Wirkung von Tuina auf die Expression und das Schlafverhalten von hypothalamischen Orexin-A in einem Rattenmodell der primären Schlaflosigkeit

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht, ob Tuina Schlaflosigkeit in einem Rattenmodell lindert, indem es die Expression von hypothalamischer Orexin-A reguliert, mittels Verhaltenstests, Immunhistochemie und Echtzeitquantitativer PCR.

Zusammenfassung

Schlaflosigkeit ist eine häufige Schlafstörung, die zu einer beeinträchtigten Tagesfunktion und einem erhöhten Risiko für Komorbiditäten führt und die Lebensqualität der Patienten erheblich beeinträchtigt. Aktuelle Behandlungen, hauptsächlich kognitive Verhaltenstherapie und Pharmakotherapie, sind durch Probleme wie Drogenabhängigkeit, Toleranz und Entzugsrückfälle eingeschränkt. Die Tuina-Therapie hat gezeigt, dass sie das Nerven-, das endokrine und das Immunsystem reguliert, während das Orexin-System ein wichtiger Regulator des Schlaf-Wach-Zyklus ist. Dies hat die Untersuchung angeregt, ob Tuina die Schlaflosigkeit lindert, indem es das hypothalamische Orexin-System moduliert. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden der Tuina-Intervention in einem Rattenmodell der primären Schlaflosigkeit, die durch die modifizierte Mehrplattform-Wasserumgebungsmethode induziert wird. Wir haben 64 Wistar-Ratten zufällig in vier Gruppen eingeteilt: Kontroll-, Modell-, Tuina- und Orexin-Antagonist. Verhaltensuntersuchungen (Open-Field-Test, Pentobarbital-induzierter Schlaftest) wurden durchgeführt, und die Expression von Orexin-A im Hypothalamus wurde mittels Echtzeit-quantitativer PCR und Immunhistochemie nachgewiesen. Das Protokoll zielt darauf ab, die Wirksamkeit von Tuina zu bewerten und seinen potenziellen Mechanismus im Zusammenhang mit dem Orexin-System zu untersuchen, um als Referenz für die Anwendung und mechanistische Untersuchung von Tuina bei Schlafstörungen zu dienen.

Einleitung

Schlaflosigkeit, gekennzeichnet durch Unzufriedenheit mit Schlafdauer oder -qualität, die zu Beeinträchtigungen tagsüber führt, ist ein weit verbreitetes globales Gesundheitsproblem mit einer erheblichen Belastung für Einzelpersonen und Gesundheitssysteme ^1,2. In China ist die Häufigkeit von Schlaflosigkeit bemerkenswert hoch, was^{ihre Auswirkungen auf} die öffentliche Gesundheit weiter verschärft. Diese Störung ist mit beeinträchtigter kognitiver Funktion, einem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und einer hohen Begleiterkrankung mit psychiatrischen Erkrankungen wie Depressionen und Angststörungen^{verbunden 4,5}. Die aktuelle klinische Behandlung basiert hauptsächlich auf kognitiver Verhaltenstherapie und Pharmakotherapie, insbesondere Benzodiazepinen und nicht-benzodiazepinen Sedativa-Hypnotika. Ihre langfristige Anwendung ist jedoch durch Medikamentenabhängigkeit, Toleranz, nachwirkende Tageseffekte und Entzugserscheinungen eingeschränkt, was die Notwendigkeit wirksamer nicht-pharmakologischer^Alternativen unterstreicht. In der klinischen Praxis eignet sich Tuina besonders für Patienten mit chronischer primärer Schlaflosigkeit, die nicht-pharmakologische Interventionen suchen, insbesondere für ältere Menschen mit hohem Risiko für Medikamentenabhängigkeit sowie für schwangere oder stillende Frauen⁷.

Als Grundpfeiler der externen Therapie der traditionellen chinesischen Medizin hat Tuina einzigartige Vorteile bei der Behandlung von Schlaflosigkeit^gezeigt. Meta-analytische Evidenz zeigt, dass Tuina Medikamente oder allein Akupunktur in der Gesamtwirksamkeit (OR = 4,12), der Schlafqualität und den angstdepressiven Zuständen signifikant übertrifft, mit hoher Sicherheit^{von 9}. Spezifische Tuina-Protokolle bieten deutliche Vorteile: Traditionelles Tuina erreicht 89,5 % Wirksamkeit bei Schleim-Hitze-Insomnie, das Bauchreiben reduziert die Rückfallrate auf 14,7 % (im Vergleich zu 38,2 % bei herkömmlichem Tuina)¹⁰. Die dreiteilige Tuina-Methode steigert die Wirksamkeit der Kräutertherapie von 80,49 % auf 92,68 % und verbessert die Schlafarchitektur sowie die Neurotransmitterprofile¹¹. Klinische Studien und systematische Übersichten haben bestätigt, dass Tuina die Schlafqualität deutlich verbessern, Angst- und Depressionswerte senken und die Serumspiegel von Neurotransmittern wie 5-Hydroxytryptamin (5-HT)¹² modulieren kann. Es wird angenommen, dass seine therapeutischen Wirkungen durch eine ganzheitliche Regulation des neuroendokrin-immunen Netzwerks vermittelt werden. Neuere Forschungen konzentrieren sich zunehmend auf das Orexin-System, ein zentrales Neuropeptidsystem, das aus dem lateralen Hypothalamus stammt und entscheidend für die Förderung und Aufrechterhaltung der Wachheit^ist. Abnormale Überaktivität der Orexinneuronen ist mit der Pathophysiologie der Schlaflosigkeit verbunden, während die Hemmung dieses Weges therapeutisches Potenzial¹⁴ gezeigt hat. Vorläufige Belege deuten darauf hin, dass Manipulationen wie das Abdominalreiben den Orexin-A-Spiegel im Gehirn bei schlaflosen Ratten^beeinflussen können, doch eine systematische Untersuchung darüber, ob Tuina seine Anti-Schlaflosigkeits-Wirkung speziell durch die Modulation des Orexin-Systems ausübt, fehlt.

