Protokolle für effiziente Aufzucht und funktionelle Analyse der endoparasitoiden Wespe Asobara japonica und ihres Wirts Drosophila melanogaster

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, die funktionelle Analyse der Parasitoid-Wirt-Interaktionen bei Asobara japonica und Drosophila melanogaster zu erleichtern. Durch optimierte Aufzuchtmethoden, einen Infektionstest mit einer einzelnen Eiablage und RNAi-vermittelte Gen-Knockdown.

Abstract

Parasitismus ist eine biologische Interaktion, bei der ein Organismus den Körper oder die Ressourcen eines anderen (des Wirts) ausbeutet, was erheblichen Schaden oder Tod des Wirts verursacht. Unter den parasitären Tieren gehören Parasitoidwespen zu den artenreichsten Linien und machen fast 20 % aller Insektenarten aus. Insbesondere legen endoparasitoide Wespen direkt in den Wirtskörper ein und setzen eine Vielzahl von Giftfaktoren ein, um die Wirtsentwicklung, Immunität und Physiologie zu beeinflussen. Als Reaktion auf den Wespenangriff versuchen die Wirte, parasitäre Eier durch angeborene Immunmechanismen zu eliminieren. Die molekularen und zellulären Mechanismen, durch die einzelne Giftkomponenten die Wirtsbiologie modulieren und erfolgreichen Parasitismus fördern, sind jedoch weiterhin wenig verstanden. Hier beschreiben wir ein standardisiertes Laborprotokoll zur Aufzucht der endoparasitoiden Wespe Asobara japonica und ihrem Wirt Drosophila melanogaster. Sowohl parthenogenetische als auch sexuelle Stämme von A. japonica sind verfügbar, und der parthenogenetische Stamm weist eine hohe Erfolgsrate beim Parasitismus auf, was eine stabile Erhaltung der Laborbestände für Genomanalysen und Parasitismustests ermöglicht. Ein Infektionstest mit einer einzelnen Eiablage und eine doppelsträngige, RNA-basierte Gen-Knockdown-Methode wurden für die funktionelle Analyse von Giftgenen optimiert. Zusammen bieten diese Protokolle einen praktischen experimentellen Rahmen zur Analyse der molekularen Mechanismen, die den Interaktionen zwischen Parasitoiden und Wirten zugrunde liegen, und werden zukünftige Forschungen in Entwicklungsbiologie, Immunologie und Physiologie erleichtern.

Introduction

Parasitismus ist ein Lebensstil, bei dem ein Organismus die Nährstoffressourcen eines anderen nutzt und in allen Taxa weit verbreitet ist. Es wird geschätzt, dass bis zur Hälfte aller bekannten Organismen im Lebenszyklus¹ Parasitismus zeigt. Unter den Parasiten sind parasitoide Wespen eine besonders vielfältige Gruppe und machen etwa 20 % aller Insekten^aus. Sie nutzen eine große Bandbreite an Gliederfüttern-Wirten wie Insekten, Spinnen und Milben und zeigen eine bemerkenswerte Vielfalt in ihren Lebensgeschichten und parasitären Strategien³. Diese Eigenschaften machen parasitäre Wespen zu einer der evolutionär und ökologisch erfolgreichsten Insektengruppen.

Interaktionen zwischen Parasitoiden und ihren Wirten wurden umfassend als Modellsysteme evolutionärer "Wettrüstungen" untersucht. Insbesondere nutzen endoparasitoide Wespen eine Vielzahl von Faktoren, darunter Gifte, symbiotische Viren und Teratozyten ^4,5. Diese Faktoren beeinflussen die Physiologie und Entwicklung des Wirts und stellen so eine erfolgreiche Entwicklung im Wirt sicher. Trotz dieser Fortschritte sind die molekularen Mechanismen, die dem Parasitismus zugrunde liegen, bei den meisten parasitoiden Arten weiterhin schlecht verstanden. Eine große Einschränkung ist ihre geringe Körpergröße, die die biochemische Identifizierung von Giftbestandteilen erschwert hat. Außerdem ist es technisch herausfordernd, Parasitoide und ihre Wirte mit synchronisierten Entwicklungsstadien unter Laborbedingungen zu erhalten.

Jüngste Fortschritte in der Next-Generation-Sequenzierung und anderen Omics-Technologien ermöglichen nun genomweite Analysen selbst bei sehr kleinen parasitären Arten. Diese Ansätze haben neue Wege eröffnet, um zuvor unzugängliche molekulare Mechanismen zu erforschen, wodurch Interaktionen zwischen Parasitoiden und Wirten mit beispielloser Auflösung untersucht werden können. In diesem Zusammenhang konzentriert sich unser Labor auf Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera: Braconidae), eine Art, die ursprünglich in Japan ^6,7,8 identifiziert wurde. A. japonica enthält einen thelytokösen parthenogenetischen Stamm, bei dem Weibchen ohne Paarung Nachkommen zeugen. Diese Funktion ermöglicht es uns, erhebliche Mengen genetisch einheitlicher genomischer DNA für die Ganzgenomsequenzierung⁹ zu sammeln. Darüber hinaus parasitiert diese Art eine breite Palette von Drosophila-Arten, darunter den Modellorganismus D. melanogaster, der aufgrund seiner gut etablierten Aufzuchtbedingungen und präzise definierten Entwicklungsstadien große experimentelle Vorteile bietet,  was reproduzierbare Infektionstests und eine genaue Kontrolle der Parasitoidentwicklung^ermöglicht.

