Menschen induzierte pluripotente, von Stammzellen abgeleitete Kardioiden als Modell zur Bewertung der Oligonukleotidabgabe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung von selbstorganisierenden, kardiomyozytenbasierten Kardioiden aus menschlich induzierten pluripotenten Stammzellen zur mikroskopischen Beurteilung der fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidaufnahme.

Zusammenfassung

Oligonukleotidbasierte Therapeutika stellen eine sich schnell entwickelnde Medikamentenklasse mit erheblichem Potenzial zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen dar; Die effiziente Abgabe an das Herzgewebe bleibt jedoch eine kritische und ungelöste Herausforderung. Ein zentrales Hindernis ist die begrenzte Verfügbarkeit robuster, physiologisch relevanter menschlicher In-vitro-Modelle , die die quantitative Bewertung der Oligonukleotidaufnahme und intrazellulären Verteilung unterstützen können. Ein detailliertes, schrittweises Protokoll wird vorgestellt, um selbstorganisierende, 3D-Kardioide aus menschlich induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu erzeugen und sie als Plattform zur Bewertung der Aufnahme fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide anzuwenden. Das Protokoll führt die Nutzer durch die gerichtete kardiale Differenzierung in der Suspensionskultur durch zeitlich modulierende Wnt/β-Catenin-Signalübertragung, wodurch die sequentielle Spezifikation von iPSCs durch die Mesoderm-, Herzmesoderm- und Kardiomyozyten-Progenitorstufen ermöglicht wird. Unter diesen Bedingungen stellen sich Zellen spontan zu schlagenden, höhlenhaltigen dreidimensionalen Strukturen zusammen, die kanonische Kardiomyozytenmarker exprimieren. Die resultierenden Kardioide bieten eine skalierbare, experimentell handhabbare Plattform für bildgebende Bewertungen der Effizienz der Oligonukleotidaufnahme und unterstützen die Entwicklung und Optimierung von Verabreichungsstrategien für kardiale Anwendungen.

Einleitung

Oligonukleotidbasierte Therapeutika, hauptsächlich Antisense-Oligonukleotide (ASOs) und kleine interferierende RNAs (siRNAs), entwickeln sich rasch als transformativer und hochspezifischer Ansatz zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich sowohl erblicher als auch erworbener Erkrankungen ^1,2,3. Diese Modalitäten ermöglichen eine direkte Modulation der Genexpression auf mRNA-Ebene durch sequenzspezifische Bindung an Zieltranskripte, wodurch Gen-Silencing oder Splicing-Korrektur krankheitsassoziierter Gene möglich sind, die konventionellen Therapien mit kleinen Molekülen oft nicht zugänglich sind ^4,5. Daher bieten oligonukleotidbasierte Gentherapeutika eine vielseitige Plattform, um verschiedene pathogene Mechanismen in verschiedenen Krankheitsbereichen, einschließlich kardiovaskulärer Erkrankungen⁶, anzusprechen. Bis heute wurden mehrere oligonukleotidbasierte Therapeutika, darunter ASOs, siRNAs und Verbindungsswitching-Wirkstoffe, für den klinischen Einsatz zugelassen⁷. Trotz dieses Fortschritts bleibt ihre therapeutische Wirksamkeit sowohl präklinisch als auch klinisch durch eine ineffiziente intrazelluläre Abgabe⁸ eingeschränkt. Aktuelle Schätzungen zeigen, dass weniger als 1 % der internalisierten Oligonukleotide endosomale Kompartimente verlassen, um das Zytosol zu erreichen und ihre Ziel-RNA zu bekämpfen, wodurch die funktionelle Aktivität ^9,10 begrenzt wird. Diese Einschränkung ist besonders ausgeprägt im Herzgewebe, wo Aufnahme und intrazellulärer Transport nur wenig verstanden sind.

Historisch gesehen stützte sich die präklinische Bewertung kardiovaskulärer Therapeutika stark auf Tiermodelle, die für die Bewertung von Pharmakokinetik, Bioverteilung, Wirksamkeit und Sicherheit in vivo unentbehrlich sind. Wichtige Unterschiede zwischen den Arten in kardialer Physiologie, Genregulation und zellulären Antworten schränken jedoch oft ihre Fähigkeit ein, therapeutische Wirksamkeit und Toxizität beim Menschen genau vorherzusagen. Diese Einschränkungen haben die Entwicklung von humanbasierten In-vitro-Modellen mit verbesserter physiologischer Relevanz vorangetrieben. Unter diesen hat die vom Menschen induzierte pluripotente Stammzelltechnologie (iPSC) die Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen revolutioniert, indem sie eine nahezu unbegrenzte Zellquelle bereitstellt, die in kardiovaskuläre Linien differenziert werden können. Humane iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) wiederholen viele molekulare, strukturelle und funktionelle Eigenschaften des menschlichen Myokards und sind zu einer weit verbreiteten Plattform für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen, Arzneimittelreaktionen und neuen therapeutischen^Modalitäten geworden. Konventionelle zweidimensionale Kulturen menschlicher iPSC-CMs haben jedoch wichtige Einschränkungen. Die meisten Differenzierungsprotokolle erzeugen Kardiomyozyten, die eher fetalen als adulten Zellen ähneln und unreife strukturelle, elektrophysiologische, metabolische und kontraktile Eigenschaften aufweisen¹².

Zudem fehlen Monoschichtkulturen die dreidimensionale (3D) Gewebearchitektur, mehrzellige Interaktionen und die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, die die Funktion der Kardiomyozyten in vivo beeinflussen. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurden immer ausgefeiltere 3D-Herzmodelle^entwickelt. Unter diesen fördern Engineered Heart Tissues (EHTs), die durch Einbettung von iPSC-CMs in Biomaterialgerüste und mechanische sowie elektrische Stimulation erzeugt werden, die strukturelle und funktionelle Reifung, während sie die biomechanische Umgebung des nativen Myokards¹³ enger reproduzieren. Obwohl EHTs physiologisch sehr relevante Plattformen für Krankheitsmodellierung und Arzneimitteltests bieten, erfordert ihre Erstellung typischerweise spezialisierte biotechnische Expertise und spezielle Ausrüstung. Am anderen Ende des Spektrums bewahren ex vivo kardiale Gewebeschnitte am ehesten die native Gewebearchitektur und zelluläre Zusammensetzung, sind jedoch auf den Zugang zu primärem Herzgewebe angewiesen, haben eine begrenzte Vitalität in der Kultur und sind nicht leicht skalierbar.

