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Ultraschallgesteuerte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) in einem mikrofluidischen BHS-Glioblastom-Chip für Studien zur Wirkstofffreisetzung

112 Ansichten

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DOI:

10.3791/72041

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18. August 2026

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines mikrofluidischen BBB-Glioblastom-(BBB-GBM)-Chips. Das Modell wird hinsichtlich der Integrität der Blut-Hirn-Schranke validiert und ermöglicht die Untersuchung einer durch niederintensiven Ultraschall induzierten, vorübergehenden und weitgehend reversiblen Öffnung der Blut-Hirn-Schranke, wodurch eine quantitative Bewertung des ultraschallvermittelten Transports von Nanomizellen über die Blut-Hirn-Schranke sowie der Tumortargeting-Effizienz ermöglicht wird.

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine wesentliche Hürde bei der Behandlung von Glioblastom (GBM) dar, da sie den Eintritt der meisten therapeutischen Moleküle in das Gehirn einschränkt. Zwischenartliche Unterschiede in Struktur und Funktion der BHS erschweren die klinische Übertragbarkeit von Tiermodellen und unterstreichen damit die Notwendigkeit menschlich relevanter in-vitro-BHS-Plattformen zur Beurteilung der Medikamentenpermeabilität in der GBM-Therapie. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung eines mikrofluidischen BHS-GBM-Chip-Modells beschrieben. Dieses Modell etabliert ein Dreikultur-System aus humanen zerebralen mikrovaskulären Endothelzellen (HCMECs), primären Astrozyten (ACs) und U87-MG-Zellen in einer mit Matrigel beschichteten mikrofluidischen Plattform. Die Integrität der BHS wird mittels kontinuierlicher Immunfärbung für Zonula occludens-1 (ZO-1) und Permeabilitätsmessung mit FITC-Dextran überprüft. Niedrigintensiver Ultraschall (US) (1 MHz, 1 W/cm²)2, 30 s) wird anschließend angewendet, um eine vorübergehende und weitgehend reversible Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu induzieren, wodurch tumorspezifische Nanomizellen (SFN@RB@SPMs) die Schranke effizient überwinden und sich in GBM-Zellen anreichern können. Ein zentrales Merkmal dieses Protokolls ist die Integration von Echtzeit-Messungen der BHS-Permeabilität und der Arzneimittelfreisetzung in einem einzigen ultraschallresponsiven Chip, der eine leistungsfähige Plattform zur Aufklärung der Mechanismen der ultraschallverstärkten Arzneimittelabgabe bei GBM bietet.

Einleitung

Die Behandlung von Glioblastomen (GBM) wird stark durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) eingeschränkt, die den Eintritt nahezu aller therapeutischen Wirkstoffe ins Gehirn erheblich begrenzt1,2. Die BHS wird von nicht fenestrierten Endothelzellen gebildet, die durch Tight-Junction-Proteine (z. B. Occludin, ZO-1) verbunden sind und zusätzlich durch Perizyten sowie astrozytäre Endfüße gestützt werden3. Obwohl tierische Modelle wertvolle Erkenntnisse zum Funktionieren der BHS geliefert haben, beschränken artenspezifische Unterschiede in Physiologie und Stoffwechsel ihre Fähigkeit, menschliche Arzneimittelreaktionen genau vorherzusagen4,5. Daher sind physiologisch relevante humane BHS-Modelle unverzichtbar, um die Medikamentenpermeabilität in der GBM-Therapie zu bewerten.

Traditionelle in vitro-BBB-Modelle, wie das Transwell-Kultursystem, können die Komplexität der Blut-Hirn-Schranke nicht hinreichend nachbilden, einschließlich Zell-Zell-Interaktionen, dynamischer Flüssigkeitswechsel und flussinduzierter Scherspannung6. Demgegenüber haben sich mikrofluidische BBB-Modelle als überlegene Plattformen etabliert, die diese in vivo-ähnlichen Eigenschaften präziser widerspiegeln7. Solche BBB-auf-einem-Chip-Systeme wurden bereits umfassend zur Untersuchung der Metastasierung von Hirntumoren8, zur Erforschung einer Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke bei neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit9 sowie zur Bewertung des Arzneistofftransports über die Blut-Hirn-Schranke10,11 eingesetzt. Die meisten derzeit verfügbaren BBB-Chip-Modelle dienen jedoch hauptsächlich der Prüfung der Arzneistoffpermeabilität und können keine externen physikalischen Reize integrieren, die die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke beeinflussen. Aktuell hat sich fokussierter Ultraschall (FUS) als vielversprechende Strategie zur vorübergehenden Öffnung der Blut-Hirn-Schranke mit anschließender weitgehender Wiederherstellung herauskristallisiert, wodurch eine verbesserte Abgabe therapeutischer Wirkstoffe ins Gehirn ermöglicht wird12,13. Frühere mechanistische Studien haben gezeigt, dass durch Ultraschall induzierte mechanische Stimulation die Barrierefunktion vorübergehend modulieren kann, indem sie die Zell-Zell-Verbindungen umgestaltet und die endotheliale Permeabilität erhöht. Beispielsweise zeigten Silvani et al., dass durch Ultraschall hervorgerufene mechanische Kräfte die reversible Bildung von interendothelialen Lücken in einem in vitro-Gefäß-auf-einem-Chip-Modell auslösen können14. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnten Beekers et al. nachweisen, dass ultraschallvermittelte mechanische Bioeffekte eine vorübergehende Öffnung der endothelialen Zell-Zell-Kontakte induzieren und dadurch die endotheliale Permeabilität erhöhen15. Kürzlich berichteten Qiao et al., dass die Permeabilität der endothelialen Barriere maßgeblich von den Ultraschallexpositionsparametern, insbesondere der Impulsdauer, abhängt, was die Bedeutung einer Optimierung der akustischen Parameter für eine sichere und kontrollierbare Modulation der Blut-Hirn-Schranke unterstreicht16. Trotz dieser Fortschritte gibt es bisher nur wenige in vitro-Plattformen, die gleichzeitig eine quantitative Analyse der ultraschallvermittelten Öffnung der Blut-Hirn-Schranke und deren Auswirkungen auf die Abgabe von Nanomedikamenten ermöglichen.

Um die oben genannte Lücke zu schließen, wird ein Protokoll zur Herstellung eines mikrofluidischen BBB-GBM-Chips vorgestellt. Die mikrofluidische Vorrichtung ermöglicht eine Tri-Kultur aus HCMECs, primären ACs und in Matrigel eingebetteten U87-MG-GBM-Zellen. Die rekonstruierte Blut-Hirn-Schranke wies sowohl strukturelle als auch funktionelle Merkmale einer intakten Barriere auf, was durch eine kontinuierliche Lokalisation von ZO-1 entlang der interzellulären Junctions sowie eine begrenzte Diffusion von 40 kDa FITC-Dextran über die vaskuläre Grenzfläche belegt wurde. Wichtig ist, dass dieser Chip mit einer kontrollierten Ultraschallstimulation gekoppelt werden kann, um eine vorübergehende Öffnung der Blut-Hirn-Schranke zu induzieren und dadurch den anschließenden Transport und die Tumorausrichtung von Nanomizellen zu verbessern. Mithilfe dieses Systems kann die Transport- und Tumorausrichtungseffizienz der Nanomizellen SFN@RB@SPM quantitativ bewertet werden. Insgesamt bietet diese Plattform ein nützliches Werkzeug, um den Zusammenhang zwischen Ultraschallparametern, einer reversibel modulierbaren Blut-Hirn-Schranke und einer verbesserten Abgabe von Nanomizellen in der GBM-Therapie zu untersuchen.

