Erhaltung der In-vivo-Gewebekomplexität in einem Maus-Riechnervensystem-Modell mittels Ganzpräparat-Analyse zur Untersuchung der neuronalen Regeneration

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen vollständigen Arbeitsablauf zur Erhaltung der anatomischen Komplexität des olfaktorischen Nervensystems der Maus. Hier haben wir den gesamten Arbeitsablauf detailliert beschrieben, einschließlich der Dissektion, der Gewebepräparation und der Bildgebung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um das olfaktorische System unter normalen oder pathologischen Bedingungen zu untersuchen, einschließlich seiner natürlichen Reparaturmechanismen.

Zusammenfassung

Im Zeitalter der dreidimensionalen (3D) Bildgebung gilt die herkömmliche Immunhistochemie als stark eingeschränkt für die Untersuchung von Pathologie und komplexer menschlicher Anatomie. Da lediglich dünne Schnitte analysiert werden, können größere Strukturen und wesentliche Aspekte der Geweearchitektur wichtige kontextuelle Details verlieren, was zu unvollständigen oder irreführenden Interpretationen führen kann. Zwar haben zweidimensionale (2D) Schnitte zum grundlegenden Verständnis der Histarchitektur beigetragen, doch reichen sie nicht aus, um die tatsächliche dreidimensionale Realität biologischer Gewebe abzubilden.

Eine zunehmende Zahl von Studien in verschiedenen anatomischen Regionen verwendet mittlerweile Techniken, die intakte anatomische Einheiten isolieren – sogenannte Flat-Mount-, Ganzpräparat- oder en-face-Präparationen – kombiniert mit hochauflösender fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung. Diese Ansätze ermöglichen eine umfassendere Visualisierung und Interpretation der strukturellen Organisation. Dies ist insbesondere im olfaktorischen Nervensystem von Bedeutung, wo zur Erfassung komplexer zellulärer Mechanismen, die der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit zugrunde liegen, ein Kontext in voller Dicke erforderlich ist. Dünne Schnitte bergen das Risiko, entscheidende pathophysiologische Merkmale zu übersehen, die bislang nur ungenügend definiert sind.

Angesichts dieser Einschränkungen und der Wissenslücke bezüglich der zellulären Interaktionen, die die olfaktorische Regeneration antreiben, war die Entwicklung einer verfeinerten Ganzpräparat-Technik, die in der Lage ist, die Komplexität des vollständigen Gewebes zu erhalten, unerlässlich. Vollständige Riechschleimhäute wurden als Vollschnittproben isoliert, begleitet von einem optimierten Protokoll zur Antikörperpenetration. Mithilfe hochauflösender Bildgebung (EVIDENT SpinSR) und 3D-Rekonstruktion konnte die zelluläre Interaktion in vivo genau visualisiert werden.

Einleitung

Das olfaktorische Nervensystem (ONS) stellt ein einzigartiges und gut etabliertes Modell zur Untersuchung der Mechanismen der neuronalen Regeneration dar, da es über die gesamte Lebensdauer hinweg die einzigartige Fähigkeit zur Neuronalerneuerung beibehält¹. Dennoch bleibt das Potenzial für die klinische Übertragung dieser neuroreparativen Fähigkeit aufgrund erheblicher Wissenslücken hinsichtlich des Verhaltens der Zellen im olfaktorischen System begrenzt^2,3,4. Die zellulären Reaktionen und die anatomische Organisation des ONS, einschließlich primärer olfaktorischer Neuronen, olfaktorischer ensheathing-Zellen (OECs) und perineuraler Fibroblasten, wurden in mehreren tierexperimentellen Studien beschrieben, die auf der Untersuchung ultradünner (<2 µm) Gewebeschnitte in Kombination mit schweren physikalischen Verletzungsmodellen am ONS von Nagetieren beruhen^1,2. Die Tiere in diesen Studien wurden üblicherweise 10 Tage nach der Verletzung getötet, wodurch nur ein kurzer Zeitraum für die Beobachtung eines einzigen, spezifischen Zeitpunkts im Verlauf der umfangreichen und komplexeren Umstrukturierung des Gewebes nach einer Neuralverletzung zur Verfügung stand². In diesen Studien wurde berichtet, dass OECs und Fibroblasten nach dem Absterben der Axone als kontinuierliche Kanäle entlang der Verletzungsstelle erhalten blieben.

Obwohl aufschlussreich, lieferte der verwendete Ansatz aufgrund der zahlreichen oben erläuterten Einschränkungen lediglich einen groben konzeptionellen Überblick auf oberflächlicher Ebene des Riechnervs und schloss damit eine umfassende Beurteilung der tatsächlichen zellulären Organisation innerhalb des intakten Riechnervs aus³. Folglich könnten wichtige räumliche Beziehungen übersehen worden sein.

Die Erhaltung der dreidimensionalen Gewebestruktur ist entscheidend für eine genaue anatomische und zelluläre Analyse und wurde bereits erfolgreich auf mehrere Organe und Krankheitsbilder angewandt^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Ganzpräparat-Ansätze wurden verwendet, um die neuronale Organisation in der Riechschleimhaut abzubilden^13,14, die Visualisierung zellulärer Interaktionen mit einer vollständigen ONS-Struktur, einschließlich einer erhaltenen Lamina propria, ist jedoch bisher nicht gelungen.

