Netzwerkpharmakologie und experimentelle Forschung zu β-Sitosterol zur Behandlung chronisch obstruktiver Lungenerkrankungen über den Glukokortikoidrezeptor

Zusammenfassung

β-Sitosterol linderte COPD und verstärkte die Wirksamkeit von Dexamethason, wobei der Glukokortikoidrezeptor diesen Effekt vermittelte. Zusätzlich reduzierte β-Sitosterol Entzündungen, oxidativen Stress und zelluläre Altersbildung sowohl bei CSE-stimulierten Bronchialepithelzellen als auch bei durch Zigarettenrauch induzierten COPD-Mäusen.

Zusammenfassung

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine häufige Atemwegserkrankung, die durch anhaltende Entzündungen, oxidativen Stress und einen fortschreitenden Rückgang der Lungenfunktion gekennzeichnet ist. Das therapeutische Potenzial von β-Sitosterol bei COPD bleibt unklar. Diese Studie hatte zum Ziel, die schützenden Wirkungen von β-Sitosterol gegen COPD zu untersuchen und dessen zugrunde liegenden Mechanismus aufzuklären. Datenbank-Screening identifizierte den Glukokortikoidrezeptor (GR) als potenzielles Ziel von β-Sitosterol. Ein von Zigarettenrauch induziertes COPD-Mausmodell und ein von Zigarettenrauch (CSE)-stimuliertes BEAS-2B-Zellmodell wurden entwickelt. Lungenfunktion, lungenschadensbezogene Marker, Entzündungen, oxidativen Stress und zelluläre Seneszenz wurden mit (RT-qPCR), DCFH-DA-Fluoreszenzsonden-Assays und Senezenz-Detektions-Kits bewertet. Auch die Effekte von β-Sitosterol allein oder in Kombination mit Dexamethason (DEX) wurden untersucht. β-Sitosterol verbesserte die Lungenfunktion signifikant, normalisierte lungenschädigungsbedingte Marker und dämpfte Entzündungen, oxidativen Stress und zelluläre Seneszenz sowohl in CSE-stimulierten BEAS-2B-Zellen als auch bei Mäusen, die mit Zigarettenrauch exponiert waren. Diese schützenden Effekte gingen mit einer erhöhten GR-Expression einher. Darüber hinaus verbesserte β-Sitosterol die Reaktionsfähigkeit auf DEX, und die kombinierte Behandlung mit β-Sitosterol und DEX führte zu größeren Verbesserungen der Lungenfunktion, der Lungenschädigungsmarker, der Entzündung, des reaktiven Sauerstoffspiegels und der zellulären Alterung als die Behandlung allein. Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass β-Sitosterol die mit COPD assoziierten pathologischen Veränderungen zumindest teilweise lindert, indem es die GR-Expression hochreguliert und die therapeutische Wirksamkeit von DEX erhöht, was dessen Potenzial als Adjuvansstrategie für die Behandlung von COPD hervorhebt.

Einleitung

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine fortschreitende Atemwegserkrankung, die durch anhaltende Atemwegsentzündungen, Alveolarschäden und irreversible Luftverstopfungen gekennzeichnet ist, die die Atemfunktion beeinträchtigt und die Lebensqualität verringert¹. Ihre Prävalenz steigt mit dem Alter deutlich an, und das Risiko für Personen ab 65 Jahren liegt etwa fünfmal so hoch wie bei Personen unter⁴² Jahren. Dieser demografische Trend steht im Zusammenhang mit erhöhter Krankheitsinzidenz, Mortalität und Behinderung³. Epidemiologische Prognosen deuten darauf hin, dass COPD bis 2030 die vierthäufigste Todesursache weltweit sein könnte und etwa 5 % aller Todesfälle ausmacht, ^4,5,6. Derzeit sind die identifizierten Risikofaktoren genetische Anfälligkeit, Lungendysplasie, Feinstoffexposition, chronische Bronchitis und Atemwegsinfektionen⁷.

Unter den Risikofaktoren ist Zigarettenrauch der wichtigste pathogene Faktor von COPD⁸. Es enthält Tausende von Chemikalien, die Schäden an der Bronchiale Epithel verursachen, die Infiltration von Entzündungszellen fördern und zur Umbildung des Lungengewebes^{führen können}. Langfristige Exposition kann eine anhaltende und irreversible Epithelverletzung auslösen, die Freisetzung einer großen Anzahl proinflammatorischer Chemokine fördern, die Produktion (ROS) signifikant steigern und Zellapoptose¹⁰ auslösen. Viele Studien haben gezeigt, dass die erhöhten Spiegel proinflammatorischer Chemokine wie Interleukin-8 (IL-8) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) zusammen mit übermäßiger ROS-Produktion und zellulärer Seneszenz eng mit dem Schweregrad von COPD^11,12 zusammenhängen. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von Wirkstoffen, die diese wichtigen pathogenen Faktoren effektiv und sicher modulieren können, um schützende und therapeutische Wirkungen bei COPD auszuüben.

Phytosterole sind natürliche bioaktive Verbindungen, die allgegenwärtig in Pflanzenzellmembranen vorhanden sind. Unter ihnen ist β-Sitosterol am häufigsten vorkommend und weit verbreitet in fettreichen pflanzlichen Lebensmitteln wie Gemüse, Nüssen, Samen und Olivenöl 13,14,15,16. Studien haben bestätigt, dass die Verabreichung von β-Sitosterol in Dosierungen von bis zu 1000 mg/kg bei Ratten und Mäusen nicht mit Zytotoxizität oder Genotoxizität¹⁷ assoziiert ist. Darüber hinaus haben Forschungen gezeigt, dass β-Sitosterol antioxidative Eigenschaften durch seine Wirkung auf antioxidative Enzyme und humane Östrogenrezeptoren^aufweist.

β-Sitosterol zeigt ein breites Spektrum pharmakologischer Wirkungen, darunter entzündungshemmend¹⁹, fiebersenkend²⁰, analgetikum²¹ und antidiabetische Wirkung¹³. Sie hat auch therapeutisches Potenzial in verschiedenen Krankheitsmodellen wie Kolitis und Darmentzündung²² gezeigt und besitzt antiatherosklerotische^{Eigenschaften 23} sowie immunmodulatorische Eigenschaften²⁴. Außerdem hat es ein günstiges Sicherheitsprofil. Angesichts dieser Eigenschaften hat β-Sitosterol großes Interesse als potenzieller Arzneimittelkandidat geweckt. Seine genaue Rolle und die zugrunde liegenden Mechanismen bei COPD bleiben jedoch weitgehend unklar.