Protokoll

Alle Tierversuche entsprachen den Richtlinien (GB/T35892-2018) für die ethische Überprüfung des Tierschutzes bei Tierversuchen und wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Ningbo Institute of Life and Health Industry, UCAS (Genehmigungsnummer GK-2023-XM-0073) genehmigt. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

1. Herstellung und Vorbereitung der BBB-GBM-Organs-auf-einem-Chip-Vorrichtung

  1. Chip-Design und Fotomaskenlayout
    1. Entwerfen Sie den Chip mithilfe einer Auto-CAD-Software.
      ​HINWEIS: Der Chip besteht aus drei parallelen mikrofluidischen Kanälen, darunter ein Blutkanal, ein Gehirnkanal und ein Tumorkanal. Die Breite des Blutkanals und des Tumorkanals beträgt jeweils 1000 µm, während die Breite des Gehirnkanals 1300 µm beträgt. Die Höhe der drei Kanäle beträgt 150 µm, und benachbarte Kanäle sind durch trapezförmige Mikrosäulen-Arrays mit einer Breite von 200 µm voneinander getrennt, die einen molekularen Diffusionsaustausch und zelluläre Kommunikation zwischen den Kompartimenten ermöglichen. Das detaillierte Designlayout der Fotomaske ist in Abbildung 1, Zusatzmaterial und Abbildung 2, Zusatzmaterial dargestellt. Das in der vorliegenden Studie verwendete SU-8-Photoresist ist 3050.
  2. Herstellung einer Silikon-Form mittels Standard-Photolithographie mit SU-8-Photoresist.
    1. Platzieren Sie eine leere Silikonwafer auf dem Vakuumhalter des Spin-Coaters und schalten Sie das Vakuum ein, um den Wafer sicher zu fixieren.
    2. Geben Sie langsam 10 mL SU-8-Photoresist in die Mitte des Wafers.
    3. Führen Sie einen zweistufigen Spin-Beschichtungsprozess durch, um eine gleichmäßige Photoresist-Schicht zu erhalten: zunächst 10 s bei 500 U/min, danach 90 s bei 2500 U/min.
    4. Überführen Sie den beschichteten Wafer auf eine Heizplatte und führen Sie eine Vorvernetzung (Soft Bake) bei 95 °C für 30 min durch, um das Lösungsmittel zu verdampfen.
    5. Lassen Sie den Wafer auf Raumtemperatur abkühlen und messen Sie die Dicke der SU-8-Schicht mit einem Dickenmessgerät.
      HINWEIS: Für eine optimale Blut-Hirn-Schranke (BBB) wird eine Kanalhöhe von 110–150 µm empfohlen. Eine einzelne Spin-Beschichtung (Schritt 1.2.3) ergibt typischerweise eine Schichtdicke von 40–50 µm; daher sind zwei bis drei Spin-Beschichtungsschritte erforderlich, um die gewünschte Gesamtdicke zu erreichen.
  3. Photolithographische Strukturierung
    1. Stellen Sie die Intensität des ultravioletten (UV-)Lichts des Maskenaligners auf 14–15 mW/cm2 ein.
    2. Richten Sie die Chrom-Fotomaske mit dem SU-8-beschichteten Silikonwafer aus und führen Sie eine UV-Belichtung für 10 s durch.
    3. Überführen Sie den Silikonwafer unmittelbar auf eine Heizplatte und führen Sie eine Nachbelichtungstrocknung (Post-Exposure Bake) unter folgenden Bedingungen durch: 65 °C für 10 s, gefolgt von 95 °C für 300 s.
    4. Nachdem der Silikonwafer auf Raumtemperatur abgekühlt ist, tauchen Sie ihn in eine Entwicklerlösung (Propylenglykolmonomethyletheracetat, PGMEA) ein und lassen Sie ihn 4–6 min entwickeln.
    5. Spülen Sie den Wafer mit Isopropanol, um die Entwicklung zu beenden, und waschen Sie anschließend mit entionisiertem Wasser.
    6. Trocknen Sie den Wafer mit Stickstoffgas und prüfen Sie die strukturierten Mikrokanäle unter dem optischen Mikroskop.
      ​HINWEIS: Bleiben unentwickelte Photoresist-Reste zurück, wiederholen Sie den Entwicklungsschritt, bis die Mikrostrukturen klar definiert sind.
    7. Vernetzen Sie die fertige Silikon-Form im Ofen bei 200 °C für 1 h, um die Haftung zwischen dem SU-8-Photoresist und der Silikonoberfläche zu verbessern.
  4. PDMS-Chip-Herstellung
    1. Stellen Sie Polydimethylsiloxan (PDMS) her, indem Sie das Basis-Prepolymer und den Härter im Gewichtsverhältnis 10:1 (m/m) gründlich 30 min lang mischen, um ein homogenes PDMS-Prepolymer zu erhalten.
    2. Gießen Sie die PDMS-Mischung auf die hergestellte Silikon-Form, wobei sichergestellt werden muss, dass die Mikrostrukturen vollständig bedeckt sind.
    3. Stellen Sie die Form in einen Vakuum-Exsikkator, um Entgasung durchzuführen und eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
    4. Überführen Sie die Form in einen Ofen und härten Sie sie bei 65 °C für 1,5–2 h aus.
    5. Schneiden Sie nach der Aushärtung die PDMS-Schicht vorsichtig entlang der Chipränder mit einem Bastelmesser ab und lösen Sie sie vorsichtig von der Silikon-Form.
    6. Tauchen Sie den PDMS-Chip zur vorläufigen Sterilisation 30 min lang in 70–75 %igen Ethanol ein, spülen Sie ihn anschließend mit entionisiertem Wasser und lassen Sie ihn an der Luft trocknen.
    7. Stanzen Sie Zulauf- und Ablauföffnungen mit einem 2-mm-Biopsiestanzer aus.
  5. Plasmabindung und Gerätezusammenbau
    1. Platzieren Sie den PDMS-Chip und eine saubere Glasobjektträger in der Kammer eines Plasma-Reinigers, wobei die Mikrokanalseite des PDMS nach oben zeigen soll.
    2. Evakuieren Sie die Kammer, bis der Druck unter 30 Pa fällt, und führen Sie anschließend Sauerstoffgas ein.
    3. Halten Sie den Sauerstoffstrom 90 s lang aufrecht, während der Kammerdruck unter 40 Pa bleibt.
    4. Stellen Sie die Hochfrequenzleistung (RF) auf 55 % ein und führen Sie eine 90 s lange Plasma-Behandlung durch, um die Oberflächen von PDMS und Glas zu aktivieren.
    5. Bringen Sie den aktivierten PDMS-Chip unmittelbar mit dem Glasobjektträger in Kontakt und drücken Sie leicht, um eine irreversible Bindung zu erzielen.
    6. Stellen Sie das zusammengebaute Gerät 24 h lang bei 65 °C in einen Ofen, um die Bindung zu stabilisieren und die Hydrophobie wiederherzustellen.
    7. Sterilisieren Sie das verbundene Gerät vor der Zellseeding 30 min lang durch Bestrahlung mit UV-Licht.
      HINWEIS: Halten Sie sterile Bedingungen aufrecht, indem Sie die sterilisierten Chips bis zur Verwendung in versiegelten Petrischalen innerhalb eines Biosicherheitswerkschranks aufbewahren.