In dieser Studie etablieren wir eine Arbeitsabfolge unter Verwendung eines Mausmodells mit Ganzpräparat-Gewebeprozessierung, Immunfärbung, hochauflösender Bildgebung und dreidimensionaler Rekonstruktion, die eine detaillierte Analyse der ONS-Architektur ermöglicht. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine Lücke in den bisher veröffentlichten Methoden zu schließen, da es eine volldicke Riechschleimhaut einschließlich der Lamina propria erhält und konserviert und somit die Untersuchung zellulärer Interaktionen erlaubt. Bemerkenswerterweise kann diese verfeinerte Methode zur Gewebeentnahme und -verarbeitung auf verschiedene Modelle des Riechsystems angewandt und mit diesen kombiniert werden.

Protokoll

Alle Experimente mit Tieren und transgenetisch veränderten Zellen wurden mit Genehmigung des Ausschusses für Biosicherheit der Griffith University (NLRD/003/2020_var3) und des Tierethikausschusses der Griffith University (MHIQ/04/23/AEC) gemäß den Richtlinien des australischen Bundesamtes für Gentechnikregulierung (OGTR) durchgeführt.

HINWEIS: Insgesamt 15 erwachsene Labor-Mäuse (8–9 Wochen) beiderlei Geschlechts wurden in der Studie verwendet. Konkret handelte es sich um S100β-DsRed-transgene Mäuse, bei denen alle Riechnervenscheidentzellen (OECs) das leuchtend rote Protein DsRed unter Kontrolle des S100β-Promotors exprimieren. S100β ist Teil einer größeren Familie kalziumbindender Proteine und wird üblicherweise in Gliazellen des zentralen Nervensystems, wie den OECs, exprimiert. Dieses Modell war für die Zwecke dieser Experimente optimal, da es eine einfache Lokalisierung der Zielzellpopulationen mittels endogener Fluoreszenzsignale ermöglichte. Die S100β-DsRed-transgenen Mäuse waren zuvor erzeugt worden, und es wurde gezeigt, dass die Verwendung dieser transgenen Mäuse im Vergleich zur Immunhistochemie eine verbesserte Detektion von OECs bei der Analyse fixierten Gewebes ermöglicht^15,16,17,18.

1. Sammlung der Köpfe und Gewebefixierung

1. Töten Sie die Tiere durch Inhalation steigender CO₂-Konzentration zu den experimentellen Zeitpunkten.
2. Stellen Sie den Tod durch das Fehlen der Hornhaut- und Flexionsreflexe an den Gliedmaßen fest, gefolgt von einer Halswirbelfraktur, oder gemäß dem genehmigten standardisierten Arbeitsprotokoll (SOP) sicher.
3. Entfernen Sie den gesamten Kopf und die Kiefer mit einer Schere.
4. Entfernen Sie die Haut vom Schädel und die Knorpel an der Nasenspitze, um die Nasenhöhle freizulegen und eine effiziente Penetration des Fixierungsmittels sicherzustellen.
   ANMERKUNG: Es wurde beobachtet, dass dieser Schritt, bei dem der vorderste Teil des Nasenknorpels des Tieres entfernt wird, entscheidend ist, um eine korrekte Fixierung des Gewebes innerhalb der Nasenhöhle zu ermöglichen.
5. Spülen Sie die Köpfe schnell mit 1× PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen.
6. Fixieren Sie das Gewebe durch eine Übernacht-Inkubation (12–18 h) in 4 % Paraformaldehyd, mindestens jedoch 6 h (ausreichende Zeit zur Fixierung des interessierenden Gewebes) bei 4 °C auf einem Rollapparat.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd ist eine gefährliche Chemikalie, die Formaldehyd-Dämpfe freisetzt. Es ist toxisch bei Inhalation, Hautkontakt und oraler Aufnahme; verursacht Reizungen der Augen, Haut und Atemwege; und gilt als vermutetes Karzinogen. Handhaben Sie es ausschließlich in einem Abzug unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PPE), einschließlich Handschuhe, Laborkittel und Augenschutz. Die sichere Entsorgung von gefährlichen Chemikalien und biologischen Abfällen, die während des Protokolls anfallen, muss gemäß den institutionellen und örtlichen Vorschriften erfolgen.
   ​ANMERKUNG: Während der Optimierungsphase stellten wir fest, dass 6 h ausreichten, um das interessierende Gewebe zu fixieren; jedoch führte eine längere Dauer von mehr als 12 h wahrscheinlich zu einer Überfixierung und Degradation der Schleimhautstrukturen.
7. Nehmen Sie die Köpfe aus dem Fixierungsmittel heraus und waschen Sie sie 3 h lang bei Raumtemperatur (20–25 °C) in 1× PBS auf einem Rollapparat.
8. Lagern Sie die Köpfe in frischem PBS bei 4 °C und entnehmen Sie das Ganzpräparat des Schleimhautgewebes innerhalb von 48 h.