Während des Parasitismus von A. japonica injiziert eine weibliche Wespe zusammen mit einem einzelnen Ei Gift in eine Fliegenlarve, in der eine Wespenlarve neben ihrem Wirt wächst. Bemerkenswert ist, dass A. japonica eine hohe Parasitismus-Erfolgsrate beim Wirt D. melanogaster aufweist, was dieses Parasitoid-Wirt-Paar zu einem leistungsstarken experimentellen Modell macht. Hier beschreiben wir Protokolle für stabile Aufzucht, einen Infektionstest mit einer Eiablage und eine doppelsträngige RNA (dsRNA)-basierte Gen-Knockdown-Methode bei A. japonica. Diese Protokolle bieten einen zuverlässigen Rahmen zur Analyse molekularer Mechanismen, die den Interaktionen zwischen Parasitoiden und Wirt zugrunde liegen.

Protocol

Eine schematische Übersicht der synchronisierten Aufzuchtmethode für D. melanogaster und A. japonica ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Aufzucht der Wirtsfruchtfliege Drosophila melanogaster im Labor

1. Halten Sie alle Versuchstiere bei 25 °C und 50-60 % relativer Luftfeuchtigkeit unter einem 12:12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus. Verwenden Sie den Wildtyp-Stamm Oregon-R (OR) als Wirt für A. japonica (Abbildung 2A).
2. Übertragen Sie erwachsene Fliegen in ein neues Fläschchen, das Standard-Maismehl-Hefe-Agar-Medium (0,55 % Agar, Tabelle 1) enthält. Beschriften Sie das Fläschchen mit dem Transferdatum und dem Namen des Stamms mit "OR".
3. Entfernen Sie diese erwachsenen Fliegen einen Tag nach dem Transfer, um eine übermäßige Anzahl von Eiern im Futter zu vermeiden. Achten Sie darauf, dass die Larven auf der Nahrungsoberfläche fressen.
   HINWEIS: Als Richtlinie sollten Sie etwa 200–250 Eier pro Fläschchen (φ30×100 mm) aufbewahren. Höhere Eidichten können den Erfolg des Parasitismus verringern und die Variation in der Entwicklung von Wirt und Wespen erhöhen.
4. Vier Tage nach Schritt 1.2 einen Löffel Fliegenlarven (4 Tage nach der Eiablage, dAEL) in ein neues Fläschchen. Halten Sie diese Larven für die nächste Generation unberührt von Parasitoiden. Dieses Verfahren hilft auch, die Larvendichte des Wirts in einem Fläschchen zu kontrollieren.

2. Aufzucht der endoparasitoiden Wespe Asobara japonica im Labor

1. Verwenden Sie einen parthenogenetischen Stamm Tokyo (TK) und einen sexuellen Stamm Iriomote-jima (IR) (Abbildung 2B). Erstere bestehen aus Weibchen, letztere aus Weibchen und Männchen. Männchen schließen zwei bis vier Tage früher als Weibchen. Daher sollten die Weibchen vor dem Transfer anhand ihrer Eilegestellen bestätigt werden.
2. Übertragen 10–20 erwachsene Wespen direkt aus dem Lagerfläschchen in das Fläschchen mit Fliegenlarven bei 4 dAEL. Beschriften Sie das Fläschchen mit dem Übertragungsdatum und dem Stammnamen "TK" oder "IR". Halten Sie die Wespen unter denselben Bedingungen wie bei Step 1.1.
3. Erlauben Sie erwachsenen Wespen, in Fliegenlarven Eier zu legen. Beseitigen Sie diese Wespen ein bis zwei Tage später, um Superparasitismus zu verhindern, was zum Tod des Wirts führen kann. Entfernen Sie geschlossene erwachsene Fliegen, die 10 oder mehr Tage nach Schritt 2.2 aus dem Parasitismus entkommen sind.
4. Zwei Wochen nach Schritt 2.2 beginnen erwachsene Wespen aus dem Wirtsfliegenpuppengehäuse zu wachsen. Übertragen Sie diese frisch gezüchteten erwachsenen Wespen in ein neues Lebensmittelfläschchen mit Filterpapier, das 25 % Glukose und 50 mM Vitamin-C-Lösung enthält. Die Filterpapierstücke sollten bei 130 °C für 2 Stunden sterilisiert werden. Die Bereitstellung der Lösung auf Filterpapier fördert das Legablageverhalten und verlängert die Lebensdauer erwachsener Wespen. Unser Ansatz zur Nutzung von Vitamin C zur Verbesserung der Eizellenablage wurde durch Beobachtungen in Drosophila-Studien ¹¹ inspiriert.