2. Zellsaat und Aufbau des BBB-GBM-Modells

  1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor:
    1. ACs-Kulturmedium (für den Gehirnkanal): DMEM/F12-Grundmedium, ergänzt mit 20 % fetalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S).
    2. HCMECs-Kulturmedium (für den vaskulären Kanal): Endothelzellen-Medium (ECM), ergänzt mit 1 % P/S.
    3. GBM-Zellkulturmedium (für den Gliomkanal): MEM-Grundmedium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S.
    4. Zelldissoziationsreagenz: Verwenden Sie eine 0,25 %ige Trypsin-EDTA-Lösung, um adhärente Zellen abzulösen.
      HINWEIS: Eine längere Exposition gegenüber Trypsin kann die Zellviabilität verringern. Überwachen Sie die Zelldissoziation unter dem Mikroskop und neutralisieren Sie das Trypsin unverzüglich mit komplettem Medium.
    5. Kultivieren Sie alle Zellen (ACs, HCMECs und U87-MG) vor der Aussaat in das mikrofluidische Gerät in 100-mm-Kulturschalen.
  2. Isolierung primärer ACs
    1. Isolieren Sie primäre ACs aus den Großhirnrinden neugeborener Ratten (postnatale Tage 1–3). Entfernen Sie nach sorgfältigem Abtrennen der Meningen und Blutgefäße auf Eis das kortikale Gewebe mit sterilen chirurgischen Scheren, zerkleinern es und unterziehen es einer enzymatischen Verdauung.
    2. Waschen Sie die dissoziierte Zellsuspension mit eiskaltem PBS, behandeln Sie sie mit Trypsin, um eine Einzelzelldissoziation zu erreichen, und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation (400 × g, 5 min, Raumtemperatur).
    3. Suspendieren Sie die Zellen erneut und säen Sie sie in T25-Kulturgefäße mit ACs-Kulturmedium aus.
    4. Identifizieren Sie die ACs mittels Immunfluoreszenzfärbung gegen GFAP. Die entsprechende Abbildung finden Sie in Supplementary Figure 3.
  3. Zellaussaat
    ​HINWEIS: Tag 1 – Aussaat der ACs in den Gehirnkanal.
    1. Geben Sie 1 mL einer 0,25 %igen Trypsin-EDTA-Lösung in die Kulturschale mit den ACs. Schwenken Sie vorsichtig, um eine gleichmäßige Benetzung zu gewährleisten.
    2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 1–2 min, bis sich die Zellen von der Kulturschale lösen.
    3. Geben Sie 3 mL ACs-Kulturmedium (aus Schritt 2.1.1) hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipettieren Sie vorsichtig, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
    4. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 3 min bei 4 °C.
    5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellenpellet in 200 µL AC-Medium.
    6. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem automatischen Zellzähler und stellen Sie die Dichte auf 2,5 × 106 Zellen/mL ein.
    7. Mischen Sie die ACs-Zellsuspension mit Matrigel im Volumenverhältnis 3:5 (AC-Zellen: Matrigel).
    8. Geben Sie mithilfe einer Mikropipette 10 µL der Matrigel-ACs-Mischung in den Gehirnkanal.
      HINWEIS: Führen Sie den Beladungsvorgang durch, während der Chip auf Eis gehalten wird, um eine vorzeitige Polymerisation von Matrigel zu verhindern.
    9. Inkubieren Sie den Chip 30 min bei 37 °C in einem 5 %igen CO2-Inkubator, um die Polymerisation von Matrigel und die Stabilisierung der Zellen zu ermöglichen.
      HINWEIS: Tag 1 – Aussaat der HCMECs in den vaskulären Kanal.
    10. Geben Sie 1 mL einer 0,25 %igen Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für etwa 30 s, bis sich die Zellen lösen.
    11. Geben Sie 3 mL HCMECs-Medium (Schritt 2.1.2) hinzu, um die enzymatische Verdauung zu stoppen.
    12. Pipettieren Sie vorsichtig, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erzeugen.
    13. Sammeln Sie die Suspension und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 3 min bei 4 °C.
    14. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellenpellet in 200 µL HCMECs-Medium.
    15. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Konzentration auf 2 × 106 Zellen/mL ein.
    16. Geben Sie vorsichtig 10 µL der HCMECs-Suspension in den vaskulären Kanal des Chips.
    17. Stellen Sie den Chip für 30 min seitlich in den Zellinkubator, um die Anheftung der Endothelzellen an die Kanalwände zu fördern.
    18. Säen Sie weitere 10 µL der HCMECs-Suspension in den vaskulären Kanal, um die Endotheldichte im vaskulären Kanal zu erhöhen.
    19. Inkubieren Sie den Chip weitere 30–60 min, um die Adhäsion der HCMECs zu ermöglichen.
    20. Geben Sie 100 µL gemischtes Kulturmedium in den Eingang des Chips.
      HINWEIS: Das gemischte Medium besteht aus AC-Medium und HCMECs-Medium im Volumenverhältnis 1:1 (v/v).
      Tag 3 – Aussaat der U87-MG-Zellen in den Gliomkanal.
    21. Geben Sie 1 mL einer 0,25 %igen Trypsin-EDTA-Lösung in die Kulturschale und inkubieren Sie bei 37 °C für 1–2 min.
    22. Geben Sie 3 mL U87-MG-Medium (aus Schritt 2.1.3) hinzu, um die Verdauung zu beenden.
    23. Pipettieren Sie vorsichtig, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erhalten.
    24. Überführen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 3 min.
    25. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellenpellet in 200 µL U87-MG-Medium.
    26. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und stellen Sie die Dichte auf 2 × 106 Zellen/mL ein.
    27. Geben Sie 10 µL der U87-MG-Zellsuspension in den Gliomkanal des Chips.
    28. Inkubieren Sie den Chip 30–60 min bei 37 °C mit 5 % CO2, um die Zelladhäsion zu ermöglichen.
    29. Geben Sie 100 µL U87-MG-Kulturmedium in den Eingang des Chips.
    30. Halten Sie das mikrofluidische Gerät weitere 48 h bei 37 °C mit 5 % CO2, um die Bildung enger Zellkontakte zwischen den Endothelzellen zu ermöglichen.

