker (CD69, CD25, ICOS, PD-1), zelluläre Proliferation mittels violettem Proliferationsmarkierungsfarbstoff (CTV)-Verdünnung sowie die Expression von Effektor-Molekülen (Granzym B, TNF-α) als Indikatoren der funktionalen Differenzierung. Die Methode bietet eine klare, schrittweise visuelle Anleitung zur Durchführung reproduzierbarer T-Zell-Stimulationen und ermöglicht es Forschenden, zu untersuchen, wie spezifische TCR-Signalparameter die Schicksalsentscheidungen der T-Zellen steuern. Dieser Ansatz unterstützt nicht nur mechanistische Studien zur T-Zell-Aktivierung und -Differenzierung, sondern bietet auch eine Plattform zur Optimierung der T-Zell-Bedingungen für adoptive Immuntherapien und In-vitro-Priming-Assays. Durch die Kombination einer Videodemonstration mit einer detaillierten Protokollbeschreibung wird die methodische Transparenz und Reproduzierbarkeit in der T-Zell-Immunologie-Forschung verbessert.

Einleitung

T-Zellen sind unverzichtbar für schützende Immunantworten gegen Krankheitserreger und Tumore. Naive T-Zellen werden aktiv in einem Ruhezustand gehalten, um ihr langfristiges Überleben und ihre Persistenz zu bewahren1. Nach Antigenstimulation verlassen T-Zellen den Ruhezustand, durchlaufen eine klonale Expansion und eine Effektor-Differenzierung2. Die T-Zell-Rezeptor-(TCR-)Signalübertragung stellt den zentralen Prozess zur Initiierung und Regulation adaptiver Immunantworten dar3. Nach spezifischer Erkennung von auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen (APCs) präsentierten Peptid–major histocompatibility complex-(pMHC)-Molekülen wird eine Kaskade von Signalevents ausgelöst, die die klonale Expansion und funktionelle Differenzierung der T-Zellen vorantreibt4,5,6.

Die Intensität der TCR-Stimulation, bestimmt durch Schlüsselfaktoren wie Antigenaffinität, Avidität und Konzentration, spielt eine entscheidende Rolle bei der Steuerung des Ausmaßes der T-Zell-Aktivierung, dem Erwerb effektorischer Funktionen sowie der Differenzierungsrichtung hin zu spezifischen effektorischen oder Gedächtnis-T-Zell-Subtypen7,8,9. Aktuelle In-vitro-Modelle zur Untersuchung der TCR-abhängigen T-Zell-Aktivierung verwenden überwiegend platten- oder kugelgebundene anti-CD3- und anti-CD28-Antikörper, die gleichzeitig sowohl die TCR-Ligation als auch kostimulatorische Signale bereitstellen10,11. Obwohl solche Systeme weit verbreitet sind, verwenden sie typischerweise lediglich eine einzige, oft saturierende Konzentration des anti-CD3-Antikörpers, wodurch nur ein binärer Alles-oder-Nichts-Vergleich der T-Zell-Aktivierung möglich ist, anstatt den dynamischen Bereich der TCR-Signalstärken abzubilden, der mit einem titrierten Stimuli-Gradienten erreichbar wäre12,13.

Das hier beschriebene Protokoll stellt ein standardisiertes und reproduzierbares In-vitro-System bereit, um systematisch zu untersuchen, wie gestufte TCR-Signalstärken die Aktivierung, Proliferation und funktionellen Phänotypen primärer muriner CD8+-T-Zellen beeinflussen, unter Verwendung titrierter Anti-CD3-Gradienten (0,1–10 µg/mL) und eines konstanten Anti-CD28 (1 µg/mL). Dieser Ansatz basiert auf der multiparametrischen Durchflusszytometrie, die sowohl upstream liegende Signalwege – erfasst über das intrazelluläre phosphorylierte S6-Ribosomenprotein (p-S6) als Messgröße für die Aktivität des mechanistischen Zielmoleküls von Rapamycin-Komplex 1 (mTORC1) – als auch downstream liegende zelluläre Effekte erfasst, einschließlich der Proliferation, verfolgt mittels CTV-Verdünnung, Oberflächenmarker der Aktivierung (CD69, CD25, induzierbares T-Zell-Kostimulationsmolekül [ICOS], programmiertes Zelltodprotein 1 [PD-1]), sowie der Expression von Effekormolekülen (Granzym B, Tumornekrosefaktor-alpha [TNF-α]), über einen Zeitraum von 6 bis 48 h.

Unser Protokoll verwendet einen Gradienten der Konzentration plattengebundener Anti-CD3-Antikörper, um die Stimulationsintensität präzise zu modulieren und dadurch die unterschiedliche TCR-Bindungsavidität unter physiologischen Bedingungen nachzuahmen. Die Methode erreicht eine hohe Effizienz bei der TCR-Vernetzung und eine robuste Aktivierung primärer ruhender T-Zellen. Das standardisierte Beschichtungsverfahren gewährleistet eine gleichmäßige Verteilung der Antikörper auf der Plattenoberfläche, was zu einer konsistenten Stimulation aller Zellen innerhalb derselben Charge und einer hervorragenden experimentellen Reproduzierbarkeit führt. Dieses Format bietet einen kostengünstigen und einfach handhabbaren Ansatz zur T-Zell-Aktivierung.

Es sollten jedoch bestimmte Grenzen dieses Ansatzes anerkannt werden. Die durch anti-CD3/CD28-Antikörper vermittelte Stimulation unterscheidet sich deutlich vom physiologischen Kontext in vivo. Obwohl experimentelle Methoden, die ausschließlich agonistische anti-CD3- und anti-CD28-Antikörper verwenden, um die T-Zell-Aktivierung zu bewerten, effektive Aktivierungsparameter liefern können, gelingt es ihnen nicht, die Interaktionen zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen sowie die kostimulatorische Mikroumgebung, die unter physiologischen Bedingungen auftreten, vollständig nachzubilden14.

Trotz dieser Einschränkungen bietet dieses Protokoll eine systematische und reproduzierbare Plattform, die als wertvolles und zugängliches Werkzeug zur Untersuchung der T-Zell-Antworten in Abhängigkeit von der TCR-Signalstärke dient und komplexere antigenspezifische Modelle ergänzen kann.

Protokoll

Alle Tierversuche in dieser Studie wurden von dem Ausschuss für Tierversuche und Tierschutz der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt.

1. Herstellung der Reagenzien und Platten

  1. Anti-CD3 für die Plattenbeschichtung in steriler PBS bei 0,1, 0,5, 1, 5 und 10 µg/mL vorbereiten.
  2. 50 µL der Anti-CD3-Beschichtungslösung pro Vertiefung in flachbodige 96-Loch-Platten geben.
  3. Platten mit Verschlussfolie abdichten und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  4. Die Beschichtungslösung absaugen und jede Vertiefung vor der Zellzugabe zweimal mit jeweils 200 µL steriler PBS waschen.