Daher zielte die vorliegende Studie darauf ab, die potenziellen therapeutischen Effekte und zugrunde liegenden Mechanismen von β-Sitosterol bei COPD zu untersuchen. Konkret wurde ein von Zigarettenrauch (CSE)-induziertes BEAS-2B-Zellverletzungsmodell verwendet, um zu bewerten, ob β-Sitosterol CSE-vermittelte Zellschäden wirksam lindern und so ein neues Kandidatenmolekül für COPD-Therapiestrategien identifizieren kann.

Protokoll

Die Studie wurde gemäß den Leitlinien für Basis- und klinische Pharmakologie sowie Toxikologie für experimentelle und klinische Studien^{durchgeführt}. Alle Tierversuchsprotokolle wurden vom Tierethikkomitee des Zweiten Angeschlossenen Krankenhauses, Zhejiang Universität Medizinische Fakultät (Genehmigungsnr. 20230102) genehmigt, und alle Experimente wurden gemäß den Richtlinien des Tierethikausschusses durchgeführt. Die Studie wurde im Einklang mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Screening von Schlüsselkomponenten und Zielen mittels Netzwerkpharmakologie

Aktive Bestandteile von Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. und Adenophora stricta Miq. wurden aus der Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database (TCMSP; abgerufen am 12. März 2024) abgerufen. Kandidaten wurden nach folgenden ADME-Kriterien getestet: orale Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30 %, Arzneimittelähnlichkeit (DL) ≥ 0,18 und Caco-2-Permeabilität ≥ −0,4²⁵. Verbindungen, die alle drei Kriterien erfüllten, wurden als mögliche Wirkstoffe für spätere Analysen beibehalten.

Die kanonische Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES)-Struktur von β-Sitosterol wurde von PubChem (abgerufen am 18. März 2024) gewonnen und in SwissTargetPrediction (Zugriff am 21. März 2024) zur Zielvorhersage importiert. Homo sapiens wurde als Zielart ausgewählt. Potenzielle Ziele wurden anhand der strukturellen 2D- und 3D-Ähnlichkeit zwischen β-Sitosterol und bekannten Liganden in der Datenbank vorhergesagt. Vorhergesagte Ziele mit einer Wahrscheinlichkeit größer als 0 wurden beibehalten und doppelte Einträge entfernt.

COPD-assoziierte Gene wurden aus der Therapeutic Target Database (TTD; abgerufen am 25. März 2024) und der Comparative Toxicogenomics Database (CTD; abgerufen am 28. März 2024) mit dem Schlüsselwort "chronisch obstruktive Lungenerkrankung" abgerufen. Nach der Entfernung duplizierter Gene wurden die COPD-assoziierten Gene mit den vorhergesagten β-Sitosterol-Zielen gekreuzt, um potenzielle Kandidatenziele zu identifizieren, die potenziell an den therapeutischen Wirkungen von β-Sitosterol gegen COPD beteiligt sind.

Molekulare Andockung von β-Sitosterol und Generativer Relativität

Die dreidimensionale Struktur von β-Sitosterol im SDF-Format wurde aus der PubChem-Datenbank abgerufen (abgerufen am 2. Juni 2026), während die Kristallstruktur des Glukokortikoidrezeptors (GR) aus der Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB; abgerufen am 3. Juni 2026) entnommen wurde. Nach der standardmäßigen Vorbereitung der Liganden- und Rezeptorstrukturen wurde das molekulare Andocken über die CB-Dock2 Online-Plattform durchgeführt (abgerufen am 3. Juni 2026). Die vorbereiteten Ligand- und Rezeptordateien wurden auf die Plattform hochgeladen, und Andockberechnungen wurden mit den Standardparametern durchgeführt.

Funktionelle Anreicherungsanalyse der Genontologie (GO) und der Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG)

Alle vorhergesagten Zielgene von β-Sitosterol wurden der funktionellen Anreicherung von GO und KEGG-Signalweg-Anreicherungsanalysen unterzogen. Anreicherungsergebnisse, darunter signifikant angereicherte biologische Prozesse, zelluläre Komponenten, molekulare Funktionen und Signalwege, wurden sortiert und in Supplementary File 1 für die spätere bioinformatische Analyse gespeichert.

Tiermodellierung und -gruppierung

Die Stichprobengröße wurde auf sechs Tiere pro Gruppe festgelegt, basierend auf einer früheren Studie, die eine a priori Power-Analyse mit G*Power-Software (α = 0,05, Leistung = 0,80) durchführte und zeigte, dass n = 6 ausreichend ist, um biologisch relevante Unterschiede unter vergleichbaren experimentellen Bedingungen^zu erkennen. Männliche C57BL/6 Mäuse im Alter von 6–8 Wochen (20 ± 2 g) wurden zufällig fünf Gruppen zugeteilt: Kontrollgruppe, COPD-Modellgruppe, COPD + Dexamethason (DEX) Gruppe, COPD + β-Sitosterol Gruppe und COPD + DEX + β-Sitosterol Gruppe. Die Mäuse wurden unter standardmäßigen Laborbedingungen (25 °C, 12 Stunden Hell/Dunkel-Zyklus) untergebracht, mit freiem Zugang zu normalem Futter und Wasser, und durften sich eine Woche vor den Experimenten akklimatisieren.

Für das COPD-Modell wurden die Mäuse in eine Ganzkörper-E-Zigarettenrauch-Expositionskammer (63 cm × 55 cm × 45 cm) gesetzt und 12 Wochen lang dem üblichen Zigarettenrauch ausgesetzt. Jede Zigarette enthielt 10 mg Teer, 0,9 mg Nikotin und 10 mg Kohlenmonoxid. Die Rauchexposition erfolgte zweimal täglich (5 Tage pro Woche) um 9:30 Uhr und 15:00 Uhr, wobei Rauch aus 18 Zigaretten erzeugt wurde, die jeweils 90 Minuten pro^{Sitzung in} die Kammer gebracht wurden.