Daher zielt diese Studie auf Basis eines Rattenmodells der primären Schlaflosigkeit darauf ab: (1) Die Verbesserung des Schlafverhaltens nach einer standardisierten Tuina-Intervention mittels Verhaltenstests zu bewerten; und (2) Den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen, indem untersucht wird, ob der Effekt von Tuina mit der Absenkung der Orexin-A-Expression im Hypothalamus zusammenhängt, wobei deren Wirksamkeit mit der eines Orexin-Rezeptor-Antagonisten verglichen wird. Diese Forschung soll experimentelle Belege für den zentralen Mechanismus von Tuina bei der Behandlung von Schlaflosigkeit liefern.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren und Tierschutzbewertungen wurden vom Tierethikkomitee der Xinjiang Medical University genehmigt (Ethikgenehmigungsnummer: IACUC-20020158). Das Protokoll folgt den institutionellen Richtlinien für die Tierpflege und -nutzung. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tiervorbereitung

1. Haus 64 spezifische, pathogenfreie (SPF) Wistar-Ratten (Körpergewicht 250 g ± 50 g, gleiche Geschlechtsverteilung) in einem SPF-Barrieresystem bei 18–22 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Versorgen Sie Nahrung und Wasser ad libitum.
2. Nach einer Woche adaptiver Fütterung werden die Ratten zufällig in 4 Gruppen eingeteilt (n = 16 pro Gruppe): Kontrollgruppe (Gruppe A), Modell (Gruppe B), Tuina (Gruppe C) und Antagonist (Gruppe D).

2. Etablierung des primären Schlaflosigkeitsmodells

HINWEIS: Mit Ausnahme der Gruppe A durchlaufen Ratten in den Gruppen B, C und D das folgende Modellierungsverfahren.

1. Bereiten Sie einen zylindrischen Kunststoffbehälter (oberer Durchmesser: 30 cm, Höhe: 40 cm) als Rattenkiste vor.
2. Befestigen Sie eine zylindrische Plattform (Durchmesser: 6 cm, Höhe: 10 cm) am Boden des Behälters.
3. Gib Wasser in den Behälter, bis der Wasserstand 1 cm unter der Plattformoberfläche liegt. Halten Sie die Wassertemperatur bei 20 °C.
4. Lege ein rundes Eisennetz (Durchmesser: 25 cm, Maschengröße: 1 cm) horizontal in den Behälter, 15 cm über der Plattform. Befestigen Sie das Netz mit dünnen Eisendrähten am Rand des Behälters.
5. Stelle Trinkwasser und Nahrung auf das Eisengitter. Täglich Wasser ersetzen und den Behälter reinigen und desinfizieren.
6. Stellen Sie acht aufeinanderfolgende Tage pro Container eine Ratte auf die Plattform.

3. Modellbewertung mittels Pentobarbitalnatrium-synergistischen Schlaftests

1. Die Pentobarbital-Natriumlösung wird durch direkte Zugabe von ultrareinem Wasser hergestellt. Wäge 1,0 g Pulver, gib sterilisiertes ultrareines Wasser zu 100 mL hinzu, löse es auf und filtere bei 0,22 μm, um eine 1 % (10 mg/mL) Lösung zu erhalten.
2. Am 9. Tag sollten alle Ratten intraperitoneal mit Pentobarbital-Natriumlösung in der minimalen Schwellendosis injiziert werden, die Schlaf induziert (in den vorläufigen Experimenten bestimmt).
3. Erfassen Sie die Schlaflatenz (Zeit von der Injektion bis zum ersten Verlust des Aufrichtreflexes) und die Schlafdauer (Zeit vom Verlust bis zur Wiederherstellung des Aufrichtreflexes). Definiere den Verlust des aufrichtenden Reflexes für 1 Minute als Einschlafenseintritt und seine Erholung als Schlafende.

4. Tuina-Intervention

HINWEIS: Die Interventionen beginnen am Tag nach der erfolgreichen Modellevaluation und werden einmal täglich 14 aufeinanderfolgende Tage fortgesetzt. Gruppe A und Gruppe B werden täglich 10 Minuten in einem Fixationsrahmen gefesselt. Die Bediener erhalten vor dem Experiment eine strenge Schulung, um eine einheitliche Kraft in Kraft, Frequenz und Rhythmus sicherzustellen.

1. Für Gruppe C fixieren Sie die Ratte auf Rücken auf einem Operationstisch.
2. Fixiere vorsichtig die vier Gliedmaßen der Ratte mit den fünf Fingern der linken Hand und strecke den Bauch vollständig aus.
3. Führen Sie mit der rechten Hand abdominale Tuina aus: Verwenden Sie die Pulpa der distalen Phalanx des Mittelfingers, um Kraft am Guanyuan-Punkt (CV4, 25 mm unterhalb des Nabels) auszuüben. Halten Sie die verbleibenden vier Finger natürlich ausgestreckt.
4. Treiben Sie den Mittelfinger mit kleinen anterolateralen Kreisbewegungen vom Schultergelenk aus und führen gegen den Uhrzeigersinn kreisförmige Translationsreibung am Bauch aus.
5. Folgen Sie einem geschlossenen kreisförmigen Weg, der aus Jiuwei (CV15, 5 mm unterhalb des Xiphoid-Prozess), Guanyuan (CV4) und beidseitigen Daimai-Punkten (GB26, Mittelpunkt zwischen dem freien Ende der 12^{. Rippe} und dem oberen Rand des Iliac-Kamms) gebildet wird.
6. Halten Sie eine gleichmäßige, gleichmäßige, kontinuierliche Kreisbewegung mit 5–7 Zyklen pro Minute aufrecht.
7. Führe 5 Minuten gegen den Uhrzeigersinn Manipulation durch, dann 5 Minuten im Uhrzeigersinn.
8. Stellen Sie sicher, dass die Kraft gleichmäßig und fest ist, damit die Ratte ruhig bleibt und sich nicht wehrt. Wenden Sie die Intervention einmal täglich für 14 Tage an.

5. Antagonistische Verwaltung

1. Für Gruppe D verabreichen Sie MK-4305 (10 mg/kg) einmal täglich für 14 Tage intragastrische Massage. Lösen Sie MK-4305 in normaler Kochsalzlösung auf, um eine 5-mL-Lösung herzustellen.