In jüngerer Zeit sind kardiale Organoide als zugängliche 3D-Modellsysteme entstanden, die zentrale Aspekte der Herzgewebsorganisation^{und -funktion} wiederholen. Kardioide sind sich selbst assemblierende kardiale Organoide, die überwiegend aus Kardiomyozyten bestehen, welche intrinsische Spezifikation, räumliche Musterbildung und Morphogenese durchlaufen, um kammerartige, höhlenhaltige Strukturen zu bilden^15,16. Methoden zur Bildung von Kardioiden basieren typischerweise auf einer anfänglichen Aktivierung der Wnt-Signalübertragung, um die Mesoderm-Spezifikation zu induzieren, gefolgt von anschließender Hemmung zur Förderung der Herzlinien-Verpflichtung. Kardioide können entweder in statischen oder gerührten Suspensionskulturen erzeugt werden, die eine skalierbare Produktion unterstützen und die Gewebeselbstorganisation verbessern 15,16,17,18,19. Komplexere multilineale kardiale Organoide, die endotheliale, epikardiale oder andere Zelltypen integrieren, erhöhen die physiologische Relevanz weiter, erfordern jedoch aufwendigere Differenzierungsprotokolle, längere Kulturperioden und umfangreiche Optimierung ^13,14.

Ein einfaches, reproduzierbares und effizientes Protokoll wird vorgestellt, um selbstorganisierende, kardiomyozytenbasierte Kardioide aus humanen iPSCs zu erzeugen und diese zur Bewertung der Aufnahme fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide anzuwenden. Das Protokoll sollte sich als wertvoll für Forscher erweisen, die die Oligonukleotidchemie und -abgabestrategien für kardiovaskuläre Anwendungen optimieren möchten. Alle in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Protokoll

1. Kultur und Vorbereitung von iPSCs zur Differenzierung

VORSICHT: Führen Sie alle offenen Handhabungen von Zellen und Medien in einem zertifizierten Biosicherheitsschrank der Klasse II durch. Trage einen Laborkittel und Handschuhe. Dekontaminieren Sie Arbeitsflächen und flüssige Abfälle mit einem geeigneten Desinfektionsmittel.

1. Pflegen Sie iPSCs.
   1. Beschichten Sie Kulturplatten mit einer geeigneten Basalmembranmatrix gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Füttere iPSCs mit einem definierten, futterfreien, pluripotenten Stammzellmedium und ersetze das Medium alle 24 Stunden.
   3. Kulturen unterhalb der Überkonfluenz und Passagezellen halten, wenn sie 70–80 % Konfluenz erreichen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass iPSCs eine hochwertige, undifferenzierte Morphologie bewahren und vor Beginn der Differenzierung als Mykoplasmafrei bestätigt werden.
2. Vor-Differenzierungs-Passaging.
   1. Taue die iPSCs auf und dehne die Zellen für mindestens zwei Passagen auf, bevor die kardiale Differenzierung eingeleitet wird.
   2. Passagezellen mit einer enzymfreien Dissoziationsmethode, PBS-EDTA, kompatibel mit iPSC-Erhaltung.
      PAUSENPUNKT: Erhalten Sie die iPSCs in der Kultur, bis sie 70–80 % Konfluenz erreichen, und erhalten Sie die typische Morphologie ohne Anzeichen spontaner Differenzierung.

2. Vorbereitung von iPSC-Aggregaten in Mikrowellplatten

1. Dissoziiere iPSCs zu einer Einzelzell-Suspension.
   1. Aspiratiere das Medium und wasche die Zellen einmal mit 1 ml 1× PBS.
   2. Zellabscheidungslösung (Accutase) bei 500 μL pro Brunnen einer 6-Well-Platte hinzufügen und bei 37 °C für 5–7 Minuten inkubieren.
   3. Fügen Sie pro Brunnen 1,5 ml Waschmedium hinzu und suspendieren Sie vorsichtig nach, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen.
   4. Übertragen Sie die Suspension in ein 15 ml konisches Rohr und zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur bei 200 × g für 3 Minuten.
   5. Aspiratieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in einem feederfreien iPSC-Medium, das mit ROCK-Inhibitor ergänzt wird (letzte 10 μM).
      HINWEIS: Passen Sie die Dissoziations-Inkubationszeit für jede iPSC-Linie an, indem Sie die Ablösung bei 5 Minuten überprüfen und bei Bedarf in kurzen Schritten verlängern.
2. Zähle die Zellen und bereite die Panzerungsdichte vor.
   1. Zählen Sie lebensfähige Zellen mit einer Standard-Zellzählungsmethode.
   2. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension mit 0,9 × 10⁶ Zellen/mL für jedes Bohrloch einer 800-μm-Mikrowell-Aggregationsplatte (24-Brunnen-Format, ~300 Mikrobohrungen/Bohrloch) vor.
      HINWEIS: Optimieren Sie die Zellanzahl pro Well, da die Gesamtgröße oder die Differenzierungseffizienz zwischen den iPSC-Linien variiert.
3. Grundieren Sie die Mikrowellplatte und entfernen Sie die Blasen.
   1. Fügen Sie 500 μL feeder-freies iPSC-Medium mit ROCK-Inhibitor (finale 10 μM) zu jedem Bohrloch hinzu.
   2. Zentrifugieren Sie die Mikrowellplatte bei 300 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um Luftblasen aus den Mikrobrunnen zu entfernen.
      KRITISCH: Alle Blasen vollständig entfernen, um eine gleichmäßige Zellablagerung am Boden jedes Mikrowells zu ermöglichen und eine effiziente Aggregatbildung zu unterstützen.
4. Säe iPSCs in Mikrowells aus.
   1. Fügen Sie jedem Bohrloch 1,0 mL der vorbereiteten Einzelzellensuspension (0,9 × 10⁶ Zellen/mL) hinzu, was 0,9 × 10^{6 Zellen pro} Bohrloch entspricht.
   2. Lassen Sie es im Brunnen 3–5 Mal vorsichtig mit einem P1000 wieder suspendieren und vermeiden Sie das Einsetzen von Luftblasen.
   3. Zentrifugiere die Platte bei 200 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um Pelletzellen in die Mikrobrunnen zu schleudern.
   4. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen in den Mikrobrunnen eingelaufen sind, bevor Sie die Platte bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 24 Stunden platzieren.
      KRITISCH: Behandle die Platte nach der Zentrifugation vorsichtig. Bewegen oder schütteln Sie die Platte nicht, da dies dazu führen kann, dass Zellen aus den Mikrowellen herauskommen.