Um die therapeutischen Wirkungen der Interventionen zu bewerten, wurde nach 8 Wochen Zigarettenrauchexposition die Medikamentenverabreichung eingeleitet und für die restlichen 4 Wochen fortgesetzt. Ab Woche 9 erhielten die Mäuse in den jeweiligen Behandlungsgruppen täglich intragastrische Verabreichung von DEX (1 mg/kg)²⁸ oder β-Sitosterol (50 mg/kg)^29,30 1 Stunde vor der Zigarettenrauchexposition. Frühere pharmakokinetische Studien berichteten eine orale Bioverfügbarkeit von etwa 4 % für β-Sitosterol bei Nagetieren³¹. Außerdem haben mehrere Mausstudien Dosen von 20 bis 50 mg/kg³² verwendet. Daher wurde eine Dosis von 50 mg/kg gewählt, um eine ausreichende systemische Exposition zu gewährleisten und dabei im üblicherweise in präklinischen Studien verwendeten Bereich zu bleiben.

Mäuse in der Kontrollgruppe waren der gefilterten Raumluft ausgesetzt, während Mäuse in der Modell- und Behandlungsgruppe ein gleichwertiges Volumen normaler Kochsalzlösung als Träger erhielten. Am Ende der experimentellen Phase wurden die Mäuse tief mit Isofluran betäubt, bis der Pedalreflex verloren ging, und durch Exblutination mittels Abdominal-Aortenblut eingeschläfert. Die Brusthöhle wurde sofort geöffnet, und intakte beidseitige Lungengewebe wurden sorgfältig entfernt, mit eiskaltem phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungsmittel (PBS) abgespült und auf Eis gelegt. Für die Entnahme von bronchoalveolarer Spülflüssigkeit (BALF) wurde die Luftröhre kanuliert und mit kaltem, sterilem PBS abgespült, das sanft eingebracht und wiederholt entsorgt wurde, um die Lavageflüssigkeit zu sammeln. Lungengewebe und BALF-Proben wurden auf Eis aufbewahrt und anschließend für nachgelagerte Analysen verarbeitet.

BEAS-2B-Zellkultur

BEAS-2B menschliche bronchiale Epithelzellen wurden in Dulbeccos Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) erhalten, das 10 % fetales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin unter 5 % CO₂ bei 37 °C enthält.

CSE-Präparation und Beas-2B-Zellexposition

BEAS-2B-Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 24-Bohrloch-Platten in dreifacher Schicht mit einer Dichte von 5 × 10^4-Zellen pro Bohrloch ausgesaat. Nach 12 Stunden Kultur erreichten die Zellen etwa 60 % Konfluenz und wurden dann CSE ausgesetzt. CSE wurde wie zuvor beschrieben frisch vorbereitet, mit geringfügigen Änderungen³³. Kurz darauf wurde eine ungefilterte kommerzielle Zigarette kontinuierlich verbrannt, und der übliche Rauch wurde mit einer Vakuumpumpe bei konstanter Durchflussrate von 1,05 L/min (ca. −11 kPa Unterdruck) für etwa 5 Minuten in 10 mL serumfreies Medium geblasen, bis die Zigarette vollständig verbrannt war. Die gewonnene Lösung wurde zunächst einer Vorfiltration unterzogen, um große partikelhaltige Verunreinigungen zu entfernen, und anschließend mit einem 0,22 μm sterilen mikroporösen Filter sterilisiert, um Restpartikel zu eliminieren; die resultierende Aktienlösung wurde als 100 % CSE definiert. Alle frisch vorbereiteten CSE wurden unmittelbar nach der Filtration ohne Lagerung für die Zellbehandlung verwendet. Die Zellen wurden mit einem Medium stimuliert, das 2,5 % CSE enthielt. Nach 24 Stunden CSE-Behandlung wurden die Kultursupernatanten gesammelt und bei -40 °C für die anschließende Analyse³⁴ gelagert.

Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

Die Gesamt-RNA wurde aus BEAS-2B-Zellen mit einem Gesamt-RNA-Extraktionskit extrahiert und gemäß den Anweisungen des Herstellers rückwärts in cDNA transkribiert. RT-qPCR wurde anschließend mit einem Echtzeit-PCR-Detektionssystem und einem SYBR Green-basierten qPCR-Mastermix durchgeführt. Alle RT-qPCR-Experimente wurden mit drei biologischen Replikaten und drei technischen Replikaten pro Probe durchgeführt, um die Datenzuverlässigkeit sicherzustellen.

Jede qPCR-Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 20 μL durchgeführt, das 10 μL SYBR Green qPCR-Mastermischung, 0,4 μL Forward Primer, 0,4 μL Reverse Primer, 2 μL verdünnte cDNA-Vorlage und 7,2 μL RNase-freies Wasser enthielt. Die Verstärkungsbedingungen waren wie folgt: erste Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 40 Denaturationszyklen bei 95 °C für 10 Sekunden und Glühen/Verlängerung bei 60 °C für 30 Sekunden. Die relativen Genexpressionsniveaus wurden mit der 2^{−ΔΔCt-Methode} berechnet, wobei GAPDH als internes Referenzgen diente. Die in dieser Studie verwendeten Primer-Sequenzen sind in Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Analyse intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)

Die intrazelluläre ROS-Produktion in BEAS-2B-Zellen wurde mit der fluorogenen Sonde 2′,7′-Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (DCFH-DA) bewertet und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Während der Durchflusszytometrie-Erfassung wurde eine standardmäßige Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Anwendung verwendet, um Zellreste auszuschließen und intakte Einzelzellen auszuwählen. Insgesamt wurden für jede Probe 10.000 gültige zelluläre Ereignisse erfasst. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen wurden auf 488 nm bzw. 525 nm eingestellt. Flusszytometrische Daten wurden anschließend analysiert, um die intrazelluläre ROS-Fluoreszenzintensität zu quantifizieren.

Malondialdehyd-(MDA)-Level-Bestimmung

Der intrazelluläre MDA-Gehalt wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Lipidperoxidations-Testkit gemessen. Kurzzeitig wurden behandelte BEAS-2B-Zellen entnommen und lysiert, dann bei niedriger Temperatur zentrifugiert, um das Supernatant zu sammeln. Anschließend wurde die kolorimetrische Reaktion der Thiobarbitursäure (TBA) durchgeführt, und die Absorptionsfähigkeit wurde bei 532 nm mit einem Mikroplattenmesser gemessen. Die relativen MDA-Werte wurden nach der Standardkurve berechnet.

Zellseneszenzbewertung

Die zelluläre Seneszenz wurde mittels eines Seneszenz-Nachweistests auf Basis der seneszenzassoziierten β-galactosidase (SA-β-gal) Aktivität untersucht. SA-β-gal-positive Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Parallel dazu wurden die mRNA-Expressionsniveaus der seneszenzassoziierten Marker p53 und p21 durch RT-qPCR bestimmt.