2. Gewinnung von Geweben im Ganzpräparat

1. Führen Sie die Gewebegewinnung unter einem Mikroskop durch.
2. Köpfe mit einem Skalpell entlang der mittleren Sagittalebene halbieren.
3. Exponieren Sie das Innere der Nasenhöhle (Abbildung 1). Identifizieren Sie die anatomischen Regionen und sammeln Sie das Mukusgewebe, das die gesamte anatomische Sektion auskleidet (Abbildung 1B).
4. Mit einem Knochenmesser vorsichtig den septalen Knochen brechen und entfernen, der teilweise die Schleimhöhlung bedeckt.
   HINWEIS: Siehe Abbildung 2A; Dieser Schritt ist entscheidend, um die konkave Kavität unterhalb des Knochens freizulegen, durch deren dorsale Wand die Axonbündel verlaufen (Abbildung 1B).
5. Sobald dieser Bereich freigelegt ist, verwenden Sie gebogene Pinzette, um das Gewebe vorsichtig zu lösen und aus der konkaven dorsalen Wand herauszuschaben. Heben Sie das Gewebe von dem darunterliegenden Knochen an und lösen Sie vorsichtig die verbleibende Riechschleimhaut, um die intakte Ganzpräparation zu gewinnen.
   HINWEIS: In diesem Schritt war äußerste Vorsicht erforderlich, um ein Einreißen des Gewebes zu vermeiden.
6. Gewinnen Sie das gewünschte Gewebe aus beiden Nasenlöchern: Die Schleimhaut bedeckt das Septum, die dorsalen linken und rechten Wände sowie die Lamina cribrosa der Nasenhöhle (Abbildung 1A, B). Gewebe von beiden Nasenlöchern einschließlich Septum, dorsalen Wänden und Siebbein sammeln, um den anatomischen Bereich zu isolieren, der die primären Riechstrukturen enthält (Abbildung 2C).
7. Die gesammelten Gewebe in PBS 1× waschen und unerwünschte Gewebeteile, einschließlich Knochenfragmente, entfernen. Die Gewebe bei 4 °C in PBS 1× für spätere immunhistochemische Analysen aufbewahren.
   HINWEIS: Falls das Gewebe langfristig gelagert wird, sollte es in einer Lösung aus PBS 1× und 0,001 % (Gew./Vol.) Natriumazid bei 4 °C aufbewahrt werden.

3. Optimiertes Färbeprotokoll

HINWEIS: Häufig verwendete Färbeprotokolle sind in der Regel für dünne bis mitteldicke Schnitte optimiert (z. B. bis zu 50 µm). Daher musste das Protokoll an das deutlich dickere Gewebe angepasst werden.
​Ein entscheidender Schritt bestand darin, das Gewebe während des gesamten Färbeprozesses in Eppendorf-Röhrchen schwimmend zu halten und die Röhrchen auf einen Rollapparat zu stellen, während die Reagenzien eindringen. Die Färbeschritte wurden folglich nicht mit dem Gewebe auf einem Bildgebungsschieber durchgeführt. Stattdessen erfolgte die Färbung zunächst im schwebenden Zustand und anschließend wurde das Gewebe auf Bildgebungsschiebern montiert. Diese Maßnahmen stellten sicher, dass das Gewebe sich nicht faltete und die Reagenzien sowie Antikörper in den gesamten Bereich eindringen konnten.

1. Entfernen Sie das Gewebe aus der Lagerung und geben Sie es in ein Eppendorf-Röhrchen mit Blockierungslösung (die verwendete Lösung hängt von der spezifischen Färbung ab).
   ​HINWEIS: Blockierungslösung: 3 % BSA, 0,3 % Triton X-100 in PBS. Eine weitere wichtige Anpassung war die Dauer, für die das Gewebe jedem Reagenz und Antikörpercocktail ausgesetzt war.
2. Belassen Sie das Gewebe 3 h bei Raumtemperatur auf einem Rollapparat in der Blockierungslösung.
   HINWEIS: Es zeigte sich, dass es nicht notwendig war, die Konzentration der ausgewählten Antikörper und Färbelreagenzien (Tabelle 1) zu erhöhen, wenn die Expositionszeit im Vergleich zum Standardverfahren der Immunhistofärbung an Dünnschnitten verlängert wurde. Dadurch wurde auch der Verbrauch teurer Antikörperreagenzien minimiert. Die Inkubationen erfolgen in einem 1,5-mL-Eppendorf-Röhrchen, bei dem der Deckelhalter entfernt wurde, damit es auf einem Rollapparat rollen kann. Das Reagenzvolumen betrug 500 µL.
3. Inkubieren Sie das Gewebe 72 h bei 4 °C mit den Primärantikörpern auf dem Rollapparat.
4. Waschen Sie das Gewebe zweimal (jeweils 1,5 h) mit 1× PBS bei Raumtemperatur auf dem Rollapparat.
5. Inkubieren Sie das Gewebe mit Sekundärantikörper (in Aluminiumfolie eingewickelt) und Kernfärbung zunächst mindestens 4 h bei Raumtemperatur auf einem Rollapparat und anschließend über Nacht (12–18 h) bei 4 °C auf dem Rollapparat.
6. Waschen Sie das Gewebe zweimal (jeweils 1,5 h) mit 1× PBS bei Raumtemperatur auf dem Rollapparat.

4. Vorbereitung der Objektträger

1. Entfernen Sie das Gewebe vorsichtig aus dem Eppendorf-Röhrchen
2. Platzieren Sie das Gewebe unter dem Mikroskop auf einem Objektträger und stellen Sie sicher, dass keine Falten im Gewebe vorhanden sind.
   HINWEIS: Es ist möglich, die Orientierung des Gewebes unter dem Mikroskop ohne Fluoreszenz zu erkennen. Die Lamina-propria-Seite des Schleimhautgewebes sollte so auf dem Objektträger platziert werden, dass das Epithel zur Glasoberfläche zeigt und die Lamina propria zur Deckglasseite weist. Die Lamina propria kann anhand der Anwesenheit dicker Nervenbündel identifiziert werden, die ohne Färbung sichtbar sind. Die korrekte Orientierung – Lamina propria zur Deckglasseite, Epithel zur Objektträgeroberfläche – erleichtert die Färbung sowie den Bildgebungsprozess.
3. Decken Sie die Objektträger mit einem fluoreszenztauglichen Eindeckmedium ab und versiegeln Sie sie.
4. Die Objektträger können nach dem Trocknen über Nacht (12–18 h) bei Raumtemperatur im Dunkeln bei 4 °C gelagert werden