2. Isolierung von naiven CD8+-T-Zellen aus der Mausmilz

  1. Wählen Sie 6–8 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse (bezogen von Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) aus und töten Sie diese durch CO2 Inhalation gefolgt von Halswirbelverrenkung. Die Mäuse werden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen bei einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Wechselzyklus mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Pro unabhängigen Versuch werden mindestens 3 Mäuse verwendet.
  2. Schneiden Sie vorsichtig mit einer chirurgischen Schere das Peritoneum ein, um die Milz freizulegen, fassen Sie die Milz mit einer Pinzette an, entnehmen Sie sie und legen Sie sie in eine Sammelschale, die mit vorab gekühltem RPMI 1640 ergänzt um 2 % fetalen Kälberserum (FBS) (R2) gefüllt ist. Bewahren Sie die Schale bis zur Dissoziation auf Eis auf.
    HINWEIS: Sammeln Sie alle Tierkadaver und Zellkulturabfälle in dafür vorgesehenen Bioabfallsäcken und autoklavieren Sie diese bei 121 °C für 20 min vor der Entsorgung.
  3. Entfernen Sie die Milz aus der Sammelschale und überführen Sie sie in eine 60-mm-Schale, die 3 mL von 1 × Ammonium-chlorid-Kalium-(ACK)-Lysispuffer
  4. Bereiten Sie eine Einzelzell-Suspension vor, indem Sie die Milz vorsichtig durch ein 70 µm Zellfilter mit dem Kolben einer 3-mL-Spritze
  5. Inkubieren Sie die Suspension 1 min bei Raumtemperatur (RT) und geben Sie dann 3 mL vorgekühltes R2-Medium zu, um den Ammonium-Chlorid-Kalium-(ACK)-Lysepuffer zu neutralisieren.
  6. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-mL-Konischgefäß und zentrifugieren Sie bei 500 × g 5 min bei 4 °C.
  7. Nach der Zentrifugation den Überstand abpipettieren und das Pellet in 10 mL Durchflusszytometrie-Färbepuffer (PBS mit 2 % FBS) resuspendieren.
  8. Filtrieren Sie die Suspension durch eine 70 µm Zellfilter in ein neues 15-mL-Konischgefäß überführen und erneut bei 500 zentrifugieren × g 5 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Natriumazid sollte aus dem Färbepuffer für die Durchflusszytometrie weggelassen werden, um die Zellviabilität für funktionelle Assays zu erhalten. Alle Proben sollten bei 4 °C und sofort analysiert.
  9. Überschüssige Flüssigkeit abpipettieren und das Zellpellet in 200 µL pro Mausmilz: Cocktail aus biotinylierten Antikörpern (gegen CD16/32 (Fc-Block), TER-119, CD19, CD4, B220, NK1.1, Ly-6G, CD11b, CD11c, CD49b, CD44 und F4/80)
  10. 25 Minuten auf Eis inkubieren, dabei alle 5 Minuten das Gefäß vorsichtig umdrehen, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.
  11. Die Zellen mit einem großen Volumen an Durchflusszytometrie-Färbepuffer waschen, bei 500 × g zentrifugieren × g 5 min lang und verwerfen Sie den Überstand.
  12. Das Pellet in dem gleichen Volumen an Durchflusszytometrie-Färbepuffer resuspendieren, das auch für die biotinylierte Antikörpercocktail verwendet wurde, magnetische Perlen, die mit Streptavidin beschichtet sind, in der halben Menge hinzufügen und 15 Minuten auf Eis inkubieren, wobei alle 5 Minuten eine sanfte Inversion des Röhrchens erfolgt, um eine vollständige Durchmischung sicherzustellen.
  13. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, stellen Sie es für 2–3 Minuten auf einen Magnethalter und pipettieren Sie vorsichtig den Überstand (angereicherte naive CD8+ T-Zellen in ein neues kegelförmiges 15-mL-Röhrchen.
  14. Die gesammelten Zellen einmal mit Durchflusszytometrie-Färbepuffer waschen, erneut bei 500 × g zentrifugieren × g für 5 min.
  15. Den Überstand verwerfen und das Pellet in RPMI 1640, ergänzt mit 10 % FBS (R10), für nachfolgende Anwendungen resuspendieren.

3. Violet-Färbung mit Proliferationsmarkierungsfarbstoff (CTV) zur Verfolgung der Proliferation

  1. Bereiten Sie unmittelbar vor der Verwendung 2 × frische CTV-Arbeitslösung (10 µM) vor. Mischen Sie die 5 mM CTV-Stammlösung (in Dimethylsulfoxid [DMSO]) gründlich durch Vortexen und verdünnen Sie sie anschließend mit steriler PBS, um eine Endkonzentration von 10 µM zu erhalten.
    ACHTUNG: Handhaben Sie die CTV-Stammlösung (in DMSO hergestellt) mit Nitrilhandschuhen in einem Abzug, da DMSO die Hautaufnahme toxischer Substanzen fördert. Vermeiden Sie Einatmen und Hautkontakt.
  2. Resuspendieren Sie die Hälfte der isolierten naiven CD8+-T-Zellen in vorab gekühlter PBS mit einer Dichte von 8 × 107 Zellen/mL.
  3. Geben Sie rasch ein gleiches Volumen der 2 × CTV-Arbeitslösung (10 µM) zur Zellsuspension hinzu und mischen Sie gut durch Pipettieren, um eine Endkonzentration von 5 µM CTV zu erreichen.
  4. Incubieren Sie die Zellen 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln, wobei die Röhrchen alle 5 min vorsichtig umgedreht werden, um eine gleichmäßige Durchmischung sicherzustellen.
  5. Geben Sie 5 Volumina Kulturmedium (mit mindestens 10 % FBS) zu den Zellen und inkubieren Sie 5 min auf Eis, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen.
  6. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 min bei 500 × g und resuspendieren Sie das Pellet in frisch vorgewärmtem vollständigem Medium R10, ergänzt mit anti-CD28 (Endkonzentration: 1 µg/mL) und IL-2 (Endkonzentration: 10 ng/mL).
  7. Geben Sie 250 µL Zellsuspension (mit 6 × 105 Zellen) in jede Vertiefung der vorbeschichteten 96-Well-Platten.
  8. Kultivieren Sie die Zellen bis zu 48 h bei 37 °C mit 5 % CO₂.

