Einfache und zugängliche Ei-Schlüpf-Assays in Caenorhabditis elegans: Anpassungsfähige Formate für Drogentests

Zusammenfassung

Diese Studie präsentiert eine flexible und standardisierte Ei-Schlüpf-Assay-Plattform in Caenorhabditis elegans , die mehrere experimentelle Formate integriert. Der Ansatz verbessert die Reproduzierbarkeit, Skalierbarkeit und Zugänglichkeit, ermöglicht eine robuste Bewertung von Arzneimittelwirkungen und Entwicklungsprozessen und bleibt kosteneffizient und leicht anpassbar sowohl für Forschungsanwendungen als auch für Bildungseinrichtungen.

Zusammenfassung

Ei-Schlüpf-Assays (EHA) werden weit verbreitet eingesetzt, um die Auswirkungen chemischer Verbindungen auf die frühen Entwicklungsstadien von Nematoden zu bewerten, insbesondere in der anthelmintischen Forschung. Bestehende Methoden unterscheiden sich jedoch erheblich in Format, Komplexität und Reproduzierbarkeit und werden oft als feste Protokolle und nicht als anpassungsfähige experimentelle Rahmenwerke präsentiert. In dieser Studie schaffen wir eine einfache, zugängliche und flexible Plattform für Ei-Schlüpf-Assays in Caenorhabditis elegans , indem wir drei experimentelle Konfigurationen integrieren und direkt vergleichen: (i) kontrollierte Inkubation in Mikrozentrifugenröhren gefolgt von Aussaat auf Agarplatten, (ii) direkte Exposition auf arzneimittelhaltigen Agarplatten und (iii) mehrfachbrunnenbasierte Flüssigkeitsanalysen. Zwei repräsentative Verbindungen wurden verwendet, um den Test zu veranschaulichen: eine, die das Schlüpfen von Eiern hemmt, und eine, die keinen nachweisbaren Effekt zeigt. Jede Konfiguration bietet deutliche Vorteile hinsichtlich experimenteller Steuerung, Durchsatz und Zugänglichkeit. Der auf Mikrozentrifugenröhren basierende Ansatz ermöglicht eine präzise Kontrolle der Arzneimittelexposition und unterstützt quantitative pharmakologische Analysen. Agar-basierte Assays bieten eine vereinfachte und kostengünstige Alternative, die sich für kontinuierliche Exposition und Bildungseinrichtungen eignet. Multiwell-Formate ermöglichen skalierbares, standardisiertes Screening im Einklang mit modernen Wirkstoffforschungspipelines. Durch den direkten Vergleich dieser Formate zeigen wir, wie methodologische Entscheidungen die Reproduzierbarkeit des Assays, die Dynamik der Arzneimittelexposition und die biologische Interpretation beeinflussen, insbesondere im Hinblick auf stadiumspezifische Faktoren wie die schützende Rolle der Eischale und die Entwicklungsvariation in der molekularen Zielexpression. Insgesamt etabliert diese Arbeit Ei-Schlüpf-Assays in C. elegans als vielseitige und skalierbare Plattform, die an vielfältige Anwendungen angepasst werden kann, darunter Anthelmintik-Screening, toxikologische Bewertung, Entwicklungsstudien und Lehrlabore, wodurch eine breitere und rationalere Anwendung dieser Methodik ermöglicht wird.

Einleitung

Ei-Schlüpf-Assays (EHA) sind seit langem als Grundpfeiler-Methodik der Nematologie zur Bewertung der oizidalen Aktivität und der frühen Entwicklungseffekte chemischer Verbindungen etabliert. Ursprünglich für parasitäre Nematoden entwickelt, quantifizieren diese Assays die Hemmung der Embryonation oder Larvenemergenz unter kontrollierten in-vitro-Bedingungen und liefern robuste und biologisch relevante Endpunkte wie Schlüpfprozentsatz oder Konzentrations-Antwort-Analyse (z. B. EC₅₀ oder IC₅₀)1,2,3,4,5,6,7.

Klassische eibasierte Ansätze bei parasitären Nematoden wie Haemonchus contortus und Trichostrongylus colubriformis wurden weit verbreitet eingesetzt, um die Wirksamkeit synthetischer Medikamente und Naturprodukte zu bewerten sowie die Anthelmintikresistenz zu überwachen ^1,2,6,8,9,10. Diese Methoden umfassen eine Vielzahl von Ergebnissen, von der direkten Bewertung der Eilebensfähigkeit und des Schlüpfens bis hin zur Bewertung der Larvenentwicklung nach der Stuhlkultur. Gemeinsam haben sie eine zentrale Rolle dabei gespielt, die Drogenexposition mit der parasitären Fortpflanzungsproduktion und dem Übertragungspotenzial zu verknüpfen. Diese Ansätze erfordern jedoch oft eine komplexe Probenvorbereitung von infizierten Wirten, verlängerte Inkubationszeiten und spezialisierte Infrastruktur, was ihre Zugänglichkeit, Skalierbarkeit und reproduzierbare Laborinfrastruktur einschränken kann.

Die Verwendung von Caenorhabditis elegans als Modellorganismus hat sich als wirksame Strategie erwiesen, um mehrere Einschränkungen parasitärer Nematoden zu überwinden. Sein kurzer Lebenszyklus, genetische Behandlungsfähigkeit, einfache Kultur und die Erhaltung wichtiger molekularer Ziele, die mit parasitären Arten geteilt werden, machen sie besonders geeignet für pharmakologische, toxikologische und entwicklungsbezogene Studien. Wichtig ist, dass die Embryogenese bei C. elegans schnell und hochgradig reproduzierbar ist, sodass Ei-Viabilitäts- und Schlüpftests als quantitative und zuverlässige Anzeigen früher Entwicklungsprozesse und deren Störung durch Xenobiotika 11,12,13,14,15,16,17 verwendet werden können.

Darüber hinaus hat die Verfügbarkeit gut charakterisierter mutierter Stämme mechanistische Einblicke in die Wirkung und Resistenz von Medikamenten ermöglicht. Frühere Studien haben gezeigt, dass Resistenzen gegen bioaktive Verbindungen phasenabhängig auftreten können, wobei embryonale und larvale Stadien eine unterschiedliche Sensitivität aufweisen. Zum Beispiel wurden Veränderungen der glutamatergen Signalübertragung mit resistenten Phänotypen bei Larven assoziiert, während das Schlüpfen der Eier^{unbeeinflusst blieb} 14,18,19,20. Dies verdeutlicht die stadiumspezifische Natur der Arzneimittelsensitivität und legt nahe, dass embryonale Stadien unterschiedliche Ziele oder unterschiedliche Zugänglichkeit im Vergleich zu späteren Entwicklungsstadien haben können.

