Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Menschen induzierte pluripotente, von Stammzellen abgeleitete Kardioiden als Modell zur Bewertung der Oligonukleotidabgabe

195 Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/72013

⸱

11. August 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung von selbstorganisierenden, kardiomyozytenbasierten Kardioiden aus menschlich induzierten pluripotenten Stammzellen zur mikroskopischen Beurteilung der fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidaufnahme.

Zusammenfassung

Oligonukleotidbasierte Therapeutika stellen eine sich schnell entwickelnde Medikamentenklasse mit erheblichem Potenzial zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen dar; Die effiziente Abgabe an das Herzgewebe bleibt jedoch eine kritische und ungelöste Herausforderung. Ein zentrales Hindernis ist die begrenzte Verfügbarkeit robuster, physiologisch relevanter menschlicher In-vitro-Modelle , die die quantitative Bewertung der Oligonukleotidaufnahme und intrazellulären Verteilung unterstützen können. Ein detailliertes, schrittweises Protokoll wird vorgestellt, um selbstorganisierende, 3D-Kardioide aus menschlich induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu erzeugen und sie als Plattform zur Bewertung der Aufnahme fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide anzuwenden. Das Protokoll führt die Nutzer durch die gerichtete kardiale Differenzierung in der Suspensionskultur durch zeitlich modulierende Wnt/β-Catenin-Signalübertragung, wodurch die sequentielle Spezifikation von iPSCs durch die Mesoderm-, Herzmesoderm- und Kardiomyozyten-Progenitorstufen ermöglicht wird. Unter diesen Bedingungen stellen sich Zellen spontan zu schlagenden, höhlenhaltigen dreidimensionalen Strukturen zusammen, die kanonische Kardiomyozytenmarker exprimieren. Die resultierenden Kardioide bieten eine skalierbare, experimentell handhabbare Plattform für bildgebende Bewertungen der Effizienz der Oligonukleotidaufnahme und unterstützen die Entwicklung und Optimierung von Verabreichungsstrategien für kardiale Anwendungen.

Einleitung

Oligonukleotidbasierte Therapeutika, hauptsächlich Antisense-Oligonukleotide (ASOs) und kleine interferierende RNAs (siRNAs), entwickeln sich rasch als transformativer und hochspezifischer Ansatz zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich sowohl erblicher als auch erworbener Erkrankungen 1,2,3. Diese Modalitäten ermöglichen eine direkte Modulation der Genexpression auf mRNA-Ebene durch sequenzspezifische Bindung an Zieltranskripte, wodurch Gen-Silencing oder Splicing-Korrektur krankheitsassoziierter Gene möglich sind, die konventionellen Therapien mit kleinen Molekülen oft nicht zugänglich sind 4,5. Daher bieten oligonukleotidbasierte Gentherapeutika eine vielseitige Plattform, um verschiedene pathogene Mechanismen in verschiedenen Krankheitsbereichen, einschließlich kardiovaskulärer Erkrankungen6, anzusprechen. Bis heute wurden mehrere oligonukleotidbasierte Therapeutika, darunter ASOs, siRNAs und Verbindungsswitching-Wirkstoffe, für den klinischen Einsatz zugelassen7. Trotz dieses Fortschritts bleibt ihre therapeutische Wirksamkeit sowohl präklinisch als auch klinisch durch eine ineffiziente intrazelluläre Abgabe8 eingeschränkt. Aktuelle Schätzungen zeigen, dass weniger als 1 % der internalisierten Oligonukleotide endosomale Kompartimente verlassen, um das Zytosol zu erreichen und ihre Ziel-RNA zu bekämpfen, wodurch die funktionelle Aktivität 9,10 begrenzt wird. Diese Einschränkung ist besonders ausgeprägt im Herzgewebe, wo Aufnahme und intrazellulärer Transport nur wenig verstanden sind.