4. Nachweis von CTV mittels Durchflusszytometrie

  1. Sammeln Sie die Zellen zu den Zeitpunkten 6, 36 und 48 h in einer 96-Well-Rundbodenplatte. Zentrifugieren Sie bei 500 × g 5 min inkubieren und zweimal mit Durchflusszytometrie-Färbepuffer waschen.
  2. Für die Oberflächenfärbung inkubieren Sie die Zellen mit 50 µL einer Antikörpercocktail-Lösung mit Anti-CD8, einem fixierbaren Viabilitätsfarbstoff und Anti-CD44 für 30 min auf Eis im Dunkeln.
    HINWEIS: Sammeln Sie alle Überstände, die fluorophor-markierte Antikörper enthalten, in dafür vorgesehenen Abfallbehältern, die zur Deskontamination mit 0,5 % Natriumhypochlorit versetzt wurden, und entsorgen Sie sie gemäß den institutionellen Richtlinien für biohazardösen Abfall.
  3. Die Zellen zweimal mit Durchflusszytometrie-Färbepuffer waschen und in 200 µL von Durchflusszytometrie-Färbepuffer für die Aufnahme am Durchflusszytometer
  4. Proben auf einem Durchflusszytometer mit drei Lasern erfassen. Einzelfarben-Kontrollröhren mit gefärbten Zellen vorbereiten, um Kompensationsparameter einzustellen.
  5. Wenden Sie die folgende Gating-Strategie an: Ausschluss von Trümmern durch Gating nach Forward-Scatter (FSC) im Vergleich zu Side-Scatter (SSC), Eliminierung von Doubletten durch Singlett-Gating und Auswahl lebensfähiger (fixierbares Vitalitätsfarbstoff-negativer) CD8-positive T-Zellen.+ T-Zellen zur Analyse.
  6. Sammeln Sie mindestens 1 × 104 gegatter CD8+ T-Zell-Ereignisse pro Probe. Analysieren Sie die Daten mithilfe der Durchflusszytometrie-Analyse-Software und berechnen Sie den Anteil der Zellen, die eine oder mehrere Teilungen durchlaufen haben, unter Verwendung des Proliferationsanalyse-Moduls.

5. Oberflächen- und intrazelluläre Färbung für Aktivierung und Signalübertragung

  1. Resuspendieren Sie eine weitere Hälfte der naiven CD8+-T-Zellen in R10, ergänzt mit Anti-CD28 bei 1 µg/mL und IL-2 bei 10 ng/mL, auf eine Konzentration von 2,4 × 106 Zellen/mL.
  2. Geben Sie 250 µL der Zellsuspension (6 × 105 Zellen) in jedes Loch der vorbeschichteten 96-Loch-Platten.
  3. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ für bis zu 48 h.
  4. Zu den angegebenen Zeitpunkten (6, 10, 12, 24 und 36 h) sammeln Sie die Zellen in einer 96-Loch-Rundbodenplatte.
    HINWEIS: Der 6-h-Zeitpunkt erfasst frühe TCR-Signalwege (phospho-S6) und CD69; letzteres wird zusätzlich zu den Zeitpunkten 12, 24 und 36 h analysiert, um die vollständige Kinetik abzubilden. CD25, PD-1 und ICOS werden zu den Zeitpunkten 10, 12, 24 und 36 h überwacht; der 48-h-Zeitpunkt ist für die Proliferationsanalyse (Abschnitt 4) und die Zytokindetektion (Abschnitt 6) vorgesehen.
  5. Zentrifugieren Sie bei 500 × g für 1 Minute und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 µL Durchflusszytometrie-Färbepuffer.
  6. Zentrifugieren Sie bei 500 × g für 1 Minute und aspirieren Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen zweimal mit jeweils 200 µL Durchflusszytometrie-Färbepuffer.
  7. Für die Oberflächenfärbung inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis im Dunkeln mit 50 µL einer Antikörpercocktail-Lösung, die Anti-CD69, Anti-CD25, Anti-CD8, Anti-PD-1, Anti-ICOS und eine fixierbare Vitalitätsfarbe enthält.
  8. Waschen Sie die Zellen dreimal mit Durchflusszytometrie-Färbepuffer, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
  9. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 µL 1 % Paraformaldehyd und fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    ACHTUNG: Führen Sie alle Schritte, die Paraformaldehyd beinhalten, in einem Abzug durch, um das Einatmen von Dämpfen zu vermeiden. Sammeln Sie alle flüssigen Abfälle, die Fixiermittel enthalten, in einem separaten Behälter, der für die Entsorgung gefährlicher Chemikalien gekennzeichnet ist.
  10. Zentrifugieren Sie bei 500 × g für 1 Minute und waschen Sie einmal mit Durchflusszytometrie-Färbepuffer.
  11. Temperieren Sie den 5 × Lyse/Fixier-Puffer vorab auf Raumtemperatur und stellen Sie eine 1 × Arbeitslösung mit destilliertem Wasser her.
  12. Geben Sie 200 µL der Arbeitslösung (1 × Lyse/Fixier-Puffer) in jedes Loch und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  13. Waschen Sie zweimal mit 1 × Permeabilisierungs/Waschpuffer für die Phospho-Epitop-Färbung. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 × Permeabilisierungs/Waschpuffer für die Phospho-Epitop-Färbung und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  14. Zentrifugieren Sie bei 500 × g für 1 Minute und verwerfen Sie die Überstände.
  15. Für die intrazelluläre Färbung inkubieren Sie die Zellen 60 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit 50 µL eines Antikörpercocktails, der Anti-p-S6 enthält.
  16. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 × Permeabilisierungs/Waschpuffer für die Phospho-Epitop-Färbung.
  17. Für die Sekundärantikörper-Färbung inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis im Dunkeln mit 50 µL eines Antikörpercocktails, der einen Anti-Kanin-Sekundärantikörper enthält.
  18. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 × Permeabilisierungs/Waschpuffer für die Phospho-Epitop-Färbung und einmal mit Durchflusszytometrie-Färbepuffer.
  19. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 µL Durchflusszytometrie-Färbepuffer und messen Sie die Proben am selben Durchflusszytometer.
  20. Wenden Sie die gleiche Gating-Strategie wie in Abschnitt 4.5 beschrieben an und erfassen Sie mindestens 1 × 104 CD8+-T-Zellen pro Probe.
  21. Analysieren Sie die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) für jeden Marker mithilfe einer Software zur Durchflusszytometrie-Analyse.