Über die Parasitologie hinaus sind Ei-Viabilitätstests in C. elegans in der Toxikologie und frühen Arzneimittelforschung immer relevanter geworden. Diese Assays wurden nicht nur zur Bewertung der anthelmintischen Aktivität eingesetzt, sondern auch zur Bewertung der Entwicklungstoxizität und medikamentinduzierter embryonaler Defekte, mit Ergebnissen, die mit Toxizitätsprofilen höherer Organismen^{korrelieren können 15,16}. Gleichzeitig bringt das Vorhandensein der Eierschale wichtige biologische Einschränkungen mit sich, da sie als schützende und selektive Permeabilitätsbarriere um den Embryo^21,22 wirkt. Infolgedessen können einige bioaktive Moleküle trotz Aktivität in späteren Entwicklungsstadien 14,19,23,24 den Embryo nicht erreichen. Der Zugang zum Embryo hängt daher wahrscheinlich von den physikochemischen Eigenschaften jeder Verbindung ab, einschließlich Molekulargröße und Polarität. Dies könnte zu Unterschieden zwischen der bei Ei-Schlüpf-Assays beobachteten Aktivitäten und der in späteren Entwicklungsstadien beitragen. Diese Unterscheidung unterstreicht die Bedeutung, sowohl den experimentellen Kontext als auch den biologischen Endpunkt klar zu definieren.

Methodisch wurden Ei-Schlüpf-Assays in Caenorhabditis elegans mit einer Vielzahl experimenteller Formate durchgeführt, darunter flüssige Inkubation synchronisierter Eier, direkte Exposition gegenüber medikamentenhaltigen Agarplatten und multiwell-basierte Assays, die für mittel- bis hochdurchsatz-Screening^{angepasst sind: 11,13,14,16,19,23,24}.

Flüssigkeitsbasierte und Mikroplatten-Formate wurden in pharmakologischen Screeningstudien weit verbreitet verwendet, da sie homogene Expositionsbedingungen bieten, eine präzise Kontrolle der Arzneimittelkonzentrationen ermöglichen und eine quantitative Analyse der Konzentrations-Antwort-Beziehungen ermöglichen. Parallel dazu wurden vergleichbare multiwell-basierte Strategien umfangreich für parasitäre Nematoden entwickelt, von konventionellen 96-Well-Plattenassays bis hin zu ultra-High-Throughput-Plattformen mit 384-Well-Formaten ^4,5. Zusammen unterstreichen diese Ansätze die Vielseitigkeit und Skalierbarkeit von Eier-Schlüpf-Assays bei verschiedenen Nematodenarten sowie deren Anpassungsfähigkeit an vielfältige experimentelle Umgebungen – von kleinmechanistischen Studien bis hin zu großflächigen Verbindungsscreening.

Jedes Format bietet unterschiedliche Vorteile und Einschränkungen hinsichtlich experimenteller Steuerung, Reproduzierbarkeit, Durchsatz und Zugänglichkeit. Flüssigkeitsbasierte Tests bieten homogene Expositionsbedingungen und eignen sich gut für quantitative pharmakologische Analysen, während Agar-basierte Tests eine kontinuierliche Exposition während der gesamten Entwicklung ermöglichen, aber Variabilitäten in Bezug auf Wirkstoffdiffusion und Bioverfügbarkeit verursachen. Multiwell-Formate wiederum ermöglichen Parallelisierung und einen reduzierten Reagenzienverbrauch, was mit modernen Screening-Strategien übereinstimmt.

Trotz der weit verbreiteten Nutzung werden Ei-Schlüpf-Assays oft als feste Protokolle präsentiert und nicht als flexibler methodischer Rahmen. Direkte Vergleiche zwischen den Formaten sind rar, und Hinweise zur Auswahl der passendsten Konfiguration für spezifische Anwendungen – von mechanistischen Studien bis hin zu Hochdurchsatz-Screening oder Lehrumgebungen – bleiben begrenzt.

In dieser Studie schlagen wir eine einfache, zugängliche und anpassungsfähige Plattform für Ei-Schlüpf-Assays in C. elegans vor, die drei experimentelle Konfigurationen integriert und vergleicht: (i) kontrollierte Inkubation in Mikrozentrifugenröhren gefolgt von Aussaat auf Agarplatten, (ii) direkte Exposition auf arzneimittelhaltigen Agarplatten und (iii) Mehrbrunnen-basierte Flüssigkeitstests.

Durch die systematische Bewertung dieser Konfigurationen wollen wir einen praktischen Rahmen schaffen, der die Kompromisse zwischen experimenteller Kontrolle, Einfachheit und Skalierbarkeit hervorhebt. Diese integrierte Perspektive verbindet klassische parasitologische Methoden mit modernen modellbasierten Screening-Ansätzen und positioniert Ei-Schlüpf-Assays nicht als eine einheitliche standardisierte Technik, sondern als vielseitige Plattform, die an verschiedene Forschungskontexte anpassbar ist, darunter Anthelmintik-Entdeckungen, toxikologische Bewertung, Entwicklungsbiologie und Bildungsanwendungen.