6. Freifeldtest

1. Nach der Interventionsphase wird der Openfield-Test mit einer schwarzen Kubikbox durchgeführt (Basis: 100 cm × 100 cm, Höhe: 40 cm). Unterteilen Sie den Boden in 25 gleiche Quadrate durch graue Linien (16 peripher, 9 zentral).
2. Platziere die Ratte auf das zentrale Quadrat und beginne mit dem Zeitpunkt.
3. Erfassen Sie die gesamte zurückgelegte Strecke, die Anzahl der Aufzuchtphasen und die Zeit im zentralen Bereich über 3 Minuten mit einem Bilderfassungssystem.
4. Nach jedem Test entfernen Sie den Kot und reinigen Sie den Boden sowie die Innenwände mit 75 % Ethanol.
5. Funktionsweise des Bilderfassungssystems
   1. Richte das Bildaufnahmesystem ein. Eine digitale CCD-Kamera (Auflösung: 1280 × 720 Pixel; Bildrate: 25 fps) vertikal 1,5 m über dem offenen Feld montieren. Verbinde die Kamera über eine USB-Schnittstelle mit einem Computer.
   2. Konfigurieren Sie die Tracking-Software und die Analyseeinstellungen. Führen Sie automatisiertes Tracking mit Verhaltensvideoanalyse-Software durch. Stellen Sie die Tracking-Parameter wie folgt ein:
      1. Definieren Sie den Tracking-Fokus als den Schwerpunkt (Schwerpunkt) der Ratte.
      2. Stellen Sie die Bildrate sowohl für die Bildaufnahme als auch für die Analyse auf 25 fps ein.
      3. Kalibrieren Sie die räumliche Auflösung so, dass jedes Pixel 1,5 mm tatsächlicher Entfernung entspricht, basierend auf den Abmessungen des offenen Feldes und der Videoauflösung.
      4. Stellen Sie die Hintergrund-Subtraktionsschwelle auf 15 Graustufen (Bereich: 0–255) ein, um die Ratte vom Hintergrund zu unterscheiden.
      5. Setzen Sie die minimale Ereignisdauer auf 0,2 s (5 Frames), um falsch-positive Erkennungen durch Rauschen zu minimieren.
      6. Teile das offene Feld virtuell in 5 × 5 flächengleiche Quadrate (Zonen 1–25). Definieren Sie die zentrale Zone als die Zonen 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18 und 19 (die zentralen 3 × 3 Felder, die 36 % der Gesamtfläche ausmachen). Definiere die periphere Zone als die verbleibenden Quadrate.
   3. Erfassen Sie folgende Ausgabeparameter: Gesamtzurückgelegte Distanz (mm), durchschnittliche Geschwindigkeit (mm/s), Zeit unbeweglich (s), Zeit in Bewegung (s), Zeit in jeder Zone (s), bewegte Entfernung in jeder Zone (mm), Anzahl der Eingänge in jede Zone und Anzahl der Aufziehphasen. Überprüfe die Aufziehepisoden manuell.

7. Perfusion für die Immunhistochemie

HINWEIS: Verwenden Sie 4 Ratten aus jeder Gruppe für die Immunhistochemie.

1. Bereiten Sie 0,9 % Kochsalzlösung (vorgewärmt auf 37 °C) und 4 % Paraformaldehydlösung (bei 4 °C gelagert) vor.
2. Ratten werden mit intraperitonealem Harnstoff (25 % Lösung, 0,6 ml/100 g Körpergewicht) tief betäubt. Bestätigen Sie den Verlust von Pedal-, Hornhaut- und Aufrichtreflexen.
3. Sichern Sie die Ratte im Rücken auf einer Schaumstoffplatte. Öffnen Sie die Brusthöhle schnell, indem Sie Haut, Faszie und Brustbein durchschneiden.
4. Ziehe das Herz vorsichtig zurück, um die Aorta freizulegen. Führen Sie eine Nadel durch den linken ventrikulären Apex in die Aorta ein, bis die Nadelspitze im Aortenlumen sichtbar ist. Stellen Sie sicher, dass Nadel, linke Herzkammer und Aorta horizontal ausgerichtet sind.
5. Klemmen Sie Aorta und Nadel mit einer hämostatischen Zange zusammen. Schneide sofort das rechte Vorhof ab, damit das Blut entweicht.
6. Perfuse mit 150–200 mL vorerwärmter 0,9 % Kochsalzlösung (37 °C). Eine erfolgreiche Durchströmung wird durch das Blanchieren von Leber, Mesenterium und Vordergliedmaßen sowie klare Flüssigkeit aus dem rechten Vorhof angezeigt.
7. Wechsel zu kaltem 4 % Paraformaldehyd (4 °C) und perfusere 400 mL. Führen Sie die erste Perfusion schnell durch, bis Faszikulationen der Ganzkörpermuskulatur und eine Versteifung der Gliedmaßen auftreten. Dann reduzieren Sie die Durchflussrate auf 2 Tropfen/s, bis das gesamte Fixativ perfundiert ist.
8. Bestätigen Sie eine erfolgreiche Fixierung, wenn das Gehirn blass und fest erscheint.

8. Gehirndissektion

1. Nach der Perfusion enthaupten Sie die Ratte und entfernen Sie vorsichtig das gesamte Gehirn aus dem Schädel.
2. Schneiden Sie den Schädel entlang der sagittalen Naht mit einer Schere ein. Entfernen Sie Parietal- und Hinterhauptknochen mit Knochen-Rongeuren.
3. Heben Sie das Gehirn vorsichtig mit einem Pfannenwender an und trennen Sie mit einer feinen Schere die Schädel- und Sehnerven.
4. Für die Immunhistochemie: Sofort das gesamte Gehirn in 4 % Paraformaldehyd übertragen und 24 Stunden bei 4 °C postfixieren.
5. Für eine quantitative PCR in Echtzeit: Die Gehirnoberfläche mit vorgekühlter Kochsalzlösung spülen, mit Filterpapier trocken tupfen, 5–10 Minuten in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei –80 °C lagern. Führe alle Schritte auf dem Eis aus.