6. Intrazelluläre Zytokinblockade und Nachweis

  1. 5 h vor der Ernte 100 µL frisches R10 pro Vertiefung zugeben, ergänzt mit PMA (50 ng/mL), Ionomycin (1 µg/mL), Proteintransportinhibitoren (Monensin) (1:1000) und Proteintransportinhibitoren (brefeldin A-basiert) (1:1000). Vorsichtig mischen und die Platten zurück in den 37 °C-Inkubator stellen, um die Zytokinausschüttung zu blockieren und die intrazelluläre Akkumulation zu ermöglichen.
  2. Zum gewünschten Zeitpunkt die Zellen in einer 96-Loch-Rundbodenplatte sammeln.
  3. Bei 500 × g für 1 min zentrifugieren und den Zellpellet in 200 µL Durchflusszytometrie-Färbepuffer resuspendieren.
  4. Bei 500 × g für 1 min zentrifugieren und das Überstand entfernen. Zweimal mit jeweils 200 µL Durchflusszytometrie-Färbepuffer waschen.
  5. Für die Oberflächenmarkierungsfärbung die Zellen mit 50 µL einer Antikörpercocktaillösung, enthaltend Anti-CD44, Anti-CD8 und ein fixierbares Vitalitätsfarbstoff, 30 min auf Eis im Dunkeln inkubieren.
  6. Dreimal mit Durchflusszytometrie-Färbepuffer waschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen.
  7. Die Zellen durch Zugabe von 200 µL Fixierungs- und Permeabilisierungslösung permeabilisieren und 30 min auf Eis im Dunkeln inkubieren.
    ACHTUNG: Alle Schritte, die die Fixierungs-/Permeabilisierungslösung (enthaltend Paraformaldehyd) beinhalten, im Abzug durchführen, um das Einatmen von Dämpfen zu vermeiden. Die gesamte flüssige Abfälle, die Fixiermittel enthalten, in einem separaten Behälter sammeln, der für die Entsorgung gefährlicher Chemikalien gekennzeichnet ist.
  8. Bei 500 × g für 1 min zentrifugieren und den Überstand in den gefährlichen chemischen Abfall entsorgen.
  9. Die Zellen dreimal mit 1 × Permeabilisierungs-/Waschpuffer waschen.
  10. Für die intrazelluläre Zytokinfärbung mit 50 µL eines Antikörpercocktails, enthaltend Anti-TNF-α und Anti-Granzym B, 30 min auf Eis im Dunkeln inkubieren.
  11. Die Zellen dreimal mit 1 × Permeabilisierungs-/Waschpuffer waschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, und abschließend einmal mit Durchflusszytometrie-Färbepuffer waschen.
  12. Den Zellpellet in 200 µL Durchflusszytometrie-Färbepuffer resuspendieren und die Proben am selben Durchflusszytometer erfassen.
  13. Die gleiche Gating-Strategie anwenden, wie in Abschnitt 4.5 beschrieben, und mindestens 1 × 104 CD8+ T-Zellen pro Probe sammeln. Den Prozentsatz positiver Zellen und den MFI für jeden Marker mithilfe einer Software zur Durchflusszytometrie-Analyse auswerten.

Ergebnisse

Um die Auswirkungen verschiedener anti-CD3-Stimulationsintensitäten auf die T-Zell-Aktivierung zu untersuchen, isolierten wir murine Milzzellen und reinigten CD8+ T-Zellen für die Kultivierung in vitro, anschließend führten wir Aktivierungsassays für T-Zellen und die Durchflusszytometrie-Analyse durch. Zur Datenanalyse wurden Lymphozyten zunächst durch eine Kombination aus FSC-A und SSC-A selektiert, gefolgt von der Selektion einzelner Zellen mittels FSC-H und FSC-W sowie SSC-H mit SSC-W. Lebende CD8+ T-Zellen wurden anschließend mithilfe von CD8 in Kombination mit einer fixierbaren Vitalitätsfarbe für die nachgeschaltete Analyse selektiert (Abbildung 1A).

Um zu überprüfen, ob das plattengebundene Antikörpersystem T-Zellen in vitro effektiv aktiviert, untersuchten wir die Phosphorylierung des ribosomalen Proteins S6 (p-S6), ein etablierter downstream-Lesepunkt der mTORC1-Aktivität und ein Konvergenzpunkt der PI3K-mTOR- und MEK-ERK-MAPK-Signalwege, die auf die TCR-Signalübertragung folgen15,16. In Übereinstimmung mit diesen Befunden beobachteten wir sechs Stunden nach Stimulation eine dosisabhängige Zunahme der p-S6-Spiegel bei steigenden Anti-CD3-Konzentrationen (0,1–10 µg/mL) (Abbildung 1B), was bestätigt, dass das plattengebundene Anti-CD3-System die TCR-mTORC1-S6-Achse in einer signalstärkeabhängigen Weise aktiviert. Dieses frühe Phosphorylierungsereignis entspricht der Aktivierung mTORC1-abhängiger Stoffwechselwege, die die anschließende Proliferation und Effektor-Differenzierung der T-Zellen unterstützen.

Die Zellproliferation wurde mittels CTV-Verdünnungs-Durchflusszytometrie nach TCR-Stimulation mit gestuften anti-CD3-Konzentrationen (0,1–10 µg/mL) zu drei Zeitpunkten nach der Stimulation bewertet: 6, 36 und 48 h. Zum frühen Signalzeitpunkt von 6 h wurde unter allen Stimulationsbedingungen lediglich eine minimale proliferative Verdünnung beobachtet. Nach 36 h hatte die Gruppe mit niedriger Dosierung (0,1 µg/mL) immer noch keine nennenswerte klonale Expansion induziert, während die Gruppen mit mittlerer und hoher Dosierung gut abgegrenzte CTV-Verdünnungsspitzen zeigten (5 und 10 µg/mL), was den Beginn des Zellzyklusfortschritts anzeigt. Nach 48 h waren die unterschiedlichen proliferativen Phänotypen über die Stimulationskonzentrationen hinweg am deutlichsten ausgeprägt. Schwache TCR-Stimulation (0,1 µg/mL) führte nur zu 1,25 % proliferierenden Zellen und einer einzigen unverdünnten CTV-Spitze, was auf eine suboptimale Aktivierung hindeutet. Mittlere Stimulation (1–5 µg/mL) induzierte drei abgegrenzte Teilungsspitzen, wobei die proliferierenden Anteile von 70,8 % auf 84,0 % anstiegen. Starke Stimulation (10 µg/mL) erreichte den höchsten Anteil proliferierender Zellen (89,5 %), zeigte die maximale Anzahl an Teilungsgenerationen und demonstrierte den Nachweis einer Proliferationssättigung (Abbildung 2).

Als Nächstes untersuchten wir die Expression früher Aktivierungsmarker, CD69 und CD25. Bemerkenswerterweise zeigte die vorliegende Studie eine schnelle und dosisabhängige Hochregulation der CD69-Expression, basierend auf der medianen Fluoreszenzintensität (MFI). Unter mittlerer und starker Stimulation (5 und 10 µg/mL) stieg CD69 bereits nach 24 h schnell an, gefolgt von einem allmählichen Rückgang zwischen 24 und 36 h. Unter schwacher Stimulation (0,1, 0,5 und 1 µg/mL) hingegen stieg CD69 während des gesamten Stimulationszeitraums kontinuierlich an. Das oben beschriebene kinetische Expressionsprofil von CD69 entspricht seiner Rolle als früher Marker der T-Zell-Aktivierung (Abbildung 3A)17. Interessanterweise beobachteten wir, dass die Expression von CD25 in dosis- und zeitabhängiger Weise progressiv anstieg (Abbildung 3B). In Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen erfolgte die Hochregulation von CD25 langsamer als die von CD69, insbesondere bei optimaler Stimulation18,19.