3. Beurteilung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke

  1. Permeabilitätsassay
    1. Stellen Sie Fluoresceinisothiocyanat-Dextran (FITC-Dextran) mit Molekulargewichten von 40 kDa in einem gemischten Kulturmedium (ACs-Medium: HCMEC-Medium = 1:1, v/v) mit einer Endkonzentration von 10 µg/mL her.
    2. Geben Sie 10 µL der FITC-Dextran-Lösung in den vaskulären Kanal.
    3. Platzieren Sie den mikrofluidischen Chip auf dem Objekttisch eines invertierten Fluoreszenzmikroskops, um alle 20 Minuten Fluoreszenzbilder sowohl des vaskulären Kanals als auch des angrenzenden Hirnkanals aufzunehmen, um die Dextran-Diffusion über die endotheliale Barriere hinweg zu überwachen.
    4. Quantifizieren Sie den Permeabilitätskoeffizienten (Papp, cm/s) mithilfe der folgenden Formel:
      Papp (cm/s)= Gleichung für Prozesseffizienz, mit Fs, Fc, Δt; mathematische Formel für wissenschaftliche Forschung.
      Dabei ist Papp der scheinbare Permeabilitätskoeffizient (cm/s), FS die Fluoreszenzintensität zum Anfangszeitpunkt im Blutkanal, FC die Fluoreszenzintensität im Hirnkanal am Ende des Diffusionsintervalls, Δt die Diffusionszeit (s), VT das Diffusionsvolumen von FITC-Dextran im Hirnkanal (cm3) und A die endotheliale Oberfläche (cm2).
      HINWEIS: Ein niedrigerer Permeabilitätskoeffizient weist auf eine höhere BBB-Integrität und eine dichtere endotheliale Barrierebildung hin.
    5. Führen Sie die Datenanalyse und Parameterdefinition durch.
      HINWEIS: Die Fluoreszenzintensitätswerte aus den Blut- und Hirnkanälen wurden um den Hintergrund korrigiert, basierend auf Messungen aus zellfreien Bereichen des Chips. Die ROIs wurden auf beiden Seiten der Blut-Hirn-Schranke basierend auf der Länge der Fluoreszenzdiffusion definiert. Die endotheliale Oberfläche (A) wurde aus der Grenzfläche zwischen vaskulärem und Hirnkanal berechnet (unter Verwendung des Abstands zwischen zwei Mikrosäulen als Referenz): 200 µm × 150 µm = 30.000 µm2 = 3 × 10-6 cm2. Das Diffusionsvolumen von FITC-Dextran (VT) wurde aus der Eindringtiefe der Diffusion im Hirnkanal multipliziert mit A ermittelt. Fluoreszenzbilder wurden über einen Zeitraum von 60 Minuten alle 20 Minuten (1200 s) aufgenommen; der Permeabilitätskoeffizient wurde anhand der Daten aus dem 20-Minuten-Intervall berechnet. Die Permeabilitätswerte wurden aus drei unabhängigen Chips pro experimenteller Gruppe berechnet. Alle Umrechnungen der Einheiten wurden vor der Angabe der Permeabilität in cm/s durchgeführt.
  2. Immunfluoreszenzanalyse von ZO-1
    1. Spülen Sie die mikrofluidischen Kanäle dreimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), um das verbleibende Kulturmedium zu entfernen.
    2. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) in die Kanäle geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
    4. Blockieren Sie unspezifische Antikörperbindungen, indem Sie die Kanäle 45 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS inkubieren.
    5. Geben Sie den primären Anti-ZO-1-Antikörper (1:200 Verdünnung) in die Kanäle und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C.
    6. Spülen Sie den Kanal gründlich mit PBS, um nicht gebundenen primären Antikörper zu entfernen.
    7. Inkubieren Sie die Chips 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln mit einem Alexa Fluor 555-konjugierten sekundären Antikörper gegen Kaninchen (1:1000 Verdünnung).
    8. Färben Sie die Zellkerne mit 1 µg/mL 4’,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 1 Minute bei Raumtemperatur im Dunkeln nach.
      HINWEIS: DAPI ist lichtempfindlich und sollte während der Färbung vor Licht geschützt werden.
    9. Spülen Sie die Kanäle dreimal mit PBS.
    10. Nehmen Sie Bilder des mikrofluidischen Geräts mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop und einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop auf, um die Lokalisation von ZO-1 entlang der endothelialen Zellkontakte sichtbar zu machen.