Historisch gesehen stützte sich die präklinische Bewertung kardiovaskulärer Therapeutika stark auf Tiermodelle, die für die Bewertung von Pharmakokinetik, Bioverteilung, Wirksamkeit und Sicherheit in vivo unentbehrlich sind. Wichtige Unterschiede zwischen den Arten in kardialer Physiologie, Genregulation und zellulären Antworten schränken jedoch oft ihre Fähigkeit ein, therapeutische Wirksamkeit und Toxizität beim Menschen genau vorherzusagen. Diese Einschränkungen haben die Entwicklung von humanbasierten In-vitro-Modellen mit verbesserter physiologischer Relevanz vorangetrieben. Unter diesen hat die vom Menschen induzierte pluripotente Stammzelltechnologie (iPSC) die Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen revolutioniert, indem sie eine nahezu unbegrenzte Zellquelle bereitstellt, die in kardiovaskuläre Linien differenziert werden können. Humane iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) wiederholen viele molekulare, strukturelle und funktionelle Eigenschaften des menschlichen Myokards und sind zu einer weit verbreiteten Plattform für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen, Arzneimittelreaktionen und neuen therapeutischenModalitäten geworden. Konventionelle zweidimensionale Kulturen menschlicher iPSC-CMs haben jedoch wichtige Einschränkungen. Die meisten Differenzierungsprotokolle erzeugen Kardiomyozyten, die eher fetalen als adulten Zellen ähneln und unreife strukturelle, elektrophysiologische, metabolische und kontraktile Eigenschaften aufweisen12.

Zudem fehlen Monoschichtkulturen die dreidimensionale (3D) Gewebearchitektur, mehrzellige Interaktionen und die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, die die Funktion der Kardiomyozyten in vivo beeinflussen. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurden immer ausgefeiltere 3D-Herzmodelleentwickelt. Unter diesen fördern Engineered Heart Tissues (EHTs), die durch Einbettung von iPSC-CMs in Biomaterialgerüste und mechanische sowie elektrische Stimulation erzeugt werden, die strukturelle und funktionelle Reifung, während sie die biomechanische Umgebung des nativen Myokards13 enger reproduzieren. Obwohl EHTs physiologisch sehr relevante Plattformen für Krankheitsmodellierung und Arzneimitteltests bieten, erfordert ihre Erstellung typischerweise spezialisierte biotechnische Expertise und spezielle Ausrüstung. Am anderen Ende des Spektrums bewahren ex vivo kardiale Gewebeschnitte am ehesten die native Gewebearchitektur und zelluläre Zusammensetzung, sind jedoch auf den Zugang zu primärem Herzgewebe angewiesen, haben eine begrenzte Vitalität in der Kultur und sind nicht leicht skalierbar.

In jüngerer Zeit sind kardiale Organoide als zugängliche 3D-Modellsysteme entstanden, die zentrale Aspekte der Herzgewebsorganisationund -funktion wiederholen. Kardioide sind sich selbst assemblierende kardiale Organoide, die überwiegend aus Kardiomyozyten bestehen, welche intrinsische Spezifikation, räumliche Musterbildung und Morphogenese durchlaufen, um kammerartige, höhlenhaltige Strukturen zu bilden15,16. Methoden zur Bildung von Kardioiden basieren typischerweise auf einer anfänglichen Aktivierung der Wnt-Signalübertragung, um die Mesoderm-Spezifikation zu induzieren, gefolgt von anschließender Hemmung zur Förderung der Herzlinien-Verpflichtung. Kardioide können entweder in statischen oder gerührten Suspensionskulturen erzeugt werden, die eine skalierbare Produktion unterstützen und die Gewebeselbstorganisation verbessern 15,16,17,18,19. Komplexere multilineale kardiale Organoide, die endotheliale, epikardiale oder andere Zelltypen integrieren, erhöhen die physiologische Relevanz weiter, erfordern jedoch aufwendigere Differenzierungsprotokolle, längere Kulturperioden und umfangreiche Optimierung 13,14.

Ein einfaches, reproduzierbares und effizientes Protokoll wird vorgestellt, um selbstorganisierende, kardiomyozytenbasierte Kardioide aus humanen iPSCs zu erzeugen und diese zur Bewertung der Aufnahme fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide anzuwenden. Das Protokoll sollte sich als wertvoll für Forscher erweisen, die die Oligonukleotidchemie und -abgabestrategien für kardiovaskuläre Anwendungen optimieren möchten. Alle in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Kultur und Vorbereitung von iPSCs zur Differenzierung

VORSICHT: Führen Sie alle offenen Handhabungen von Zellen und Medien in einem zertifizierten Biosicherheitsschrank der Klasse II durch. Trage einen Laborkittel und Handschuhe. Dekontaminieren Sie Arbeitsflächen und flüssige Abfälle mit einem geeigneten Desinfektionsmittel.