Um den regulatorischen Einfluss der Stärke der TCR-Stimulation auf die Expression von inhibitorischen Rezeptoren und kostimulatorischen Molekülen in CD8+-T-Zellen weiter zu untersuchen, analysierten wir die Expressionsniveaus von PD-1 und ICOS. Die induzierbare Expression von PD-1 setzt eine intensive TCR-Stimulation voraus. In der Gruppe mit schwacher Stimulation (0,5–1 µg/mL) wurde PD-1 während des gesamten Stimulationszeitraums nur in geringem Maß exprimiert. Im Gegensatz dazu stieg die Expression von PD-1 in der Gruppe mit mittlerer bis hoher Stärke der Stimulation (5–10 µg/mL) ab 10 Stunden allmählich an und erreichte nach 36 Stunden ein Maximum (Abbildung 4A). Auch die Expression von ICOS stieg entsprechend der zunehmenden Stärke der Stimulation an und erreichte bei 5–10 µg/mL nach 36 Stunden ihr Maximum (Abbildung 4B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine intensive TCR-Stimulation die Expressionsniveaus von PD-1 und ICOS signifikant hochregulieren kann.

Abschließend untersuchten wir die funktionelle Kapazität stimulierter T-Zellen nach erneuter Stimulation mit PMA und Ionomycin 24 h und 48 h nach der Initialstimulation. Nach 24 h quantifizierten wir die Produktion von TNF-α und Granzym B und beobachteten, dass die Frequenzen von TNF-α+-, Granzym B+- und TNF-α+Granzym B+-Zellen schrittweise in einer anti-CD3-dosisabhängigen Weise anstiegen (Abbildung 5A, B). Entsprechend zeigte auch der MFI von TNF-α und Granzym B eine konzentrationsabhängige Zunahme und erreichte unter starker Stimulation (10 µg/mL) ein Maximum (Abbildung 5C), was einer dosisabhängigen frühen Effektor-Differenzierung entspricht, die durch die Stärke des TCR-Signals gesteuert wird. Nach 48 h kehrte sich dieses Muster jedoch deutlich um. Höhere Konzentrationen von anti-CD3 reduzierten signifikant die Anteile von TNF-α+Granzym B+-Zellen und downregulierten die Expressionsniveaus der Effektor-Moleküle pro Zelle.

Alle gezeigten Daten sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. Die statistischen Analysen wurden mittels einfaktorieller oder zweifaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Post-hoc-Test durchgeführt; die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Zellviabilität überstieg durchgängig 90 %, und pro Probe wurden mindestens 1 × 104 lebende CD8+ T-Zell-Ereignisse erfasst.

Daten der Durchflusszytometrie: Gating-Diagramme der Zellpopulationen, Histogramme zur Proteinquantifizierung und Balkendiagramm.
Abbildung 1: In-vitro-Aktivierung und durchflusszytometrische Analyse von CD8+-T-Zellen. (A) Reine CD8+-T-Zellen, isoliert aus murinen Milzzellen, wurden in vitro mit variierenden Konzentrationen von Anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) in Kombination mit einer festen Konzentration von Anti-CD28 (1 µg/mL) über einen Zeitraum von 6 bis 48 Stunden stimuliert und anschließend hinsichtlich ihrer zellulären Aktivierung durchflusszytometrisch analysiert. Zelltrümmer wurden durch Gating auf Forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) ausgeschlossen, Doppelzellen mittels Singulett-Gating eliminiert, und schließlich wurden lebensfähige, fixierbare Viabilitätsfarbstoff-negative CD8+-T-Zellen für nachfolgende Analysen selektiert. (B) Phosphorylierung des ribosomalen Proteins S6 (p-S6) in CD8+-T-Zellen 6 Stunden nach Stimulation mit den angegebenen Konzentrationen von Anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) sowie konstantem Anti-CD28 (1 µg/mL). Repräsentatives Histogramm (links) und Zusammenfassung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI, rechts). Die Durchflusszytometrie-Diagramme sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Die Daten zeigen Mittelwert ± SEM. Statistik: einwegige ANOVA mit wiederholten Messungen und Tukey’s Post-hoc-Test. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zellproliferationsassay, Histogramm, das CTV im Vergleich zur Proliferationsrate über die Zeit zeigt.
Abbildung 2: Analyse der Proliferation primärer mauslicher CD8+-T-Zellen mittels violettem Proliferationsmarkerfarbstoff (CTV) unter gestufter TCR-Stimulation. Mit CTV markierte CD8+-T-Zellen wurden in vitro mit anti-CD3 in konzentrativen Gradienten von 0,1–10 µg/mL über 6 bis 48 h stimuliert. Die Zellproliferation wurde anhand der Verdünnung und Abschwächung der CTV-Fluoreszenz in CD8+-T-Zellen durch Durchflusszytometrie bewertet. Die Histogramme zeigen die Verteilung der CTV-Fluoreszenz für jede Konzentrationsgruppe, wobei der Prozentsatz der Zellen, die eine oder mehrere Teilungen durchlaufen haben, angegeben ist. Die Durchflusszytometrie-Diagramme sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Durchflusszytometrie-Analyse, CD69- und CD25-Expression, Histogramm und Liniendiagramm, Immunzellaktivierung.
Abbildung 3: Kinetik der Expression früher Aktivierungsmarker CD69 und CD25 auf CD8+-T-Zellen nach Stimulation mit anti-CD3. Naive CD8+-T-Zellen wurden mit plattengebundenem anti-CD3 in den angegebenen Konzentrationen (0,1–10 µg/mL) sowie konstantem anti-CD28 (1 µg/mL) stimuliert. CD69 wurde nach 6, 12, 24 und 36 h gemessen; CD25 nach 10, 12, 24 und 36 h und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die linken Diagramme zeigen repräsentative Histogramme zu den angegebenen Zeitpunkten; die rechten Diagramme zeigen die zeitlichen dynamischen Veränderungen der MFI. (A) CD69. (B) CD25. Die Durchflusszytometrie-Diagramme sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Die Daten zeigen Mittelwert ± SEM. Statistik: zweifaktorielle Varianzanalyse mit wiederholten Messungen und Tukey’s post-hoc-Test. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Durchflusszytometrie-Analyse, PD-1- und ICOS-Expression, Histogramme und Graphen, zelluläre Reaktion über die Zeit
Abbildung 4: Kinetik der Expression des inhibitorischen Rezeptors PD-1 und des kostimulatorischen Moleküls ICOS auf CD8+-T-Zellen nach Stimulation mit anti-CD3. Naive CD8+-T-Zellen wurden mit plattengebundenem anti-CD3 in den angegebenen Konzentrationen (0,1–10 µg/mL) sowie konstantem anti-CD28 (1 µg/mL) stimuliert. Die Zellen wurden nach 10, 12, 24 und 36 Stunden gewonnen und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die linken Diagramme zeigen repräsentative Histogramme zu den angegebenen Zeitpunkten; die rechten Diagramme zeigen die zeitlichen dynamischen Veränderungen der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI). (A) PD-1. (B) ICOS. Die Durchflusszytometrie-Diagramme sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Die Daten zeigen Mittelwert ± SEM. Statistik: zweifaktorielle Varianzanalyse mit wiederholten Messungen und Tukey’s post-hoc-Test. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse, Expression von TNF-α und Granzym B, Balken- und Streudiagramme, immunologische Studie.
Abbildung 5: Die intrazelluläre Zytokinproduktion durch CD8+-T-Zellen hängt von der TCR-Stärke ab. Naive CD8+-T-Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) sowie konstantem anti-CD28 (1 µg/mL) stimuliert. 24 h und 48 h nach Stimulation wurden die Zellen nach einer 5-stündigen Inkubation mit Proteinentransportinhibitoren (Monensin und Brefeldin A) in Gegenwart von PMA und Ionomycin gewonnen, um die Zytokinsekretion zu blockieren und eine intrazelluläre Akkumulation zu ermöglichen. (A) Konturdiagramme zeigen die Häufigkeiten von TNF-α- und Granzym-B-positiven Zellen bei den jeweils angegebenen Konzentrationen und Zeitpunkten. Nicht stimulierte Zellen dienten als negativer Kontrollwert. (B) Die Anteile der TNF-α+-, Granzym-B+- und TNF-α+Granzym-B+-Zellen. (C) Der MFI von TNF-α und Granzym B. Die Durchflusszytometrie-Diagramme sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. Die Daten zeigen Mittelwert ± SEM. Statistik: zweifaktorielle Varianzanalyse mit wiederholten Messungen und Tukey’s post-hoc-Test. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine systematische und reproduzierbare Methode zur Untersuchung der T-Zell-Antworten in Abhängigkeit von der Stärke des T-Zell-Rezeptor-(TCR-)Signals bereit. Die gestufte Beschichtungsstrategie mit anti-CD3-Antikörpern ermöglicht eine präzise Kontrolle der Stimulationsintensität und erlaubt es Forschenden, die quantitative Beziehung zwischen TCR-Eingangssignal und nachgeschalteten funktionellen Ergebnissen zu analysieren. Zu den zentralen experimentellen Punkten gehören die Aufreinigung naiver CD8⁺ T-Zellen, die exakte Steuerung des Konzentrationsgradienten der anti-CD3-Beschichtung sowie die strikte Normalisierung der Zellzahl pro Mulde. Um die Vergleichbarkeit der Daten über verschiedene Experimente hinweg sicherzustellen, empfehlen wir zudem die Verwendung einheitlicher Instrumenteneinstellungen, Kompensationsmatrizen und Gating-Strategien sowie – soweit möglich – identischer Antikörper-Lots und Chargen von fixierbaren Vitalitätsfarbstoffen. Die Zuverlässigkeit dieser kritischen Schritte bestimmt unmittelbar, ob die experimentellen Ergebnisse die Auswirkungen variierender TCR-Stimulationsintensitäten auf die phänotypische Dynamik der T-Zellen korrekt widerspiegeln können.