5. Bildaufnahme und Nachbearbeitung

1. Erwerb von immunfluoreszenten Aufnahmen mit niedriger Vergrößerung
   1. Führen Sie während der Bildaufnahme ein automatisches Zusammensetzen (Stitching) mittels linearer Alpha-Überblendung durch.
      ​HINWEIS: Die Anzahl der Z-Stack-Bilder sollte entsprechend der Dicke der Probe angepasst werden, um eine vollständige Abdeckung des Gewebevolumens sicherzustellen.
   2. Nehmen Sie benachbarte Sichtfelder mit einer Überlappung von 15 % auf. Erstellen Sie Kachelbilder (Tiled Images) unter Verwendung eines Schlangenlinien-Aufnahmemusters (meander acquisition pattern).
   3. Passen Sie die Gesamtanzahl der optischen Schichten entsprechend der Gewebedicke an.
   4. Stellen Sie die Bildkalibrierung auf 215,594 nm/Pixel sowohl auf der X- als auch auf der Y-Achse ein. Erwerben Sie die Bilder als Z-Stacks mit einer Z-Schrittgröße von 0,8 µm.
   5. Platzieren Sie das montierte, ganzflächig präparierte Gewebe auf dem Objekttisch des konfokalen Mikroskops. Erstellen Sie Übersichtsbilder unter Verwendung eines 30x-Objektivs (NA 1,04).
2. Erwerb von immunfluoreszenten Aufnahmen mit hoher Vergrößerung.
   1. Erstellen Sie detaillierte Aufnahmen unter Verwendung eines 60×-Objektivs (NA 1,5). Stellen Sie die Bildkalibrierung auf 107,923 nm/Pixel sowohl auf der X- als auch auf der Y-Achse ein. Erwerben Sie Z-Stack-Bilder mit einer Z-Schrittgröße von 0,41 µm.
   2. Passen Sie die Gesamtanzahl der optischen Schichten entsprechend der Gewebedicke an. Erfassen Sie die Bilder aus einem einzelnen Sichtfeld.
      ​HINWEIS: Für 60×-Aufnahmen ist kein Bild-Stitching erforderlich, da jeder Datensatz aus einem einzigen Sichtfeld besteht.
3. Erwerb histologischer Referenzbilder
   1. Nehmen Sie H&E-gefärbte mittelsagittale Mauskopfschnitte mit einem Objektträger-Scanning-Mikroskop unter Hellfeldbeleuchtung auf.
   2. Erwerben Sie die Bilder mit einem 40×-Objektiv (NA 0,95) und einer Kamera-Vermehrung von 0,63×, was einer effektiven Vergrößerung von 25,2× entspricht.
   3. Bestätigen Sie eine Pixelkalibrierung von 136,905 nm/Pixel sowohl auf der X- als auch auf der Y-Achse. Erstellen Sie das Bild als einzelne Fokusebene.
   4. Setzen Sie Kachelbilder automatisch mittels eines Schlangenlinien-Aufnahmemusters und linearer Alpha-Überblendung zusammen.
4. Erwerb von übersichtsartigen immunfluoreszenten Referenzbildern
   1. Erwerben Sie ergänzende Übersichtsimmunfluoreszenzbilder unter Verwendung eines 10x-Objektivs.
   2. Erfassen Sie die Probe als einzelnen Z-Schnitt, indem Sie während der Bildaufnahme eine Überlappung der Kacheln von 0 % verwenden.
   3. Stellen Sie die Bildkalibrierung auf 647,249 nm/Pixel sowohl auf der X- als auch auf der Y-Achse ein. Erstellen Sie anschließend ein Übersichtsbild, das die gesamte anatomische Region von Interesse umfasst.
5. Bildverarbeitung und Erstellung der endgültigen Abbildungen.
   1. Exportieren Sie die erfassten Bilddatensätze in eine Bildanalyse-Software. Erzeugen Sie Projektionen mit maximaler Intensität (Maximum Intensity Projections, MIPs) aus den Z-Stack-Datensätzen.
   2. Wählen Sie Regionen von Interesse (ROIs) für die nachfolgende Analyse und die Abbildungsvorbereitung aus.
   3. Kombinieren Sie übersichtsartige immunfluoreszente Bilder mit den entsprechenden H&E-Bildern, um anatomische Referenzabbildungen zu erzeugen. Überprüfen Sie anschließend die Ausrichtung und die anatomische Übereinstimmung zwischen den Fluoreszenz- und histologischen Datensätzen, bevor Sie die Abbildungen erstellen.
      HINWEIS: Das gesamte Bild-Stitching sollte automatisch während der Bildaufnahme unter Verwendung vordefinierter Mikroskopeinstellungen erfolgen und bedarf keiner zusätzlichen Nachbearbeitung. In unserem Fall wurde die 3D-Darstellung mit der Imaris-Software erzeugt: Das Oberflächenrekonstruktions-Plugin, basierend auf der Schwellenintensität für jeden erfassten Kanal, wurde zur Erstellung der 3D-Rekonstruktion verwendet. Schließlich wurden die endgültigen Bilder in Adobe Illustrator zusammengestellt.