  1. Pflegen Sie iPSCs.
    1. Beschichten Sie Kulturplatten mit einer geeigneten Basalmembranmatrix gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Füttere iPSCs mit einem definierten, futterfreien, pluripotenten Stammzellmedium und ersetze das Medium alle 24 Stunden.
    3. Kulturen unterhalb der Überkonfluenz und Passagezellen halten, wenn sie 70–80 % Konfluenz erreichen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass iPSCs eine hochwertige, undifferenzierte Morphologie bewahren und vor Beginn der Differenzierung als Mykoplasmafrei bestätigt werden.
  2. Vor-Differenzierungs-Passaging.
    1. Taue die iPSCs auf und dehne die Zellen für mindestens zwei Passagen auf, bevor die kardiale Differenzierung eingeleitet wird.
    2. Passagezellen mit einer enzymfreien Dissoziationsmethode, PBS-EDTA, kompatibel mit iPSC-Erhaltung.
      PAUSENPUNKT: Erhalten Sie die iPSCs in der Kultur, bis sie 70–80 % Konfluenz erreichen, und erhalten Sie die typische Morphologie ohne Anzeichen spontaner Differenzierung.

2. Vorbereitung von iPSC-Aggregaten in Mikrowellplatten

  1. Dissoziiere iPSCs zu einer Einzelzell-Suspension.
    1. Aspiratiere das Medium und wasche die Zellen einmal mit 1 ml 1× PBS.
    2. Zellabscheidungslösung (Accutase) bei 500 μL pro Brunnen einer 6-Well-Platte hinzufügen und bei 37 °C für 5–7 Minuten inkubieren.
    3. Fügen Sie pro Brunnen 1,5 ml Waschmedium hinzu und suspendieren Sie vorsichtig nach, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen.
    4. Übertragen Sie die Suspension in ein 15 ml konisches Rohr und zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur bei 200 × g für 3 Minuten.
    5. Aspiratieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in einem feederfreien iPSC-Medium, das mit ROCK-Inhibitor ergänzt wird (letzte 10 μM).
      HINWEIS: Passen Sie die Dissoziations-Inkubationszeit für jede iPSC-Linie an, indem Sie die Ablösung bei 5 Minuten überprüfen und bei Bedarf in kurzen Schritten verlängern.
  2. Zähle die Zellen und bereite die Panzerungsdichte vor.
    1. Zählen Sie lebensfähige Zellen mit einer Standard-Zellzählungsmethode.
    2. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension mit 0,9 × 106 Zellen/mL für jedes Bohrloch einer 800-μm-Mikrowell-Aggregationsplatte (24-Brunnen-Format, ~300 Mikrobohrungen/Bohrloch) vor.
      HINWEIS: Optimieren Sie die Zellanzahl pro Well, da die Gesamtgröße oder die Differenzierungseffizienz zwischen den iPSC-Linien variiert.
  3. Grundieren Sie die Mikrowellplatte und entfernen Sie die Blasen.
    1. Fügen Sie 500 μL feeder-freies iPSC-Medium mit ROCK-Inhibitor (finale 10 μM) zu jedem Bohrloch hinzu.
    2. Zentrifugieren Sie die Mikrowellplatte bei 300 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um Luftblasen aus den Mikrobrunnen zu entfernen.
      KRITISCH: Alle Blasen vollständig entfernen, um eine gleichmäßige Zellablagerung am Boden jedes Mikrowells zu ermöglichen und eine effiziente Aggregatbildung zu unterstützen.
  4. Säe iPSCs in Mikrowells aus.
    1. Fügen Sie jedem Bohrloch 1,0 mL der vorbereiteten Einzelzellensuspension (0,9 × 106 Zellen/mL) hinzu, was 0,9 × 106 Zellen pro Bohrloch entspricht.
    2. Lassen Sie es im Brunnen 3–5 Mal vorsichtig mit einem P1000 wieder suspendieren und vermeiden Sie das Einsetzen von Luftblasen.
    3. Zentrifugiere die Platte bei 200 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um Pelletzellen in die Mikrobrunnen zu schleudern.
    4. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen in den Mikrobrunnen eingelaufen sind, bevor Sie die Platte bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 24 Stunden platzieren.
      KRITISCH: Behandle die Platte nach der Zentrifugation vorsichtig. Bewegen oder schütteln Sie die Platte nicht, da dies dazu führen kann, dass Zellen aus den Mikrowellen herauskommen.