In diesem Protokoll verwendeten wir die stimulierte Antikörperbindung an die Platte, bei der Anti-CD3-Antikörper direkt auf die Oberfläche der Kulturplatte aufgebracht werden, um den TCR-CD3-Komplex zu vernetzen. Dieser Ansatz zeichnet sich durch Kosteneffizienz, gleichmäßige Verteilung der Antikörper, geringe Variabilität zwischen den Vertiefungen und hervorragende Reproduzierbarkeit aus. Insbesondere ermöglicht die Titration der beschichtenden Antikörperkonzentrationen eine präzise, gestufte Modulation der Stimulationsintensität – eine Eigenschaft, die dieses System von der an Perlen gebundenen Stimulation unterscheidet, bei der die Liganden-Dichte üblicherweise auf einem sättigenden Niveau fixiert ist und daher eine feinabgestimmte Signalmodulation begrenzt14. Allerdings führt die an die Platte gebundene Stimulation zu einer überphysiologischen und anhaltenden Vernetzung des T-Zell-Rezeptors, die sich grundlegend von der vorübergehenden, affinitätsabhängigen Bindung unterscheidet, die durch Peptid-MHC-Komplexe auf antigenpräsentierenden Zellen induziert wird. Obwohl die pMHC-basierte Stimulation physiologisch relevanter ist, ist sie technisch anspruchsvoll, erfordert spezielle Fachkenntnisse zur Herstellung von Multimeren und verursacht deutlich höhere Kosten. Zur Zellisolierung verwendeten wir die negative immunmagnetische Selektion, die einfach, schnell und kostengünstig ist. Obwohl sie im Vergleich zur FACS geringere Reinheit liefert, vermeidet sie mechanische Belastungen und die Fluoreszenzmarkierung, die den physiologischen Zustand der sortierten Zellen beeinträchtigen könnten20,21.

Zu den Hauptproblemen, die während der Protokolldurchführung auftreten können, gehören geringe Sortierreinheit, schwache Proliferation, CTV-induzierte Zytotoxizität, schlechte Lebensfähigkeit nach der Kultur und inkonsistente Färbung. Bei geringer Reinheit sollte sichergestellt werden, dass die Zellen gründlich mit dem biotinylierten Antikörper-Cocktail und den Streptavidin-beschichteten Perlen gemischt werden; gegebenenfalls sollte die Dauer der magnetischen Trennung verlängert und das Verhältnis von Perlen zu Antikörpern für jede neue Charge der Reagenzien optimiert werden. Wenn trotz der höchsten anti-CD3-Konzentration nur minimale Proliferation beobachtet wird, überprüfen Sie die Lebensfähigkeit und Reinheit der isolierten naiven Zellen (insbesondere Kontamination mit CD44hi-Zellen), bestätigen Sie das Beschichtungsverfahren mit anti-CD3 (versiegeln Sie die Platten mit Abdichtfolie während der Übernachtinkubation bei 4 °C und stellen Sie eine gleichmäßige Antikörperbedeckung sicher) und validieren Sie die IL-2-Konzentration, da dieser Zytokin für die Unterstützung der T-Zell-Expansion unerlässlich ist. Bei CTV-induzierter Zytotoxizität sollte die Färbe-Konzentration reduziert werden, wobei eine klare Auflösung der Teilungsspitzen erhalten bleiben muss; außerdem muss der Abbruchschritt streng auf Eis für volle 5 Minuten durchgeführt werden, um verbleibende freie Farbstoffe zu entfernen22,23. Bei schlechter Lebensfähigkeit nach der Kultur kontrollieren Sie die Zelldichte, stellen Sie ausreichendes Mediumvolumen sicher und wahren Sie sterile Arbeitsbedingungen. Wenn inkonsistente Färbung oder hohe Variabilität in der Durchflusszytometrie beobachtet wird, bereiten Sie die Antikörper-Cocktails als Master-Mixes zu, schützen Sie alle gefärbten Proben vor Licht und verwenden Sie dieselben Antikörper-Chargen sowie Chargen des fixierbaren Vitalitätsfarbstoffs innerhalb aller Wiederholungen.