3. Infektionstest mit einer Eiablage

1. Synchronisieren Sie das Entwicklungsstadium der für das Infektionsexperiment verwendeten Fliegenlarven.
   1. Setzen Sie die ausgewachsenen Fliegen in ein 50-ml-Rohr mit einer Traubensaft-Agarplatte (3 % Agar), bestrichen mit frischer Hefepaste, und lassen Sie sie 24 Stunden lang Eier legen.
   2. Sammeln Sie frisch geschlüpfte Larven des ersten Stadiums auf der Agarplatte des Traubensafts und geben Sie sie in ein kleines Fläschchen (12 ml) mit 2–3 g Fliegenfutterpaste (Fliegenfutter mit einer angemessenen Menge Wasser gemischt). 20–30 Larven werden in das Fläschchen gelegt. Die Fliegenlarven dürfen bei 25 °C wachsen.
2. Zum richtigen Zeitpunkt bereiten Sie eine 4 cm große Petrischale vor, die eine dünne, gleichmäßig verteilte Schicht Fliegenfutterpaste enthält, die eine Fläche von etwa 1,5–2,0 cm Durchmesser bedeckt (im Folgenden als Infektionstestarena bezeichnet). Zusätzlich zum Infektionstest bereiten Sie ein neues kleines Fläschchen (12 ml) vor, das eine passende Menge Fliegenfutterpaste enthält. Dieses Fläschchen wird zur Aufzucht der Wirtslarven nach dem Infektionstest verwendet.
3. Sammeln Sie gestaffelte Larven und geben Sie sie in eine Schale mit deionisiertem Wasser (Widerstand = 15 MΩ·cm, 25 °C). Spülen Sie die Larven im Napf mit sanftem Rühren ab, um die Restnahrung aus ihrem Körper zu entfernen.
4. Nach dem Abspülen werden überschüssige Feuchtigkeiten vorsichtig mit fusselfreien Papiertüchern entfernt, da überschüssiges Wasser das Verhalten der Wespenablagerung im Infektionsassay-Arenen beeinträchtigt. Dann bringen Sie die Larven in die Arena. Dieser Schritt erhöht die Larvenaktivität während des Infektionsexperiments.
5. Betäuben erwachsene Wespen mit CO2-Gas_bei einer Durchflussrate von 5 L·^min-1 und einem Druck von 0,2 MPa. Dann werden etwa drei weibliche Wespen vorsichtig in die Infektionstestarena gelegt. Schließen Sie den Deckel der Schüssel und lassen Sie sie sich von Fliegenfutterpaste erholen.
6. Beobachten Sie das Ovpositionsverhalten dieser Wespen unter einem Stereomikroskop (Zoomeinstellung: 10× bis 15×).
   HINWEIS: Wenn eine Wespe einen sich bewegenden Fliegenlarvenkörper berührt, setzt sie schnell ihren Eilegespender in den Fliegenkörper ein und injiziert Giftbestandteile. Obwohl die Fliegenlarve sich windet und ihren Körper windet, wird sie sofort gelähmt. Anschließend vibriert die Wespe mit ihrem Abdomen und legt ein Ei in den Wirtslarvenkörper, woraufhin der Eigelege herausgezogen wird. Dieses Eierablagerungsverhalten wird als Infektion bezeichnet.
7. Nach der Infektion öffnen Sie den Deckel und übertragen Sie die infizierte Fliegenlarve in das neue kleine Fläschchen mit der in Schritt 3.2 vorbereiteten Fliegenfutterpaste. Um den Zeitpunkt der Infektion zu standardisieren, führen Sie das Infektionsexperiment innerhalb von 15 Minuten durch.
8. Beschriften Sie das kleine Fläschchen mit experimentellen Informationen wie Datum, Probenname, Infektionszeit und Anzahl der Personen. Diese Fläschchen werden verstopft, dann in einen feuchten Behälter gestellt und bei 25 °C aufbewahrt.