3. Erweiterung der iPSC-Aggregate in Mikrobohrlöchern

1. Saugen Sie vorsichtig ab und ersetzen Sie das Medium, ohne die Zuschlagstoffe zu stören oder zu verdrängen.
   1. Neigen Sie die Platte und saugen Sie langsam etwa 1,0 ml Medium aus jedem Bohrloch mit einer P1000-Pipette ab, um sicherzustellen, dass die Zuschlagstoffe in den Mikrobrunnen sitzen.
   2. Langsam aspirieren Sie die verbleibenden ~500 μL Medium mit einer P1000-Pipette.
   3. Geben Sie jedem Brunnen 1,5 ml zuführfreies iPSC-Medium, indem Sie es langsam mit einer serologischen Pipette an der Seite des Brunnens abgeben.
   4. Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂ und wiederholen Sie täglich den Mediumwechsel.
      KRITISCH: Medium auf die Wand des Brunnens dosieren und direkten Zufluss auf Zuschlagstoffe vermeiden.

4. Kardiale Differenzierung der iPSC-Aggregate (Tag 0 bis Tag 12)

1. Mesoderm-Einleitung (Tag 0).
   1. Entfernen Sie das Medium mit der sanften Aspirationsmethode, die in den Schritten 3.1.1–3.1.2 beschrieben ist.
   2. Fügen Sie pro Bohrloch 1,5 ml Basalmedium hinzu, ergänzt mit 2 % B27 minus Insulin und dem Wnt/β-Catenin-Aktivator (CHIR99021, Endkonzentration: 11 μM).
      HINWEIS: Bereiten Sie eine 10 mM große Grundlösung von CHIR99021 vor, einem Kleinmolekülinhibitor des Glykogensynthase-Kinase-3 (GSK-3). Um eine Endkonzentration von 11 μM zu erreichen, fügen Sie 1,65 μL der Standardlösung zu 1,5 mL Medium hinzu.
2. Mittlere Veränderung nach der Einleitung (Tag 1).
   1. Nach 24 Stunden nach Zugabe von CHIR99021 aspirieren Sie das Medium vorsichtig aus jedem Brunnen.
   2. Fügen Sie pro Brunnen 1,5 ml frisches Basalmedium hinzu, ergänzt mit 2 % B27 minus Insulin, und inkubieren Sie dann 48 Stunden.
      KRITISCH: Halten Sie sich strikt an das Timing der Wnt-Modulationsschritte, da Abweichungen die Differenzierungseffizienz beeinträchtigen können.
      HINWEIS: Ein gewisser Zelltod wird nach der Exposition gegenüber dem Wnt/β-Catenin-Aktivator erwartet. Wenn ein weit verbreiteter aggregierter Verlust beobachtet wird, sollten Sie in zukünftigen Experimenten eine Reduzierung der Aktivatorkonzentration in Betracht ziehen.
3. Herzaufnahme durch WNT-Hemmung (Tag 3).
   1. Bereiten Sie ein konditioniertes Medium vor, indem Sie 760 μL verbrauchtes Medium aus jedem Bohrloch in ein steriles 50-mL konisches Rohr umleiten.
   2. Für jedes Bohrloch geben Sie 760 μL frisches Basalmedium, ergänzt mit 2 % B27 minus Insulin, in das Rohr mit dem gesammelten konditionierten Medium und mischen Sie vorsichtig.
   3. Fügen Sie dem Mischmedium den Wnt-Pathway-Inhibitor IWP4 zu einer Endkonzentration von 5 μM hinzu und wenden Sie das Rohr vorsichtig mehrmals um, um zu mischen.
   4. Saugen Sie vorsichtig das verbleibende Medium aus jedem Brunnen ab und fügen Sie dann pro Brunnen 1,5 ml konditioniertes Medium hinzu, ergänzt mit IWP4.
   5. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 48 Stunden.
      HINWEIS: Bereiten Sie eine 1-mM-Lagerlösung des Wnt-Pathway-Inhibitors IWP4 vor. Um eine Endkonzentration von 5 μM zu erreichen, fügen Sie 7,6 μL der Lagerlösung pro 1,52 ml Gesamtmedium (760 μL konditioniertes Medium + 760 μL frisches Basalmedium) für jedes Bohrloch hinzu.
4. Mittlere Veränderung in Mikrowells (Tag 5).
   1. Ersetze Medium mit dem in den Schritten 3.1.1–3.1.2 beschriebenen Sanftaspirationsansatz.
   2. Fügen Sie 1,5 ml Basalmedium mit 2 % B27 minus Insulin zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie dann bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 48 Stunden.
5. Übertragung von Zuschlagstoffen aus Mikrobohrungen auf 6-Well-Platten (Tag 7).
   1. Saugen Sie das Medium vorsichtig aus jedem Bohrloch mit der in den Schritten 3.1.1–3.1.2 beschriebenen sanften Aspirationsmethode.
   2. Fügen Sie 1,0 ml Basalmedium mit 2 % B27 mit Insulin in jede Mulde der Mikrowellplatte hinzu. Mit einer P1000-Pipette pipettieren Sie das Medium vorsichtig fünfmal auf und ab, während die Pipettenspitze in einer kreisenden Bewegung über die Bohrlochoberfläche bewegt wird, um die Zuschlagstoffe in den Mikrobrunnen zu lösen und in die Suspension zu bringen.
   3. Übertragen Sie die Zuschlagstoffsuspension in einen einzelnen Brunnen einer unbehandelten 6-Well-Kulturplatte.
   4. Spülen Sie jeden Brunnen der Mikrowellplatte zwei- bis dreimal mit zusätzlichen 1,0 ml frischem Medium, um verbleibende Aggregate zurückzugewinnen, und übergeben Sie jede Spülung in denselben Brunnen der 6-Loch-Platte.
   5. Inkubieren bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 72 Stunden.
      HINWEIS: Das Vorhandensein von toten Zellen und Zellresten nach dem Aggregattransfer wird erwartet. Die meisten Ablagerungen werden während des anschließenden Mediumwechsels entfernt.
6. Mittlere Veränderung während der Suspensionskultur (Tag 10).
   1. Bewegen Sie die Platte vorsichtig, um lose angesetzte Aggregate zu lösen.
   2. Neige die Platte, damit die Zuschlagstoffe durch die Schwerkraft am Boden des Brunnens absinken können.
   3. Saugen Sie das verbrauchte Material vorsichtig ab, ohne die Zuschlagstoffe zu stören oder zu aspirieren.
   4. Fügen Sie jeweils 2,0 ml frisches Basalmedium mit 2 % B27 mit Insulin hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 48–72 Stunden.
      HINWEIS: Spontanes Schlagen wird typischerweise ab etwa Tag 10 beobachtet.
      PAUSENPUNKT: Schlägende Kardioide können durch Austausch des Mediums alle 2–3 Tage in der Suspensionskultur erhalten bleiben.