9. Immunhistochemische Färbung

1. Implantieren Sie das Gewebe des Hypothalamus in Paraffin und schneiden Sie koronale Schnitte mit einer Dicke von 4–5 μm mit einem Mikrotom. Teile auf Anti-Drop-Rutschen montieren und bei 65 °C 1,5–2 Stunden backen.
2. Entwachse Abschnitte in Xylol I und II (jeweils 10 Minuten). Rehydrieren durch klassifiziertes Ethanol: wasserfreies Ethanol I und II (jeweils 5 Minuten), dann 95 %, 90 %, 80 %, 70 % Ethanol (jeweils 5 Minuten), dann destilliertes Wasser (5 Minuten).
3. Führen Sie Antigengewinnung durch, indem Sie Abschnitte in einen siedenden 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) in einem Schnellkochtopf legen. Erhitze, bis das Druckventil ansteigt, dann die Heizung ausschalten. 10 Minuten einweichen lassen und dann natürlich auf Zimmertemperatur abkühlen.
4. Inaktivieren Sie endogene Peroxidase, indem Sie Abschnitte in frischen 3 % H₂O₂ für 10 Minuten bei Zimmertemperatur eintauchen. Wasche 3 × mit PBS (jeweils 5 Minuten).
5. Kreise Gewebe mit einem Immunhistochemie-Stift. Trage den polyklonalen Antikörper von Rabbit Anti-HCRT/Orexin-A auf (Verdünnung 1:50, ~50 μL pro Objektträger). Über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Box bebrüten.
6. Am nächsten Tag wärme ich sie 20 Minuten bei Zimmertemperatur auf. Wasche 3 × mit PBS (jeweils 5 Minuten).
7. Tragen Sie einen sekundären Antikörper mit Meerrettichperoxidase auf. Inkubiere 20 Minuten bei Zimmertemperatur. Wasche 3 × mit PBS (jeweils 3 Minuten).
8. Verwenden Sie eine mit Meerrettich beschriftete Streptavidin-Arbeitslösung. Inkubiere 20 Minuten bei Zimmertemperatur. Wasche 3 × mit PBS (jeweils 5 Minuten).
9. Bereite DAB-Chromogenlösung vor (0,85 mL destilliertes Wasser + jeweils 50 μL der Reagenzien A, B, C). Auf Schnitte auftragen und 3–10 Minuten bei Raumtemperatur entwickeln, unter Beobachtung unter dem Mikroskop. Stoppe die Reaktion, indem du sie 3 Minuten lang in Leitungswasser tauchst.
10. Gegenverfärbung mit Hämatoxylin für 3 Minuten. Differenzieren Sie in 1 % Salzsäurealkohol für 1–2 Sekunden. Blau im Leitungswasser für 5 Minuten.
11. Dehydrieren Sie durch destilliertes Wasser (3 Min), 70 %, 80 %, 90 %, 95 % Ethanol (jeweils 3 Min) und wasserfreies Ethanol I und II (jeweils 5 Min). Kläre in Xylen I und II (jeweils 5 Minuten).
12. Trage neutrales Balsam und Deckdeckel auf. Trockne über Nacht bei 37 °C.
13. Beobachten und fotografieren Sie Schnitte mit einem Lichtmikroskop (40×, 100×, 200×, 400×). Zählen Sie Orexin-A-positive Zellen (braunes granuläres Präzipitat im Zytoplasma) mit ImageJ.
14. Berechnen Sie den Gesamtwert (0–12) als Intensitätsscore für die Färbung (0 = negativ, 1 = hellgelb, 2 = hellbraun, 3 = dunkelbraun) multipliziert mit dem positiven Zellprozentwert (0 = 0 %, 1 = 1–25 %, 2 = 26–50 %, 3 = 51–75 %, 4 = 76–100 %). Definiere 1–5 als niedrige Expression, 6–12 als hohe Expression.

10. Echtzeit-quantitative PCR für Orexin-A mRNA

1. Die RNA-Verarbeitung nach dem Auftauen des Gewebes muss unter RNase-freien Bedingungen erfolgen. Die spezifischen RNase-freien Anforderungen sind wie folgt:
   1. Arbeitsumgebung: Verwenden Sie einen speziellen RNA-Arbeitsbereich, der mit einem RNase-Dekontaminant abgewischt und UV-Bestrahlung ausgesetzt wurde.
   2. Verbrauchsgüter: Verwenden Sie zertifizierte RNase-freie Zentrifugenröhren und Pipettenspitzen oder weichen Sie sie alternativ in 0,1 % DEPC-Wasser und anschließend in Autoklaven.
   3. Reagenzien: Verwenden Sie einen RNase-freien Lysepuffer und mit DEPC behandeltes Wasser.
   4. Bedienung: Tragen Sie während des gesamten Eingriffs puderfreie Handschuhe, wechseln Sie häufig die Handschuhe und vermeiden Sie direkten Kontakt mit dem Inneren der Verbrauchsmaterialien und den Proben.
   5. Experimentelles Verfahren
      HINWEIS: Während der RNA-Extraktion und der Reverse-Transkriptionsschritte müssen alle Verbrauchsmaterialien und Werkzeuge, die mit RNA oder Reverse-Transkriptionsreagenzien in Kontakt kommen, RNasefrei sein. In der PCR-Amplifikationsphase, da cDNA eine doppelsträngige Struktur ist und RNase doppelsträngige DNA nicht abbauen kann, müssen Verbrauchsmaterialien und Werkzeuge in diesem Stadium lediglich frei von DNase und anderen Verunreinigungen sein, die PCR-Reaktionen hemmen könnten; eine weitere RNase-freie Behandlung ist nicht erforderlich. Zerkleinern Sie gefrorenes Hypothalamus unter flüssigem Stickstoff. Wägen Sie 50–100 mg Gewebepulver in eine Tube mit 1 ml Trizol. Rühren und 15 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
2. Fügen Sie 200 μL Chloroform hinzu, mischen Sie durch Inversion und stehen Sie 5 Minuten bei Zimmertemperatur. Zentrifugiere bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C.
3. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Rohr. Gleiche Menge Isopropanol hinzufügen, mischen und 35 Minuten bei –20 °C stehen. Zentrifugiere bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C. Entsorge das Supernatant.
4. Waschen Sie den Niederschlag mit 75 % Ethanol, zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C. Werfen Sie das Überdachungsmittel weg und wiederholen Sie das Waschen einmal.
5. Lufttrocknen Sie bei Zimmertemperatur. Lösen Sie sich in RNase-freiem Wasser.
6. Messung der RNA-Konzentration und -Reinheit (A260/A280-Verhältnis 1,8–2,1). Beurteile die Integrität anhand von 1 % Agarose-Gel-Elektrophorese (klare 28S- und 18S-Bänder, schwaches oder fehlendes 5S-Band).
7. Bereite eine Reverse-Transkriptionsreaktion vor (20 μL): 800 ng Gesamt-RNA, 1 μL Zufalls-Primer (0,1 μg/μL), 10 μL 2× TS-Reaktionsmischung, 1 μL TransScript RT/RI-Enzymmischung, 1 μL gDNA-Entferner und RNase-freies Wasser auf Volumen.
8. Inkubieren Sie bei 25 °C für 10 Minuten, dann bei 85 °C für 5 Sekunden, um die cDNA des ersten Strangs zu synthetisieren. Verdünne cDNA 1:1 mit RNase-freiem Wasser.
9. Bereite qPCR-Reaktion vor (10 μL): 5 μL EvaGreen 2× qPCR MasterMix, 0,3 μL Vorwärtsprimer (10 μM), 0,3 μL Rückwärtsprimer (10 μM), 1 μL cDNA-Vorlage, RNase-freies Wasser auf Volumen. In dreifacher Ausführung laufen.
   HINWEIS: Primer: Orexin-A-F: 5'-CGCCAGAAGACGTGTGTTCCT-3'; Orexin-A-R: 5'-GCCGCTTTCCCAGAGTGAG-3' (Produktlänge 88 bp); β-Actin-F: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
   β-Actin-R: 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTTTC-3' (Produktlänge 150 bp).
10. Führe das qPCR-Programm durch: 95 °C für 30 Sekunden (vor der Denaturierung); 40 Zyklen à 95 °C für 5 Sekunden (Denaturierung) und 60 °C für 30 Sekunden (Glühen/Verlängerung).
11. Überprüfen Sie Amplifikations- und Schmelzkurven. Geben Sie 5 μL Produkt mit 2 % Agarosegel, um die Spezifität zu bestätigen.
12. Berechnen Sie die relative Orexin-A-mRNA-Expression mit der 2^{⁻ΔΔCt-Methode} und β-Actin als interne Kontrolle.