Zellproliferations-Assay

Die Zellproliferation wurde mit einem kolorimetrischen Zell-Vitalitätstest untersucht. Die Absorption wurde mit 450 nm mittels eines Mikroplattenlesers gemessen.

GR Knockdown-Assay

Die Zelltransfektion wurde mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz durchgeführt. Folgende Oligonukleotide wurden transfektiert: Glukokortikoidrezeptor-zielende kleine interferierende RNA (si-GR) und negative kontrollierende kleine interferierende RNA (si-NC). Kandidaten-siRNA-Sequenzen, die auf GR abzielen, wurden mit der Online-Bioinformatikplattform siDirect 2.0 entwickelt. Nach der Transfektion wurden die Zellen 48 Stunden lang kultiviert, und alle siRNAs wurden bei einer Endkonzentration von 50 nM verwendet. Die Knockdown-Effizienz wurde durch Messung der GR-mRNA-Expression mittels RT-qPCR bestätigt.

Vehikelkontrollgruppen wurden sowohl in β-Sitosterol-Behandlungs- als auch in Transfektionsexperimenten einbezogen. Bei der β-Sitosterol-Intervention dienten Zellen, die ausschließlich mit Vehikellösungsmittel behandelt wurden, als Kontrollgruppe für das Vehikel (bezeichnet als CSE+0). Statistische Analysen bestätigten, dass keine signifikanten Unterschiede zwischen der Fahrzeugkontroll- und der Blankkontrollgruppe beobachtet wurden.

Statistische Analyse

Alle quantitativen Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologisch unabhängigen In-vitro-Experimenten angegeben. Statistische Analysen wurden mit Statistiksoftware durchgeführt. Der Shapiro–Wilk-Test wurde verwendet, um die Normalität der Datensatzverteilung vor statistischen Tests zu untersuchen; Die Bonferroni-Post-hoc-Korrektur wurde eingeführt, um P-Werte für mehrere Vergleiche nach Varianzanalyse (ANOVA) anzupassen. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden durch einen ungepaarten Student's t-Test bewertet, während für Multigruppenvergleiche Einweg- oder Zwei-Wege-ANOVA eingesetzt wurde. Ein p-Wert ≤ 0,05 galt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

β-Sitosterol war ein potenzielles Naturprodukt zur Behandlung von COPD

Aufgrund der berichteten heilenden Wirkung von Fritillaria cirrhosa D. Don, getrockneter Blüte von Lonicera japonica Thunb., getrockneter Wurzel von Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. und Adenophora stricta Miq. bei der Behandlung von Lungenerkrankungen 35,36,37,38 nutzte diese Studie die TCMSP-Datenbank, um systematisch die Wirkstoffe dieser Kräuter der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) zu identifizieren, β-Sitosterol als wichtiger Wirkstoff identifiziert wurde, der von diesen TCM-Kräutern geteilt wurde (Abbildung 1A). Um systematisch den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus von β-Sitosterol zu erforschen, wurden seine SMILES-Strukturinformationen aus der PubChem-Datenbank abgerufen und zur Zielvorhersage in die SwissTargetPrediction-Datenbank importiert; Alle vorhergesagten Ziele mit einer prädiktiven Wahrscheinlichkeit über 0 wurden für die spätere Analyse beibehalten. Das resultierende Wirkstoff-Ziel-Interaktionsnetzwerk zwischen β-Sitosterol und seinen Kandidatenzielen wurde in Abbildung 1B visualisiert und dargestellt. Insgesamt wurden 43 vermutete Zielgene von β-Sitosterol mittels der Datenbank SwissTargetPrediction vorhergesagt. Anschließend wurden GO-funktionelle Anreicherungs- und KEGG-Signalweganreicherungsanalysen an den Zielgenen von β-Sitosterol durchgeführt, und alle vollständigen Anreicherungsdatensätze wurden in Supplementary File 1 archiviert. Bemerkenswert ist, dass steroidmetabolische Prozesse als einer der wichtigsten signifikant angereicherten Signalwege identifiziert wurden. Die gesammelte Literatur hat die enge Korrelation zwischen abweichendem Steroidstoffwechsel und Glukokortikoidresistenz bei COPD³⁹ nachgewiesen. Darüber hinaus war GR in funktionellen Clustern, die mit dem Steroidstoffwechsel verbunden sind, deutlich angereichert. Dieses Ergebnis liefert entscheidende bioinformatische Unterstützung für unsere späteren zellulären Experimente, die den Mechanismus untersuchen, durch den β-Sitosterol die DEX-Sensitivität verbessert und die GR-Expression verändert.

Die mit COPD verbundenen Gene wurden aus den TTD- und CTD-Datenbanken abgerufen. Eine anschließende Venn-Schnittanalyse (Abbildung 1C) zeigte zwei überlappende Gene zwischen β-Sitosterol-Zielen und TTD-abgeleiteten COPD-bezogenen Genen, zwei weitere überlappende Gene zwischen β-Sitosterol-Zielen und CTD-abgeleiteten COPD-bezogenen Genen sowie fünf gemeinsame COPD-Gene zwischen den TTD- und CTD-Datensätzen. Letztlich war GR das einzige gemeinsame Gen aller drei Datensätze und wurde als Kernziel von β Sitosterol gegen COPD definiert. Detaillierte numerische Daten der Venn-Analyse sind in Supplementary File 2 aufgeführt. Zur weiteren Überprüfung der Bindungsaffinität wurde das molekulare Andocken von β-Sitosterol mit der GR durchgeführt (Abbildung 1D). Bindungstaschen mit Vina-Werten unter −7,0 kcal/mol wurden als vorteilhafte Bindungsaffinität angesehen. Die Vina-Werte der Pockets C1 und C5 lagen bei −8,8 bzw. −7,2 kcal/mol, was auf eine starke vorhergesagte Wechselwirkung zwischen β-Sitosterol und GR hinweist.