3. Erweiterung der iPSC-Aggregate in Mikrobohrlöchern

  1. Saugen Sie vorsichtig ab und ersetzen Sie das Medium, ohne die Zuschlagstoffe zu stören oder zu verdrängen.
    1. Neigen Sie die Platte und saugen Sie langsam etwa 1,0 ml Medium aus jedem Bohrloch mit einer P1000-Pipette ab, um sicherzustellen, dass die Zuschlagstoffe in den Mikrobrunnen sitzen.
    2. Langsam aspirieren Sie die verbleibenden ~500 μL Medium mit einer P1000-Pipette.
    3. Geben Sie jedem Brunnen 1,5 ml zuführfreies iPSC-Medium, indem Sie es langsam mit einer serologischen Pipette an der Seite des Brunnens abgeben.
    4. Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂ und wiederholen Sie täglich den Mediumwechsel.
      KRITISCH: Medium auf die Wand des Brunnens dosieren und direkten Zufluss auf Zuschlagstoffe vermeiden.

4. Kardiale Differenzierung der iPSC-Aggregate (Tag 0 bis Tag 12)

  1. Mesoderm-Einleitung (Tag 0).
    1. Entfernen Sie das Medium mit der sanften Aspirationsmethode, die in den Schritten 3.1.1–3.1.2 beschrieben ist.
    2. Fügen Sie pro Bohrloch 1,5 ml Basalmedium hinzu, ergänzt mit 2 % B27 minus Insulin und dem Wnt/β-Catenin-Aktivator (CHIR99021, Endkonzentration: 11 μM).
      HINWEIS: Bereiten Sie eine 10 mM große Grundlösung von CHIR99021 vor, einem Kleinmolekülinhibitor des Glykogensynthase-Kinase-3 (GSK-3). Um eine Endkonzentration von 11 μM zu erreichen, fügen Sie 1,65 μL der Standardlösung zu 1,5 mL Medium hinzu.
  2. Mittlere Veränderung nach der Einleitung (Tag 1).
    1. Nach 24 Stunden nach Zugabe von CHIR99021 aspirieren Sie das Medium vorsichtig aus jedem Brunnen.
    2. Fügen Sie pro Brunnen 1,5 ml frisches Basalmedium hinzu, ergänzt mit 2 % B27 minus Insulin, und inkubieren Sie dann 48 Stunden.
      KRITISCH: Halten Sie sich strikt an das Timing der Wnt-Modulationsschritte, da Abweichungen die Differenzierungseffizienz beeinträchtigen können.
      HINWEIS: Ein gewisser Zelltod wird nach der Exposition gegenüber dem Wnt/β-Catenin-Aktivator erwartet. Wenn ein weit verbreiteter aggregierter Verlust beobachtet wird, sollten Sie in zukünftigen Experimenten eine Reduzierung der Aktivatorkonzentration in Betracht ziehen.
  3. Herzaufnahme durch WNT-Hemmung (Tag 3).
    1. Bereiten Sie ein konditioniertes Medium vor, indem Sie 760 μL verbrauchtes Medium aus jedem Bohrloch in ein steriles 50-mL konisches Rohr umleiten.
    2. Für jedes Bohrloch geben Sie 760 μL frisches Basalmedium, ergänzt mit 2 % B27 minus Insulin, in das Rohr mit dem gesammelten konditionierten Medium und mischen Sie vorsichtig.
    3. Fügen Sie dem Mischmedium den Wnt-Pathway-Inhibitor IWP4 zu einer Endkonzentration von 5 μM hinzu und wenden Sie das Rohr vorsichtig mehrmals um, um zu mischen.
