Methodenartikel

Ein Mausmodell der Endometriose unter Verwendung ex vivo Cy5.5 von Farbstoff dotierter Silizium-Nanopartikel-Markierung zur Läsionsvisualisierung

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DOI:

10.3791/72070

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4. August 2026

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1Department of Obstetrics, Gynecology and Women’s Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Engineering, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie zeigt die Induktion der Endometriose mittels ex vivo Markierung mit Cy5.5-Farbstoff-dotierten Siliziumnanopartikeln, wodurch eine fluoreszente Visualisierung endometriotischer Läsionen ohne genetische Manipulation ermöglicht wird.

Zusammenfassung

Endometriose ist eine häufige gynäkologische Erkrankung, die durch das Wachstum von endometriumähnlichem Gewebe außerhalb der Gebärmutterhöhle gekennzeichnet ist, was zu chronischer Entzündung, Beckenschmerzen und Unfruchtbarkeit führt. Zuverlässige Mausmodelle sind unerlässlich für die Untersuchung der molekularen, hormonellen, immunen und Umweltmechanismen, die der Krankheitsentwicklung und -progression zugrunde liegen. Konventionelle Methoden zur Identifizierung endometriotischer Läsionen basieren oft auf gentechnisch veränderten fluoreszierenden Reportermäusen, die zeitaufwendig und kostspielig in der Herstellung sind. Hier präsentieren wir einen einfachen, nicht-genetischen Ansatz zur Induzierung und Visualisierung von Endometriose bei Mäusen, indem Spender-Gebärmuttergewebefragmente ex vivo mit Cy5.5-dotierten Siliziumnanopartikeln vor der Transplantation markiert werden. Die Nanopartikel weisen günstige physikochemische Eigenschaften, hohe Fluoreszenzstabilität und minimale Zytotoxizität auf, was eine effiziente Markierung des Gebärmuttergewebes ermöglicht, ohne experimentelle Verfahren zu beeinträchtigen. Nach der intraperitonealen Implantation in Empfängermäuse können Cy5.5-markierte endometriotische Läsionen mithilfe von Fluoreszenzbildgebung leicht von umgebenden Wirtsgeweben unterschieden werden. Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare und vielseitige Methode zur Visualisierung und Verfolgung von Läsionen, die Studien zur Endometriose-Pathogenese und die präklinische Bewertung diagnostischer und therapeutischer Strategien ohne genetische Manipulation erleichtert.

Einleitung

Endometriose ist eine häufige gynäkologische Erkrankung, bei der Zellen, die das Endometrium auskleten, außerhalb der Gebärmutter wachsen. Die daraus resultierenden endometriotischen Läsionen führen zu einer chronisch entzündlichen Erkrankung1, und betroffene Frauen erleben häufig Beckenschmerzen und Unfruchtbarkeit2. Dysfunktion in endometrialen Stromal- und Epithelzellen verbessert das Überleben und die Entwicklung endometriotischer Läsionen 3,4,5,6. Diese häufige Störung betrifft allein in den USA etwa 11 % der Frauen. Sie ist eine Hauptursache für Unfruchtbarkeit und Beckenschmerzen7, und ihre Prävalenz steigt bei Frauen mit chronischen Beckenschmerzen und Unfruchtbarkeitauf 50–60 % an. Die geschätzten jährlichen Kosten für die Diagnose und Behandlung von Endometriose übersteigen in den Vereinigten Staaten14,15 Milliarden US-Dollar. Aktuelle Behandlungen umfassen die chirurgische Entfernung der Läsionen oder die Einleitung eines hypoöstrogenen Zustands. Allerdings ist ein Rückfall nach einer Operation häufig, und bestehende Therapien sind oft wirkungslos. Die Diagnose wird typischerweise nur durch chirurgische Visualisierung und histologische Verifikation17,18 festgestellt. Außerdem wird Endometriose häufig nicht diagnostiziert oder falsch diagnostiziert, mit einer diagnostischen Verzögerung von 9–11 Jahren19,20 Jahren. Diese Verzögerung stellt sowohl die Patienten als auch dasGesundheitssystem für eine erhebliche emotionale und finanzielle Belastung dar. Daher besteht ein dringender Bedarf, nicht-invasive Methoden sowohl zur Diagnose als auch zur Behandlung der Endometriose zu entwickeln.