β-Sitosterol schützte BEAS-2B-Zellen vor CSE-Schäden, die mit erhöhter GR-Expression in Verbindung stehen könnten

β-Sitosterol zeigte im Modell der durch CSE induzierten BEAS-2B-Zellverletzungen einen signifikanten Schutzeffekt. Die CSE + 0-Gruppe wurde als Vehicle-Control-Empfänger von CSE plus ein gleiches Volumen Arzneimittellösungsmittel ohne β-Sitosterol konzipiert. Wie erwartet wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den CSE- und CSE-+0-Gruppen festgestellt. Die Verbindung hemmte die durch CSE induzierte Produktion von TNF-α und IL-6 auf konzentrationsabhängige Weise (Abbildung 2A). Es senkte außerdem die intrazellulären ROS-Spiegel (Abbildung 2B). β-Sitosterol verringerte außerdem den MDA-Gehalt signifikant (Abbildung 2C), unterdrückte die durch CSE induzierte zelluläre Senezenz (Abbildung 2D) und senkte die senezenzbezogenen Marker p53 und p21 (Abbildung 2E). Diese Effekte wurden von einer hochregulierten GR-mRNA-Expression begleitet (Abbildung 2F), was darauf hindeutet, dass ihre Schutzfunktion eng mit der transkriptionellen Hochregulation der GR verknüpft sein könnte. Innerhalb des getesteten Konzentrationsbereichs hatte β-Sitosterol keine offensichtliche Zytotoxizität auf die Zelllebensfähigkeit von BEAS-2B (Abbildung 2G), was auf eine günstige zelluläre Toleranz gegenüber dieser Verbindung hinweist. Da 20 μg/mL (etwa 48,2 μM) die stärksten inhibitorischen Effekte zeigten, wurde diese Dosis für spätere Experimente ausgewählt. Obwohl zwischen den 10 μg/mL- und 20 μg/mL-Gruppen kein statistisch signifikanter Unterschied hinsichtlich der Unterdrückung proinflammatorischer Zytokine beobachtet wurde, zeigte 20 μg/mL β-Sitosterol einen leichten Abwärtstrend bei den Entzündungsfaktoren. Darüber hinaus erzielte 20 μg/mL im Vergleich zu 10 μg/mL eine überlegene Wirksamkeit bei der Hemmung der CSE-induzierten ROS- und MDA-Akkumulation, der Reduktion der zellulären Seneszenz und der Hochregulierung der GR-mRNA-Expression. Dies unterstützte die Auswahl von 20 μg/mL als optimale Arbeitskonzentration für Folge-Rettungstests.

RT-qPCR-Ergebnisse (Abbildung 2H) bestätigten einen erfolgreichen GR-Knockdown. Die GR-mRNA-Spiegel in der si-GR-Gruppe wurden im Vergleich zur si-NC-Kontrollgruppe um etwa 78 % reduziert, was die Effizienz der GR-Silencing für nachfolgende Rettungstests bestätigt. Nach dem GR-Knockdown wurden die inhibitorischen Effekte von β-Sitosterol auf entzündliche Faktoren und ROS signifikant umgekehrt (Abbildung 2I, J). Ebenso wurde auch die Abschwächung der zellulären Alterung durch β-Sitosterol aufgehoben (Abbildung 2K). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass β-Sitosterol eine schützende Rolle gegen CSE-induzierte Schädigungen von Bronchialepithelzellen durch GR-vermittelte antiinflammatoriske, antioxidative und anti-Aging-Mechanismen spielt.

β-Sitosterol verstärkte die therapeutischen Effekte von DEX auf die Lungenfunktion und Entzündung in einem Mausmodell von COPD

In einem Mausmodell der COPD, das durch Zigarettenrauchexposition etabliert wurde, zeigte die Behandlung mit β-Sitosterol, DEX oder deren Kombination alle deutliche Schutzwirkungen. Statistische Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden mittels Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt vom Tukey-Post-hoc-Test. Fünf unterschiedliche Symbolstile wurden verwendet, um experimentelle Kohorten zu unterscheiden: Kreise für die Kontrollgruppe, Dreiecke für die Modellgruppe, Sternchen für die Modell + DEX-Gruppe, Quadrate für die Modell + β-Sitosterol-Gruppe und Rauten für die Modell + DEX + β-Sitosterol-Gruppe. Jede horizontale Klammer stellt einen statistischen Vergleich zwischen zwei verbundenen experimentellen Gruppen dar.

Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten die Mäuse der COPD-Modellgruppe deutliche Reduktionen im erzwangenen Ausatmungsvolumen in 0,1 Sekunden (FEV₀.₁), erzwungener Lebenskapazität (FVC), Spitzenausatmungsfluss (PEF) und dem FEV₀.₁/FVC-Verhältnis. Wie in Abbildung 3A–D dargestellt, bestätigte ein FEV₀.₁/FVC-Verhältnis unter 70 % die erfolgreiche Etablierung des COPD-Modells. Die Verabreichung von DEX oder β-Sitosterol allein kehrte diese Lungenfunktionsstörungen im Vergleich zu Modellmäusen signifikant um, und die kombinierte Behandlung führte zu weiteren Verbesserungen gegenüber der Einzelmedikamentenverabwandlung. Darüber hinaus ist ein verändertes MMP-9/TIMP-1-Verhältnis ein charakteristischer molekularer Marker für die Umgestaltung der Atemwege, und die erhöhte MUC5AC-Expression steht für eine übermäßige Schleimhypersekretion^40,41. Wir haben außerdem die mRNA-Spiegel von MMP-9, TIMP-1 und dem Schleimmarker MUC5AC nachgewiesen und das MMP-9/TIMP-1-Verhältnis berechnet (Abbildung 3E, F). Die Modellgruppe zeigte ein deutlich erhöhtes MMP-9/TIMP-1-Verhältnis und eine erhöhte MUC5AC-Expression. DEX oder β-Sitosterol allein reduzierten beide Parameter effektiv, und die Kombinationstherapie erzielte eine überlegene inhibitorische Wirksamkeit im Vergleich zur Monotherapie.

COPD-Modellmäuse zeigten ausgeprägte Erhöhungen der BALF-Spiegel von TNF-α und IL-6 sowie einen erhöhten ROS-Gehalt der Lunge im Vergleich zu Kontrollmäusen. DEX oder β-Sitosterol allein senkten sowohl die entzündlichen Zytokinspiegel als auch den oxidativen Stress deutlich, und die kombinierte Behandlung erzeugte stärkere inhibitorische Effekte (Abbildung 3G, H). Darüber hinaus wurde die lungenartige GR-mRNA-Expression in den COPD-Modellmäusen deutlich herunterreguliert. DEX oder β-Sitosterol allein erhöhten die GR-Expression signifikant, und die kombinierte Behandlung erhöhte die GR-Werte weiter (Abbildung 3I).