4. Ultraschallverstärkte Abgabe von Nanomizellen über die Blut-Hirn-Schranke zu GBM-Zellen

  1. Ultraschallstimulation
    1. Nehmen Sie den Chip vorsichtig aus der Kulturschale und stellen Sie ihn in einem Biosicherheitswerkbank ab.
    2. Wenden Sie Ultraschallstimulation unter Verwendung eines therapeutischen Ultraschallsystems mit einem 1-MHz-Wandler (effektive Strahlfläche: 5 cm2) an.
    3. Tragen Sie ein 3 mm dickes medizinisches akustisches Koppelgel zwischen Ultraschallsonde und Oberfläche des mikrofluidischen Chips auf, um eine effiziente Schallübertragung sicherzustellen.
    4. Positionieren Sie die Ultraschallsonde direkt über dem vaskulären Kanalbereich des mikrofluidischen Geräts.
      ​HINWEIS: Luftblasen zwischen Wandler und Chip reduzieren die Schallenergieübertragung erheblich und sollten vermieden werden.
    5. Stellen Sie die Ultraschallparameter wie folgt ein: Arbeitszyklus: 60 %; Frequenz: 1 MHz; Intensität: 1 W/cm2; Expositionszeit: 30 s; Impuls-Wiederholfrequenz (PRF): 100 Hz. Die detaillierten Ultraschallparameter sind in Ergänzungstabelle 1 angegeben.
    6. Platzieren Sie für die unbehandelte Kontrollgruppe den Ultraschallwandler an derselben Position, schalten Sie ihn jedoch aus, um eine Scheinkontrolle zu gewährleisten, und stellen Sie identische Handhabungsprozeduren ohne akustische Exposition sicher.
    7. Entfernen Sie nach der Ultraschallexposition das Koppelgel und bringen Sie den Chip unverzüglich in eine sterile Kulturschale zurück.
    8. Geben Sie frisches Kulturmedium in die Zulauföffnungen des Chips.
    9. Brüten Sie das Gerät bei 37 °C mit 5 % CO2, bis weitere Analysen durchgeführt werden.
  2. Beurteilung der Ultraschall-induzierten BBB-Modulation
    1. Führen Sie die ZO-1-Immunfluoreszenz-Färbung unmittelbar nach der Ultraschallbehandlung (0 h) und 24 h nach der Behandlung durch, um Veränderungen der Tight-Junction-Integrität zu bewerten.
    2. Befolgen Sie die in Schritt 3.2 beschriebene Immunfluoreszenz-Färbeprozedur.
    3. Vergleichen Sie die Verteilung der ZO-1-Färbung entlang der z-Achse, um die Wirkung der Ultraschallstimulation auf die Tight-Junction-Integrität der Blut-Hirn-Schranke zu beurteilen.
  3. Herstellung und Charakterisierung von SFN@RB@SPM-Nanomicellen
    1. Stellen Sie die SFN@RB@SPM-Nanomicellen gemäß dem zuvor etablierten Protokoll17 her. Kurz gesagt, wurden Stammlösungen des amphiphilen Peptids (als SPM bezeichnet, 6 mg/mL), RB (0,6 mg/mL) und SFN (6 mM) im Volumenverhältnis 1:1:1 gemischt.
    2. Geben Sie die Mischung in einen Ultraschallzerreicher und beschallen Sie sie 30 min lang bei 28 kHz und 25 °C.
    3. Dialysieren Sie die Mischung (Molekulargewichts-Cutoff: 1000 Da) 48 h lang, um freies RB und SFN zu entfernen.
    4. Messen Sie Größe und Zeta-Potential der Nanomicellen mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS). Die Charakterisierungsdaten sind in Ergänzungsabbildung 4 dargestellt.
  4. Beurteilung der ultraschallgesteuerten Nanomicellen-Abgabe und -Anreicherung in Gliomzellen
    1. Geben Sie unmittelbar nach der Ultraschallexposition das kulturmediumhaltige Nanomicellenmedium in den vaskulären Kanal des mikrofluidischen Geräts.
    2. Um den Transport der Nanomicellen über die Blut-Hirn-Schranke zu bewerten, stellen Sie den mikrofluidischen Chip auf den Objekttisch eines invertierten Fluoreszenzmikroskops und nehmen Sie in 20-minütigen Abständen über 60 min hinweg Fluoreszenzbilder sowohl des vaskulären Kanals als auch des angrenzenden Hirnkanals auf.
    3. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzbilder im Hirnkanal, um die ultraschallverstärkte Permeabilität der Nanomicellen zu bewerten.
    4. Um die Anreicherung der Nanomicellen in Gliomzellen zu beurteilen, brüten Sie das Gerät nach der Ultraschallexposition unter standardmäßigen Kulturbedingungen (37 °C, 5 % CO2) 3 h lang, und nehmen Sie anschließend mit einem Fluoreszenzmikroskop Bilder des Gliomkanals auf, um die intrazelluläre Aufnahme der Nanomicellen zu bewerten.
  5. Statistische Analyse
    1. Stellen Sie alle quantitativen Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar.
    2. Führen Sie jedes Experiment mit drei unabhängigen biologischen Wiederholungen (n = 3 Chips pro Versuchsbedingung) durch. Für jede biologische Wiederholung wurden mindestens drei technische Wiederholungen (ROI pro Kanal) gemessen, um die Datenzuverlässigkeit sicherzustellen.
    3. Berechnen Sie den Permeabilitätskoeffizienten (Papp, cm/s) aus jedem unabhängigen Chip, der als primäre Analyseeinheit für alle statistischen Vergleiche diente.
      HINWEIS: Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mittels ungepaarten zweiseitigen Student’s t-Test durchgeführt. Vergleiche zwischen drei oder mehr Gruppen wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Tukey’s Post-hoc-Test für multiple Vergleiche analysiert. Für Experimente mit zwei unabhängigen Variablen wurde eine zweifaktorielle ANOVA mit anschließendem Tukey’s Multiple-Comparisons-Test durchgeführt. Die statistischen Analysen wurden mit statistischer und grafischer Software durchgeführt. Ein p-Wert von <0,05 galt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in vivo Aufbau der BBB wurde ein Dreikultur-Mikrofluidik-Chip entwickelt, der HCMECs, primäre ACs und U87-MG-Zellen enthält (als „Chip-Modell“ bezeichnet). Wie dargestellt in Abbildung 1A,B, drei parallele Kanäle sind innerhalb des Geräts angeordnet: der vaskuläre Kanal (links, blau), der mit Matrigel gefüllte Hirnkanal (zentral, rosa) und der Tumorkanal (rechts, grün), die jeweils mit HCMECs, ACs und U87-MG-Zellen besiedelt werden. Die Kanäle sind durch Mikrosäulen-Arrays voneinander getrennt, die die Begrenzung des Matrigels im zentralen Kompartiment sicherstellen, gleichzeitig jedoch den molekularen und zellulären Austausch zwischen den Kanälen ermöglichen. Nach der Sterilisation des Geräts werden die ACs (2,5 × 106 Zellen/mL), die in Matrigel im Volumenverhältnis 3:5 (v/v) suspendiert waren, wurden in den Gehirnkanal appliziert. Nach der Polymerisation von Matrigel wurden HCMECs (2 × 106 Zellen/mL) wurden in den linken vaskulären Kanal eingesät. Nach einem zweitägigen Kokultivierung von ACs und HCMECs wurden U87-MG-Zellen (2 × 106 Zellen/mL) in den rechten Tumorkanal eingebracht, um die GBM-Kompartiment zu etablieren. Das Chip-Modell war am Tag 5 vollständig etabliert. Anschließend wurde die Integrität der Barriere überprüft über Immunfärbung von ZO-1 und Permeabilitätsmessungen mit 40 kDa FITC-Dextran. Wie in Abbildung 1C, zeigte ZO-1 eine kontinuierliche, linienförmige Verteilung entlang der Grenzfläche der HCMEC-ACs, was die Bildung einer engen Zellverbindung (tight junction) an der BBB-Grenzfläche bestätigt. Die konfokale 3-D-Rekonstruktion zeigte zudem ausgeprägte ZO-1-Signale an der Grenzfläche zwischen Gefäß- und Gehirnkanal (z-y-Ebene, Abbildung 1D), was die Bildung einer intakten endothelialen Barriere innerhalb des Chips bestätigt. Um die Funktion der Barriere weiter zu überprüfen, wurde die Permeabilität für 40 kDa FITC-Dextran evaluiert. Die Permeabilität wurde über einen Zeitraum von 1 h in 20-minütigen Intervallen quantifiziert. Wie in Abbildung 1E,F, beträgt der Permeabilitätskoeffizient (3,46 ± 0,50) × 10-6 cm/s nach 60 min, was vergleichbar ist mit in vivo Rattenmikrozirkulation18 und fortgeschrittene auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) basierende Modelle19und stellt eine wesentliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen, ausschließlich endothelialen Modellen dar13Zusammen validierten diese strukturellen und funktionellen Daten die erfolgreiche Etablierung einer physiologisch relevanten BBB-GBM-Plattform.