Ergebnisse

Unser hier vorgestellter Ganzpräparat-Ansatz ermöglichte die Isolierung und vollständige Erhaltung der Riechschleimhaut. In unserem Fall lag der Schwerpunkt darauf, zelluläre und anatomische Veränderungen sowohl auf makroskopischer (vollständige anatomische Übersicht) als auch auf mikroskopischer (zellulärer Ebene) Ebene zu verstehen.

Der Ganzpräparat-Ansatz ermöglicht es uns, sowohl das Epithel als auch die Lamina propria zu gewinnen und die räumlichen Beziehungen zwischen Axonbündeln, olfaktorischen ensheathing-Zellen (OECs) und Fibroblasten – unseren Zellen von Interesse – zu bewahren. Mit diesem Ansatz konnten umfangreiche, kontinuierliche Datensätze gewonnen werden, die die gesamte Dicke und eine große Oberfläche des Schleimhautgewebes erfassten (Abbildung 3) und es uns ermöglichten, Details der komplexen zellulären Struktur und Interaktion zu dokumentieren (Abbildung 3) sowie deren Unterschiede zwischen intakten (n = 3) (Abbildung 3A, B) und geschädigten Bedingungen (n = 12) (Abbildung 3C, D) zu analysieren.

Durch die Kombination dieses optimierten Gewebemanagements und Färbeprotokolls mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie konnten wir Bilder größerer Schleimhautbereiche mit hervorragender und präziser zellulärer Detailgenauigkeit über die gesamte Gewebetiefe hinweg erhalten. Die Aufnahme von Z-Stapeln über mehrere benachbarte Bereiche ermöglichte die Rekonstruktion ausgedehnter anatomischer Domänen, ohne die Auflösung oder Signalintegrität zu beeinträchtigen (Abbildung 4A–F). Aufgrund der hochauflösenden zellulären Details konnten wir zudem die erfassten Z-Stapel über die volle Gewebedicke (Abbildung 4G) nutzen, um gerenderte Bilder (Abbildung 4H) zu erstellen, um die mikroanatomische Gewebestruktur besser zu verstehen.

Die zuverlässige Bestimmung der Gewebeorientierung vor der Einbettung und Bildgebung wurde durchgängig ohne die Notwendigkeit fluoreszierender Markierungen erreicht. Die Seite der Lamina propria war im Hellfeldmikroskop durch das Vorhandensein dicker Nervenbündel leicht erkennbar, die sich deutlich von der epithelialen Schicht abgrenzten. Die Standardisierung der Probenorientierung durch Platzieren der Lamina propria direkt an der Deckglasunterseite und der epithelialen Oberfläche an der Objektträgeroberseite verbesserte die Bildgebungskonsistenz zwischen den Proben und erleichterte die anschließende dreidimensionale Rekonstruktion. Der Antikörperpenetrationsgrad kann durch die Analyse des entsprechenden Signals über die gesamte Dicke des Gewebes hinweg bestimmt werden. Dies zeigt sich typischerweise entweder durch ein vollständiges Fehlen des Signals oder durch ein Signal, das kontinuierlich abnimmt, je tiefer in das Gewebe vorgedrungen wird.

Die in Imaris durchgeführte dreidimensionale Darstellung ermöglichte eine klare Visualisierung komplexer zellulärer Netzwerke und der axonalen Organisation innerhalb der intakten Mukosa. Die oberflächenbasierte Darstellung, angewendet mittels kanalspezifischer Intensitätsschwellenwerte, erzeugte genaue 3D-Repräsentationen der Gewebearchitektur, wobei feine strukturelle Details erhalten blieben.

Für die Färbung und Visualisierung werden klare Sichtbarkeit des Ziel-Färbungssignals ohne abnormen Signalverlust oder Signalverschlechterung über die gesamte Dicke des Gewebes erwartet. Die Unfähigkeit, ein bekanntes gefärbtes Ziel mittels Mikroskopie sichtbar zu machen, sollte als erfolgloses Ergebnis betrachtet werden.