Diese Ergebnisse zeigten zusammen, dass β-Sitosterol vor COPD-bedingten pathologischen Veränderungen bei Mäusen schützt, indem es die Lungenfunktion aufrechterhält, Entzündungen hemmt, oxidativen Stress lindert und die GR-Expression erhöht. Darüber hinaus verstärkte die kombinierte Verabreichung von β-Sitosterol die schützende Wirkung von DEX in diesem Modell.

β-Sitosterol verbesserte die therapeutische Wirksamkeit von DEX, möglicherweise durch die Regulation des GR-Signalwegs im CSE-induzierten BEAS-2B-Zellmodell

Im CSE-induzierten BEAS-2B-Zellmodell reduzierte die DEX-Monotherapie signifikant die mRNA-Expression proinflammatorischer Zytokine, senkte die intrazellulären ROS- und MDA-Spiegel und reduzierte den Anteil der seneszenten Zellen sowie die Expression der Altersmarker p53 und p21. Diese Ergebnisse bestätigen die entzündungshemmende, antioxidative und anti-seneszente Wirkung von DEX. Bemerkenswert ist, dass die gemeinsame Verabreichung von β-Sitosterol die schützenden Wirkung von DEX weiter verstärkte, was zu einer stärkeren Unterdrückung von Entzündungen, oxidativem Stress und zellulärer Seneszenz im Vergleich zur DEX-Monotherapie führte. Nach dem GR-Knockdown (si-GR) in der DEX + β-Sitosterol Kobehandlungsgruppe war die zelluläre Reaktion auf die kombinierte Therapie deutlich abgeschwächt. Wie in Abbildung 4A–E dargestellt, wurde die komediale Hemmung von Entzündung, oxidativem Stress und Seneszenz durch DEX und β-Sitosterol signifikant umgekehrt, was darauf hindeutet, dass ein GR-Mangel die vorteilhaften Effekte von β-Sitosterol auf die DEX-Wirksamkeit abschwächte.

Zusammen zeigten diese Ergebnisse, dass β-Sitosterol die DEX-Wirksamkeit erhöhte, möglicherweise durch die Regulation von GR-bezogenen Prozessen, wodurch die schützenden Wirkung von DEX gegen CSE-induzierte Bronchienepithelzellverletzungen verstärkt wurden.

DATENVERFÜGBARKEIT:

Alle Rohdaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind in den ergänzenden Materialien (Supplementary File 1, Supplementary File 2) bereitgestellt.

Abbildung 1: Schlüsselrolle von β-Sitosterol in der COPD-Therapie. (A) Aktive Bestandteile in Fritillaria cirrhosa D. Don, getrockneter Blüte von Lonicera japonica Thunb. und getrockneter Wurzel von Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. und Adenophora stricta Miq. wurden über die TCMSP-Datenbank geprüft. (B) Die potenziellen Ziele von β-Sitosterol. (C) Schnittanalyse von β-Sitosterol nachgelagerten Zielen und COPD-bezogenen Genen. (D) Molekulare Andockungsanalyse zwischen β-Sitosterol und GR-Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Beteiligung von GR am β-Sitosterol-bezogenen Schutz gegen CSE-induzierte Zellverletzungen. (A) Konzentrationsabhängige Modulation von CSE-induzierten entzündlichen Mediatoren (TNF-α, IL-6) durch β-Sitosterol. (B) β-Sitosterol-Dosis wirkt sich auf das ROS-Niveau in CSE-exponierten Zellen aus. (C) Auswirkungen von β-Sitosterol auf den von CSE hochregulierten MDA-Inhalt. (D) Der Einfluss von β-Sitosterol auf CSE-geförderte zelluläre Senezzenz. (E) Modulation von seneszenzbezogenen p53 und p21 durch β-Sitosterol unter CSE-Stimulation. (F) β-Sitosterol konzentrationsabhängige Regulation der GR-Expression unter CSE-Stimulation. (G) Zellviabilität von β-Sitosterol über getestete Konzentrationen in BEAS-2B-Zellen. (H) RT-qPCR-Nachweis der GR-mRNA-Expression zur Überprüfung der Knockdown-Effizienz nach GR-gezielter siRNA-Transfektion. (I) Regulatorischer Zusammenhang zwischen GR und β-Sitosterol gegenüber CSE-induzierten Entzündungsfaktoren. (J) Regulatorische Assoziation zwischen GR und β-Sitosterol gegenüber CSE-induzierter ROS-Akkumulation. (K) Regulatorische Assoziation zwischen GR und β-Sitosterol gegen CSE-induzierte zelluläre Senezenz. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; NS, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Effekte von β-Sitosterol in Kombination mit DEX auf die Lungenfunktion, Entzündung, oxidativen Stress und GR-Expression bei COPD-Modellmäusen. (A) Veränderungen des erzwungenen exiratorischen Volumens in 0,1 s (FEV₀.₁) bei COPD-Mäusen. (B) Veränderungen der erzwungenen Vitalkapazität (FVC) bei COPD-Mäusen. (C) Auswirkungen auf den Peak Breath Flow (PEF) bei COPD-Mäusen. (D) FEV₀.₁/FVC-Verhältnis bei COPD-Modellmäusen. (E) Relatives mRNA-Verhältnis von MMP-9/TIMP-1 spiegelt die Umgestaltung der Atemwege wider. (F) Die relative mRNA-Expression von MUC5AC weist auf Schleimhypersekretion im Lungengewebe der Maus hin. (G) Werte von TNF-α und IL-6 in der bronchoalveolaren Spülflüssigkeit (BALF). (H) ROS-Produktion im Lungengewebe von COPD-Mäusen. (I) Relative mRNA-Expression von GR im Lungengewebe der Maus. *p < 0,05; **p < 0,01; S. < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Wirkung von β-Sitosterol auf GR-vermittelte DEX-Resistenz in CSE-induzierten BEAS-2B-Zellen. (A) Relative mRNA-Expression von Entzündungsfaktoren (TNF-α, IL-6) in jeder Gruppe. (B) ROS-Level in jeder Gruppe. (C) MDA-Inhalte in jeder experimentellen Gruppe. (D) Prozentsatz der seneszenten BEAS-2B-Zellen in jeder Gruppe. (E) Relative mRNA-Werte der seneszenzassoziierten Marker p53 und p21. **p < 0,01; p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Tabelle 1: Primer-Sequenzen, die für die RT-qPCR-Analyse verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Vollständige GO- und KEGG-Anreicherungsanalyse-Datensätze für β-Sitosterol-Zielgene. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Detaillierte numerische Ergebnisse der Venn-Analyse, die die sich überschneidenden Ziele zwischen β-Sitosterol und COPD identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