4. Entstehung von RNA-Interferenzwespen (RNAi) durch dsRNA-Injektion

1. Synthese von dsRNAs von 400 bp oder mehr für dsRNA-vermittelte Gen-Knockdown (RNA-Interferenz, RNAi) mit einem in vitro transkriptionsbasierten dsRNA-Synthesesystem. Die dsRNA-Proben sollten bis zur Nutzung bei -20 bis -80 °C aufbewahrt werden. Detaillierte Protokolle sind wie zuvor beschrieben⁹.
2. Bereiten Sie eine 5,5 cm große Petrischale mit 2 % Agar zur Platzierung von Wespenkörpern vor. Füllen Sie zwei Drittel jedes Gerichts mit Agar, um eine dicke Schicht Agarplatte für die Injektion zu erzeugen.
3. Legen Sie ein fusselfreies, mit Wasser befeuchtetes Papiertuch auf den Deckel einer Plastikschale.
4. Sammeln Sie 7 Tage nach der Infektion (DPI) die Wirtsfliegenpuppen aus dem Fläschchen und legen Sie sie auf die in Schritt 4.3 vorbereiteten Papiertücher. Ein Tropfen Wasser an die Fläschchenwand zu geben, hilft, die Puppenhüllen der Wirtsfliegen vom Fläschchen zu lösen.
5. Unter dem Stereomikroskop (Zoomeinstellung: 20× entfernen Sie das Puppengehäuse der Wirtsfliegen und legen Sie einen Wespenkörper mit der Pinzette frei. Bei 7 dpi befinden sich die meisten Wespen im Puppenstadium, in dem Kopf, Thorax und Hinterleib erkennbar sind. Ein Wespenkörper ist unbeweglich.
6. Platzieren Sie die geborgenen Wespenkörper auf die in Schritt 4.2 vorbereitete Agarplatte, wobei ihre Körperachsen in derselben Ausrichtung ausgerichtet werden. Stellen Sie 20-30 Wespenkörper mit der Rückenseite nach oben in ein bis zwei Reihen an. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit auf der Agarplatte mit einem fusselfreien Papiertuch, um das Ausrutschen der Wespen zu verhindern.
7. Richten Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers das Injektionsgerät und das Stereomikroskop auf (Abbildung 3A). Verwenden Sie ein Mikroinjektionssystem, das mit einer Glas-Kapillarnadel ausgestattet ist, die eine präzise Steuerung von Injektionsvolumen und Einspritzgeschwindigkeit ermöglicht. Platzieren Sie die Agarplatte, in der die Wespenköpfe ausgerichtet sind, zur Spitze der Einspritznadel. Das Einspritzvolumen beträgt 50 nL·^wasp-1 und die Einspritzgeschwindigkeit beträgt 50 nL·^sec-1 am Injektor.
8. Bereiten Sie Glas-Kapillarnadeln mit einem Nadelzieher vor. Die Form der Glaskapillare ist mit der Heiztemperatur einstellbar.
9. Setzen Sie die Glas-Kapillarnadel in einem Winkel von 30–35° auf den Nadelschleifer. Schleifen Sie die Nadel, bis die Spitzenlänge 0,04 mm erreicht (vier Teilungen am Okular-Retikel, Abbildung 3B).
10. Kurz vor der Injektion dsRNA auftauen. Die Konzentration von dsRNA beträgt 0,25–1 μg·^μL-1. Zur Visualisierung wird die dsRNA-Lösung mit einem blauen Farbstoff (Erioglaucindinatriumsalz, 2 % Gewicht·^Volumen-1) gefärbt. Mit einer Mikrolader-Pipettespitze füllt man die Glaskapillare mit einer dsRNA-Lösung mit blauem Farbstoff. 4 μL reichen aus, um 30 Wespenkörper zu injizieren. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Lösung vorhanden sind.
    HINWEIS: Nachdem Sie die dsRNA-Lösung geladen haben, tippen Sie vorsichtig mit einem Fingernagel auf die Seite der Nadel, um alle eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen. Restluftblasen können den Fluss der Lösung behindern und die erfolgreiche Injektion behindern.
11. Mit einer 1-ml-Spritze und einer Nadel füllen Sie den freien Teil der Glaskapillare mit Mineralöl, wobei keine Luftblasen in der Kapillare verbleiben.
12. Befestigen Sie die Glas-Kapillarnadel mit dsRNA-Lösung und Mineralöl am Nadelbehälter und montieren Sie sie dann am Einspritzgerät.
13. Stellen Sie die Position der Agarplatte und der Glaskapillarnadel am Injektor so ein, dass die Glasnadel in einem Winkel von 30–45° relativ zu den Wespenkörpern positioniert ist (Abbildung 3A).
14. Führe die Glaskapillarnadel in die dorsale Seite des Wespenkörpers ein, mit der leicht seitlichen Seite zur dorsalen Mittellinie. Mikroinjizieren Sie die dsRNA-Lösung im Körper. Die injizierte dsRNA-Lösung ist mit blauem Farbstoff  sichtbar (Abbildung 3C).
15. Nach der Injektion werden die Agarplatten in einen feuchten Behälter (70–80 % relative Luftfeuchtigkeit) gelegt und eine Woche lang in einem 25 °C-Inkubator gelagert, bis die erwachsenen Wespen eingeschlossen sind. Verletzte Wespenkörper sollten von der Agarplatte entfernt werden, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern.
    PAUSENPUNKT: In Schritt 4.6 dürfen die Wespepuppen mehrere Stunden vor der Injektion auf der Agarplatte gehalten werden. Nadeln können im Voraus vorbereitet werden (Schritt 4.8 und 4.9); allerdings neigen sie mit der Zeit zu Verstopfen. Frisch vorbereitete Nadeln bieten in der Regel eine zuverlässigere Injektionsleistung.