    4. Saugen Sie vorsichtig das verbleibende Medium aus jedem Brunnen ab und fügen Sie dann pro Brunnen 1,5 ml konditioniertes Medium hinzu, ergänzt mit IWP4.
    5. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 48 Stunden.
      HINWEIS: Bereiten Sie eine 1-mM-Lagerlösung des Wnt-Pathway-Inhibitors IWP4 vor. Um eine Endkonzentration von 5 μM zu erreichen, fügen Sie 7,6 μL der Lagerlösung pro 1,52 ml Gesamtmedium (760 μL konditioniertes Medium + 760 μL frisches Basalmedium) für jedes Bohrloch hinzu.
  4. Mittlere Veränderung in Mikrowells (Tag 5).
    1. Ersetze Medium mit dem in den Schritten 3.1.1–3.1.2 beschriebenen Sanftaspirationsansatz.
    2. Fügen Sie 1,5 ml Basalmedium mit 2 % B27 minus Insulin zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie dann bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 48 Stunden.
  5. Übertragung von Zuschlagstoffen aus Mikrobohrungen auf 6-Well-Platten (Tag 7).
    1. Saugen Sie das Medium vorsichtig aus jedem Bohrloch mit der in den Schritten 3.1.1–3.1.2 beschriebenen sanften Aspirationsmethode.
    2. Fügen Sie 1,0 ml Basalmedium mit 2 % B27 mit Insulin in jede Mulde der Mikrowellplatte hinzu. Mit einer P1000-Pipette pipettieren Sie das Medium vorsichtig fünfmal auf und ab, während die Pipettenspitze in einer kreisenden Bewegung über die Bohrlochoberfläche bewegt wird, um die Zuschlagstoffe in den Mikrobrunnen zu lösen und in die Suspension zu bringen.
    3. Übertragen Sie die Zuschlagstoffsuspension in einen einzelnen Brunnen einer unbehandelten 6-Well-Kulturplatte.
    4. Spülen Sie jeden Brunnen der Mikrowellplatte zwei- bis dreimal mit zusätzlichen 1,0 ml frischem Medium, um verbleibende Aggregate zurückzugewinnen, und übergeben Sie jede Spülung in denselben Brunnen der 6-Loch-Platte.
    5. Inkubieren bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 72 Stunden.
      HINWEIS: Das Vorhandensein von toten Zellen und Zellresten nach dem Aggregattransfer wird erwartet. Die meisten Ablagerungen werden während des anschließenden Mediumwechsels entfernt.
  6. Mittlere Veränderung während der Suspensionskultur (Tag 10).
    1. Bewegen Sie die Platte vorsichtig, um lose angesetzte Aggregate zu lösen.
    2. Neige die Platte, damit die Zuschlagstoffe durch die Schwerkraft am Boden des Brunnens absinken können.
    3. Saugen Sie das verbrauchte Material vorsichtig ab, ohne die Zuschlagstoffe zu stören oder zu aspirieren.
    4. Fügen Sie jeweils 2,0 ml frisches Basalmedium mit 2 % B27 mit Insulin hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 48–72 Stunden.
      HINWEIS: Spontanes Schlagen wird typischerweise ab etwa Tag 10 beobachtet.
      PAUSENPUNKT: Schlägende Kardioide können durch Austausch des Mediums alle 2–3 Tage in der Suspensionskultur erhalten bleiben.