COPD verursacht eine erhebliche globale Krankheitslast und bleibt eine große Herausforderung für die weltweite Gesundheit¹. Das aktuelle Management von COPD umfasst sowohl pharmakologische als auch nicht-pharmakologische Interventionen⁴². Unter den pharmakologischen Behandlungen werden Glucokortikosteroide (GCs) häufig bei chronischen entzündlichen Erkrankungen eingesetzt. Sie wirken, indem sie an die GR binden und Histondeacetylase 2 in Transkriptionskomplexe rekultieren, um die Histonacetylierung⁴³ umzukehren. Mehrere Studien haben jedoch eine verringerte GC-Sensitivität bei COPD-Patienten^44,45 gezeigt, und Untersuchungen haben Hinweise auf GC-Resistenz bei dieser Krankheit geliefert⁴⁶. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Überwindung der GC-Resistenz eine bedeutende klinische Herausforderung darstellt und den Bedarf an neuartigen Therapeutika unterstreicht. Daher ist es von großer Bedeutung, wirksamere therapeutische Optionen für COPD zu identifizieren.

Frühere Studien haben gezeigt, dass γ-Sitosterol eine antiproliferative Wirkung auf bronchiale Epithelzellen bei COPD⁴⁷ hat. Da γ-Sitosterol und β-Sitosterol beide gängige bioaktive Bestandteile von Phytosterolen sind, erweitert die vorliegende Studie das aktuelle Verständnis der Wirkung von Phytosterol bei COPD und hebt den potenziellen Schutzwert von β-Sitosterol bei der Krankheitspathogenese hervor. Unsere Ergebnisse zeigten, dass β-Sitosterol die Freisetzung von Entzündungsfaktoren signifikant hemmte, oxidativen Stress reduzierte und die zelluläre Seneszenz unterdrückte. Dies stimmt mit früheren Berichten überein, die zeigen, dass β-Sitosterol die Hochregulation von lipopolysaccharidinduzierten entzündlichen Mediatoren wie IL-6, induzierbarer Stickstoffmonoxidsynthase und TNF-α⁴⁸ effektiv unterdrückt. Diese Ergebnisse bestätigen seine entzündungshemmende Wirkung und unterstützen seine Konsistenz in verschiedenen Entzündungsmodellen.

Inhalierte GCs sind wirksame entzündungshemmende Mittel zur Kontrolle der Atemwegsentzündungen. Sie handeln in erster Linie, indem sie den GR⁴⁹ binden und aktivieren. Ein zentrales pathologisches Merkmal von COPD ist jedoch die verminderte Empfindlichkeit der Zellen gegenüber den entzündungshemmenden Effekten von GCs⁴⁴. Die Downregulation oder funktionelle Beeinträchtigung der GR gilt als ein Hauptmechanismus für die Entwicklung der GC-Resistenz bei COPD-Patienten⁵⁰. Frühere Studien haben gezeigt, dass bestimmte Medikamente die GC-Sensitivität erhöhen können. Zum Beispiel hat die Kombination aus Azithromycin und Budesonid eine signifikant stärkere hemmende Wirkung auf die Produktion von IL-4 und CXCL8 als beide allein^{Wirkstoffe 51}.

Bemerkenswert ist, dass die vorliegende Studie sowohl in Zigarettenrauch-exponierten COPD-Mausmodellen als auch in CSE-induzierten BEAS-2B-Zellmodellen die Kombination von β-Sitosterol mit DEX signifikant stärkere hemmende Effekte auf Entzündungsfaktoren, oxidativen Stress und zelluläre Seneszenz hervorbrachte als DEX allein. Diese Kombination verbesserte zudem die schützende Wirksamkeit von DEX gegen COPD-bedingte pathologische Veränderungen und Verletzungen von bronchialen Epithelzellen bei Mäusen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass β-Sitosterol die Empfindlichkeit der bronchialen Epithelzellen gegenüber DEX verbessern und einen neuartigen Ansatz zur Behandlung von GC-Insensitivität oder -Resistenz bei einigen COPD-Patienten bietet. Im Einklang mit den in-vitro quantitativen PCR-Ergebnissen erhöht β-Sitosterol die GR-mRNA-Spiegel konzentrationsabhängig, anstatt direkt als GR-Agonist oder Antagonist zu dienen. Bestätigte si-GR-Knockdown-Effizienz und anschließende funktionelle Rettungsassays bestätigen zudem, dass β-Sitosterol die zelluläre GC-Reaktionsfähigkeit verbessert, indem es die gesamten intrazellulären GR-Spiegel erhöht, anstatt GR direkt zu aktivieren, was in Kombination mit DEX, einem kanonischen GR-Agonisten, verstärkte therapeutische Effekte erzeugt. Dementsprechend können Veränderungen in der GR-Expression mit der Wirkung von β-Sitosterol in Verbindung gebracht werden, was mit früheren Beobachtungen signifikant reduzierter GR und ihrer aktiven Isoform GRα in glatten Atemwegszellen von COPD-Patienten^{übereinstimmt}. Wichtig ist, dass GR-Knockdown-Experimente zudem die zentrale Rolle dieses Rezeptors bei der β-Sitosterol-vermittelten Zytoprotektion aufzeigten, was darauf hindeutet, dass einige der biologischen Funktionen von β-Sitosterol von der Integrität des GR-Weges abhängen.

Zusammengenommen zeigt die vorliegende Studie nicht nur, dass GR als wichtiger Mediator von β-Sitosterol bei der COPD-Intervention dienen könnte, sondern auch einen potenziellen neuen Ansatz zur Überwindung der klinischen Herausforderung der DEX-Resistenz bietet und so eine experimentelle Grundlage für die Entwicklung natürlicher Zusatztherapien mit Blick auf den GR-Pfad legt.