Protokoll

1. Caenorhabditis elegans Strömungen und Kultur

1. Verwenden Sie den Wildtyp-N2 (Bristol)-Stamm und/oder den transgenen Stamm PD4251 (ccIs4251; dpy-20(e1282)), um die Methodik^25,26 zu entwickeln und zu validieren. PD4251 exprimiert GFP, erleichtert bei Bedarf Visualisierung und potenzielle Bildgebungsanwendungen, während es Eier-Schlüpf- und Entwicklungsreaktionen zeigt, die nicht von denen zu unterscheiden sind, die im Wildtyp-N2-Stamm unter den experimentellen Bedingungen in dieser Studie beobachtet wurden²⁷.
2. Beziehe Stämme (z. B. Wildtyp-N2-Stamm) vom Caenorhabditis Genetic Center (CGC), unterstützt vom National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
3. Würmer werden unter Standardlaborbedingungen bei 18–25 °C auf frisch zubereiteten Nematoden Growth Medium (NGM)-Agarplatten mit Escherichia coli OP50 als Nahrungsquelle aufbewahrt. Bereiten Sie NGM vor, indem Sie 16 g Agar, 3 g NaCl und 2,5 g Bactopepton in 975 mL destilliertem oder ultrareinem Wasser auflösen. Sterilisieren Sie durch Autoklavierung. Nach dem Abkühlen des Mediums auf 55 °C werden sterile Lösungen aus Kaliumphosphatpuffer (25 mL, 1 M, pH 6,0), CaCl₂ (1 mL, 1 M), MgSO₄ (1 mL, 1 M) und Cholesterin (1 mL, 5 mg/mL in absolutem Ethanol) hinzugefügt. Gründlich mischen und Teller unter sterilen Bedingungen einschenken.
4. Führen Sie routinemäßige Handhabung, Vermehrung und Wartung nach festgelegten Verfahren durch, wie sie in WormBook und verwandten Studien 24,26,28,29 beschrieben sind. Halten Sie die Würmer unter Bedingungen ohne Hunger, indem Sie eine kontinuierliche Verfügbarkeit von bakterieller Nahrung gewährleisten und überfüllte Teller vermeiden. Bewahren Sie Kulturen im empfohlenen Temperaturbereich (18–25 °C) auf und vermeiden Sie übermäßig trockene Bedingungen, da diese die Agar-Dehydrierung beschleunigen können.
5. Allgemeine Überlegungen vor Beginn des Tests
   1. Definieren Sie alle experimentellen Parameter im Voraus, einschließlich Temperatur (18–25 °C), Inkubationszeit (4–8 H), Luftfeuchtigkeit (50–70 %) und Handhabungsverfahren.
   2. Bereiten Sie alle Materialien vor Beginn des Tests vor, um das richtige Timing und die Koordination des Arbeitsablaufs sicherzustellen.
   3. Halten Sie konsistente experimentelle Bedingungen über alle Replikate hinweg aufrecht, um die Variabilität zu minimieren.

2. Herstellung von Testverbindungen und Kontrollen

1. Bereiten Sie alle Verbindungen am Tag des Experiments frisch vor. Lösen Sie die Bestände in M9-Puffer (22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO₄) oder sterilem destilliertem Wasser, abhängig von der Kompatibilität der Verbindung und den Prüfbedingungen^30,31.
   HINWEIS: Die Wahl des wässrigen Mediums kann die Verbindung in C. elegans-Assays beeinflussen. Beispielsweise können Verbindungen wie Serotonin unterschiedliche wirksame Konzentrationen zeigen, wenn sie in sterilem destilliertem Wasser im Vergleich zu M9-Puffern hergestellt werden. Daher sollten sowohl die Fahrzeugkompatibilität als auch die biologische Reaktion während der Assay-Optimierung empirisch bewertet werden. Für Verbindungen mit geringer Wasserlöslichkeit können auch geeignete Träger wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Ethanol verwendet werden. Die endgültigen Lösungsmittelkonzentrationen sollten niedrig bleiben (typischerweise unter 0,2 % v/v), um eine Toxizität zu vermeiden. Frühere Studien bei C. elegans berichteten, dass DMSO-Konzentrationen bis zu 0,5 % unter Standardlaborbedingungen minimale Effekte erzielen¹⁷.
2. Bereiten Sie mindestens fünf Konzentrationen pro Verbindung vor, um die Erstellung von Konzentrations-Antwortkurven und die Schätzung von IC₅₀ - oder IC_90-Werten zu ermöglichen. Verwenden Sie eine serielle Verdünnung mit 2- bis 3-fachen Konzentrationsschritten als Ausgangspunkt und passen Sie den endgültigen Konzentrationsbereich entsprechend der erwarteten Potenz, Löslichkeit und experimenteller Reaktion jeder Verbindung an.
   HINWEIS: Wenn die Teststoffe lichtempfindlich sind, sollten alle Vorbereitungsschritte bei schwachem Licht durchgeführt werden, um einen Verfall zu verhindern. Dazu gehört die Herstellung von Lagerlösungen, Verdünnungen und arzneimittelhaltigen Agarplatten. Wann immer möglich, sollten die Platten mit Alufolie bedeckt und im Dunkeln aufbewahrt werden. Ebenso sollten Mehrschichtplatten während der Inkubation abgedeckt gehalten werden (z. B. mit Folie oder undurchsichtigen Deckeln). Es wird empfohlen, geschlossene Behälter oder feuchte Kammern zu verwenden, die die Lichteinwirkung begrenzen, um die Stabilität der Verbindung während des gesamten Experiments zu erhalten.
3. Beziehen Sie in jedem Experiment folgende Kontrollen ein: reine Puffersteuerung (M9 oder Wasser) und Fahrzeugsteuerung (z. B. DMSO oder Ethanol in derselben Konzentration, die in Behandlungen verwendet wird).
   HINWEIS: Die Wahl des Lösungsmittels ist entscheidend. DMSO und Ethanol werden häufig verwendet, weil sie hydrophobe Verbindungen lösen und bei niedrigen Konzentrationen biokompatibel bleiben. Alternative Ansätze wie Tween 20 oder Cyclodextrine können zur Verbesserung der Löslichkeit in Betracht gezogen werden. Arzneimittellösungen sollten unmittelbar nach der Vorbereitung verwendet werden, da die Stabilität im Laufe der Zeit variieren und die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen kann.

3. Synchronisierte C. elegans-Eier gewinnen

HINWEIS: Die Isolierung von C. elegans-Eiern wurde in früheren Studien ausführlich beschrieben^29,32. Hier werden die Hauptschritte zusammengefasst, wobei kleinere Modifikationen zur Optimierung der Rückgewinnung sauberer, schmutzfreier Eier sind, die für die Ausbrütproben geeignet sind.