11. Statistische Analyse

1. Verwenden Sie SPSS 26.0 für die Datenanalyse. Drücken Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardabweichung aus. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen verwenden Sie unabhängige Stichproben mit t-Test , falls die Daten normalverteilt sind; ansonsten verwenden Sie den Mann-Whitney U-Test.
2. Für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen verwenden Sie den Einweg-ANOVA mit dem LSD-Post-hoc-Test für homogene Varianzen oder den Tamhane-Test für heterogene Varianzen. Wenn die Daten nicht normal verteilt sind, verwenden Sie den Kruskal-Wallis H-Test. Betrachten wir P < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt, dass im Vergleich zu Gruppe A die Schlaflatenz in den Gruppen B, C und D signifikant verlängert war und die Schlafdauer nach der Modellierung signifikant verkürzt wurde, was darauf hindeutet, dass das primäre Schlaflosen-Rattenmodell erfolgreich etabliert wurde. Die Ergebnisse in Tabelle 2 und Tabelle 3 bieten vorläufige Unterstützung für die therapeutische Wirkung von Tuina bei der Behandlung von Schlaflosigkeit. Der Open-Field-Test (OFT) ist eines der klassischsten und am häufigsten verwendeten Paradigmen in der Verhaltensneurowissenschaft zur Bewertung angstähnlichen Verhaltens^{bei Nagetieren}. Studien haben gezeigt, dass die Präferenz für den Viereckenbereich ein sensibler Indikator zur Messung angstähnlichen Verhaltens ist und bei mittleren bis niedrigen Angstniveaus diskriminierender sein kann als der zentrale Bereich. Die Schlaflosigkeitsmodellratten zeigten signifikante angstähnliche Verhaltensweisen und Veränderungen^16,17 im explorativen Verhalten, während die Tuina-Intervention das angstähnliche Verhalten bei diesen Ratten effektiv linderte. Die molekularbiologischen Ergebnisse in Tabelle 4 und Tabelle 5 sowie Abbildung 1 zeigen zudem, dass Tuina die Überexpression von Orexin-A im Hypothalamus von Schlaflosigkeitsmodellratten effektiv herunterreguliert.

Abbildung 1: Ergebnisse der immunohistochemischen Färbung von Orexin-A im Hypothalamus der Ratten jeder Gruppe (40×, 100×, 200×, 400×). (A) Orexin-A-positive Neuronen wurden im hypothalamischen Gewebe der Ratten beobachtet und traten als dunkelbraune, granulare Signale auf. Der Färbungsintensitätswert betrug 3 Punkte, der Prozentsatz positiver Zellen lag bei 40 % (im Bereich von 26–50 % und erzielte 2 Punkte) und der Gesamtwert lag bei 6 Punkten, was im Bereich der hohen Expression liegt. (B) Die Anzahl der Orexin-A-positiven Neuronen im hypothalamischen Gewebe der Ratten war im Vergleich zur normalen Gruppe signifikant erhöht, mit einer dichteren Verteilung positiver Zellen. Der Färbungsintensitätswert betrug 3 Punkte (dunkelbraun), der Anteil positiver Zellen erreichte 80 % (im Bereich von 76 % bis 100 % und 4 Punkte), und der Gesamtwert lag bei 12 Punkten, was im Bereich der hohen Expression liegt. (C) Die Anzahl der Orexin-A-positiven Neuronen im Ratten-Hypothalamus Gewebe war im Vergleich zur Modellgruppe reduziert. Der Färbungsintensitätswert lag bei 3 Punkten (dunkelbraun), der Prozentsatz positiver Zellen bei 75 % (im Bereich von 51 % bis 75 % und erreichte 3 Punkte) und der Gesamtwert lag bei 9 Punkten, was im Bereich der hohen Expression liegt. (D) Die Anzahl der Orexin-A-positiven Neuronen im Ratten-Hypothalamus Gewebe war im Vergleich zur Modellgruppe ebenfalls reduziert. Der Färbungsintensitätswert betrug 3 Punkte (dunkelbraun), der Prozentsatz positiver Zellen lag bei 60 % (im Bereich von 51 % bis 75 % und erreichte 3 Punkte) und der Gesamtwert lag bei 9 Punkten, was im Bereich der hohen Expression liegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Gruppe	Schlaflatenz / min	Schlafdauer / Min
A	4.13 ± 1.80	49,75 ± 38,46
B	6,31 ± 2,80*	22.13 ± 11.41*
C	6,33 ± 2,60*	24,93 ± 14,43*
D	6,53 ± 1,90*	24,73 ± 17,59*

Tabelle 1: Vergleich von pentobarbital-natriuminduzierten Schlaftests zwischen Gruppen nach Modellierung. * zeigt P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe an.