Trotzdem weist dieses Protokoll bestimmte Einschränkungen auf. Als In-vitro-System kann es die komplexe Gewebemikroumgebung, zellulären Interaktionen oder das Zytokinspektrum sekundärer lymphatischer Organe nicht nachbilden. Das Kulturzeitfenster ist auf 48 h begrenzt, wodurch die Analyse auf frühe Aktivierungsereignisse beschränkt bleibt und die Beurteilung später Differenzierungsstadien, Erschöpfungszustände oder die Bildung von Gedächtniszellen ausgeschlossen ist. Zudem stützt sich das Protokoll stark auf Durchflusszytometrie-basierte Messungen, die eine strikte Standardisierung der Geräteeinstellungen, Kompensationsmatrizen und Gating-Strategien über unabhängige Experimente hinweg erfordern. Außerdem basieren die mit diesem anti-CD3/CD28-System gewonnenen Erkenntnisse ausschließlich auf CD8+-T-Zellen und sind möglicherweise nicht direkt auf CD4+-T-Zellen übertragbar, deren Aktivierungsschwellen, kostimulatorische Anforderungen und downstream Differenzierungswege bekanntermaßen abweichen12,24,25. Zusätzlich kann der basale Aktivierungsstatus von T-Zellen zwischen einzelnen Mauskolonien aufgrund von Unterschieden in der kommensalen Mikrobiota variieren, was eine potenzielle Quelle für interlaborübergreifende Variabilität darstellt und bei der Interpretation von Ergebnissen über verschiedene Studien hinweg berücksichtigt werden sollte.

Das hier beschriebene gestufte Stimulationsverfahren ermöglicht es Forschenden, die Stärke des T-Zell-Rezeptor-(TCR-)Signals an spezifische experimentelle Ziele anzupassen, basierend auf den unterschiedlichen Reaktionsmustern, die bei verschiedenen Messparametern beobachtet wurden. Diese Daten zeigen, dass die Wahl der Anti-CD3-Konzentration und des Zeitpunkts der Zellgewinnung von der jeweiligen biologischen Fragestellung abhängen sollte. Bei frühen Aktivierungsmarkern ist die Hochregulierung von CD69 bereits 6–12 Stunden nach Stimulation bei allen Konzentrationen nachweisbar, weist jedoch unterschiedliche Kinetiken auf: Hohe Konzentrationen (5–10 µg/mL) führen zu einem schnellen Peak, dem ein Abfall folgt, während niedrige Konzentrationen (0,5–1 µg/mL) einen langsamen, anhaltenden Anstieg verursachen. Bei Proliferationsassays sind Konzentrationen unter 1 µg/mL suboptimal und können als interne negative Kontrollen dienen, während 5–10 µg/mL zu einer robusten, clonalen Expansion führen, die mittels CTV-Verdünnung nach 48 Stunden detektierbar ist. Die Expression des ko-inhibitorischen Rezeptors PD-1 und des ko-stimulatorischen Moleküls ICOS erfordert eine intensive Stimulation (5–10 µg/mL) und erreicht nach 36 Stunden ihr Maximum, was darauf hinweist, dass Studien zu diesen Molekülen frühere Zeitpunkte oder niedrigere Dosen vermeiden sollten. Bei der Analyse der Effektorfunktion (TNF-α und Granzym B) ist der Zusammenhang zwischen Stärke der Stimulation und Zytokinproduktion zeitabhängig und folgt einem charakteristischen zweiphasigen Muster. Nach 24 Stunden korreliert die Produktion von Effektormolekülen positiv mit der Anti-CD3-Konzentration, wobei höhere Dosen eine stärkere Zytokinproduktion hervorrufen. Nach 48 Stunden hingegen, obwohl die absoluten Anteile zytokinproduzierender Zellen unter allen Bedingungen im Vergleich zu 24 Stunden deutlich erhöht sind, kehrt sich die Dosis-Wirkungs-Beziehung um: Niedrigere Stimulationskonzentrationen (0,5–1 µg/mL) führen zu relativ höheren Anteilen an TNF-α⁺ Granzym-B⁺-Zellen als hohe Dosen (5–10 µg/mL). Diese Umkehrung legt nahe, dass eine anhaltend starke TCR-Signalübertragung, obwohl sie die initiale Differenzierung von Effektorzellen fördert, möglicherweise eine relative Einschränkung der Fähigkeit zur Zytokinproduktion pro Zelle bewirkt, was auf den Beginn einer aktivierungsinduzierten Erschöpfung oder Hyporesponsivität hindeuten könnte.