1. Sammlung trächtiger Würmer
   1. Beginnen Sie mit 3–5 NGM-Platten, die konfluente Kulturen trächtiger Erwachsener enthalten:^25,26. Bevorzugen Sie Platten mit großen Mengen trächtiger Würmer und sichtbaren Eiern, was auf aktive Fortpflanzung hinweist, während überbelebte oder ausgehungerte Kulturen vermieden werden. Die genauen Wurmzählungen werden in diesem Stadium in der Regel nicht festgelegt, da Eizellen-Isolationsprotokolle bei C. elegans meist auf konfluenten Fortpflanzungskulturen statt auf präzisen Tierzählungen basieren. Als allgemeine Referenz sollte jede 60-mm-Platte mehrere hundert trächtige Erwachsene enthalten.
   2. Gib jedem Teller destilliertes Wasser hinzu und wasch die Würmer vorsichtig in ein 15-mL konisches Rohr. Vermeiden Sie es, die Agaroberfläche abzukratzen, um Schmutz zu minimieren.
   3. Zentrifugiere bei 266 × g bis 3 Minuten (18–25 °C), um die Würmer zu pelletieren. Entfernen Sie den Supernatant mit Bakterien.
   4. Entfernen Sie das Überdachungsmittel und wiederholen Sie den Waschschritt dreimal. Lassen Sie das Pellet jedes Mal vorsichtig wieder aufhängen, um die Entfernung der Restbakterien zu verbessern.
2. Eiisolierung durch Bleichen
   1. Das Wurmpellet wird in einer frisch zubereiteten Bleichlösung (1,2 % NaOCl und 0,5 M NaOH; Endvolumen 5 mL) erneut suspendiert. Bereiten Sie die Lösung sofort vor der Anwendung vor, um Aktivität sicherzustellen.
      HINWEIS: Korrekt gebleichte Proben wurden als Präparate definiert, bei denen adulte Schlachtkörper zerstört/verdaut wurden, während intakte Eier morphologisch normal und lebensfähig blieben. Übergebleichte Proben wurden durch beschädigte oder lysierte Eier, abnormale Eiermorphologie, verringerte Schlüpfraten oder das Fehlen lebensfähiger Larven nach der^{Inkubation identifiziert}.
   2. Bewegt den Röhrchen energisch, um die Auflösung der erwachsenen Körper und die Freisetzung von Eiern zu fördern. Während der Inkubation kontinuierlich mischen, um eine gleichmäßige Exposition zu gewährleisten.
   3. Beobachte die Reaktion genau und überschreite nicht 5 Minuten. Überprüfen Sie visuell: Erwachsene Körper sollten größtenteils aufgelöst sein, solange die Eier intakt bleiben.
   4. Beobachten Sie die Reaktion genau und stoppen Sie sie nach 5 Minuten, indem Sie kaltes, steriles destilliertes Wasser (vorzugsweise 10 °C) bis zu einem Endvolumen von 14 ml hinzufügen. Lassen Sie die Brutzeit nicht länger als diese Zeit erteilen, um Eierschäden zu vermeiden.
   5. Decken Sie das Rohr ab und wenden Sie es vorsichtig mehrmals um, um die Bleichlösung schnell zu verdünnen. Führen Sie diesen Schritt ohne Verzögerung durch, um die Lebensfähigkeit der Eizellen zu erhalten.
   6. Zentrifugieren Sie bei 266 × g für 3 Minuten (18–25 °C) und entsorgen Sie vorsichtig das Übersetzungsmittel.
   7. Waschen Sie das Eipellet dreimal mit sterilem destilliertem Wasser, um das Bleichmittel vollständig zu entfernen. Sorgen Sie für eine gründliche Wiederaufsetzung zwischen den Waschgängen. Die Eier werden in 5 ml M9-Puffer- oder sterilem Wasser wieder suspendiert.
      HINWEIS: Das Bleichen trächtiger Hermaphroditen ergibt eine sterile Eizubereitung, die für synchronisierte Assays geeignet ist. In Abwesenheit von Nahrung treten die geschlüpften Larven in einen L1-Entwicklungsstillstand ein und setzen die Entwicklung nach der Frütterung synchron fort.
3. Reinigungsstufe (Saccharose-Flotation)
   1. Führen Sie diesen Schritt durch, wenn nach dem Bleichen Wurmreste sichtbar sind.
   2. Bereiten Sie eine 30%ige Saccharoselösung vor, indem Sie eine 60%ige sterile Saccharosebrühlösung verdünnen (z. B. gleiche Volumen mischen: 5 ml 60% Sucharose mit 5 ml destilliertem Wasser).
   3. Gib die Saccharoselösung zur Kugel und vermische vorsichtig durch Inversion. Vermeide Vortexen.
      HINWEIS: Da dieser Reinigungsschritt kurz ist und von sofortigen Waschschritten zur Entfernung von Rest-Saccharose gefolgt wird, wurden unter den in dieser Studie verwendeten Bedingungen keine nachweisbaren Effekte auf die Eierlebensfähigkeit beobachtet. Im Gegensatz dazu verbessert die Entfernung von Wurmresten die Ei-Visualisierung, die Zählgenauigkeit und die Gleichmäßigkeit der Medikamentenexposition in den Proben erheblich.
   4. Zentrifugiere bei 266 × g für 5 Minuten (18–25 °C).
   5. Identifizieren Sie die Eileiche als einen dünnen weißen Ring am oberen Rand der Lösung. Sammeln Sie sofort 4 ml des Überlagerungsmittels mit den Eiern auf, indem Sie die Pipettenspitze vorsichtig entlang des Rings bewegen.
   6. Führen Sie diesen Schritt schnell durch, da die Eier kurz nach der Zentrifugation aufgrund der Schwerkraft zu sinken beginnen.
   7. Übertragen Sie das gesammelte Supernatant in ein sauberes Rohr mit sterilem destilliertem Wasser. Waschen Sie die Eier zweimal mit kaltem, sterilem Wasser, um die restlichen Saccharose zu entfernen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist optional, aber dringend empfohlen. Das Entfernen von Schmutz verbessert die Sichtbarkeit der Eier und die Zählgenauigkeit und sorgt für eine gleichmäßigere Exposition gegenüber Teststoffen, indem verhindert wird, dass Eier im restlichen Wurmmaterial gefangen bleiben.
4. Herstellung der Eierfondlösung
   1. Rühren Sie die Eisuspension vorsichtig vor der Probenahme, da die Eier schnell absinken.
   2. Setze drei 20-μL-Tropfen auf einen Objektträger und zähle die Eier unter einem Stereomikroskop.
   3. Berechnen Sie den Durchschnitt und passen Sie die Konzentration mit M9-Puffer auf 50–100 Eier pro 100 μL an. Mische erneut, bevor du alizitierst, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
   4. Aliquot das erforderliche Volumen Eisuspension für jede experimentelle Bedingung gemäß dem gewählten Protokoll.