Gruppe	Aufgestautungsfrequenz	Immobilitätszeit (s)	Fortbewegungszeit (s)	Fortbewegungsentfernung (m)	Zeit in der Center Zone (s)	Entfernung in der Mittelzone (m)	Zeit in der Eckzone (s)	Distanz in der Eckzone (m)	Zeit in der Eckzone (s)	Entfernung in der lateralen Zone (m)
A	1,875 ± 0,835	76.700 ± 34.324	103.350 ± 34.307	18.318 ± 16.314	8.750 ± 7.718	2.937 ± 5.112	103.000 ± 28.582	6,315 ± 3,893	56.600 ± 27.772	6,705 ± 3,666
B	7.125 ± 5.668	31.513 ± 10.964	148.488 ± 10.964	22.399 ± 9.159	16.275 ± 10.703	3.244 ± 2.991	75.088 ± 21.561	6,578 ± 1,972	85,463 ± 23,374	11,724 ± 4,959
T-Wert	-2.592	3.547	-3.545	-0.617	-1.613	-0.146	2.205	-0.171	-2.249	-2.302
P-Wert	0.035	0.007*	0.007*	0.547	0.129	0.886	0.045*	0.867	0.041*	0.037*

Tabelle 2: Analyse des Einflusses jeder Indikatorebene zwischen der Kontrollgruppe (A) und der Modellgruppe (B).* zeigt P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Gruppe	Aufgestautungsfrequenz	Immobilitätszeit (s)	Fortbewegungszeit (s)	Fortbewegungsentfernung (m)	Zeit in der Center Zone (s)	Entfernung in der Mittelzone (m)	Zeit in der Eckzone (s)	Distanz in der Eckzone (m)	Zeit in der Eckzone (s)	Entfernung in der lateralen Zone (m)
B	5,875 ± 2,295	29.819 ± 12.871	150.219 ± 12.867	19.165 ± 8.054	24.838 ± 13.068	3.178 ± 2.438	69.075 ± 13.992	5,823 ± 1,422	83.019 ± 15.464	9,878 ± 4,393
C	6,357 ± 0,627	35.993 ± 32.237	144.021 ± 32.246	23,291 ± 4,873	14.321 ± 3.774	3.106 ± 2.214	87.057 ± 12.658 △	8.087 ± 1.496 △	68,943 ± 9,240	10.420 ± 1.225
D	6,667 ± 1,633	30.808 ± 15.389	149.200 ± 15.380	18,584 ± 4,969	27.792 ± 12.460	3.085 ± 1.114	74.600 ± 22.248	5,744 ± 1,291▲	74.192 ± 17.011	9,465 ± 3,380

Tabelle 3: Analyse des Einflusses jeder Indikatorebene bei der Modellgruppe (B), der Tuina-Gruppe (C) und der Antagonistengruppe (D). ^△P < 0,05 im Vergleich zur Modellgruppe (B); ^▲P < 0,05 im Vergleich zur Tuina-Gruppe (C).

Gruppe	Orexin-A
A	1.011 ± 0.173
B	10,436 ± 2,512△
C	2,392 ± 0,998▲
D	3,227 ± 1,703▲

Tabelle 4: Orexin-A mRNA-Expressionsniveaus im hypothalamischen Gewebe. ^△P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe (A); ^▲P < 0,05 im Vergleich zur Modellgruppe (B).

Gruppe	Orexin-A
	Färbungsintensität	Prozentsatz positiver Zellen	Prozentwerte	Partitur
A	3	40%	2	6
B	3	80%	4	12
C	3	75%	3	9
D	3	60%	3	9

Tabelle 5: Immunhistochemische Färbungswerte von Orexin-A im Hypothalamus der Ratten jeder Gruppe. Bewertungskriterien für die Färbungsintensität: 0 = negative Färbung (farblos), 1 = hellgelb, 2 = hellbraun, 3 = dunkelbraun. Prozentsatz der positiven Zellen Bewertungskriterien: 0 = 0 %, 1 = 1 %–25 %, 2 = 26 %–50 %, 3 = 51 %–75 %, 4 = 76 %–100 %. Gesamtpunktzahl = Intensitätswert der Färbung × prozentualer Wert. Gesamtwerte von 1–5 wurden als niedriger Ausdruck definiert, und Werte von 6–12 als hoher Ausdruck.

Diskussion

Diese Studie hatte zum Ziel, die Wirksamkeit von Tuina in einem primären Schlaflosigkeitsrattenmodell zu bewerten und seinen möglichen Mechanismus im Zusammenhang mit dem hypothalamischen Orexin-System zu untersuchen. Die aktuellen Ergebnisse zeigen, dass ein standardisiertes Tuina-Protokoll die Schlaflatenz und -dauer signifikant verbesserte, angstähnliche Verhaltensweisen linderte und die Überexpression von Orexin-A sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinniveau im Hypothalamus effektiv herunterregulierte. Bemerkenswert ist, dass die Wirkung von Tuina mit der des Orexinrezeptorantagonisten MK-4305 vergleichbar ist, was darauf hindeutet, dass die Modulation des Orexin-Systems ein entscheidender Mechanismus sein könnte, durch den Tuina die Schlaflosigkeit lindert.

Im Vergleich zu pharmakologischen Interventionen bietet Tuina als nicht-invasive externe Therapie Vorteile in Bezug auf Sicherheit, minimale Nebenwirkungen und Patientencompliance^12,18. Seine therapeutischen Vorteile bei Schlaflosigkeit werden durch klinische Evidenz gestützt, die Verbesserungen der Schlafqualität und des psychischen Zustands^{zeigen 18,19}. Der Mechanismus ist vielschichtig und umfasst die Regulation der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse, der Homöostase des autonomen Nervensystems und wichtiger Neurotransmitter wie 5-HT^18,20. Die Ergebnisse erweitern dieses Verständnis, indem sie das Orexin-System als spezifisches Ziel identifizieren. Orexin-Neuronen sind zentrale Treiber der Wachheit, und ihre Übererregbarkeit steht im Zusammenhang mit Schlafinstabilität 21,22,23. Die nach Tuina beobachtete Downregulation von Orexin-A scheint mit dem Effekt des neuartigen Schlaflosigkeitsmedikaments dualen Orexinrezeptorantagonisten übereinzustimmen und weist auf einen möglichen konvergenten Weg zwischen pharmakologischen und nicht-pharmakologischen Interventionen^{hin 24,25}.

Während diese Studie auf unserer zuvor veröffentlichten Arbeit zu abdominalem Tuina und Orexin-A Regulation²⁵ aufbaut, stellt das aktuelle Manuskript eine erhebliche Erweiterung und methodische Verfeinerung über den ursprünglichen Bericht hinaus. Konkret erweitert diese Studie die Stichprobengröße auf 64 Ratten, um die statistische Leistungsfähigkeit zu verbessern, und führt eine umfassende Reihe von Verhaltensanalysen ein, darunter den Open-Field-Test und pentobarbital-induzierte Schlaftests, um systematisch die Schlafarchitektur und angstähnliche Verhaltensweisen zu bewerten, die in der vorherigen Studie nicht behandelt wurden. Im Gegensatz zur vorherigen Arbeit, die sich stark auf oxidativen Stress und klassische Neurotransmitter konzentrierte, priorisiert dieser Artikel die funktionelle Validierung des Orexin-Systems durch integrierte Verhaltensergebnisse und molekulare Tests und dient als eigenständige mechanistische Untersuchung, die die vorherigen Ergebnisse eher ergänzt als repliziert.