Abbildung 1. Darstellung des anatomischen Bereichs mit Überlagerung des Mukosa-Ganzpräparats. (A–C). Sagittale Ansicht des linken Naseninnenraums (Hämisin- und Eosinfärbung, HE-Färbung) der Maus (A) mit Überlagerung der Mukosa-Ganzpräparat-Färbung aus dem gleichen Bereich (zur anatomischen Orientierung) (B), die die Orientierung und Position der Axonbündel in Grün sowie der Zellkerne in Blau zeigt. Diese Technik ermöglichte die Erhaltung der gesamten anatomischen Struktur: Es ist möglich, die primären Riechnerven (ON) und die zugehörigen (vomeronasalen Nerven, VNN) Axonbündel deutlich zu unterscheiden und ihrem Verlauf vom Septum bis zum Riechkolben (OB) durch die Lamina cribrosa zu folgen (B, C). Das hier dargestellte Gewebe wurde mit Hoechst für die Kerne (blau) und β-III-Tubulin für die Axonbündel (grün) gefärbt. Repräsentative Bilder aus n = 15 unabhängigen Präparationen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Makro- und schematische Ansichten des Geruchssystems. (A) Mithilfe eines Knochenzangen wird entlang der roten gestrichelten Linie das Septumknochen (gelber Bereich) entfernt. (B) Sobald die darunterliegende konkave Nasenhöhle (braun) freigelegt ist, kann das gesamte Schleimhautgewebe, das sich von diesem Bereich bis zur respiratorischen und olfaktorischen Schleimhaut erstreckt, gewonnen werden. (C) Grafische Darstellung zur Veranschaulichung der Kontinuität dieser Strukturen, die sich vom olfaktorischen Epithel bis zum Riechkolben ziehen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3. Erweiterte Ansicht des anatomischen Bereichs, erhalten mit einem Ganzpräparat-Sammel- und Färbeprotokoll. (A–D). Dargestellt sind repräsentative Bilder von gesunden und geschädigten Schleimhäuten. Von oben nach unten: intakte Schleimhaut aus gesundem Gewebe (n = 3) und geschädigte Schleimhaut (n = 12). Im gesunden Gewebe (A) umhüllen OECs mit ihrer langgestreckten bipolaren Morphologie (A, links) die Axonbündel (A, Mitte), und Fibroblasten bilden die äußere Schicht dieser tunnelartigen Strukturen (A, rechts, weißer Pfeil). Die drei ausgewählten ROIs spiegeln diese Details wider (B). In der geschädigten Schleimhaut zeigen OECs sowohl bipolare als auch runde Morphologien (C, D, links, weiße Pfeile). Die Axonbündel erscheinen weniger gleichmäßig und kompakt (C, D, Mitte, weiße Pfeile). Fibroblasten sind über die gesamte Region verbreitet (C, D, rechts, weiße Pfeile). Maßstab = 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4. Dreidimensionale fluoreszenzoptische Aufnahmen von Schleimhaut-Präparaten in toto. (A–H). Niedrigvergrößerte Aufnahmen der Zellen (A–F) sowie eine hochvergrößerte Aufnahme (G) wurden aus Bilddatenstapeln mehrerer aufeinanderfolgender Bereiche mithilfe eines SpinSR-Mikroskops gewonnen. Riechschwann-Zellen (OECs) sind rot dargestellt, Fibroblasten in Magenta, Axone in Grün und Zellkerne in Blau. Pfeile markieren unterschiedliche OEC-Morphologien (A) sowie eine äußere Fibroblastenschicht um Axonbündel herum (B und C). In den Abbildungen D–F heben Pfeile strukturelle Ähnlichkeiten bei gesunden Fibroblasten hervor. Diese Aufnahmen verdeutlichen die räumliche Organisation der zellulären Bestandteile, die anschließend mit der Imaris-Software dreidimensional dargestellt wurden (H). Maßstabsbalken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Reagenz	Zielstruktur	Verdünnung	INKUBATIONSBEDINGUNGEN	Begründung
Primärantikörper
β-III-Tubulin (Kaninchen)	Axone	1:300	72 h bei 4 °C, auf dem Rollapparat	um eine vollständige Durchdringung der gesamten Dicke zu ermöglichen
PDGFR-β (Ratte)	Fibroblasten	1:100
Sekundärantikörper
Alexa 488	Primärantikörper von Kaninchen	1:250	In Aluminiumfolie eingewickelt, mindestens 4 h bei Raumtemperatur auf dem Rollapparat, anschließend über Nacht bei 4 °C auf dem Rollapparat.	Die Aluminiumfolie verhindert eine Photobleiche, Dauer, Temperatur und durch den Rollapparat verursachte Bewegung ermöglichen eine gute Durchdringung
Alexa 647	Primärantikörper von Ratte	1:500
Chromosomen
Hoechst	Zellkerne	1:2500

Tabelle 1: Liste der Antikörper mit für dieses Protokoll optimierten Verdünnungen. Diese Tabelle enthält die verwendeten Färbe-Reagenzien mit ihren Zielstrukturen, Verdünnungen und der Begründung für die Inkubationsbedingungen.

Diskussion

In den letzten Jahrzehnten hat sich langsam das Zeitalter der dreidimensionalen Darstellung etabliert, wobei zahlreiche innovative Ansätze im wissenschaftlichen Bereich entwickelt wurden. So haben dreidimensionale Rekonstruktionsverfahren, die durch die Entwicklung komplexer Ganzpräparat-Bildgebungsmethoden in Kombination mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopen ermöglicht wurden, ein besseres Verständnis mehrerer vollständig durchgehender Gewebearchitekturen erbracht. Diese dreidimensionalen Darstellungsverfahren wurden verwendet, um verschiedene Strukturen des menschlichen Körpers zu definieren, wie beispielsweise Gefäße, Drüsen und häufige Tumore^4,5,6,7,8,9. Darüber hinaus wurden Informationen über die Unterschiede zwischen pathologischen und normalen Strukturen gesammelt, beispielsweise in vollständigen Mausgehirnen^10,11,12. Dieser Ansatz wurde als entscheidender Schritt hin zu einem besseren Verständnis der verschiedenen biologischen Systeme erkannt und ermöglicht ein tieferes Verständnis zellulärer Schaltkreise, ihrer räumlichen Organisation in Struktur und Funktion sowie ihres möglichen Beitrags zu menschlichen Erkrankungen.

Ein Nachteil der verschiedenen Kombinationen der dreidimensionalen Geweberekonstruktion und Bildgebung besteht darin, dass die meisten Ansätze Schritte zur Gewebedurchsichtigung erfordern. Obwohl diese Methode für viele Gewebearten nützlich ist, eignet sie sich nicht für alle Gewebetypen^8,9,19. Tatsächlich umfassen Durchsichtigungsmethoden mehrere Waschschritte, die gezielt markierte Epitope beschädigen und endogene Signale beeinflussen könnten²⁰.