5. Mikroskopische Charakterisierung von Kardioiden

HINWEIS: Diese Methode bietet einen Workflow für die histologische Charakterisierung von Kardioiden mittels Kryosektionen. Die resultierenden Schnitte können für verschiedene histologische Analysen verwendet werden, einschließlich Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbungen zur Beurteilung der Gesamtgewebearchitektur sowie der Immunfluoreszenz-Markierung zur Bewertung der Identität der Kardiomyozyten.

  1. Fixierung und Kryosektion.
    1. Über Nacht Kardioide in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C fixieren.
      VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig und wahrscheinlich krebserregend; Behandle es mit einer chemischen Abzugshaube und trage geeignete persönliche Schutzausrüstung. Sammeln Sie alle paraformaldehydhaltigen Abfälle (Fixationsmittel und Waschmittel) in einem klar gekennzeichneten Behälter für Aldehyd-/chemisch gefährliche Abfälle und entsorgen Sie sie gemäß den institutionellen Verfahren für gefährliche Abfälle.
      SICHERHEIT: Führen Sie alle Paraformaldehydfixierungen und -handhabungen in einer chemischen Dampfhaube durch, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
    2. Waschen Sie die fixierten Kardioide in 30 % (w/v) über Nacht in PBS dreimal mit PBS und Cryoprotect.
    3. Die Kardioide in Gelatine einbetten, einfrieren und 10 μm dicke Kryoschnitte auf Objektträger schneiden. Lagern Sie die Stücke bis zur Nutzung bei −20 °C.
  2. Immunkennzeichnung.
    1. Die Abschnitte 15 Minuten bei Zimmertemperatur auftauen.
    2. Waschen Sie die Abschnitte zweimal in PBS bei 37 °C für 10 Minuten.
    3. Umkreisen Sie den Interessenbereich auf jedem Objektträger mit einem hydrophoben Stift, um einen Brunnen zu schaffen, der die Blockierung und Antikörperlösungen beibehält.
    4. Rehydrieren Sie die Abschnitte für 2–3 Minuten im Permeabilisierungspuffer (PB; PBS mit 0,1 % Tween-20) in einem Coplin-Glas.
    5. Entferne die Objektträger aus PB, lasse die überschüssige Lösung ab und lege die Objektträger in eine feuchte Kammer.
      KRITISCH: Ab diesem Punkt ist es entscheidend, die Abschnitte nicht trocknen zu lassen.
    6. Blockieren Sie die Abschnitte mit 200–300 μL PB, das 5 % fetales Rinderserum (FBS) enthält, bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer für 90 Minuten.
    7. Entfernen Sie die Blocklösung und inkubieren Sie die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit 100 μL Primärantikörper (Anti-cMYBP-C; 1:50), verdünnt in Blocklösung (PB mit 1 % FBS).
    8. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PB und inkubieren Sie 2 Stunden bei Zimmertemperatur mit einem grünen fluoreszierenden Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:200), weitrotem fluoreszierendem Phalloidin (1:400) und DAPI (1 μg/mL).
    9. Dreimal in PB waschen und mit einem Antifade-Befestigungsmedium montieren.
      VORSICHT: Sammeln Sie alle fluoreszierend farbstoffhaltigen Lösungen (sekundäre Antikörper, Phalloidin und DAPI-Färbungslösungen sowie die entsprechenden Waschmittel) in einem Behälter und entsorgen Sie sie gemäß institutionellen Richtlinien als chemischer Abfall.
  3. Bildaufnahme.
    1. Aufnehmen Sie konfokale Bilder mit einem laserabtastenden konfokalen Mikroskop, das mit einem Array-Detektor ausgestattet ist, für Superauflösungsbildgebung mit einem 10×- und einem 63×/1,40-Ölimmersionsobjektiv.
    2. Erzeugen Sie den Fernrot-Fluorophor, den grünen Fluorophor und die Kernfarbe mit 639 nm, 488 nm und 405 nm Laserlinien bei 4,0 %, 4,0 % und 1,0 % Laserübertragung.
    3. Erfassen einzelner optischer Abschnitte mit einer Pixelgröße von 0,0353 × 0,0353 μm2, unidirektionales Scannen, Scangeschwindigkeit 6, Zoom 1,7, Liniendurchschnitt 1 und eine Pixel-Verweilzeit von 0,935 μs pro Pixel.
    4. Array-Detektor-Super-Resolution-Bildverarbeitung mit automatischer Wiener-Filterung anwenden.