Da berichtet wurde, dass Ultraschall eine vorübergehende und weitgehend reversible Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) induzieren kann, wobei die Barrierefunktion typischerweise innerhalb von 24 Stunden wiederhergestellt wird20, wurde als Nächstes der direkte Einfluss der Ultraschallstimulation auf die BHS-Funktion am Chip-Modell zu den Zeitpunkten 0 h oder 24 h nach Ultraschall-Behandlung untersucht. Das Chip-Modell wurde Ultraschall ausgesetzt (1 W/cm2, 1 MHz, 30 s). Die Immunfluoreszenzanalyse von ZO-1 zeigte eine vergleichbare Intensität 0 h und 24 h nach der Ultraschallbehandlung (Abbildung 2A), was auf die Erhaltung der Integrität der engen Zellkontakte hindeutet. Die quantitative Fluoreszenzanalyse von ZO-1 bestätigte eine vergleichbare Signalintensität an der Gefäß-Hirn-Grenzfläche zwischen der Kontrollgruppe und der mit Ultraschall behandelten Gruppe (Abbildung 2B). Um weiter zu prüfen, ob die Ultraschallbehandlung die Durchlässigkeit der BHS erhöht, wurde 40 kDa FITC-Dextran als Permeabilitätstracer verwendet. Wie in Abbildung 2C,D dargestellt, beschleunigte die Ultraschallbehandlung unmittelbar die Diffusion des Tracers über die BHS hinweg, wobei sich der Permeabilitätskoeffizient von 4,20 × 10-6 cm/s in der unbehandelten Gruppe auf 1,33 × 10-5 cm/s erhöhte. 24 h nach der Ultraschallbehandlung sank der Permeabilitätskoeffizient auf 8,04 × 10-6 cm/s, was im Vergleich zur unmittelbar nach der Ultraschallbehandlung gemessenen Gruppe eine erhebliche Erholung darstellt, obwohl er weiterhin leicht über dem Niveau der unbehandelten Kontrollgruppe lag. Diese Ergebnisse zeigen, dass niederintensiver Ultraschall eine vorübergehende Öffnung der BHS induziert, der eine erhebliche Wiederherstellung der Barrierefunktion folgt, während die strukturelle Integrität im Chip-Modell erhalten bleibt.

Die Permeabilität der Nanomicellen SFN@RB@SPM durch die Blut-Hirn-Schranke unter Ultraschallstimulation wurde anschließend bewertet. In unserer vorherigen Studie zeigte sich, dass diese selbstassemblierten Nanomicellen effektiv die Blut-Hirn-Schranke überwinden und sich an der Tumorstelle in einem xenotransplantierten Gliom-Mausmodell anreichern17. Um zu untersuchen, ob eine Ultraschallmodulation den Transport von SFN@RB@SPM in diesem Chip-Modell verstärkt, verwendeten wir dieselben Sonikationsparameter wie in Abbildung 2C. Die Ultraschallbehandlung beschleunigte SFN@RB@SPM deutlich beim Durchtritt durch die Blut-Hirn-Schranke und erhöhte den Permeabilitätskoeffizienten von (2,42 ± 0,15) × 10-5 cm/s auf (4,58 ± 0,07) × 10-5 cm/s 60 min nach der Behandlung, was einer 1,9-fachen Steigerung gegenüber der Kontrollgruppe entspricht (Abbildung 3A,B). Zur Überprüfung einer aktiven Tumortargetierung wurde das rote Fluoreszenzsignal von RB im Gliomkanal nach Injektion der Nanomicellen in den vaskulären Kanal gemessen. Wie in Abbildung 3C dargestellt, war drei Stunden nach Ultraschallbehandlung ein deutlicher Anstieg der roten Fluoreszenz im Gliomkanal zu beobachten, was auf einen verbesserten Transport der Nanomicellen durch die Blut-Hirn-Schranke hinweist. Ohne Ultraschallbehandlung wurde lediglich eine vernachlässigbare Fluoreszenz detektiert, was bestätigt, dass eine Öffnung der Blut-Hirn-Schranke notwendig ist, damit SFN@RB@SPM die Tumorstelle erreichen und sich dort anreichern können.

Diagramm des mikrofluidischen Chips für die Blut-Hirn-Schranke und Experiment zur Analyse der Permeabilitätsdaten.
Abbildung 1: Herstellung und Charakterisierung des BBB-GBM-auf-einem-Chip. (A) Schematische Darstellung des dreikanaligen mikrofluidischen Geräts: vaskulärer Kanal (blau), Hirnkanal (pink) und Tumorkanal (grün). (B) Fotografie des zusammengesetzten PDMS-Glas-Chips. (C) ZO-1-Immunfärbung (rot) an endothelialen Zellkontakten mit DAPI-Kerngegenfärbung (blau). Maßstab: 50 µm. (D) Orthogonale konfokale Ansichten (x-z und y-z), die die Anreicherung von ZO-1 (rot) an der vaskulär-hirnseitigen Grenzfläche zeigen. (E) Repräsentative Zeitrafferaufnahmen der Diffusion von 40 kDa FITC-Dextran vom vaskulären in den Hirnkanal über einen Zeitraum von 60 Minuten (in 20-Minuten-Abständen). Maßstab: 200 µm. (F) Quantifizierte Permeabilitätskoeffizienten, die die größenselektive Barrierefunktion bestätigen. Die Daten zeigen den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus drei unabhängigen Chips (n = 3). Die statistische Signifikanz wurde mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, gefolgt von Tukeys post-hoc-Test für multiple Vergleiche. Der exakte p-Wert ist in der Abbildung angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Fluoreszenzmikroskopie, Permeabilitätsdiagramm, US-Vergleich, Zeitrafferaufnahme, Permeabilitätsanalyse.
Abbildung 2: Öffnung der Blut-Hirn-Schranke und anschließende Wiederherstellung der Barrierefunktion durch Ultraschall. (A) ZO-1-Immunfärbung an der Grenzfläche zwischen Gefäß und Gehirn unmittelbar (0 h) und 24 h nach der Sonifikation. Es werden 3-D-Konfokalrekonstruktionen gezeigt. (B) Normalisierte ZO-1-Fluoreszenzintensität entlang der z-Achse (Tiefe) an der Grenzfläche zwischen Gefäß und Gehirn in der Kontrollgruppe und der mit Ultraschall behandelten Gruppe. (C) Diffusionskinetik von 40 kDa FITC-Dextran von der Gefäß- in die Gehirnkompartimente bei 0 h und 24 h, mit oder ohne Ultraschallbehandlung (Bilder wurden im Abstand von 20 Minuten über 60 Minuten aufgenommen). Maßstab: 200 µm. (D) Quantifizierter Permeabilitätskoeffizient für den 40 kDa-Tracer 0 h oder 24 h nach Ultraschallbehandlung, mit oder ohne Sonifikation. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM aus drei unabhängigen Chips dar (n = 3). Die statistische Signifikanz wurde mittels zweifaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, gefolgt von Tukeys post-hoc-Test für multiple Vergleiche. Statistische Signifikanz: p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Studie zur Zellpermeabilität mit Ultraschallanwendung; umfasst Zeitrafferaufnahmen, ein Permeabilitäts-Balkendiagramm und einen Vergleich mittels Fluoreszenzmikroskopie mit DAPI-Färbung.
Abbildung 3: Ultraschallverstärkte Permeabilität und gezielte Anreicherung von SFN@RB@SPM in U87-MG-Zellen. (A) Permeabilitätsmessung von SFN@RB@SPM an der Blut-Hirn-Schranke mit und ohne Ultraschallbehandlung. Maßstabsbalken: 200 µm. (B) Quantifizierte Permeabilitätskoeffizienten von SFN@RB@SPM unter Kontrollbedingungen und nach Ultraschallbehandlung. (C) Anreicherung von SFN@RB@SPM im Tumorkanal nach ultraschallinduzierter Öffnung der Blut-Hirn-Schranke; rote Fluoreszenz wurde 3 h nach der Injektion erfasst. Maßstabsbalken: 50 µm. Die Daten zeigen den Mittelwert ± SEM aus drei unabhängigen Chips (n = 3). Die statistische Signifikanz wurde mittels eines ungepaarten zweiseitigen Student’s t-Tests bestimmt. Statistische Signifikanz: p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung einzusehen.