5. Mikroskopische Charakterisierung von Kardioiden

HINWEIS: Diese Methode bietet einen Workflow für die histologische Charakterisierung von Kardioiden mittels Kryosektionen. Die resultierenden Schnitte können für verschiedene histologische Analysen verwendet werden, einschließlich Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbungen zur Beurteilung der Gesamtgewebearchitektur sowie der Immunfluoreszenz-Markierung zur Bewertung der Identität der Kardiomyozyten.

1. Fixierung und Kryosektion.
   1. Über Nacht Kardioide in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C fixieren.
      VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig und wahrscheinlich krebserregend; Behandle es mit einer chemischen Abzugshaube und trage geeignete persönliche Schutzausrüstung. Sammeln Sie alle paraformaldehydhaltigen Abfälle (Fixationsmittel und Waschmittel) in einem klar gekennzeichneten Behälter für Aldehyd-/chemisch gefährliche Abfälle und entsorgen Sie sie gemäß den institutionellen Verfahren für gefährliche Abfälle.
      SICHERHEIT: Führen Sie alle Paraformaldehydfixierungen und -handhabungen in einer chemischen Dampfhaube durch, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
   2. Waschen Sie die fixierten Kardioide in 30 % (w/v) über Nacht in PBS dreimal mit PBS und Cryoprotect.
   3. Die Kardioide in Gelatine einbetten, einfrieren und 10 μm dicke Kryoschnitte auf Objektträger schneiden. Lagern Sie die Stücke bis zur Nutzung bei −20 °C.
2. Immunkennzeichnung.
   1. Die Abschnitte 15 Minuten bei Zimmertemperatur auftauen.
   2. Waschen Sie die Abschnitte zweimal in PBS bei 37 °C für 10 Minuten.
   3. Umkreisen Sie den Interessenbereich auf jedem Objektträger mit einem hydrophoben Stift, um einen Brunnen zu schaffen, der die Blockierung und Antikörperlösungen beibehält.
   4. Rehydrieren Sie die Abschnitte für 2–3 Minuten im Permeabilisierungspuffer (PB; PBS mit 0,1 % Tween-20) in einem Coplin-Glas.
   5. Entferne die Objektträger aus PB, lasse die überschüssige Lösung ab und lege die Objektträger in eine feuchte Kammer.
      KRITISCH: Ab diesem Punkt ist es entscheidend, die Abschnitte nicht trocknen zu lassen.
   6. Blockieren Sie die Abschnitte mit 200–300 μL PB, das 5 % fetales Rinderserum (FBS) enthält, bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer für 90 Minuten.
   7. Entfernen Sie die Blocklösung und inkubieren Sie die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit 100 μL Primärantikörper (Anti-cMYBP-C; 1:50), verdünnt in Blocklösung (PB mit 1 % FBS).
   8. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PB und inkubieren Sie 2 Stunden bei Zimmertemperatur mit einem grünen fluoreszierenden Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:200), weitrotem fluoreszierendem Phalloidin (1:400) und DAPI (1 μg/mL).
   9. Dreimal in PB waschen und mit einem Antifade-Befestigungsmedium montieren.
      VORSICHT: Sammeln Sie alle fluoreszierend farbstoffhaltigen Lösungen (sekundäre Antikörper, Phalloidin und DAPI-Färbungslösungen sowie die entsprechenden Waschmittel) in einem Behälter und entsorgen Sie sie gemäß institutionellen Richtlinien als chemischer Abfall.
3. Bildaufnahme.
   1. Aufnehmen Sie konfokale Bilder mit einem laserabtastenden konfokalen Mikroskop, das mit einem Array-Detektor ausgestattet ist, für Superauflösungsbildgebung mit einem 10×- und einem 63×/1,40-Ölimmersionsobjektiv.
   2. Erzeugen Sie den Fernrot-Fluorophor, den grünen Fluorophor und die Kernfarbe mit 639 nm, 488 nm und 405 nm Laserlinien bei 4,0 %, 4,0 % und 1,0 % Laserübertragung.
   3. Erfassen einzelner optischer Abschnitte mit einer Pixelgröße von 0,0353 × 0,0353 μm², unidirektionales Scannen, Scangeschwindigkeit 6, Zoom 1,7, Liniendurchschnitt 1 und eine Pixel-Verweilzeit von 0,935 μs pro Pixel.
   4. Array-Detektor-Super-Resolution-Bildverarbeitung mit automatischer Wiener-Filterung anwenden.