Die vorliegende Studie hatte jedoch mehrere Einschränkungen. Erstens wurde die Lungenfunktion nur bewertet, um die erfolgreiche Etablierung des COPD-Mausmodells zu bestätigen, und Hämatoxylin-Eosin (HE) und Masson-Färbungen wurden nicht durchgeführt, um typische pathologische Merkmale wie Emphysem, Atemwegsanbau und Schleimhypersekretion weiter zu überprüfen. Da bei früheren Experimenten alle fixierten Lungenproben konsumiert wurden, war die Rekonstruktion des 12-Wochen-Zigarettenrauch-induzierten COPD-Mausmodells innerhalb des verfügbaren Studienzeitraums nicht machbar. Um diese Einschränkung teilweise auszugleichen, wurden das MMP-9/TIMP-1-Verhältnis und die MUC5AC-mRNA-Expression mit konservierten Lungen-RNA-Proben quantifiziert. Zweitens wurde nur eine einzige Kombinationsdosis von β-Sitosterol und DEX in vivo untersucht, und Dosis-Wirkungs- oder synergistische Effekte wurden nicht systematisch untersucht. Weitere Studien mit mehreren Dosiskombinationen sind notwendig, um potenzielle synergistische Wechselwirkungen zu charakterisieren. Drittens wurden aufgrund experimenteller Einschränkungen und Forschungskosten nur sechs Mäuse in jede Gruppe aufgenommen. Die relativ kleine Stichprobengröße könnte die Anfälligkeit für intertierische Variabilität erhöht und die statistische Robustheit der Ergebnisse eingeschränkt haben. Zukünftige Studien mit größeren Stichprobengrößen sind erforderlich, um die aktuellen Ergebnisse weiter zu validieren. Viertens wurden stabile DEX-resistente Zelllinien nicht etabliert; Daher konnte die Fähigkeit von β-Sitosterol, etablierte Glukokortikoidresistenz umzukehren, nicht direkt bewertet werden. Weitere Studien mit validierten glukokortikoidresistenten Modellen sind erforderlich, um diesen potenziellen Mechanismus weiter zu untersuchen.

Abschließend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die GR-Signalübertragung an den schützenden Effekten von β-Sitosterol gegen CSE-induzierte Verletzungen in BEAS-2B-Zellen beteiligt sein könnte, einschließlich der Hemmung der Freisetzung von Entzündungsfaktoren, oxidativem Stress und zellulärer Senezenz sowie Verbesserungen der Lungenfunktion und der Biomarker der Lungenverletzung. Darüber hinaus verbesserte β-Sitosterol die therapeutische Empfindlichkeit dieser Zellen gegenüber DEX. Zusammen identifizieren diese Ergebnisse β-Sitosterol als mögliches natürliches Kandidatmolekül, das zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für COPD beitragen könnte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BEAS-2B human bronchial epithelial cells	SunnCell, China	SC-0218	Humane bronchiale Epithelzelllinie für die In-vitro-Studie
C57BL/6 Mäuse	Vital River Laboratories, China	213	Tiermodell für COPD-In-vivo-Experiment
CB-DOCK2	China	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	für die Molekulardock-Simulation zwischen Ligand und Rezeptorprotein
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, China	C0038	Erkennung der Zelllebensfähigkeit und Proliferation
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, USA	C10851	Erkennung der zellulären Seneszenz
Zigaretten	Hongta, China	Nicht bereitgestellt	Zigarette zur Rauchexposition und CSE-Vorbereitung
CTD	USA	https://ctdbase.org/	zum Abrufen von COPD-bezogenen Genen
DCFH-DA-Fluoreszenzsonde	Sigma-Aldrich, USA	D6883-50MG	Erkennung des intrazellulären ROS-Spiegels
Dexamethason (DEX)	Yeasen, China	40323ES03	Glukokortikoid für die kombinierte Intervention
DMEM/F12-Medium	Gibco, USA	11330032	Basismedium für BEAS-2B-Zellkultur
Fötales Kälberserum (FBS)	Gibco, USA	10270106	Ergänzung für Zellkulturmedium
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	9.3.1	Statistische Datenanalyse und Grafiken
Isofluran	RWD Life Science, China	R510-22-10	Inhalationsanästhetikum zur Tierbetäubung
Lipidperoxidation MDA Assay Kit	Beyotime Biotechnology, China	S0131S	Erkennung des intrazellulären Malondialdehyds (MDA)-Gehalts
Lipofectamin 2000	Thermo Fisher, USA	11668030	Transfektionsreagenz für die siRNA-Übertragung
Multimode-Mikroplattenleser	Thermo Fisher, USA	VL0000D0	Erkennung von Absorptions- und Fluoreszenzwerten
Navios EX Flow Cytometer	Beckman Coulter, USA	B80912	Analyse von ROS und seneszenten Zellen
Penicillin/Streptomycin	HyClone, USA	SV30010	Antibiotika zur Verhinderung bakterieller Kontamination
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, USA	4367659	Fluoreszierende quantitative PCR-Amplifikation
PrimeScript™ RT Reagenz-Kit	Takara, Japan	RR037Q	Reverse Transkription zur cDNA-Synthese
PubChem-Datenbank	USA	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	zum Abrufen der kanonischen SMILES-Sequenz und Herunterladen von 3D-SDF-Strukturinformationen von Beta-Sitosterol
QuantStudio Dx PCR-Instrument	Thermo Fisher, USA	4479889	Real-time RT-qPCR-Erkennung
RCSB PDB	USA	https://www.rcsb.org/	zum Abrufen der GR-Kristall-3D-Strukturdatei
RNA/Protein-Isolierungs-Kit	Beyotime Biotechnology, China	R0018S	Totale RNA-Extraktion aus Zell- und Lungengewebe
si-GR	Designed in silico via siDirect 2.1	Benutzerdefinierte Synthese	Guide: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Passagier: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, Knockdown für GR
si-NC	Thermo Fisher, USA	4390843	als negativer Transfektionskontroll für zelluläre und In-vivo-Assays
SwissTargetPrediction-Datenbank	Schweiz	http://swisstargetprediction.ch/	zur in-silico-Vorhersage potenzieller arzneimittelbezogener Protein-Ziele
TCMSP-Datenbank	China	https://www.tcmsp-e.com/	zur Prüfung von Kräuterzutaten und Zielvorhersage
TTD	Singapur	https://db.idrblab.net/ttd/	zur Sammlung validierter COPD-assoziierter Krankheitsgene
Ganzkörper-Rauchexpositionskammer	Teague Enterprise, USA	TE-2	Aufbau eines durch Zigarettenrauch induzierten COPD-Modells
β-Sitosterol	ChemicalBook, China	83-46-5	Aktiver Phytosterol für die Arzneimittelbehandlung