Das experimentelle Design orientierte sich an die TCM-Theorie, indem es sich auf den Bauchraum und spezifische Akupunkte wie Guanyuan (CV 4) konzentrierte, von dem angenommen wird, dass es das urzeitliche Qi tonifiziert und die viszerale Funktion reguliert, innerhalb eines geschlossenen Manipulationspfades^26,27. Die Parameter (Häufigkeit, Dauer, Verlauf) wurden auf Grundlage von Vorarbeiten standardisiert, um Konsistenz und Reproduzierbarkeit sicherzustellen, ein entscheidender Aspekt für mechanistische Tierstudien¹².

Dieses Protokoll hat jedoch Einschränkungen. Zunächst wurde die Intervention zu einem einzigen Zeitpunkt nach der Modellierung durchgeführt. Künftige Studien sollten verschiedene Interventionszeiten und -häufigkeiten untersuchen, um eine optimale "Dosis-Antwort"-Beziehung für Tuina herzustellen. Zweitens ist diese Studie ein beobachtendes Forschungsdesign. Obwohl eine Korrelation zwischen Tuina und der verminderten Expression von Orexin-A und der Verhaltensverbesserung festgestellt wurde, ist weiterhin unklar, ob dieser Zusammenhang ein direkter oder indirekter Effekt von Tuina oder anderer Faktoren ist. Zukünftige Forschungen können experimentelle Strategien wie Gen-Knockout, Chemogenetische Hemmung oder Antagonistenblockade nutzen, um weiter zu überprüfen, ob Tuina das Schlaflosigkeitsverhalten durch die Regulierung der Orexin-A-Expression verbessert und so dessen kausalen Mechanismus aufklärt. Schließlich stellte diese Studie weder eine Placebo-Kontrollgruppe noch eine Placebo-Intervention fest. Diese Studie hat dies jedoch beim Design berücksichtigt, und alle Tiergruppen erhielten das gleiche Maß an Greif- und Fixationsoperationen, die bis zu einem gewissen Grad den Einfluss unspezifischer Stressfaktoren kontrollierten. Darüber hinaus wurden die Häufigkeit, Intensität und der Aktionsweg des Tuina-Programms in dieser Studie auf Grundlage von vorläufigen Experimenten standardisiert, um Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Intervention sicherzustellen. Künftige Forschung sollte sich darauf konzentrieren, strengere Kontrollmethoden zu entwickeln, wie etwa kontaktlose Simulation oder minimale taktile Stimulation, um die spezifischen Auswirkungen der Tuina-Operationen zu klären.

Wichtige Schritte, die für den Erfolg dieses Protokolls entscheidend sind, sind: Erstens eine strikte Kontrolle der Wassertemperatur und der Plattformmaße in der modifizierten Methode der Wasserumgebung mit mehreren Plattformen; zweitens, vorexperimentelle Titration der subschwellenwerten Pentobarbital-Natriumdosis; drittens, Standardisierung der Tuina-Manipulationsparameter (Frequenz von 5–7 Zyklen/min, gegen den Uhrzeigersinn und dann im Uhrzeigersinn jeweils 5 Minuten) und Bedienerschulung; und viertens das schnelle Einfrieren des hypothalamischen Gewebes in flüssigem Stickstoff, gefolgt von RNase-freier Handhabung zur Sicherstellung der Stabilität von Orexin-A-mRNA.

Mögliche Modifikationen umfassen: Erstens die Entwicklung eines automatisierten mechanischen Tuina-Geräts zur Verringerung der Variabilität zwischen den Bedienern; zweitens, der Einsatz von EEG/EMG-Telemetrie als Ersatz für den Pentobarbital-Natrium-Schlaftest, wodurch eine kontinuierliche Überwachung der Schlafphasen ermöglicht wird; und drittens die Kombination chemogenetischer oder optogenetischer Ansätze, um die Notwendigkeit von Orexin-Neuronen zur Vermittlung der Effekte von Tuina zu überprüfen.

Die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls basiert auf detaillierten operativen Trajektorien und Parametern, der Verwendung eines positiven Kontrollmedikaments, der Erkennung in zwei Dimensionen sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene sowie einer rigorosen statistischen Berichterstattung. Seine praktische Nutzbarkeit spiegelt sich in folgenden Aspekten wider: niedriger Gerätebedarf für Verhaltenstests ohne teure Telemetriesysteme; ein gesamter experimenteller Zyklus von nur 8 Tagen für die Modellierung und 14 Tage für die Tuina-Intervention, der innerhalb von 4 Wochen abgeschlossen wird und gut zu den Finanzierungszyklen und Laborplänen der meisten routinemäßigen Forschungsprojekte passt und eine schnelle Datenerhebung sowie methodische Validierung erleichtert. Darüber hinaus wird das Tuina-Manipulationsprotokoll eindeutig in Bezug auf operative Trajektorie (CV15 → CV4 → bilaterale GB26 → Rückkehr zu CV15), Frequenz (5–7 Zyklen/min), Richtungsabfolge (gegen den Uhrzeigersinn gefolgt von im Uhrzeigersinn) und die Dauer (10 Minuten pro Sitzung) klar quantifiziert. Diese Spezifikationen ermöglichen es verschiedenen Bedienern, die Technik nach kurzer Ausbildung zu beherrschen, wodurch das Risiko einer schlechten Reproduzierbarkeit durch individuelle Unterschiede, wie sie häufig in manuellen Manipulationsstudien beobachtet werden, verringert wird.