6. Fluoreszierender Oligonukleotidaufnahmetest

1. Bereiten Sie eine Lagerlösung des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids vor, das mit Palmitinsäure konjugiert ist, um die Lipophilie zu erhöhen.
   1. Rekonstituierte das lyophilisierte, fluoreszierend markierte Oligonukleotid in nukleasefreiem Wasser auf eine Endkonzentration von 1 mM. Kurz vortexen und bei 3.000 × g für 30 Sekunden zentrifugieren, um die Lösung am Boden des Rohrs zu sammeln.
   2. Bereite Einweg-Aliquoten der 1-mM-Lagerlösung vor und lagere bei −20 °C Lichtschutz.
   3. Am Tag des Experiments wird 1 μL des 1 mM großen Materials zu 1 ml Kardioidkulturmedium gegeben, um eine endgültige Oligonukleotidkonzentration von 1 μM zu erhalten. Mischen Sie durch sanfte Plattenbewegung.
2. Inkubieren Sie Kardioide mit dem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid (1 μM Endkonzentration) in serumfreiem Medium bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 24 Stunden.
3. Waschen Sie die Kardioide dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um extrazelluläres Oligonukleotid zu entfernen.
4. Die Kardioide mit 4 % Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixieren, dreimal mit PBS waschen und vor der Bildgebung weiter fluoreszierend markieren.
5. Inkubieren Sie intakte fixierte Kardioide über Nacht bei 4 °C, geschützt vor Licht, in PBS mit 5 μg/mL Weizenkeimagglutinin (WGA), konjugiert mit einem grünen Fluorophor und 1 μg/mL DAPI. Dreimal in PBS waschen und mit einem Antifade-Befestigungsmedium montieren.
   VORSICHT: Sammeln Sie alle oligonukleotidhaltigen und fluoreszierenden farbstoffhaltigen Medien und Waschmittel, einschließlich des gekennzeichneten Oligonukleotid-Inkubationsmediums aus Schritt 6.2 und der WGA/DAPI-Färbelösung, in einem separaten Behälter und entsorgen Sie sie gemäß den institutionellen Richtlinien als chemische/biogefährliche Abfälle.
6. Aufnehmen Sie konfokale Bilder der Aufnahme und Verteilung von Oligonukleotiden.
   1. Aufnehmen Sie konfokale Bilder mit einem laserscannenden konfokalen Mikroskop, das mit einem Array-Detektor für Superauflösungsbildgebung und einem 40× Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist. Bilder werden als 8-Abschnitt-Z-Stacks mit einer Z-Schrittgröße von 2 μm aufgenommen, die eine Gesamttiefe von 16 μm abdecken.
   2. Erzeugen Sie die Kernfärbung, den Membranmarker und das fernrot fluoreszierend markierte Oligonukleotid mit 405 nm, 488 nm und 639 nm Laserlinien bei 0,9 %, 0,2 % bzw. 3,0 % Lasertransmission.
   3. Aufnahme von Bildern mit einer Voxelgröße von 0,0449 × 0,0449 × 2 μm³, bidirektionales Scannen, Scangeschwindigkeit 5, Liniendurchschnitt 1 und einer Pixel-Verweilzeit von 1,51 μs pro Pixel. Wenden Sie Airyscan/Super-Resolution-Bildverarbeitung mit automatischer Wiener-Filterung an.
   4. Halten Sie alle Erfassungseinstellungen (Laserleistung, Detektorverstärkung, Z-Step und Voxelgröße) über alle Z-Positionen und alle Proben hinweg konstant, um einen gültigen Vergleich des Oligonukleotidsignals zwischen den Bedingungen zu ermöglichen.

Ergebnisse

Abbildung 1 fasst den Differenzierungsworkflow zusammen und veranschaulicht die charakteristischen morphologischen Veränderungen, die in jeder Phase des Protokolls erwartet werden, von der iPSC-Aggregation bis zur Bildung selbstorganisierender Kardioide. Die suspensionsbasierte Mikrowell-Aggregation bietet einen einfachen und standardisierten Ansatz zur parallelen Erzeugung großer Zahlen von größenkontrollierten Kardioiden. Eine erfolgreiche Differenzierung ist gekennzeichnet durch die Bildung gleichmäßig großer Aggregate, gefolgt von der Entwicklung innerer Hohlräume und dem Beginn spontaner Schläge, typischerweise ab etwa Tag 10. Zusammen bieten diese morphologischen Merkmale praktische Qualitätskontrollpunkte zur Bewertung der Effizienz und Reproduzierbarkeit der Erzeugung von Kardioiden.

Die kardioide Architektur und Gewebeorganisation können durch histologische Analyse von Kryosektionen beurteilt werden. Wie in Abbildung 2 gezeigt, zeigt die Färbung von Hämatoxylin und Eosin (H&E) erfolgreich differenzierten Kardioiden gut organisierte dreidimensionale Gewebe mit einer oder mehreren inneren Hohlräumen, die von kompakten zellulären Schichten umgeben sind und mit einer kammerähnlichen Organisation übereinstimmen. Erfolgreiche Kardioide weisen typischerweise keine nekrotischen Regionen und minimale strukturelle Fragmentierung auf. Im Gegensatz dazu führen suboptimale Differenzierungen häufig zu unregelmäßigen oder kollabierten Strukturen ohne erkennbare Hohlräume, was auf eine beeinträchtigte Gewebeselbstorganisation hinweist.

Die Kardiomyozytendifferenzierung kann weiter durch Immunfluoreszenzfärbung von Kryosektionen bewertet werden. Wie in Abbildung 3A–B dargestellt, zeigen erfolgreiche Kardioide eine weit verbreitete Expression des sarkomerischen Markers cMYBP-C, organisiert in hochgeordnete, periodische Striationen, die für Sarkomere charakteristisch sind. Diese gestreiften Strukturen sind breit im gesamten Gewebe verteilt und oft entlang der Längsachse der Kardiomyozyten ausgerichtet, was eine effiziente kardiale Differenzierung widerspiegelt. Im Gegensatz dazu zeigen suboptimale Kardioide eine schwache, fleckige oder regional eingeschränkte sarkomerische Färbung, die häufig auf periphere Bereiche beschränkt ist, wobei ausgedehnte Bereiche keine nachweisbaren Signale zeigen, was auf eine ineffiziente Kardiomyozytendifferenzierung hinweist.