Die oben beschriebenen Ansätze wurden verwendet, um zahlreiche wichtige zelluläre Strukturen in verschiedenen Systemen zu definieren. Allerdings weist das Geruchssystem und seine strukturellen Zielstrukturen nur ein minimales Vorkommen knöcherner Bestandteile auf, die eine einfache Isolierung ermöglichen würden; daher wurden in den letzten Jahren Ganzpräparat-Ansätze, die keine Klärungsschritte beinhalten, erprobt^13,14.

Diese Studien erkannten die Bedeutung einer genaueren Definition der Organisation neuronaler Strukturen im Geruchssystem. Entsprechend lag ihr Hauptaugenmerk darauf, eine klare topografische Karte der Verteilung der olfaktorischen Sinnesneuronen basierend auf der Expression verschiedener Marker¹⁴ bereitzustellen sowie neue Einblicke in deren eigenartige Zilien zu gewinnen¹³.

Die hier entwickelte und vorgestellte Ganzpräparat-Technik ermöglicht die vollständige Gewinnung und Konservierung des Schleimhautgewebes und eröffnet die Möglichkeit, entscheidende Einblicke in die anatomische und physiologische Struktur dieses Milieus zu gewinnen, wobei unser spezieller Fokus auf der Beziehung zwischen Riechschwann-Zellen, Fibroblasten und Axonbündeln liegt. Die Kombination dieser verfeinerten Isolations- und Färbetechnik mit hochauflösender konfokaler Bildgebung ermöglichte die Aufnahme großer Bilder, die die Struktur der gesamten Zielregion und der darin befindlichen Zellen widerspiegeln. Insbesondere bietet unsere optimierte Technik zwei besondere Vorteile: Zum einen wird die gesamte Schleimhaut einschließlich der Architektur der Lamina propria¹³ gewonnen und verarbeitet, zum anderen trägt die schonendere Gewebepräparation dazu bei, die makroskopische Anatomie sowie die zellulären Wechselwirkungen (wie beispielsweise zwischen Riechschwann-Zellen, Axonen und Fibroblasten) im Vergleich zu anderen Flat-Mount-Protokollen besser zu erhalten¹⁴. Aus diesem Grund enthält dieses Protokoll keine Validierung mittels Dünnschnittfärbung.

Wie oben erwähnt, erfordern Whole-Mount-Techniken in der Regel lange Gewebeprozessierungszeiten und die Verwendung spezifischer, kostengünstiger Reagenzien. Diese Methode wurde unter besonderer Berücksichtigung einer minimalen Gewebeprozessierung entwickelt, um sowohl den zeitlichen Rahmen als auch das Risiko einer Beschädigung wichtiger zellulärer Strukturen zu minimieren. Die optimierte Methode stellt daher einen schnellen Prozess dar, der mit Reagenzien durchgeführt werden kann, die üblicherweise für die Immunhistochemie an Dünnschnitten verwendet werden, und bietet eine valide Alternative zu Verfahren, die längere Bearbeitungszeiten erfordern und für knochenfreie Strukturen wie Schleimhautgewebe nicht geeignet sind.

Die Bildaufnahme und Nachbearbeitung kann mit jeder konfokalen Mikroskopieplattform durchgeführt werden, die in der Lage ist, hochauflösende Z-Stapel aus dicken Gewebeproben aufzunehmen und über eine ausreichende Laserdurchdringung verfügt, um durch die betreffenden Schleimhäute abzubilden (weitere Einzelheiten zu unseren Einstellungen für die Aufnahme und Bildverarbeitung finden Sie im Methodenteil).

Mit geeigneten Modifikationen glauben wir, dass dieses Protokoll auf andere gängige Nagetiermodelle übertragen und angewendet werden kann. Mit einigen gewebespezifischen Anpassungen kann diese Methode in verschiedenen Kontexten eingesetzt werden, einschließlich der Untersuchung von Schleimhaut- und Submukosageweben aus dem Atmungs- und Magen-Darm-Trakt (GIT); der Erforschung der Gewebeorganisation und multizellulärer Wechselwirkungen innerhalb des Nervensystems; der Analyse entzündlicher Prozesse und der schleimhautassoziierten lymphatischen Gewebe (MALTs); sowie der Untersuchung verschiedener multisystemischer Achsen, wie beispielsweise der Darm-Hirn-Achse.

Die Hauptstärke dieses Protokolls liegt in den methodischen Verbesserungen, die eine hochwertige dreidimensionale Bildgebung ermöglichen, während gleichzeitig die Gewebestruktur erhalten bleibt, und zudem einen relativ schnellen Ansatz im Vergleich zu anderen bisher im Forschungsfeld erprobten Whole-Mount-Methoden gewährleisten.

Die erfolgreiche Umsetzung dieses Ansatzes hing stark von einem tiefen anatomischen Verständnis des betreffenden Gewebes ab. Tatsächlich war im vorliegenden Fall die Kenntnis der erwarteten Lokalisation der Axonbündel entscheidend, um die Invasivität des Gewinnungsverfahrens zu minimieren, sobald das Schädelinnere freigelegt war. Dieses anatomische Wissen war von entscheidender Bedeutung, um schnell die Region und das Gewebe von Interesse zu lokalisieren und die Gesamtstruktur der Mukosa zu erhalten, was verdeutlicht, dass eine erfolgreiche Gewebeaufbereitung untrennbar mit einer fundierten Sammelmethode verknüpft ist und nicht allein von Nachbearbeitungsschritten abhängt.