Results

Die asexuellen und sexuellen Varianten von Asobara japonica
A. japonica ist in ganz Japan weit verbreitet. Die parthenogenetischen Stämme der Lylytokos sind auf den Hauptinseln vorherrschend, während arrhenotokische sexuelle Stämme auf den subtropischen Inseln, darunter Amami-Oshima und Iriomote-jima ^8,12, vorkommen. Bei sexuellen Stämmen kommen die Männchen einige Tage früher als die Weibchen aus, sodass der Zeitpunkt des erwachsenen Transfers zwischen diesen Stämmen unterschiedlich ist. Die thylytouse Parthenogenese bei A. japonica wird durch eine Infektion mit Wolbachia, einem mütterlich übertragenen endosymbiotischen Bakterium¹³, induziert. Die Eliminierung von Wolbachia durch antibiotische Behandlung führt zur Produktion von Männchen ^9,14, und die Transplantation von Wolbachia in sexuelle Stämme induziert Parthenogenese¹⁵. Sowohl asexuelle als auch sexuelle Stämme von A. japonica zeigen bei mehreren Drosophila-Arten einen hohen Parasitismus-Erfolg. Zum Beispiel können sie D. suzukii, einen wirtschaftlich wichtigen Obstschädling, parasitieren und gelten als potenzielle biologische Bekämpfungsmittel in der Landwirtschaft¹⁶. Unter den verfügbaren Stämmen verwendeten wir hauptsächlich den mit Wolbachia infizierten TK-Stamm für unsere Experimente. Der TK-Stamm zeigt eine höhere Parasitismusaktivität gegenüber Wirtslarven im Vergleich zum IR-Stamm¹⁴, was ihn für Analysen geeignet macht.

Der Erfolg des Parasitismus hängt von den Aufzuchtbedingungen ab
Die Parasitismus-Erfolgsrate von A. japonica ist im Allgemeinen hoch, wird jedoch stark vom Aufziehzustand der Wirtsfliegen beeinflusst. Unter nährstoffarmen Bedingungen verlängert sich die Wachstumsphase der Fliegenlarven und der Zeitpunkt der Pupariierung verzögert^{sich um 17}. Unter diesen Bedingungen können Wespen es versäumen, die Ressourcen des Wirts richtig zu nutzen und ihre Entwicklung mit der der der Wirte zu synchronisieren. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, züchteten wir Fliegen und Wespen unter normalen Hefebedingungen (1×) und hefearmen Bedingungen (0,1×). Anschließend bewerteten wir den Erfolg des Parasitismus und den Entwicklungszeitpunkt (Abbildungen 2C, 2D). Der Parasitismus-Erfolg wurde als Verhältnis von ausgewachsenen Wespen zu Wirtslarven berechnet.

Unter normalen Hefepilzbedingungen lag die Erfolgsrate bei Parasitismus bei 81,7 % im Infektionstest mit einer einzelnen Eiablagerung (Abbildung 2C, links; Tabelle 2). Wenn der Hefegehalt auf 10 % reduziert wurde (hefeschwacher Zustand), sank die Parasitismus-Erfolgsrate auf 35,0 % (Abbildung 2C, rechts; Tabelle 2). Diese Reduktion lässt sich dadurch erklären, dass etwa 50 % der Wirtslarven nach einer Infektion starben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ressourcenverteilung zwischen Wirt und Parasitoid unter nährstoffarmen Bedingungen gestört wird.

Bemerkenswert ist, dass der Zeitpunkt der Wespen-Eklusion unter hefearmen Bedingungen nicht in dem Maße verzögert wurde wie unter normalen Hefebedingungen. Während die Öffnungszeit der Fliegen um bis zu 9 Tage verzögert wurde, verzögerte sich die Zeit der Wespen-Eklusion nur um bis zu 4–5 Tage. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Nährstoffverfügbarkeit hauptsächlich die Entwicklung des Wirts beeinflusst. Der Zeitpunkt der Eklusion ist sowohl bei Fliegen als auch Wespen unter normalen Hefebedingungen konsistent, jedoch nicht unter hefearmen Bedingungen, was darauf hindeutet, dass die synchronisierte Entwicklung zwischen Parasitoiden und Wirten von der Nährstoffverfügbarkeit abhängt.

RNAi-basierter Ansatz zur funktionellen Analyse von Giftgenen
Obwohl transkriptomische und proteomische Analysen der Giftdrüse zahlreiche Kandidatenmoleküle identifizieren, bleibt unklar, welche davon für einen erfolgreichen Parasitismus erforderlich sind. Um die physiologischen Rollen dieser Kandidatenmoleküle zu bestimmen, sind in vivo funktionelle Analysen mit Gen-Knockdown-Ansätzen erforderlich.

Wir haben kürzlich berichtet, dass der Parasitismus von A. japonica Apoptose, Autophagie und mitotischen Stillstand in den imaginären Bandscheiben der Larven von D. melanogaster induziert, was zu einer schweren Gewebedegradation führt, ein Phänomen, das als imaginale Scheibenabbau (IDD)¹⁰ bezeichnet wird. Um die Moleküle zu identifizieren, die für IDD verantwortlich sind, führten wir ein RNAi-Screening von Kandidatengenen durch, die durch transkriptomische, proteomische und vergleichende genomische Analysen identifiziert wurden. Daher wurden zwei Gene identifiziert: imaginal disc degradation factor (IDDF)-1 und IDDF-2 . Sowohl IDDF-1 als auch IDDF-2 enthalten die Domäne der unbekannten Funktion 4803 (DUF4803). Bemerkenswert ist, dass nach unserem ersten Bericht eine unabhängige Studie mehrere A. japonica-Giftproteine (sogenannte Venom-Induced Degradation, VID) identifizierte, die mit IDD assoziiert sind, wobei alle ebenfalls die DUF4803 Domäne¹⁸ besitzen.