4. Eier-Schlüpf-Assay-Formate

1. Kurzzeitige Eizellexposition in Mikrozentrifugenröhren (Hochkontrollformat)
   HINWEIS: Diese experimentelle Konfiguration basiert auf den zuvor beschriebenen Verfahren²⁵, mit Anpassungen zur Verbesserung der Kontrolle über Belichtungsbedingungen und Reproduzierbarkeit.
   1. Vorbereitung von Agarplatten für Eier-Schlüpfproben
      1. Bereite medikamentenfreie Agarplatten ausschließlich mit Agar und destilliertem Wasser (1,7 g Agar in 100 ml Wasser) vor. Füge keine Nährstoffe oder Bakterien hinzu, da das Ziel ist, das Ausbrüten der Eier ohne Störungen durch Nahrungsquellen zu bewerten. Gießen Sie etwa 3 ml Agar pro 35 mm Petrischale, um die Agartiefe in den Experimenten konstant zu halten.
      2. Bereiten Sie die Teller 12–24 Stunden vor der Verwendung vor. Vermeiden Sie das Überschreiten dieses Zeitfensters, da übermäßiges Trocknen die Lebensfähigkeit der Eier verringert und die Larvenbewegung beeinträchtigt.
      3. Teile jede Platte nach der Verfestigung in vier Quadranten, um das Zählen zu erleichtern.
      4. Lagern Sie Teller bei 8–10 °C unter verschlossenen Bedingungen, um eine Dehydrierung zu verhindern. Lassen Sie die Platten vor der Nutzung auf Raumtemperatur ausgleichen.
   2. Für jede Bedingung werden 500 μL Eisuspension in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zwischen den Pipettierschritten vorsichtig mischen, um die Sedimentation der Eier zu verhindern, da sich Eier durch die Schwerkraft schnell absetzen. Die Aufrechterhaltung einer homogenen Suspension ist entscheidend, um unter allen Bedingungen vergleichbare Eierzahlen zu gewährleisten.
   3. Fügen Sie 500 μL Behandlungslösung oder entsprechende Kontrolle zur 500 μL Eisuspension hinzu. Inkubieren bei 22 °C für 4–8 Stunden. Definieren Sie die Inkubationszeit im Voraus und halten Sie sie über Experimente hinweg konstant (z. B. 6 Stunden), da Schwankungen in dieser Zeit die Medikamentenexposition direkt beeinflussen.
      HINWEIS: Bereiten Sie Behandlungslösungen mit dem 2-fachen der gewünschten Endkonzentration vor, sodass die Verdünnung nach der Vermischung mit der Eisuspension die beabsichtigte Endverarbeitungskonzentration ergibt.
   4. Halten Sie während der Inkubation eine kontinuierliche sanfte Bewegung mit einem Röhrenrotator (z. B. 5–20 U/min vertikale Drehung) oder einer Schaukelplattform aufrecht. Stellen Sie sicher, dass die Röhren in ständiger Bewegung bleiben, um die Sedimentation der Eier zu verhindern und eine gleichmäßige Exposition zu fördern. Dieser Schritt ist entscheidend, da statische Bedingungen zu Eiansammlung und heterogener Arzneimittelexposition führen.
   5. Zentrifugieren Sie die Röhren mit 3.420 × g für 3 Minuten (18–25 °C) nach der Inkubation. Identifizieren Sie die Kugel, die als kleine weiße Ablagerung an der Röhrenwand erscheint. Richte die Röhren vor der Zentrifugation konsequent aus (z. B. markiere eine Seite), um eine schnelle Pelletlokalisierung zu ermöglichen und einen versehentlichen Verlust während der Supernatantenentfernung zu verhindern.
   6. Entfernen Sie das Überlagermittel vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Eier dreimal mit M9-Puffer, um Reststoffe zu entfernen. Die letzte Kugel in 240 μL M9-Puffer wieder aufhängen.
   7. Schichten Sie die Federung auf Agarplatten, indem Sie 20 μL pro Quadranten dosieren. Verwenden Sie drei Platten pro Zustand. Lassen Sie die Tropfen vollständig trocknen, bevor Sie Platten bewegen oder umdrehen, um eine Verschiebung der Eier über die Oberfläche zu verhindern.
      HINWEIS: Beginnen Sie mit einem größeren Gesamtvolumen Eisuspension als streng vorgeschrieben, um den Eiverlust während der Waschschritte auszugleichen und eine ausreichende Endprobengröße für Anrichten und Zählen sicherzustellen. Um das Verfahren zu vereinfachen und die Nutzung von Agarplatten zu reduzieren, insbesondere in Lehrumgebungen, werden die umaufgehängten Eier direkt in eine Mehrfachplatte übertragen, anstatt auf Agarplatten. Stellen Sie das Endvolumen pro Bohrloch auf 200 μL ein und füllen Sie ungenutzte Bohrlöcher mit sterilem Wasser, um die Verdunstung zu minimieren.
2. Direkte Eiexposition auf medikamentenhaltigen Agarplatten
   1. Bereiten Sie eine Agarlösung vor, die nur Agar und steriles destilliertes Wasser enthält (1,7 g Agar in 100 ml). Erhitze sie, bis sie vollständig gelöst ist, und halten Sie die Lösung in flüssiger Form aufrecht. Lassen Sie den Agar auf 50–55 °C abkühlen, bevor Sie eine Verbindung hinzufügen, und überwachen Sie die Temperatur mit einem Laborthermometer. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Verbindungsstabilität zu erhalten und eine homogene Inkorporation zu gewährleisten, wie bereits^{beschrieben 28}. Bereiten Sie mindestens fünf Konzentrationen pro Verbindung vor, um eine Konzentrations-Antwort-Analyse und_{IC-50-Schätzung} zu ermöglichen.
      HINWEIS: Fügen Sie keine bakteriellen Nahrungsquellen hinzu. Ohne Nahrung treten die geschlüpften Larven in einen synchronisierten L1-Entwicklungsstillstand ein, der während des Assay-Zeitraums^26,33 den Übergang zu späteren Larvenstadien verhindert.
   2. Fügen Sie die passende Menge Arzneimittellösung oder Fahrzeugkontrolle dem gekühlten Agar hinzu. Sanft durch langsame Inversion mischen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. Vermeiden Sie Vortex oder starkes Schütteln, um die Bildung von Blasen zu verhindern.
   3. Sofort etwa 3 ml Agar in 35 mm Petrischalen gießen. Arbeiten Sie stetig, um eine konstante Temperatur und Plattendicke zu halten. Bereiten Sie pro Bedingung mindestens 3–5 Teller vor.
   4. Lagerung und Handhabung der Platten wie folgt: Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur auf einer ebenen Oberfläche erstarren. Lagere die Platten umgekehrt, um zu verhindern, dass Kondenswasser die Agaroberfläche erreicht.
   5. Richten Sie das Experiment ein: Säen Sie 50–100 Eier direkt auf die Agarplatten. Halten Sie konstante experimentelle Parameter ein, einschließlich Temperatur, Inkubationszeit, Luftfeuchtigkeit und Zeitpunkt der Plattenvorbereitung. Verwenden Sie mindestens fünf Konzentrationen für die Konzentrations-Antwort-Analyse.
      HINWEIS: Bereiten Sie Teller 12–24 Stunden vor der Verwendung vor. Vermeiden Sie Übertrocknung, da dies die Lebensfähigkeit der Eier und die Larvenbewegung beeinträchtigen kann. Wickle Platten ein, um die Austrocknung zu reduzieren und vor Licht zu schützen, wenn du mit lichtempfindlichen Stoffen arbeitest. Bewahren Sie die Teller in einer sauberen, vorzugsweise befeuchteten Umgebung auf (z. B. in einem verschlossenen Behälter mit feuchtem Papier), um die Variabilität zu minimieren.
3. Ei-Schlüpf-Assay in Mehrfachplatten (mittel- bis hochdurchsatz-Format)
   HINWEIS: Dieses Format wird sowohl in C. elegans - als auch in parasitären Nematodenstudien häufig für mittel- bis hochdurchsatz-Screening verwendet und ermöglicht eine parallele Bewertung mehrerer Verbindungen und Konzentrationen unter standardisierten Bedingungen.
   1. Bohrlochplattenvorbereitung und experimentelles Design: Verwenden Sie 96-Bohrlochplatten (oder ein alternatives Format je nach Durchsatzbedarf). Bereiten Sie das Plattenlayout im Voraus vor und definieren Sie Arzneimittelkonzentrationen (über Spalten angeordnet), Replikationen (über Reihen) und Kontrollmechanismen, einschließlich Puffer-Only-Kontrollen (M9 oder Wasser) und Fahrzeugkontrollen (z. B. DMSO oder Ethanol bei derselben Endkonzentration wie bei Behandlungen).
      HINWEIS: Verwenden Sie transparente, flachbodenige Mehrschichtplatten, um eine direkte Visualisierung und Zählung in jedem Brunnen unter durchgelassener LED-Beleuchtung mit Stereomikroskop zu ermöglichen. Eier und geschlüpfte L1-Larven werden direkt in den Brunnen ohne Transferschritte quantifiziert, wodurch der Probenverlust minimiert und Artefakte behandelt werden.
   2. Jede Bohrung mit dem passenden Volumen an Arzneimittellösung oder -kontrolle vorzuladen. Verwenden Sie gleiche Volumina über alle Brunnen.
   3. Zugabe von Eisuspension
      1. Bereiten Sie eine gut homogenisierte Eisuspension mit einer definierten Konzentration vor (siehe Abschnitt 2).
      2. Gib jedem Brunnen mit der Arzneimittellösung gleich viel Eisuspension hinzu. Verwenden Sie ein Endvolumen von 200 μL pro Bohrloch.
      3. Passen Sie die Eidichte auf mindestens 30 Eier pro Brunnen an (idealerweise 30–100). Überschreiten Sie nicht 100 Eier pro Brunnen, da Überfüllung die manuelle Quantifizierung erheblich erschwert. Einzelne Eier werden schwer zu unterscheiden, während bewegliche L1-Larven aktiv durch den Brunnen schwimmen, was die Zählgenauigkeit verringert und die experimentelle Variabilität erhöht.
      4. Verrühren Sie die Eisuspension vorsichtig vor der Dosierung, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
   4. Lade den Teller vorsichtig ein. Vermeiden Sie es, Luftblasen einzuführen. Pipettieren Sie regelmäßig und wechseln Sie die Spitzen zwischen den Bedingungen, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, damit sich der gesamte Inhalt am Boden der Brunnen absetzt.
   5. Brutbedingungen: Die Platte wird bei 20–22 °C unter kontrollierten und feuchten Bedingungen insgesamt 24 Stunden nach der Eiisolation bebrütet.
      HINWEIS: Minimieren Sie die Variabilität, indem Sie die Verwendung von äußeren Brunnen vermeiden oder diese mit Puffern füllen, um die Verdunstung zu verringern. Inkubieren Sie Platten in einer befeuchteten Kammer (z. B. einem verschlossenen Behälter mit feuchtem Papier) und schützen Sie vor Licht, wenn Sie mit lichtempfindlichen Verbindungen arbeiten. Vermeiden Sie unnötige Bewegungen während der Inkubation. Halten Sie eine einheitliche Zeitplanung der Eizellpräparation und der Medikamentenexposition über alle Replikate hinweg ein, da Variationen die Entwicklungsphase und die Dateninterpretation beeinflussen können.