Abbildung 1, Zusatzmaterial: CAD-Konstruktionslayout des BBB-GBM-Mikrofluidik-Chips.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 2, Zusatzmaterial: Die detaillierte Konstruktion des BBB-GBM-Chips. Die Konstruktion besteht aus drei parallelen mikrofluidischen Kanälen; die Breite beider Seitenkanäle beträgt 1000 µm, während die Breite des zentralen Kanals 1300 µm beträgt.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzliche Abbildung 3: Charakterisierung der primären Astrozyten mittels GFAP (grün) und Färbung der Zellkerne mit DAPI (blau). Maßstabsleiste: 50 µm.Klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 4, Zusatzmaterial: Charakterisierung der selbstassemblierenden Nanomizellen SFN@RB@SPM. (A) Dynamische Lichtstreuung (DLS) zur Bestimmung der Größenverteilung von SFN@RB@SPM mit einem mittleren Partikeldurchmesser von etwa 64 nm. (B) Die Zetapotential-Messung zeigt eine Oberflächenladung von etwa 150,67 ± 2,85 mV. Alle Messungen wurden mit DLS-Geräten durchgeführt.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Zusammenfassungstabelle der Ultraschallparameter.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Einrichtung eines mikrofluidischen BBB-GBM-Chips zur Untersuchung der ultraschallvermittelten Modulation der Blut-Hirn-Schranke und der Abgabe von Nanomizellen. Im Vergleich zu herkömmlichen in vitro-BBB-Modellen (z. B. Transwell) ermöglicht diese mikrofluidische Plattform eine räumlich definierte Kokultur von Endothelzellen, ACs und Gliomzellen und erlaubt somit die Untersuchung des Arzneistofftransports über eine physiologisch relevante Blut-Hirn-Schranke. Mehrere kritische Schritte des Protokolls erfordern eine sorgfältige Optimierung, um eine zuverlässige Barrierebildung sicherzustellen. Ein entscheidender Parameter ist das Volumenverhältnis zwischen Matrigel und dem AC-Zellsuspensionsmedium, das zur Herstellung der Mischung verwendet wird, die in den zentralen Hirnkanal geladen wird. Dieses Verhältnis ist entscheidend, um eine geeignete Gelviskosität aufrechtzuerhalten, sodass die AC-Matrigel-Mischung während des Beladens im mittleren Kanal verbleibt. Enthält die Mischung einen zu hohen Anteil an AC-Zellsuspensionsmedium, kann die verringerte Viskosität dazu führen, dass das Matrigel in benachbarte Mikrokanäle ausläuft und AC-Zellen in benachbarte Kanäle migrieren. Umgekehrt kann ein zu konzentriertes Matrigel die Zellviabilität beeinträchtigen und den Nährstofftransport behindern. Das optimierte Volumenverhältnis von 3:5 (V/V) zwischen AC-Zellsuspension und Matrigel (Schritt 2.2.7) bietet ausreichende mechanische Stabilität, um das Gel im zentralen Kanal zu halten, und unterstützt gleichzeitig das Wachstum der ACs im Matrigel. Ähnliche Überlegungen wurden bereits in anderen mikrofluidischen BBB-Modellen hervorgehoben, bei denen eine geeignete Hydrogelviskosität (z. B. Fibrin oder Matrigel) entscheidend ist, um einen Übergang zwischen den Kanälen zu verhindern, die räumliche Trennung der Zellkompartimente aufrechtzuerhalten und die Eigenschaften der extrazellulären Matrix nachzuahmen7,21,22.

Zweitens muss das mikrofluidische Gerät unmittelbar nach dem Ansäen der HCMECs in den vaskulären Kanal etwa 30 Minuten lang seitlich positioniert werden. Dieser Schritt fördert die Anheftung der HCMECs an der Seitenwand zwischen vaskulärem und Gehirnkanal, was notwendig ist, um eine kontinuierliche endotheliale Barriere an der Zell-Zell-Grenzfläche zu bilden. Ohne diesen Schritt lagern sich die HCMECs hauptsächlich auf der Bodenfläche des Kanals ab, was zu einer unvollständigen endothelialen Bedeckung entlang der Seitenwand und einer verminderten Barriereintegrität führt. Der anschließende zusätzliche Ansäeschritt für HCMECs sorgt weiterhin für eine ausreichende Zelldichte innerhalb des vaskulären Kanals. Die Aufrechterhaltung einer angemessenen Zelldichte ist wichtig, da eine geringe HCMEC-Dichte zu einer unvollständigen Monolayerbildung und einer erhöhten Apoptose führen kann. Frühere Studien zu BBB-auf-einem-Chip haben ähnlich betont, dass die Erzielung eines konfluenten endothelialen Monolayers entscheidend für die Barriereintegrität und die Expression von Tight-Junction-Proteinen in mikrofluidischen Systemen ist23,24.

Die Fehlerbehebung bei häufig auftretenden Problemen kann die Reproduzierbarkeit erheblich verbessern. Wenn während des Beladens des Gehirnkanals (Schritt 2.2.8) Matrigel in benachbarte Kanäle austritt: (1) sicherstellen, dass die Matrigel-Zell-Mischung auf Eis gehalten wird, um die Polymerisation von Matrigel zu verhindern; (2) die Zell-Matrigel-Mischung langsam und gleichmäßig injizieren, um ein Überlaufen in die benachbarten Kanäle zu vermeiden; (3) das Volumenverhältnis von Matrigel zu Zellen auf 5:4 (v/v) anpassen, was dabei hilft, eine geeignete Viskosität sicherzustellen und die Mischung im zentralen Kanal zu begrenzen. Zudem hängt die erfolgreiche Bildung der endothelialen Barriere stark von einer ausreichenden Anheftung und Dichte der Endothelzellen ab. Falls die Endothelzellen keine zusammenhängende Monolage entlang der Grenzfläche des vaskulären Kanals bilden, sollte die Ansiedlungsdichte der Endothelzellen erhöht oder die Adhäsionszeit verlängert werden, um die endotheliale Abdeckung und die Bildung enger Junctions zu verbessern. Wenn nach dem Hinzufügen des Mediums Luftblasen im Kanal erscheinen, kann man vorsichtig auf den Chip klopfen oder die Blasen mit einer gelben Pipettenspitze unter leichtem Saugdruck entfernen, da eingeschlossene Blasen in der Nähe der endothelialen Barriere die Integrität der engen Junctions lokal stören können.