6. Fluoreszierender Oligonukleotidaufnahmetest

  1. Bereiten Sie eine Lagerlösung des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids vor, das mit Palmitinsäure konjugiert ist, um die Lipophilie zu erhöhen.
    1. Rekonstituierte das lyophilisierte, fluoreszierend markierte Oligonukleotid in nukleasefreiem Wasser auf eine Endkonzentration von 1 mM. Kurz vortexen und bei 3.000 × g für 30 Sekunden zentrifugieren, um die Lösung am Boden des Rohrs zu sammeln.
    2. Bereite Einweg-Aliquoten der 1-mM-Lagerlösung vor und lagere bei −20 °C Lichtschutz.
    3. Am Tag des Experiments wird 1 μL des 1 mM großen Materials zu 1 ml Kardioidkulturmedium gegeben, um eine endgültige Oligonukleotidkonzentration von 1 μM zu erhalten. Mischen Sie durch sanfte Plattenbewegung.
  2. Inkubieren Sie Kardioide mit dem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid (1 μM Endkonzentration) in serumfreiem Medium bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 24 Stunden.
  3. Waschen Sie die Kardioide dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um extrazelluläres Oligonukleotid zu entfernen.
  4. Die Kardioide mit 4 % Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixieren, dreimal mit PBS waschen und vor der Bildgebung weiter fluoreszierend markieren.
  5. Inkubieren Sie intakte fixierte Kardioide über Nacht bei 4 °C, geschützt vor Licht, in PBS mit 5 μg/mL Weizenkeimagglutinin (WGA), konjugiert mit einem grünen Fluorophor und 1 μg/mL DAPI. Dreimal in PBS waschen und mit einem Antifade-Befestigungsmedium montieren.
    VORSICHT: Sammeln Sie alle oligonukleotidhaltigen und fluoreszierenden farbstoffhaltigen Medien und Waschmittel, einschließlich des gekennzeichneten Oligonukleotid-Inkubationsmediums aus Schritt 6.2 und der WGA/DAPI-Färbelösung, in einem separaten Behälter und entsorgen Sie sie gemäß den institutionellen Richtlinien als chemische/biogefährliche Abfälle.
  6. Aufnehmen Sie konfokale Bilder der Aufnahme und Verteilung von Oligonukleotiden.
    1. Aufnehmen Sie konfokale Bilder mit einem laserscannenden konfokalen Mikroskop, das mit einem Array-Detektor für Superauflösungsbildgebung und einem 40× Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist. Bilder werden als 8-Abschnitt-Z-Stacks mit einer Z-Schrittgröße von 2 μm aufgenommen, die eine Gesamttiefe von 16 μm abdecken.
    2. Erzeugen Sie die Kernfärbung, den Membranmarker und das fernrot fluoreszierend markierte Oligonukleotid mit 405 nm, 488 nm und 639 nm Laserlinien bei 0,9 %, 0,2 % bzw. 3,0 % Lasertransmission.
    3. Aufnahme von Bildern mit einer Voxelgröße von 0,0449 × 0,0449 × 2 μm3, bidirektionales Scannen, Scangeschwindigkeit 5, Liniendurchschnitt 1 und einer Pixel-Verweilzeit von 1,51 μs pro Pixel. Wenden Sie Airyscan/Super-Resolution-Bildverarbeitung mit automatischer Wiener-Filterung an.
    4. Halten Sie alle Erfassungseinstellungen (Laserleistung, Detektorverstärkung, Z-Step und Voxelgröße) über alle Z-Positionen und alle Proben hinweg konstant, um einen gültigen Vergleich des Oligonukleotidsignals zwischen den Bedingungen zu ermöglichen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 1 fasst den Differenzierungsworkflow zusammen und veranschaulicht die charakteristischen morphologischen Veränderungen, die in jeder Phase des Protokolls erwartet werden, von der iPSC-Aggregation bis zur Bildung selbstorganisierender Kardioide. Die suspensionsbasierte Mikrowell-Aggregation bietet einen einfachen und standardisierten Ansatz zur parallelen Erzeugung großer Zahlen von größenkontrollierten Kardioiden. Eine erfolgreiche Differenzierung ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Oligonukleotidbasierte Therapeutika haben sich als eine mächtige Klasse von gen-zielgerichteten Modalitäten etabliert, unterstützt durch jahrzehntelange Fortschritte in der Oligonukleotidchemie, die die Zielspezifität, metabolische Stabilität und immungene Verträglichkeit verbessert haben 7,8. Trotz der zunehmenden Zahl klinisch zugelassener RNA-Therapeutika bleibt ihre breitere Anwendung durch die ineffiziente intrazelluläre Abg...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern des Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape, insbesondere Knud Jensen für das Design und die Synthese von Oligonukleotiden sowie Nikos S. Hatzakis und Tomas Kirchhausen für wertvolle Hinweise zu quantitativer Bildgebung und intrazellulärer Trafficking-Analyse. Diese Arbeit wurde vom Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape (NNF23OC0081287) finanziert. M.F. erhielt ein Stipendium von der Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (2020.04836.BD). Wir danken GIMM Bioimaging und den GIMM Histopathology Platforms (Lissabon, Portugal) für die technische Unterstützung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

Referenzen

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Induzierte pluripotente StammzellenCardioid Modellkardiale DifferenzierungWnt Signalwegkardiales MesodermKardiomyozyten Progenitorenfluoreszierende Oligonukleotidezellul re Aufnahmedreidimensionale Cardioide

Dieser Artikel wurde veröffentlicht

Video demnächst verfügbar

Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.