5. Bewertung und Auszählung

1. Bewerten Sie das Schlüpfen des Eies 24 Stunden nach der Eiisolation und stellen Sie sicher, dass die Kontrollbedingungen das vollständige Schlüpfen unter der definierten Temperatur erreicht haben. Berechnen Sie diesen Zeitpunkt ab dem Zeitpunkt der Eizellentnahme, um eine ausreichende embryonale Entwicklung zu ermöglichen. Betrachten Sie alle Eier, die in diesem Stadium noch nicht geschlüpft sind, als durch die Behandlung betroffen.
2. Untersuchen Sie Proben unter einem Stereomikroskop. Für jede Bedingung (Agarplatten oder Mehrbrunnenplatten) quantifizieren Sie die Anzahl der nicht geschlüpften Eier und die Anzahl der geschlüpften L1-Larven.
3. Scannen Sie das gesamte Beobachtungsareal, einschließlich Plattenkanten und Brunnengrenzen, da sich bewegliche L1-Larven ungleichmäßig verteilt und sich in diesen Bereichen ansammeln können.
   HINWEIS: Führen Sie eine direkte Zählung unter einem Stereomikroskop zur schnellen Begutachtung ohne zusätzliche Ausrüstung durch. Halten Sie eine konstante Eidichte über Bedingungen hinweg, verwenden Sie mindestens 3–5 technische Replikaten pro Bedingung und führen Sie mindestens drei unabhängige Experimente mit verschiedenen Eizubereitungen durch, um zuverlässige Vergleiche sicherzustellen.