Die Aufnahme fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide kann entweder durch Lebendzellbildgebung oder konfokale Mikroskopie fixierter Kardioide untersucht werden. Wie in Abbildung 4 gezeigt, ist die erfolgreiche Aufnahme durch leicht nachweisbare intrazelluläre, oligonukleotidassoziierte Fluoreszenz gekennzeichnet, die als diskrete Puncta verteilt ist, was mit endosomaler Lokalisation übereinstimmt. WGA definiert Zellmembranen und DAPI konterfärbt Zellkerne, was die Bestätigung der intrazellulären Oligonukleotidlokalisierung ermöglicht. Neben der qualitativen Visualisierung der Oligonukleotidaufnahme können die aufgenommenen Bildstapel für quantitative Analysen verwendet werden, einschließlich Fluoreszenzintensität pro Punctum, Puncta-Anzahl pro Zelle und des Prozentsatzes der oligonukleotidpositiven Zellen. Wie in Abbildung 5A–C dargestellt, ermöglicht die Z-Stack-Bildgebung zudem die Beurteilung der Oligonukleotidverteilung im dreidimensionalen Gewebe, wobei die Fluoreszenz über mehrere optische Abschnitte hinweg von der Oberfläche bis ins Innere des Kardioids detektiert wird, was auf eine effektive Gewebepenetration hinweist.

Abbildung 1: Arbeitsablauf zur Erzeugung menschlicher iPSC-abgeleiteter Kardioide. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) werden in Mikrowellplatten (Tag−2) aggregiert und durch zeitliche Modulation der Wnt-Signalübertragung einer gerichteten kardialen Differenzierung unterzogen. Die Mesoderminduktion beginnt am Tag 0 durch Behandlung mit dem Wnt-Aktivator CHIR99021 in Basalmedium, ergänzt mit B27 minus Insulin, gefolgt von der Entfernung des Aktivators am ersten Tag. Die kardiale Spezifikation wird am dritten Tag durch Behandlung mit dem Wnt-Pathway-Inhibitor IWP4 induziert, der am 5. Tag entfernt wird. Am 7. Tag werden die Aggregate auf 6-Well-Platten übertragen und in basalem Medium aufrechterhalten, das mit B27-haltigem Insulin ergänzt wird. Am 14. Tag sind selbstorganisierende Kardioide etabliert und für nachgelagerte Anwendungen geeignet, einschließlich Oligonukleotidaufnahmetests. Dieses Bild wurde von den Autoren mit Biorender erstellt, und die erforderliche Urheberrechtslizenz ist beigefügt. Repräsentative Brightfield-Bilder, die zu den angegebenen Zeitpunkten aufgenommen wurden, zeigen die erwartete morphologische Entwicklung von gleichmäßig großen iPSC-Aggregaten zu kavitierten, selbstorganisierenden Kardioiden. Skala = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Histologische Charakterisierung menschlicher iPSC-abgeleiteter Kardioide. Repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-gefärbte Kryosektionen von Kardioiden am Tag 14 zeigen innere Hohlräume, umgeben von kompakten Zellschichten, was mit der kammerartigen Gewebeorganisation übereinstimmt. Die Bilder wurden mit einem Bildmikroskop aufgenommen. Die Quantifizierung der Differenzierungsergebnisse zeigte, dass 94,0 ± 2,6 % der Kardioiden spontanes Schlagen zeigten und 60,3 ± 20,6 % eine oder mehrere sichtbare innere Karies aufwiesen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen Differenzierungen präsentiert, wobei etwa 115 Kardioide pro Differenzierung analysiert werden. Skala = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Immunfluoreszenzcharakterisierung der Kardiomyozytendifferenzierung. Repräsentative Kryosektionen der Kardioide am Tag 14. (A) DAPI-Färbung, die die Verteilung der Zellkerne zeigt. (B) Immunfluoreszenzbild, das Kerne zeigt, die mit DAPI (blau) markiert sind, und Sarkomere, die mit einem Antikörper gegen das kardiale Myosin-bindende Protein C (cMYBP-C, grün) markiert sind, und organisierte sarkomerische Strukturen in differenzierten Kardiomyozyten zeigt. Die Bilder wurden mit laserabtastender konfokaler Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen, wobei ein 10×/0,30 Trockenobjektiv (links) und ein 63×/1,40 Ölimmersionsobjektiv (rechts) verwendet wurde. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Bildgebung der Oligonukleotidaufnahme durch Kardioide. Konfokale Bilder, die die intrazelluläre Lokalisierung fluoreszierend markierter Antisense-Oligonukleotide (ASOs, gelb) bei Kardioiden am Tag 14 zeigen. Zellmembranen sind mit fluoreszierendem Weizenkeim-Agglutinin (WGA, Magenta) markiert, und die Kerne werden mit DAPI (blau) gefärbt. ASO-assoziierte Fluoreszenz wird als diskrete intrazelluläre Puncta (Pfeile) nachgewiesen. Die unteren Panels zeigen Negativkontroll-Kardioide, die nicht mit fluoreszierenden ASOs inkubiert wurden. Die Bilder in den rechten Panels entsprechen höher vergrößerten Ansichten der abgekapselten Bereiche in den linken Panels. Repräsentative Bilder wurden durch Laser-Raster-Konfokalmikroskopie mit Array-Detektor-Superauflösungsbildgebung unter Verwendung eines 40× Wasserimmersionsobjektivs aufgenommen. Skalenbalken = 10 μm (links) und 5 μm (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Beurteilung der Oligonukleotidpenetration in den Kardioiden. (A) Schaltplan, der die Erfassung optischer Schnitte in zunehmenden Tiefen innerhalb des Kardioids veranschaulicht. Dieses Bild wurde von den Autoren mit Biorender erstellt, und die erforderliche Urheberrechtslizenz ist beigefügt. (B) Repräsentative konfokale Bilder, die die Verteilung fluoreszenzmarkierter ASOs an z-Positionen von 0 μm, 6 μm und 10 μm relativ zur Gewebeoberfläche zeigen. Die Bildeinstellungen wurden über alle z-Positionen hinweg konstant gehalten. Skalenleiste = 10 μm. (C) Die Quantifizierung des Prozentsatzes der Zellen, die mindestens ein ASO-assoziiertes Punktationssignal bei jeder Bildtiefe enthalten, zeigte eine vergleichbare Oligonukleotidaufnahme im gesamten Gewebe, mit 83,1 ± 2,5 %, 84,9 ± 4,5 % und 84,0 ± 4,5 % ASO-positiven Zellen bei 0 μm, 6 μm bzw. 10 μm. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von drei Kardioiden dargestellt, wobei pro Kardioid drei optische Schnitte analysiert werden und insgesamt 1.305 Zellen quantifiziert wurden. Repräsentative Bilder wurden durch Laser-Raster-Konfokalmikroskopie mit Array-Detektor-Superauflösungsbildgebung unter Verwendung eines 40× Wasserimmersionsobjektivs aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Video 1: Zeitraffersequenz. Ein Video, das mit 40 Bildern pro Sekunde aufgenommen wurde, zeigt spontane kontraktile Aktivität bei Kardioiden. Die Bildgebung erfolgte mit einem Weitfeldmikroskop, das mit einer sCMOS-Kamera ausgestattet war. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