Obwohl das hier beschriebene BBB-GBM-auf-einem-Chip-Modell ein physiologisch relevanteres System darstellt, können mehrere Aspekte in zukünftigen Studien weiter optimiert werden, um die physiologische Relevanz und das mechanistische Verständnis zu verbessern. Erstens verwendet das derzeitige Modell primäre, aus Ratten stammende Astrozyten (ACs), die mit HCMECs kокultiviert werden, was zu einer Artenschwankung führt. Obwohl dieser Ansatz häufig zur Konstruktion von BBB-auf-einem-Chip-Plattformen verwendet wurde13,23, könnten die artbedingten Unterschiede die Barriereeigenschaften und die Reaktionen auf Arzneimittelpermeabilität beeinflussen. Zukünftige Studien werden humane, aus iPSCs abgeleitete ACs oder primäre humane ACs integrieren, um ein vollständig humanisiertes Modell zu etablieren, wodurch diese Einschränkung beseitigt und die translationale Relevanz der Plattform weiter erhöht würde. Zweitens fehlen im aktuellen Modell Komponenten der neurovaskulären Einheit, insbesondere Perizyten und Immunzellen, die wichtige Regulatoren der BBB-Funktion und des Tumorfortschritts darstellen25,26. Die Einbindung dieser Komponenten würde die Komplexität der Tumormikroumgebung besser nachbilden. Drittens arbeitet das Gerät unter statischen Bedingungen ohne kontinuierliche Mediumperfusion. Der physiologische Scherspannungsreiz, der durch den Blutfluss erzeugt wird, hat sich als förderlich für die BBB-Eigenschaften erwiesen, da er die Expression von Tight-Junction-Proteinen wie Claudin-5 und Occludin hochreguliert. Daher könnte das Fehlen eines Flusses zu einem höheren Permeabilitätskoeffizienten führen, wie er bei statischen Chips im Vergleich zu dynamischen Systemen beobachtet wird27. Viertens wurde die BBB-Integrität hauptsächlich durch die Kombination von ZO-1-Immunfluoreszenz-Färbung mit der Permeabilitätsanalyse mittels FITC-Dextran bewertet. Diese komplementären strukturellen und funktionellen Assays sind jedoch weithin etabliert zur Validierung der BBB sowohl in konventionellen Transwell-BBB-Modellen als auch in mikrofluidischen BBB-auf-einem-Chip-Modellen6,28,29. Eine zusätzliche Charakterisierung zentraler Regulatoren des parazellulären und transzellulären Transports, einschließlich Claudin-530, MFSD2A und Caveolin-1, würde eine umfassendere Beurteilung der BBB-Funktion ermöglichen30,31,32. Diese Marker werden in zukünftigen Studien integriert, um die physiologische Charakterisierung der Plattform weiter zu stärken. Schließlich verwendet das vorliegende Protokoll niederintensiven therapeutischen Ultraschall ohne exogene Mikrobläschen oder direkte Messung des akustischen Drucks. Im Gegensatz zu herkömmlichen fokussierten Ultraschallsystemen, die typischerweise eine mikroblasengestützte Öffnung der BBB in vivo nutzen, wurde die vorliegende Studie darauf ausgelegt, eine vereinfachte, reproduzierbare in vitro-Plattform zu schaffen, um die ultraschallinduzierte Modulation der BBB-Permeabilität und den Transport von Nanomedikamenten zu untersuchen. Dieser Ansatz minimiert zusätzliche Variablen, die mit der Konzentration, Verteilung und Kavitationsdynamik von Mikrobläschen in mikroskaligen mikrofluidischen Umgebungen verbunden sind. Dennoch werden zukünftige Studien, die mikroblasengestützten Ultraschall, Temperaturüberwachung und eine detaillierte Charakterisierung des akustischen Feldes einbeziehen, die physiologische Relevanz und das quantitative Verständnis der ultraschallvermittelten BBB-Modulation weiter verbessern.

Insgesamt bietet das hier vorgestellte Protokoll eine kontrollierte BBB-GBM-Mikrofluidikplattform, die in der Lage ist, Ultraschallstimulation und die quantitative Analyse der Zufuhr von Nanomizellen zu integrieren. Dieses System ermöglicht die direkte Untersuchung der ultraschallvermittelten Öffnung der Blut-Hirn-Schranke und des anschließenden Transports von Nanomedikamenten über die endotheliale Barriere. Neben der Bewertung der Zufuhr von Nanomizellen kann die Plattform auch zur Untersuchung der BBB-Penetranzfähigkeit von Wirkstoffen, zur Erforschung der Mechanismen der BBB-Störung sowie als leistungsfähige Plattform für die präklinische Bewertung von auf das zentrale Nervensystem (CNS) gerichteten Therapeutika verwendet werden.

Offenlegungen

Während der Vorbereitung dieses Manuskripts verwendeten die Autoren ChatGPT (OpenAI) ausschließlich zur sprachlichen Überarbeitung und Verbesserung. Die Autoren haben alle mithilfe von KI erstellten Inhalte überprüft und bearbeitet und übernehmen volle Verantwortung für die Genauigkeit und Integrität des Manuskripts. Es wurden keine KI-Tools zur Datenerzeugung, Datenanalyse oder zur Erstellung von Abbildungen verwendet.

Danksagungen

Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (LQ24H160003), die Medical Scientific Research Foundation der Provinz Zhejiang (2024KY351), die Ningbo Natural Science Foundation (2023J365), das Yongjiang-Talent-Integrationsprogramm (Projekt für junge innovative Talente, 2021A-012-G) und das Bei’An-Talentprogramm des Bezirks Jiangbei, Ningbo (2023RC004).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alexa Fluor 555-konjugiertes sekundäres Antikörper gegen KaninchenCell Signaling Technology, Inc.4413
Anti-ZO-1-AntikörperThermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
Biopsie-PunchZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
RinderserumalbuminAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
ZellzählerThermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
Zellkulturschale (100 mm)Corning Inc.430167
ZentrifugeBeckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
ChrommaskeSuzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
Konfokales LaserscanningmikroskopCarl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
EntwicklerSuzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
ECMScienCell Research Laboratories1001
ÄthanolNingbo Zhenhai Yongfeng Chemical Plant6923193900015
Fötales RinderserumScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)Open-Source-ProjektN/V
FITC-Dextran (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
GlasobjektträgerCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
GraphPad Prism 9.5GraphPad Software, Inc.N/V
Menschliche zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen (HCMECs)BeNa Culture CollectionBNCC337717
BrutschrankEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
Invertiertes FluoreszenzmikroskopNikon Instruments Inc.TS2-FL
IsopropanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
MEMPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PM150410
StickstoffNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/V
SauerstoffNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/V
Paraformaldehyd (PFA, 4 %)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
PBSScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
PDMSCorning Inc.220777
Penicillin/StreptomycinPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
PhotolithographieInstitut für Optik und Elektronik, Chinesische Akademie der WissenschaftenURE-2000\AL
Heizplatte für die PhotolithographieSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
Plasma-ÄtzerTIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
Primäre AstrozytenN/VN/VAus Gehirn von neugeborenen Ratten (Tag 1–3) isoliert
SiliziumwaferZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
Spin-CoaterSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
TrypsinScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
U87-MG-ZellenPricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
Ultraschallgerät Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4 (blaue Edition)Carl Zeiss AGN/V

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