6. Bildaufnahme und Dokumentation

1. Aufnahmen Sie Bilder mit einem Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist. Für Agarplatten wird jedes Quadrant erfasst; Für Mehrfachbrunnenplatten wird jeder einzelne Brunnen erfasst. Stellen Sie sicher, dass alle Bereiche eingefangen werden, einschließlich Plattenkanten und Brunnengrenzen, in denen sich Larven ansammeln können.
   HINWEIS: Standard-10x-Okulare und Objektive, die von 0,6x bis 5x reichen (Gesamtvergrößerung von 6x bis 50x), werden weit verbreitet verwendet und ermöglichen eine klare Darstellung sowohl der Eier als auch der L1-Larven im Zählbereich. Verwenden Sie eine übertragene LED-Beleuchtung. Halten Sie die konstanten Kameraaufnahmeeinstellungen (Helligkeit, Belichtung und Kontrast) über alle experimentellen Bedingungen hinweg, um eine konsistente Bildqualität und einen zuverlässigen Vergleich zwischen den Proben zu gewährleisten.
2. Verwenden Sie geeignete Aufnahmesoftware, um Bilder aufzunehmen. Verarbeiten und analysieren Sie Bilder mit Bildanalysesoftware. Identische Analyseparameter über alle experimentellen Bedingungen hinweg beibehalten, einschließlich Helligkeit, Kontrast, Vergrößerung, gleicher Erfassungsfläche/-feld und Zählkriterien.
3. Quantifizieren Sie die Anzahl der nicht geschlüpften Eier und L1-Larven anhand der aufgenommenen Bilder. Betrachte Larven als geschlüpft, wenn sie vollständig aus der Eierschale geschlüpft sind. Eier mit teilweise ausgeschlüpften Larven sollten als ungeschlüpft klassifiziert werden. Identische Klassifikationskriterien für alle experimentellen Bedingungen anwenden.
4. Inkubieren Sie Platten oder Mehrschichtplatten für weitere 12–24 Stunden bei 16–18 °C, um zu beurteilen, ob die beobachtete Hemmung des Schlüpfens reversibel ist. Unter den definierten experimentellen Bedingungen gelten Eier, die in diesem Stadium noch nicht geschlüpft sind, als von der Behandlung betroffen.

7. Datenanalyse

1. Berechnen Sie die Schlüpfungshemmung als:
   Anteil der ungeschlüpften Eier = (Anzahl der ungeschlüpften Eier) / (Gesamtzahl der Eier + Larven)
2. Führen Sie mindestens 3–5 unabhängige Experimente mit verschiedenen Eierchargen durch. Drücken Sie Daten als Mittelwert ± Standardabweichung aus (Mittelwert ± SD).
3. Erstelle Konzentrations-Antwort-Kurven mittels nichtlinearer Regression und bestimme_IC-50-Werte .
4. Führen Sie statistische Vergleiche zwischen den Bedingungen mit dem Schüler-t-Test durch und definieren Sie die statistische Signifikanz bei p < 0,05.
5. Analysieren Sie Daten mit geeigneter statistischer Software.

8. Anwendung von Ei-Schlüpf-Assays mit Trans-Cinnamaldehyd und Linalylacetat

HINWEIS: Diese Studie konzentriert sich nicht auf eine bestimmte Verbindung, sondern verwendet repräsentative Substanzen, um zu veranschaulichen, wie jedes experimentelle Format unter vergleichbaren Bedingungen umgesetzt, kontrolliert und interpretiert werden kann. Trans-Zinnamaldehyd (TCA) wurde als illustrative Verbindung ausgewählt, weil es zuvor charakterisiert wurde und eine robuste, reproproduzierbare Hemmung des Eischlüpfens über die drei hier vorgestellten Assay-Konfigurationen erzeugt. Wichtig ist, dass der Zweck der Aufnahme von TCA darin bestand, die Implementierung des Protokolls und das repräsentative Konzentrations-Antwort-Verhalten zu demonstrieren, anstatt die relative Wirksamkeit oder vergleichende Leistung zwischen den Formaten zu etablieren.