Oligonukleotidbasierte Therapeutika haben sich als eine mächtige Klasse von gen-zielgerichteten Modalitäten etabliert, unterstützt durch jahrzehntelange Fortschritte in der Oligonukleotidchemie, die die Zielspezifität, metabolische Stabilität und immungene Verträglichkeit verbessert haben ^7,8. Trotz der zunehmenden Zahl klinisch zugelassener RNA-Therapeutika bleibt ihre breitere Anwendung durch die ineffiziente intrazelluläre Abgabe ^7,8 begrenzt. Aufgrund ihrer Größe, Ladung und Hydrophilität können Oligonukleotide nicht passiv über die Plasmamembran diffundieren und werden stattdessen über endozytische Wege^{internalisiert 9,10}. Nach der Aufnahme bleiben die überwiegende Mehrheit (~99 %) der internalisierten Oligonukleotide in endosomalen^{Kompartimenten (9,10}) abgeschlossen. Endosomaler Handel durchläuft einen Reifungsprozess von frühen bis späten Endosomen und letztlich Lysosomen; Die genauen Kompartimente, aus denen Oligonukleotide zum Zytosol entweichen, sind jedoch noch unvollständig verstanden und könnten mehrere endosomale Populationen umfassen⁹. Diese begrenzte zytosolische Freisetzung stellt eine kritische Geschwindigkeitsbegrenzung dar und unterstreicht die Notwendigkeit physiologisch relevanter experimenteller Systeme, die eine quantitative Bewertung der Oligonukleotidaufnahme, intrazellulären Transports und endosomaler^Entbindung ermöglichen.

Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um diesem Bedarf gerecht zu werden, indem humane iPSC-abgeleitete Kardioiden mit bildgebenden Messungen der Oligonukleotidaufnahme kombiniert wurden. Die Robustheit dieses Systems beruht auf mehreren kritischen Schritten, die direkt die Reproduzierbarkeit und die experimentellen Ergebnisse beeinflussen. Erstens ist die Qualität der ersten iPSC-Kulturen ein entscheidender Faktor für eine erfolgreiche kardiale Differenzierung. Die Autoren empfehlen eine periodische Karyotypanalyse, um eine langfristige genomische Stabilität sowie eine routinemäßige Bewertung der Koloniemorphologie, Integrität und Wachstumsdynamik sicherzustellen. Hochwertige Kulturen zeichnen sich durch kompakte, klar definierte Kolonien mit glatten Grenzen, minimaler spontaner Differenzierung und konstanter Vermehrung aus. Kulturen mit unregelmäßigen Koloniekanten, heterogener Zellmorphologie oder Differenzierungsbereichen sollten vor Beginn der Differenzierung durch tiefdurchlaufende gefrorene Bestände verworfen und ersetzt werden.

Ein zweiter entscheidender Schritt ist die kontrollierte Bildung von iPSC-Aggregaten mit Mikrowellplatten, was die Erzeugung einheitlicher, größendefinierter dreidimensionaler Strukturen fördert, die für die reproduzierbare kardiale Differenzierung^{unerlässlich sind}. Die mikrowellbasierte Aggregation erzeugt embryoide Körper mit definierten Durchmessern (optimal 200–230 μm), wodurch Zell-Zell-Interaktionen und die Exposition gegenüber Morphogengradienten während der temporalen Modulation der Wnt-Signalübertragung standardisiert werden. Nach unserer Erfahrung wird diese Größe konsequent erreicht, indem etwa 3.000 Zellen pro einzelnes Mikrobohrloch ausgesat werden (Schritt 2.2), ein Zustand, der empirisch optimiert und über mehrere menschliche iPSC-Linien hinweg validiert wurde, einschließlich kommerziell verfügbarer Leitungen und intern umprogrammierter Leitungen. Da jedoch die Proliferationsraten von iPSC variieren können, kann die optimale Aussaatdichte eine Anpassung erfordern, um die gewünschte Aggregatgröße zu erhalten. Das Versäumnis, diese Parameter zu kontrollieren, kann zu heterogenen Strukturen, verminderter Viabilität und beeinträchtigter Differenzierungseffizienz führen.

Die histologische Analyse, wie in Abbildung 2 gezeigt, bietet eine bequeme Qualitätskontrollbewertung der Kardioidbildung. Insbesondere kann das Fehlen innerer Hohlräume oder das Vorhandensein kollabierter oder fragmentierter Strukturen auf eine suboptimale Aggregatformation oder eine unzureichende zeitliche Kontrolle der Wnt-Signalgebung während der Differenzierungsschritte hinweisen (Schritte 4.1–4.3). Bei einigen erfolglosen Differenzierungen entstehen nicht-kontraktile Zellpopulationen innerhalb oder um die Kardioide. Diese Zellen erscheinen typischerweise gelblich bei der Hellfeldmikroskopie und neigen dazu, an kulturplatten mit niedriger Haftung anzuheften, während kardiomyozytenreiche Kardioide im Allgemeinen grau sind, als kompakte dreidimensionale Strukturen verbleiben und sich nicht leicht anheften. Wenn ein erheblicher Anteil der Aggregate diesen adhärenten, nicht-kontraktilen Phänotyp aufweist, sollte die Differenzierung als suboptimal betrachtet werden. In diesem Fall sollte die Fehlersuche damit beginnen, die Morphologie der iPSC-Kolonie vor der Differenzierung zu überprüfen, die Gesamtgröße zwischen Tag −1 und Tag 0 zu bestätigen und, falls nötig, die Saatdichte sowie die Konzentrationen von CHIR99021 und IWP4 für die spezifische iPSC-Linie neu zu optimieren.