Während der Umsetzung dieses Protokolls können mehrere häufige Probleme auftreten, und geeignete Fehlerbehebungsmaßnahmen werden empfohlen. Erstens können Ratten während des modifizierten Mehrplattform-Wasserumgebungsverfahrens von der Plattform fallen. Dies wird meist durch eine extrem rutschige Plattformoberfläche verursacht. Die Lösung besteht darin, die Plattformoberfläche leicht mit feinem Schleifpapier zu rauen, um die Reibung zu erhöhen. Außerdem sollte jeder Behälter nur eine Ratte beherbergen, um gegenseitige Störungen zu vermeiden. Zweitens kann der Pentobarbital-Natrium-Schlaftest keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zeigen. Die Lösung besteht darin, die minimale Sub-Schwellen-Dosis in 5 mg/kg-Schritten während der Pilotversuche mit einer separaten Tierkohorte (3–4 pro Gruppe) neu zu titrieren. Injektionen sollten jeden Tag zur gleichen Zeit (vorzugsweise zwischen 9:00 und 11:00 Uhr) durchgeführt werden, um zirkadiane Schwankungen zu minimieren. Drittens können Ratten sich während der Tuina-Manipulation wehren oder Laute geben, was typischerweise auf übermäßige Gewalt oder unangemessene Fixierung hinweist. Der Bediener sollte die aufgebrachte Kraft reduzieren, bis die Ratte ruhig bleibt und sich wehrt. Vorherige Schulungen mit einer druckempfindlichen Dummy werden empfohlen, um die Kraftanwendung zu standardisieren. Die Ratte sollte im Rücken liegen und alle vier Gliedmaßen vorsichtig, aber sicher fixiert sein, um den Bauch vollständig freizulegen. Viertens entsteht die große Variabilität des Prozentsatzes der Orexin-A-positiven Zellen innerhalb derselben experimentellen Gruppe oft durch inkonsistente Schnittebenen im Hypothalamus, subjektive Zählverzerrung oder Batch-zu-Batch-Unterschiede bei der Färbung. Die empfohlene Lösung besteht darin, die anatomische Ebene zu standardisieren, indem man auf einen Rattenhirnatlas (z. B. Paxinos & Watson) verweist und koronale Schnitte von Bregma –1,8 mm bis –3,3 mm für die hypothalamische Analyse sammelt. Zwei unabhängige Beobachter, die der Gruppenzuweisung blind sind, sollten Zellzählungen durchführen, und der Durchschnittswert sollte verwendet werden. Alle Proben für ein gegebenes Ergebnismaß sollten in derselben Charge gefärbt werden, und eine halbautomatisierte Schwellenwertanalyse mit ImageJ wird empfohlen, um die Subjektivität des Beobachters zu verringern.

Abschließend etablierte diese Studie ein standardisiertes Tuina-Interventionsprotokoll und ein mehrstufiges Bewertungssystem in einem primären Schlaflosigkeitsmodell. Es liefert überzeugende Beweise dafür, dass Tuina Schlaflosigkeitsverhalten verbessert, möglicherweise durch einen Mechanismus, der die Unterdrückung der hypothalamischen Orexin-A-Überexpression beinhaltet. Dieser methodische Rahmen bietet nicht nur ein reproduzierbares Paradigma zur Untersuchung der zentralen Mechanismen von Tuina, sondern dient auch als Referenz für mechanistische Studien anderer nicht-pharmakologischer Interventionen bei Schlafstörungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5x All-In-One RT MasterMix	abm	G492	cDNA-Synthese
Acetylcholin (Ach)	Nanjing Jiancheng	A105-1	ELISA-Reagenz
Adhärenz-Mikroskop-Objektträger	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Gewebesektionsmontage
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A811BA0014	Gelelektrophorese
Wasserfreies Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Gewebeentwässerung
Antikörperdiluent	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9029	Primärantikörperverdünnung
Korb	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	N/A	Objektträgerhalter
Citratpulver	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	MVS-0066	Antigen-Retrieval-Puffer-Zubereitung
Deckglas	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Mikroskopie
DAB-Chromogen-Kit	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	DAB-1031	Chromogene Detektion
DEPC	Sangon Biotech (Shanghai)	B417BA0001	RNase-freie Behandlung
Dopamin (DA)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08660r	ELISA-Reagenz
Elektrophoresezelle	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYCZ-21	Gelelektrophorese
Elektrophorese-Stromversorgung	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C	Gelelektrophorese
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	qPCR-Reagenz
Gamma-Aminobuttersäure (γ-GABA)	AMOKE	AE91068Ra	Neurotransmitter ELISA-Reagenz
Gel-Imaging-System	Shanghai Tanon	2500	Gel-Dokumentation
H2O2 (30%)	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Endogene Peroxidase-Blockierung
Hämatoxylin-Färbelösung	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	CTS-1097	Gegenfärbung
Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge	Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.	Nefuqe 15R	Probezentrifugation
Histamin (HIS)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	EH171-1	ELISA-Reagenz
Heißlufttrockner	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DHG-Serie	Trocknen von Proben
IHC-Färbe-Feuchtigkeitskammer	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	BOX-1001	Feuchte Inkubationskammer
Immunhistochemie-Färbe-Kit	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	SP9000	IHC-Färbung
Inkubator	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DNP-9272	Temperaturgesteuerte Inkubation
Induktionskocher	Guangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.	C21-RK2101	Wärmequelle
Mikroplatten-Reader	Bio-Rad, China	xMark	Extinktionsmessung
Mikroskop	Nikon	E200	Mikroskopische Bildgebung
MK-4305	Meilun Bio	MB3773	Experimentelles Reagenz
Neutrales Balsam	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9555	Einbettungsmittel
Noradrenalin (NA)	Nanjing Jiancheng	H096	ELISA-Reagenz
Nukleinsäure- und Proteinquantifikator	Beijing Kaiao	K5500	Nukleinsäurenquantifizierung
Orexin A	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08860r	ELISA-Reagenz
PCR-Thermocycler	Bio-Rad, USA	MyCycler Thermal Cycler	PCR-Amplifikation
Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PBS-0060/0061	Spülpuffer
Pipette	Eppendorf, Deutschland	Dragon lab	Flüssigkeitshandhabung
Druckkocher	Zhejiang Supor Co., Ltd.	YW20F1	Antigen-Retrieval
Proteinquantifizierungs-Kit	TransGen Biotech	DQ111-01	BCA-Protein-Assay-Kit
Kaninchen-Anti-HCRT (Orexin-A)-Polyklonales Antikörper	Sangon Biotech (Shanghai)	D163595	Primärantikörper
Real-Time-PCR-Gerät	ABI (Thermo Fisher)	QuantStudio 6 Flex	qPCR-Analyse
Kühlschrank	Hefei Meiling Co., Ltd.	BCD-249LCK	Stichprobenlagerung
Serotonin (5-HT)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08364r	ELISA-Reagenz
Färbeglas	Generisch	N/A	Objektträger-Färbebehälter
Super-Immunhistochemie-Stift	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PEN-0002	Hydrophobe Barriere-Stift
Trans2K DNA-Marker	TransGen Biotech	BM101	DNA-Leiter
TRIzol Reagenz	Ambion	15596026	RNA-Extraktion
Vortex-Mischer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	GL-88B	Labormischer
Xylol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Deparaffinierung