1. Versuchsaufbau und Verbindungsvorbereitung
   1. Bereiten Sie Agarplatten (3 ml pro 35 mm Schüssel) 12–24 Stunden im Voraus mit einem reinen Agarmedium (1,7 % in destilliertem Wasser) vor. Beschriften Sie die Teller, teilen Sie sie in vier Quadranten, um das Zählen zu erleichtern, lagern Sie sie unter verschlossenen Bedingungen zur Vermeidung von Dehydrierung und gleichen Sie sie vor der Verwendung auf Raumtemperatur aus.
   2. Bereiten Sie frische Trans-Cinnamaldehyd-(TCA)-Lagerlösungen in DMSO vor und verdünnen Sie sie in sterilem Wasser oder Agar, um acht Endkonzentrationen (0,05–0,7 mM) zu erhalten. Halten Sie die endgültige DMSO-Konzentration unter 0,2 % unter allen Bedingungen. Beziehen Sie Wasser, Agar und/oder DMSO als negative bzw. Fahrzeugsteuerung ein.
   3. Testen Sie Linalylacetat mit 5 mM als negative Kontrollverbindung, um die Fähigkeit des Tests zu bewerten, unter identischen experimentellen Bedingungen zwischen aktiven und inaktiven Verbindungen zu unterscheiden.
   4. Bereiten Sie synchronisierte Eisuspensionen wie oben beschrieben vor und passen Sie die Dichte auf 50–100 Eier pro 100 μL an. Verwenden Sie gleiche Volumina und vergleichbare Eierzahlen in allen Formaten, um Konsistenz zwischen den Bedingungen sicherzustellen.
2. Anwendung experimenteller Formate unter Verwendung eines Referenzzusammensatzes
   1. Kurzzeitexposition in Mikrozentrifugenröhren (Hochkontrollformat)
      1. Mischen Sie 500 μL Eisuspension mit 500 μL Behandlungslösung, die 0,05–0,7 mM TCA enthält. Inkubieren Sie die Röhren 6 Stunden bei 18–20 °C und halten Sie die Inkubationszeit über alle Experimente hinweg konstant.
      2. Während der Inkubation werden die Eileiter mit einem Rotator kontinuierlich sanft bewegt.
      3. Zentrifugieren Sie die Röhren bei 3.420 × g für 3 Minuten (18–25 °C) nach der Belichtung und entfernen Sie vorsichtig den Überstandsstoff. Waschen Sie die Eier dreimal mit destilliertem Wasser, um Rückstände zu entfernen und die Exposition während der festgelegten Inkubationszeit zu begrenzen.
      4. Das Endpulver wird in 240 μL destilliertem Wasser wieder aufgehängt und die Federung auf Agarplatten mit 20 μL pro Quadranten mit drei Platten pro Bedingung aufgetragen. Die Platten werden nach der Eiisolation 24 Stunden bei 16–18 °C ausgebrütet.
   2. Direkte Exposition gegenüber arzneimittelhaltigen Agarplatten
      1. Bereiten Sie arzneimittelhaltige Agarplatten vor, indem Sie TCA-Lösungen in den auf 50–55 °C abgekühlten Agar geben und vorsichtig mischen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. Geben Sie etwa 3 ml Agar pro Platte ein und bereiten Sie die Platten 12–24 Stunden vor der Verwendung vor.
      2. Säe Eier direkt auf die Oberfläche der Platten mit einer Dichte, die mit denen anderer Formate vergleichbar ist (50–100 Eier pro 100 μL). Führen Sie in dieser Konfiguration keine Waschschritte durch.
      3. Inkubieren Sie die Platten bei 16–18 °C bis 24 Stunden nach der Eiisolation.
   3. Mehrfach-Platten-Assay (mittel- bis hochdurchsatz-Format)
      1. Vorladen Sie 96-Bohrloch-Platten mit Arzneimittellösungen und Kontrollen. Fügen Sie Eisuspensionen hinzu, um ein Endvolumen von 200 μL pro Bohrloch und eine Dichte von 50–100 Eiern pro Bohrloch zu erhalten.
      2. Sorgen Sie für eine homogene Verteilung während der Belastung, indem Sie Blasen vermeiden und konstante Volumina über die Bohrungen hinweg halten. Inkubieren Sie die Platten bei 20–22 °C unter feuchten Bedingungen für 24 Stunden nach der Eiisolation.
3. Bildaufnahme und Quantifizierung
   1. Bewerten Sie das Schlüpfen des Eies 24 Stunden nach der Isolierung, sobald das Schlüpfen unter Kontrollbedingungen abgeschlossen ist. Zählen Sie die Anzahl der ungeschlüpften Eier und L1-Larven unter einem Stereomikroskop für jede Erkrankung. Untersuchen Sie Plattenränder und Muldengrenzen sorgfältig, da sich in diesen Regionen Larven ansammeln können.
   2. Aufnahme von Bildern mit einem Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, für Dokumentationszwecke. Jeden Quadranten für Agarplatten aufzeichnen und systematisch jeden Brunnen für Mehrfachbrunnenplatten abbilden. Verwenden Sie Bildanalyse-Software, wenn dies erforderlich ist, um die Quantifizierung zu unterstützen.
   3. Inkubieren Sie die Platten weitere 12–24 Stunden nach der Bildaufnahme, um zu beurteilen, ob die beobachtete Hemmung des Schlüpfens reversibel ist.
   4. Führen Sie alle Experimente mit mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten durch.

Ergebnisse

TCA führte zu einer klaren, konzentrationsabhängigen Hemmung des Schlüpfens der Eier in allen experimentellen Formaten, wie in Abbildung 1 dargestellt. Für jede Prüfkonfiguration werden repräsentative Konzentrations-Antwort-Kurven dargestellt: Mikrozentrifugenröhren (Abbildung 1A), direkte Belichtung auf Agarplatten (Abbildung 1B) und Mehrfachbohrplatten (Abbildung 1C)....

Diskussion

Diese Studie bietet eine einfache und anpassungsfähige Plattform für Eier-Schlüpf-Assays in Caenorhabditis elegans, strukturiert um drei komplementäre experimentelle Formate, die sich in Kontrolle, Expositionsdynamik und Skalierbarkeit unterscheiden. Anstatt ein einziges optimales Protokoll zu definieren, unterstützen unsere Ergebnisse die Ansicht, dass Ei-Schlüpf-Assays als flexibler methodischer Rahmen betrachtet werden sollten, der an spezifische experimentelle Ziele angepass...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bacteriologisches Agar	Britania	B0101406	sollte frisch zubereitet werden (1,7 gr in 100 mL H2O)
Bleichlösung	N/A	N/A	1,2 % (v/v) NaOH und 0,5 M NaOH
Zentrifuge	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
Zentrifuge	BiofugePICO zu Eppendorf-Röhrchen	Heraeus 75003235
Digitalkamera	ToupCam	TP605100A	Industrielle Digitalkamera. Einstellbare Brennweite USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	MW: 78,13
Linalylacetat	SIGMA	Nr.CAS: 115-95-7	sollte frisch zubereitet werden
Lysogeneriebouillon (LB) Medium	N/A	N/A	10 g Bacto-Tryptone, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl auf 1 L destilliertes Wasser
M9 Puffer	N/A	N/A	3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g  NaCl, 0,25 g MgSO4 auf 1 L destilliertes Wasser
Mini-Rotator	BioSan	Bio RS-24
Nematodenwachstumsmedium (NGM)	N/A	N/A	3 g NaCl, 17 g Agar, 2,5 g  Bacto-Pepton auf 1 L destilliertes Wasser. Durch Autoklavieren sterilisieren. Ergänzt um 1 mL Cholesterin (5 mg/mL),  1 mL CaCl2 (1 M), 25 mL Kaliumphosphatpuffer (1 M, pH 6,0) und 1 mL  MgSO4 (1 M)
Petrischale (3 - 5 mm)	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
Petrischale (90 mm x 15 mm)	ExtraGene	1026160305	Nur für den Laborgebrauch, Polystyrol.
Pipette	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	Version 12.0
Stereomikroskop	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	Trinoculaires Stereomikroskop (10x–40x Gesamtvergrößerung; LED-Schein- und Durchlichtbeleuchtung)
Saccharose	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60 % (v/v) Saccharose
Gewebekulturplatte 96-Well	Biofil	TCP 012096	Polystyrol, Deckel mit geringer Verdunstung.
ToupView	ToupTek Photonics	N/A
Transcinnamaldehyd (TCA)	Santa Cruz Biotechnology	J1712	Sollte frisch zubereitet werden