Wie in mehreren Anmerkungen im Methodenteil erwähnt, waren mehrere technische Anpassungen entscheidend für die Entwicklung und Optimierung dieser Methode. Das Freischwimmen des Gewebes in Eppendorf-Röhrchen während des gesamten Färbeprozesses, kombiniert mit kontinuierlicher Rotation während der Reagenzien- und Antikörperinkubation, stellte einen entscheidenden Fortschritt gegenüber statischeren Whole-Mount- und Dünnschnittprotokollen dar. Diese Verbesserung verhinderte eine Faltung des Gewebes und sorgte gleichzeitig für eine homogene Durchdringung der Reagenzien im gesamten Probematerial, wodurch die Färbekonsistenz verbessert wurde, ohne dass zusätzliche Clearing-Schritte erforderlich waren. Darüber hinaus erwies sich eine sorgfältige Optimierung der Inkubationsdauer für jeden Reagenzien- und Antikörpercocktail als essenziell. Dieser letzte Schritt könnte je nach gewähltem Antikörpertyp weiter angepasst werden müssen.

Zusammen führten diese spezifischen Faktoren zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit, während die gesamte Verarbeitungszeit sowie die beanspruchung der Proben verringert wurden.

Ein weiterer wichtiger methodischer Schritt war die zuverlässige Bestimmung der Gewebeorientierung vor der Montage und Bildgebung, ohne auf fluoreszierende Markierungen angewiesen zu sein. Die Seite der Lamina propria des Schleimhautgewebes konnte im Hellfeldmikroskop anhand dicker Nervenbündel leicht identifiziert werden, die sich deutlich vom umgebenden Epithelgewebe abheben. Die Standardisierung der Probenorientierung durch Positionierung der Lamina propria zur Deckglasseite hin und der epithelialen Schicht auf dem Objektträger erwies sich als vorteilhaft für die Bildqualität. Diese einfache, aber wirksame Verbesserung trug zur Konsistenz der Bildaufnahmen zwischen den Proben bei und verbesserte die Qualität der erhaltenen dreidimensionalen Rekonstruktionen.

Es gibt jedoch einige Einschränkungen zu berücksichtigen. Dieses Protokoll wurde nicht an vielen gängigen Mausstämmen oder anderen Nagetierarten getestet. Ebenso wurden die Optimierungen unter den spezifischen experimentellen Bedingungen durchgeführt, wie oben beschrieben, und ausschließlich mit den aufgeführten Antikörpansetzungen. Obwohl das Protokoll mit den meisten Maus- und Rattenstämmen, mehreren verschiedenen Antikörpern und beliebigen experimentellen Modellen funktionieren sollte, bei denen Schleimhäute in voller Dicke gewonnen werden können, könnte eine weitere sorgfältige Optimierung erforderlich sein. Eine weitere bemerkenswerte Einschränkung besteht darin, dass ein einzelner Ganzpräparatschnitt nur mit einem einzigen Antikörpersatz gefärbt werden kann, im Gegensatz zu dünneren Schnittpräparaten, bei denen jeder Schnitt mit einem individuellen Antikörpersatz gefärbt werden kann und daher mehrere verschiedene Antikörperserien an dünnen Schnittpräparaten getestet werden können.

Insgesamt zeigen diese methodischen Innovationen, wie relativ einfache Anpassungen bei der Gewebehandhabung, den Färbebedingungen und der Probenausrichtung die Ergebnisse der Ganzpräparat-Bildgebung erheblich verbessern können. Indem umfangreiche Gewebeverarbeitungs- und Klärungsschritte vermieden werden, bietet dieser Ansatz eine praktische und anpassungsfähige Alternative zur Untersuchung empfindlicher, knochenfreier Gewebe, während dennoch die Erfassung detaillierter, großskaliger dreidimensionaler Daten ermöglicht wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	Immunhistochemie
Adobe Illustrator		Version 28.5
Anti-Beta-III-Tubulin-Antikörper – Neuronaler Marker	Abcam	ab18207
Anti-PDGFR-beta-Antikörper [APB5]	Abcam	ab91066
bisBenzimid H 33342 Trihydrochlorid	Sigma Aldrich	14533
DECKGLÄSCHEN 24X50MM NR. 1,5 100 STÜCK	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	Immunhistochemie
Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H+L), hochgradig kreuzadsorbiertes sekundäres Antikörper, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-21206
Dumont #15A Knochenquetsche – Epoxidbeschichtet	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	Gewebedissection
Dumont #7 Pinzette – Biologie/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	Gewebedissection
Ziege-Anti-Ratte-IgG (H+L), kreuzadsorbiertes sekundäres Antikörper, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Imaris-Software	Imaris	Version 9.5.0	Bildgebung
Mayo-Dissektionschere	ProSciTech	420SS	Gewebedissection
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Gewebeprozessierung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, sterile PBS-Tabletten (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	Gewebeprozessierung
ProLong Glass Antifade Mounting-Medium	Thermo Fisher Scientific	P36980	Immunhistochemie
Skalpellklinge #23	Skalpellklingen Swann Morton	COS240B	Gewebedissection
Skalpellgriff #4	ProSciTech	T134	Gewebedissection
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Gewebeprozessierung
Saccharose	Chem-Supply	57-50-1	Gewebeprozessierung
TOMO-Adhäsionsmikroskopobjektträger	ProSciTech	GEMS63705-09	Immunhistochemie
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	Immunhistochemie