Insgesamt positionieren diese empirischen Beobachtungen unser Protokoll als Referenzrahmen, der es Anwendern ermöglicht, Stimulationsbedingungen basierend auf spezifischen downstream-Zielgrößen vorab auszuwählen, wodurch die Effizienz des experimentellen Designs und die Interpretierbarkeit der Daten verbessert werden. Über grundlegende mechanistische Studien hinaus kann dieses System auch zur Optimierung von Protokollen zur T-Zell-Expansion für die adoptive Immuntherapie beitragen, wobei eine präzise Regulierung der TCR-Signalstärke helfen könnte, die Differenzierung in günstige Effektor- oder Gedächtnisphänotypen zu lenken26,27,28.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (Nr. T2394504, LY) und dem Startkapital für die Forschung des leitenden Wissenschaftlers Lilin Ye (Nr. R2045, LY) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL kegelförmiges ReagenzglasLabgicCD-002-15ASteriles 15 mL kegelförmiges Zentrifugenröhrchen
4 % ParaformaldehydBeyotimeP00994 % wässrige Fixierlösung zur Konservierung von Zellen vor der Färbung
60-mm-SchaleLabgic1221160-mm-Zellkulturschale
70 µm-ZellsiebLabgicBS-70-CS70 µm-Nylonsieb zur Herstellung von Einzelzell-Suspensionen
Rundboden-Mikrotiterplatte mit 96 VertiefungenBeyotimeFPT01696-Well-Rundbodenplatte für Zellkultur und Färbung
ACK-LysispufferBeyotimeC3702Ammoniumchlorid-basierter Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen
Anti-Maus-CD25Biolegend101910APC-konjugierter Anti-Maus-CD25-Antikörper, Klon 3C7, für die Durchflusszytometrie
Anti-Maus-CD28Bio X CellBE0015-1Reiner Anti-Maus-CD28-Antikörper, Klon 37.51, zur Kostimulation von T-Zellen
Anti-Maus-CD3Bio X CellBP0001-1Reiner Anti-Maus-CD3ε-Antikörper, Klon 145-2C11, zur Aktivierung von T-Zellen
Anti-Maus-CD69BD Biosciences553237PE-konjugierter Anti-Maus-CD69-Antikörper zur Färbung von Aktivierungsmarkern
Anti-Maus-CD8Invitrogen17-0081-82APC-konjugierter Anti-Maus-CD8a-Antikörper, Klon 53-6.7, für die Durchflusszytometrie
Anti-Maus-GZMBBiolegend372212PerCP/Cyanin5.5-konjugierter Anti-Mensch/Maus-Granzym-B-Antikörper, Klon QA16A02, für die intrazelluläre Durchflusszytometrie
Anti-Maus-ICOSBD Biosciences565886BV421-konjugierter Anti-Maus-ICOS-(CD278)-Antikörper für die Durchflusszytometrie
Anti-Maus-PD-1Biolegend135220BV605-konjugierter Anti-Maus-PD-1-(CD279)-Antikörper, Klon 29F.1A12, für die Durchflusszytometrie
Anti-Maus-TNF-αInvitrogen46-7321-82PerCP-eFluor-710-konjugierter Anti-Maus-TNF-α-Antikörper, Klon MP6-XT22, für die intrazelluläre Durchflusszytometrie
Anti-Maus/Human-CD44Biolegend103030PE/Cyanin7-konjugierter Anti-Maus/Human-CD44-Antikörper, Klon IM7, für die Durchflusszytometrie
Biotin-Anti-Maus-CD11bBiolegend101204Biotin-konjugierter Anti-Maus-CD11b-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-CD11cBiolegend117304Biotin-konjugierter Anti-Maus-CD11c-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-CD16/32Biolegend156604Biotin-konjugierter Anti-Maus-CD16/32-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-CD19Biolegend115504Biotin-konjugierter Anti-Maus-CD19-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-CD4Biolegend100508Biotin-konjugierter Anti-Maus-CD4-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-CD44Biolegend103004Biotin-konjugierter Anti-Maus-CD44-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-CD45RBiolegend103204Biotin-konjugierter Anti-Maus-CD45R/B220-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-CD49bInvitrogen13-5971-85Biotin-konjugierter Anti-Maus-CD49b-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-F4/80Biolegend123106Biotin-konjugierter Anti-Maus-F4/80-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-Ly6GBiolegend127604Biotin-konjugierter Anti-Maus-Ly6G-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-NK1.1Biolegend108704Biotin-konjugierter Anti-Maus-NK1.1-Antikörper zur Linienablage
Biotin-Anti-Maus-TER119Biolegend116204Biotin-konjugierter Anti-Maus-TER-119-Antikörper zur Linienablage
C57BL/6-MäuseSibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.N/A6–8 Wochen alte männliche Mäuse, die für die Experimente verwendet wurden
Kohlenstoffdioxid-(CO2)-InkubatorThermo Fisher3120Befeuchteter CO2-Inkubator für die Kultur von Säugetierzellen
CellTrace-Violett-FarbstoffInvitrogenC34557Violetter fluoreszierender Farbstoff zur Überwachung der Zellproliferation
DMSOSigmaD2650Dimethylsulfoxid; Lösungsmittel zur Herstellung von Stammlösungen von Reagenzien
Esel-Anti-Kaninchen-IgG-(H+L)-Sekundärantikörper mit hoher Kreuzadsorption, Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206Alexa-Fluor-488-konjugierter Esel-Anti-Kaninchen-IgG-(H+L)-Sekundärantikörper
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500Dulbecco’s phosphatgepufferter Salzlösung zur Spülung und Reagenzherstellung
Fötales Kälberserum (FBS)GibcoC11995500BTSerumzusatz für Kulturmedien von Säugetierzellen
Fixierbarer VitalitätsfarbstoffInvitrogen65-0865-14Fixierbarer Vitalitätsfarbstoff zur Ausschließung toter Zellen während der Durchflusszytometrie
Fixierungs- und PermeabilisierungslösungBD Biosciences51-2090KZFixierungs- und Permeabilisierungsreagenz für intrazelluläre Färbungen
Flachboden-Mikrotiterplatte mit 96 VertiefungenLabgic1151096-Well-Flachbodenplatte für Zellkultur und Stimulationsassays
DurchflusszytometerBD BiosciencesLSRFortessa-3 laserDurchflusszytometer mit drei Lasern zur Erfassung multicolor-Fluoreszenz
Golgi PlugBD Biosciences51-2301KZBrefeldin-A-basierter Proteintransportinhibitor für die intrazelluläre Zytokin-Färbung
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZMonensin-basierter Proteintransportinhibitor für die intrazelluläre Zytokin-Färbung
Calciumsalz von IonomycinSigmaI3909-1MLCalciumionophor, der zusammen mit PMA zur Zellstimulation verwendet wird
Perm/Wash-PufferBD Biosciences51-20911KZPermeabilisierungs- und Waschpuffer für intrazelluläre Färbungen
Phosflow-Lysier-/FixierpufferBD Biosciences5580495×-Puffer zur simultanen Lyse roter Blutkörperchen und Fixierung von Leukozyten
Phosflow-Perm/Wash-Puffer IBD Biosciences557885Methanolbasierter Permeabilisierungspuffer für die intrazelluläre Färbung von Phosphoproteinen
Phospho-S6-Ribosomenprotein (Ser235/236) (D57.2.2E) Kaninchen-monoklonaler AntikörperCell Signaling4858SKaninchen-monoklonaler Antikörper gegen Phospho-S6-Ribosomenprotein (Ser235/236), Klon D57.2.2E
PMASigmaP1585-1MGPhorbol-12-myristat-13-acetat; Aktivator zur ex-vivo-Zellstimulation
Rekombinantes Maus-Interleukin-2Gibco200-02-50UGRekombinantes Maus-Interleukin-2 für die Kultur und Expansion von T-Zellen
RPMI 1640Life-LabAC01L064Roswell-Park-Memorial-Institute-1640-Medium für die Kultur von Säugetierzellen
Streptavidin-MagnetbeadsBEAVER22307Magnetische Streptavidin-beschichtete Beads zur Zelldepletion mittels Biotin-Antikörper
Färbepuffer für DurchflusszytometrieNicht angegebenNicht angegebenFärbepuffer für Durchflusszytometrie; Hersteller oder Herstellungsformel wurde nicht angegeben
Parafilm M LaborfolieAmcorPM996Flexible, selbstversiegelnde Laborfolie zum Versiegeln von Platten, Röhrchen und Kulturgefäßen
Lysier-/FixierpufferBD Biosciences5580495×-Puffer zur simultanen Lyse roter Blutkörperchen und Fixierung von Leukozyten
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1Software, Version 10.8.1, zur Analyse von Durchflusszytometriedaten

Referenzen

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CD8 T ZellenIn vitro StimulationAnti CD3 StimulationAnti CD28 CostimulationDurchflusszytometrieIsolation naiver T ZellenmTORC1 Aktivit tT Zell Differenzierung
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