Basierend auf diesen Ergebnissen haben wir das RNAi-Protokoll weiter optimiert, um die Reproduzierbarkeit und Effizienz zu verbessern. Insbesondere ermöglichte der Einsatz von Nanoject III eine präzise Steuerung von Injektionsvolumen und -geschwindigkeit, was zu konsistenteren Knockdown-Ergebnissen führte.

Um die Effizienz des optimierten RNAi-Protokolls zu bewerten, führten wir eine Knockdown von IDDF-1 durch. Bei geschlossenen erwachsenen Wespen war das Expressionsniveau von IDDF-1 im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verringert (Abbildung 3D). Zur funktionellen Validierung führten wir Infektionstests mit einer einzelnen Eiablage mit diesen RNAi-Wespen und Wirtsfliegenlarven durch und exprimierten den Apoptose-Reporter GC3Ai in der Flügelbeutelregion¹⁹. Nach einer Infektion mit Kontrollwespen (GFP RNAi) wurde ein GC3Ai-Signal im Flügelbeutel nachgewiesen. Im Gegensatz dazu war das GC3AI-Signal nach einer Infektion mit IDDF-1-RNAi-Wespen signifikant reduziert (Abbildung 3E, 3F). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Befunden überein und bestätigen, dass die Funktion von IDDF-1 effektiv durch RNAi unterdrückt wird.

Abbildung 1. Schematische Übersicht der Aufziehverfahren für D. melanogaster und A. japonica. 
Schrittweise Verfahren werden entsprechend den Entwicklungsstadien von D. melanogaster dargestellt.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Parasitismus von Asobara japonica. (A) Schematische Diagramme der Entwicklungsbeziehung zwischen D. melanogaster und seinem Parasitoiden A. japonica. Eine weibliche Wespe deponiert Gift und ein einzelnes Ei in eine Fliegenlarve. Nach dem Schlüpfen entwickelt sich die Wespenlarve parallel zur Wirtslarve, die anschließend Pupariate bildet. Nach der Verpuppung frisst die Wespe den gesamten Fliegenkörper und schließt sich schließlich aus dem Puppengehäuse der Fliegen heraus. (B) Erwachsene Wespen des asexuellen Stamms (links) und des sexuellen Stamms (rechts) von A. japonica. Schuppenbar, 1 mm. (C) Ausstiegsrate von Fliegen oder Wespen unter normalen (1×) und hefearmen (0,1×) Bedingungen. Infektionstests mit einer einzelnen Eiablage wurden 4 Tage nach der Eiablage (dAEL) mit Wirtsfliegenlarven durchgeführt. n = 267 (1×, Fliegen), 120 (0,1×, Fliegen), 85 (1×, Wespen) bzw. 80 (0,1×, Wespen). (D) Eclosionszeitpunkt von Fliegen und Wespen unter den beiden in (C) dargestellten Ernährungsbedingungen. Das Verhältnis von Erwachsenen zu Puppen ist angegeben. n = 250, 107, 61 und 41, jeweils. Der schwarze Pfeil zeigt den Zeitpunkt der Wespeninfektion an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3. Optimiertes RNAi-Verfahren mit Nanoject III. (A) Aufbau der Mikroinjektionsanlage unter einem Stereomikroskop. Die Glaskapillarnadel wurde in einem Winkel von 30–45° relativ zur Agarplatte positioniert. (B) Die Spitze der Glas-Kapillarnadel wurde mit einem Nadelschleifer geschärft. (C) Eine blau gefärbte Lösung wurde mit einer Glas-Kapillarnadel mikroinjiziert in einen Wespenkörper. Die vordere Seite der Wespe ist im Bild durch A gekennzeichnet. P, hinten. Skalenbar, 1 mm. (D) Die Expressionsniveaus von IDDF-1 in GFP-RNAi- und IDDF-1-RNAi-Wespen wurden mit der Delta-Delta-C-t-Methode quantifiziert. Die Expressionsniveaus wurden auf RpL32-Aj normalisiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD mit einzelnen Datenpunkten (n = 5). P < 0,005 (T-Test des Schülers). (E und F) GC3AI-Signale in den Flügelscheiben uninfizierter Larven und Wirtslarven 6 Stunden nach der Infektion (HPI) nach der Infektion mit Kontrollwespen (GFP RNAi)  oder IDDF-1 RNAi. Die Flügelscheiben sind mit weißen gepunkteten Linien umrandet, die auf der DAPI-Färbung der Kerne basieren (1:10000, 62247; Thermo Fisher Scientific). Das Verhältnis von GC3Ai-positiver Fläche zur Flügelbeutelfläche wurde quantifiziert. P < 0,005 (Einweg-ANOVA, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest). n = 11 biologische Replikationen pro Gruppe. Maßstabsleiste, 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Komponenten	Betrag
Wasser	1 L
Agar	5,5 g
Hefe	40 g
Maismehl	90 g
Glukose	100 g
Propionsäure	3 mL
10 % Butylp-Hydroxybenzoat in 70 % EtOH	3,5 mL

Tabelle 1: Komponenten des Standard-Maismehl-Hefe-Agar-Mediums (Fliegenfutter).