Niedriges oder fehlendes spontanes Schlagen bis Tag 10–12 spiegelt meist eine ineffiziente Mesoderminduktion oder Herzspezifikation wider, meist aufgrund ungeeigneter Wnt-Modulatorkonzentration oder -timing oder auf übermäßigen Zelltod nach CHIR99021 Behandlung (Schritt 4.2). Nach unserer Erfahrung kann das Titrieren von CHIR99021 innerhalb eines Bereichs von 9–13 μM für jede iPSC-Linie sowie die Überprüfung der Konzentration und Aktivität von Lagerlösungen die Differenzierungseffizienz erheblich verbessern. Die Immunfluoreszenzanalyse der Organisation sarkomerer Proteine, wie in Abbildung 3 gezeigt, bietet eine bequeme Qualitätskontrollbewertung der Kardiomyozytendifferenzierung. Schwache oder fleckige sarkomerische Proteinfärbung, insbesondere wenn sie auf periphere Bereiche des Kardioids beschränkt ist, deutet in der Regel auf eine unvollständige oder heterogene Kardiomyozytendifferenzierung hin. In diesen Fällen wird empfohlen, die Reifezeit der Suspensionskultur (Schritt 4.6 und Pausenpunkt) vor der Fixierung zu verlängern sowie die Fixierungs- und Antikörperfärbungsbedingungen zu überprüfen.

Obwohl dieses kardioide Modell eine dreidimensionale menschliche kardiale Mikroumgebung bietet, die konventionelle zweidimensionale Kardiomyozytenkulturen deutlich verbessert, stellt es die Komplexität des erwachsenen menschlichen Herzens nicht vollständig wieder. Kardioide stellen ein frühes Stadium der menschlichen Herzentwicklung dar, wobei Kardiomyozyten ein unreifes, fetalähnliches Phänotyp¹⁴ behalten. Zudem fehlen den Geweben die vaskuläre Perfusion, Innervation, die ansässigen Immunzellen und die vollständige kammerspezifische Architektur des reifen Myokards. Daher ist diese Plattform zwar gut geeignet für die Untersuchung der zellulären Aufnahme und intrazellulären Verteilung von Oligonukleotiden unter kontrollierten experimentellen Bedingungen, jedoch sollte Vorsicht geboten werden, wenn die Aufnahmekinetik und Abgabemechanismen direkt in vivo übertragen werden. Die zukünftige Integration zusätzlicher Herzzelltypen, Gefäßnetzwerke und Gewebereifungsstrategien sollte die physiologische Relevanz dieser Plattform weiter erhöhen.

Eine zuverlässige Bewertung der Oligonukleotidaufnahme durch die in diesem Protokoll beschriebenen Kardioiden erfordert eine Optimierung und Standardisierung der ASO-Konzentration, Inkubationszeit und Bildaufnahmeeinstellungen, wie in Abbildung 4 und Abbildung 5 dargestellt. Die Wahl des Fluorophors ist besonders wichtig, da Farbstoffe sich in Helligkeit, Photostabilität und Empfindlichkeit gegenüber Umwelteinflüssen unterscheiden. In dieser Studie verwendeten wir Janelia Fluor 646 (JF646)²², ein weitrotes Silizium-Rhodamin-Fluorophor mit hoher Helligkeit und Photostabilität, das eine robuste Signalerkennung ermöglicht und gleichzeitig die Gewebeautofluoreszenz in dreidimensionalen Proben minimiert. Diese Eigenschaften machen es gut geeignet für die bildgebende Oligonukleotidaufnahme in lebenden oder fixierten Kardioiden. Bemerkenswert ist, dass die Konjugation von Fluorophoren das Verhalten von Oligonukleotiden beeinflussen kann, einschließlich Aufnahme und Transport, und sollte daher für jedes experimentelle System validiert werden.

In seiner aktuellen Form bietet dieses Protokoll sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Bewertung der Oligonukleotidaufnahme. Die konfokale Bildgebung intrazellulärer ASO-assoziierter Puncta ermöglicht die Visualisierung der Oligonukleotid-Lokalisation in Kardioiden, während die Aufnahmeeffizienz durch manuelle Bestimmung des Prozentsatzes ASO-positiver Zellen mit dem Cell Counter-Plugin in Fiji/ImageJ quantifiziert wird. Obwohl dieser Ansatz gut für die hier vorgestellten Analysen mit moderater Durchsatz geeignet ist, ist die manuelle Bildanalyse arbeitsintensiv und kann insbesondere bei großen Datensätzen von Beobachterverzerrungen betroffen sein. Jüngste Fortschritte im selbstüberwachten Deep Learning für die dreidimensionale Mikroskopie bieten vielversprechende Möglichkeiten, diese Einschränkungen zu überwinden. KI-basierte Bildanalyse kann heterogene subzelluläre Strukturen in komplexen dreidimensionalen Umgebungen präzise segmentieren, identifizieren und verfolgen, was eine automatisierte Quantifizierung der Oligonukleotidaufnahme und intrazellulären Transports, einschließlich endosomaler^Dynamik, ermöglicht. Die Integration dieser Ansätze in zukünftige Implementierungen des Protokolls sollte den Durchsatz, die Reproduzierbarkeit und die analytische Präzision verbessern.

Mit Blick auf die Zukunft bietet die Integration von humanen iPSC-abgeleiteten Kardioiden mit quantitativer Bildgebung, maschineller Lern-basierter Bildanalyse und Einzelteilchenmethodologien einen leistungsstarken Rahmen zur Untersuchung der Mechanismen, die die Oligonukleotidabgabe im menschlichen Herzgewebe steuern. Die Kombination physiologisch relevanter dreidimensionaler kardialer Modelle mit fortschrittlichen analytischen Werkzeugen, die in der Lage sind, subzelluläre Organisation und Dynamik zu lösen, ermöglicht eine umfassende quantitative Charakterisierung der Oligonukleotidaufnahme, intrazellulären Transports und mit geeigneten komplementären Assays die endosomale Flucht. Solche integrierten Ansätze sollen die systematische Identifizierung von Faktoren erleichtern, die die Verabreichungseffizienz bestimmen, die rationale Optimierung von Oligonukleotidchemikalien und Verabreichungsvehiken unterstützen und eine skalierbare Plattform zur Bewertung neuer Oligonukleotid-Therapeutika im Kontext kardiovaskulärer Erkrankungen bieten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021