Nahrungsart	Zustand	# der Gesamtzahl der Individuen	# von eingeschlossenen oder toten Individuen				Erscheinungsrate von Fliegen oder Wespen (%)
			Fliegen	Wespe	Puppen-tödlich	Larve tödlich
1×	Uninfiziert	267	248	0	2	17	92.88389513
	A. japonica infiziert	120	0	98	9	13	81.66666667
0,1×	Uninfiziert	85	38	0	23	24	44.70588235
	A. japonica infiziert	80	0	28	13	39	35

Tabelle 2: Anzahl der Individuen und Auszeitraten unter normalen (1x) und hefearmen (0,1x) Bedingungen.

Name des Primers	Sequenz (5'>3')	Zweck
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTTCCTACT	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGCGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGGCTAG	CDS-Klonen
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	CDS-Klonen, dsRNA-Vorlage
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	GAGGAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	dsRNA-Schablone
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT CAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	dsRNA-Schablone
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAG GAGAGTGGAAGCCAGGTGTAG	dsRNA-Schablone
※ Diese Primer und dsRNA-Vorlagen werden in Kamiyama et al. berichtet. 2022.
※ gene007424 steht für IDDF-1.

Tabelle 3: Sequenzen von Primern und dsRNA-Vorlagen, die in dieser Studie verwendet wurden.

Discussion

In dieser Studie haben wir eine vielseitige experimentelle Plattform zur Untersuchung von Parasitoid-Wirt-Interaktionen auf molekularer Ebene eingerichtet. Durch die Optimierung der Aufzuchtbedingungen, einen Infektionstest mit einer einzelnen Eierablagerung und das RNAi-Protokoll bieten wir ein robustes System für funktionelle Studien parasitoid-abgeleiteter Faktoren. Diese Plattform wird zukünftige Studien erleichtern, die darauf abzielen, die Mechanismen aufzudecken, mit denen parasitäre Wespen die Entwicklung des Wirts manipulieren, und kann auch zur Entwicklung biologischer Schädlingsbekämpfungsstrategien beitragen.

Der mit Wolbachia infizierte TK-Stamm von A. japonica bietet ein hochgradig reproduzierbares experimentelles System zur Analyse von Parasitismus. In vielen Studien zum Parasitoid-Wirt sind die experimentellen Ergebnisse oft variabel, wobei das Überleben und der Erfolg des Parasitoiden des Wirts sensibel von Umwelt- und physiologischen Bedingungen abhängen. Im Gegensatz dazu zeigt der TK-Stamm durchgehend hohe Parasitismus-Erfolge, wodurch effektiv eine "parasitoid-dominante" Erkrankung entsteht, bei der das Ergebnis der Infektion weitgehend einheitlich ist. Außerdem reduziert er als parthenogenetischer Stamm aufgrund seines einheitlichen genetischen Hintergrunds die experimentelle Variation zwischen Individuen. Diese Reproduzierbarkeit ermöglicht eine zuverlässige Verfolgung des Parasitismusprozesses und erleichtert quantitative Analysen der Wirtsantworten und parasitoid-abgeleiteter Faktoren.

Darüber hinaus erleichtert die Fortpflanzung des Thelytokus die genomischen Analysen erheblich, indem sie die Erzeugung hochhomogener genomischer DNA ermöglicht, was für die hochwertige Genomassemblierung^{entscheidend ist}. Obwohl solche parthenogenetischen Stämme nicht bei allen parasitoiden Arten vorhanden sind, heben unsere Ergebnisse das Potenzial von Wolbachia-induziertem Thelytoky als Strategie zur Verbesserung der genomischen Ressourcen hervor. Die Etablierung von Wolbachia-infizierten Linien in anderen parasitoiden Arten könnte daher ein wirkungsvoller Ansatz sein, um genomische Ressourcen zu erweitern und vergleichende molekulare Studien bei Parasitoiden zu beschleunigen.

Parasitismus-Ergebnisse werden stark von den Ernährungsbedingungen des Wirts beeinflusst, was darauf hindeutet, dass die Aufzuchtbedingungen ein entscheidender Faktor für den Erfolg parasitoider sind. Da ein erfolgreicher Parasitismus von einer präzisen zeitlichen Koordination mit der Entwicklung von Wirt und Wespe abhängt, stören unkontrollierte Ernährungsbedingungen diesen Prozess wahrscheinlich und verringern die Reproduzierbarkeit. Daher ist eine sorgfältige Standardisierung der Wirtsaufziehbedingungen unerlässlich, um ein zuverlässiges experimentelles System zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Parasitoiden und Wirten zu etablieren. Außerdem sollten die Fliegenvials getrennt von den Waspenfläschchen aufbewahrt werden, da das Vorhandensein von Wespen das Eierabsetzungsverhalten der Fliegen^{um 20,21} reduziert.

Um eine quantitative Bewertung der Interaktionen zwischen Parasitoiden und Wirten zu ermöglichen, entwickelten wir einen Infektionstest mit einer einzelnen Eiablagerung, bei dem jeweils eine Eizelle in jeden Wirt abgelegt wird. Dieser Assay steht im Gegensatz zu herkömmlichen Masseninfektionstests, die oft mehrere Eiablagerungen beinhalten, die zu übermäßigen Wirtsschäden und Sterblichkeit führen. Um eine effiziente Eiablage innerhalb eines begrenzten Zeitfensters (~15 Minuten) zu fördern, wurden frisch eingekapselte erwachsene Wespen mit einer Glukose- und Vitamin-C-Lösung vorkonditioniert, wodurch die Effizienz der Eiablage und die allgemeine Reproduzierbarkeit verbessert wurden.

Darüber hinaus haben wir das RNAi-Protokoll für die Genfunktionsanalyse bei parasitoiden Wespen optimiert. Durch den Einsatz des Mikroinjektionssystems erreichten wir eine präzise Kontrolle des Einspritzvolumens und verbesserten die Konsistenz der Knockdown-Effizienz. Die funktionelle Validierung mit IDDF-1 bestätigte, dass diese Methode die Genexpression effektiv unterdrückt und reproduzierbare phänotypische Ergebnisse erzeugt. Da transkriptomische und proteomische Studien weiterhin große Zahlen von Kandidatengiftfaktoren identifizieren, wird die Verfügbarkeit einer funktionalen Screening-Plattform entscheidend sein, um deren biologische Rolle zu bestimmen.

Eine Einschränkung dieses RNAi-Protokolls besteht darin, dass es nicht geeignet ist, Gene zu analysieren, die in den frühen Entwicklungsstadien der Wespen funktionieren, da es technisch schwierig ist, dsRNA in Wespen-Eier zu injizieren, die im Wirtskörper vorhanden sind. Um dies zu überwinden, könnte die Einrichtung eines ex-vivo-Aufzuchtsystems ein nützlicher Ansatz^sein. Alternativ können Gen-Knockout-Ansätze mit Direct Parental (DIPA)-CRISPR eine ergänzende Strategie bieten, bei der Reagenzien in erwachsene Weibchen injiziert werden, um genom-editierte Nachkommen^{zu erzeugen 23}. Tatsächlich hat dieser Ansatz erfolgreich Gen-Knockout-Individuen im puppen-ektoparasitoiden Nasonia vitripennis erzeugt, indem Reagenzien in erwachsene Weibchen oder Personen im späten Puppenstadium²⁴ injiziert wurden. Zusammen mit unserer RNAi-basierten Gen-Knockdown-Methode ermöglichen diese Ansätze umfassendere Analysen der Genfunktionen, die am Parasitismusprozess beteiligt sind.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Infektionstest
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	dsRNA Injektion
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Aufzucht
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Infektionstest
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA Injektion
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA Injektion
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Aufzucht
CO2 Druckregler	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Infektionstest
Konfokales Laserscanningmikroskop	Zeiss	LSM700	Bildanalyse
Maisgrieß	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Aufzucht
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Kernfärbung, 1:10000
Deionisiertes Wasser	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Infektionstest
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	dsRNA Injektion
Fiji	NA	https://fiji.sc	Bildanalyse
Filterpapier	Advantec	ITEM 526	Aufzucht
Fliegenfutterglas	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Aufzucht
Fliegenfutterglasdeckel	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Aufzucht
Pinzette	Dumont Biologie	11252-20	Sektion
Gefrierschrank, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Musterlagerung
Gefrierschrank, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Musterlagerung
Glasobjektträger	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Infektionstest
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Nicht verfügbar	Aufzucht
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA Synthese
Inkubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Aufzucht
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	dsRNA Synthese
Mikropipettenschleifer	Narishige	EG-401	dsRNA Injektion
Mineralöl	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA Injektion
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA Injektion
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA Injektion
pBluescript KS (+) Plasmid	Nicht verfügbar	Nicht verfügbar	dsRNA Synthese
pBluescript SK (-) Plasmid	Nicht verfügbar	Nicht verfügbar	dsRNA Synthese
PrimeScript reverse Transkriptase	Takara	2680A	dsRNA Synthese
Propionsäure	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Aufzucht
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Infektionstest, dsRNA Injektion.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix mit gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus Reagenz	Takara	9108	qRT-PCR
Kleines Fläschchen (Teströhrchen 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Infektionstest
Kleines Fläschchen-Deckel	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Infektionstest
Löffel	As One Corporation	6-522-02	Aufzucht
Quadratisches Petrischalen	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA Injektion
Stereomikroskop	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Infektionstest
Stereomikroskop	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA Injektion
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	dsRNA Synthese
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA Synthese, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Nicht verfügbar	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbinsäure	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Aufzucht
Welch's Traubensaft 100	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Infektionstest
Hefe	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Aufzucht