In-vitro-Modelle haben die Forschung zur Endometriose weiterentwickelt. Dennoch bleiben sie in ihrer Fähigkeit, die Komplexität der Krankheit vollständig zu replizieren, eingeschränkt. Eine große Herausforderung liegt in der multifaktoriellen Natur der Endometriose, die komplexe Wechselwirkungen zwischen Hormonen, Entzündungen, Immunzellen, Nerven und verschiedenen Zelltypen innerhalb einer dynamischen dreidimensionalen Umgebung umfasst. Darüber hinaus erfassen in vitro Systeme die natürlichen Schwankungen der Ovarialsteroidhormone nicht, was die Fähigkeit einschränkt, die Auswirkungen der Krankheit auf den Fortpflanzungstrakt zu untersuchen(21,22,23). Daher bietet ein Modell der induzierten Endometriose mit intakten Mäusen eine vielseitige Plattform, um die individuellen und interaktiven Rollen des Immunsystems24, der Hormone25,26 und Umweltfaktoren27,28 bei der Entwicklung der Endometriose und deren Auswirkungen auf den Fortpflanzungstraktzu untersuchen 29. Darüber hinaus ermöglicht der Einsatz transgener Mausmodelle, bei denen bestimmte Gene selektiv im Endometrium gelöscht oder überexprimiert werden, den Forschern, die Rolle unterschiedlicher molekularer Signalwege bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der Endometriose zu erläutern. Die genaue Unterscheidung endometriotischer Läsionen aus dem umliegenden Wirtsgewebe bleibt jedoch eine erhebliche technische Herausforderung.

Farbstoffdotierte Silizium-Nanopartikel sind vielseitige und robuste Sonden für zelluläre Verfolgung und Biobildgebung. Sie sind einfach zu synthetisieren, hochdispersiv, fotostabil, biokompatibel und effizient bei der Zellkennzeichnung30,31. Das Silizium-Rückgrat stabilisiert hydrophobe Fluorophore innerhalb der Matrix und macht sie so effiziente, hochquantenreiche (QY) fluoreszierende molekulare Reporter. Im Laufe der Jahre wurden solche fluoreszierenden Silizium-Nanopartikel weit verbreitet als leuchtende, haltbare ex-vivo-Labels für Zellen und Gewebestrukturen vor der Transplantation und anschließender Bildgebung in vivo 32,33,34,35. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Induktion von Endometriose bei Mäusen mit ex vivo Labeling unter Verwendung von Cy5.5-Farbstoff-dotierten Siliziumnanopartikeln, wie sie in einer früheren Veröffentlichung35 verwendet wurden, was deren Anwendung als stabile Bildmarker für die Läsionenverfolgung ermöglicht.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Missouri (Protokoll Nr. 65323) genehmigt und gemäß institutionellen Richtlinien sowie den geltenden nationalen Vorschriften für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt.

1. Vorbereitung der Cy5.5-APTES-Konjugation

  1. Lösen Sie 1 mg Cyanin 5,5-NHS-Ester in 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem klaren 11,1 ml Glas-Gewinde-Fläschchen. Decken Sie das Fläschchen sofort mit Alufolie ab, um die Lösung vor Licht zu schützen.
    HINWEIS: Cy 5.5-APTES-Konjugat kann bei 4 °C bei Raumtemperatur eine Woche lang gelagert werden.
  2. Fügen Sie 1 μL (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) zur Farbstofflösung hinzu.
  3. Fügen Sie 0,5 μL Triethylamin (TEA) hinzu und mischen Sie sofort, um die Reaktion zu erleichtern.
  4. Rühren Sie das Reaktionsgemisch bei 300 U/min bei 30 °C im Dunkeln 24 Stunden lang, um eine kovalente Kopplung zwischen Cy5.5 und APTES zu ermöglichen.
  5. Versiegeln Sie das Fläschchen mit dem Deckel und schützen Sie es weiterhin vor Licht, indem Sie es mit Alufolie umwickeln.

2. Synthese von Cy5.5-farbstoffdotierten Siliziumnanopartikeln

  1. Gib 1 μL konzentrierte Ammoniaklösung (28 %) in ein neues, klares Glas-Fläschchen mit Gewinde.
  2. Fügen Sie 8,5 ml absolutes Ethanol (molekularbiologische Qualität) hinzu.
  3. Fügen Sie 350 μL Tetraethylorthosilikat (TEOS) hinzu.
  4. Fügen Sie 15 μL der vorbereiteten Cy5.5-APTES-Lösung zur Siliziumsynthese-Reaktionsmischung hinzu.
  5. Rühren Sie das Reaktionsgemisch bei 500 U/min bei Raumtemperatur im Dunkeln 24 Stunden lang um, um die kovalente Einbindung des Farbstoffs in die Siliziummatrix zu ermöglichen.

3. Reinigung und Verbreitung

  1. Übertragen Sie das gesamte Reaktionsgemisch in ein 15-mL-Zentrifugenrohr.
  2. Bereiten Sie ein Balanceröhrchen mit gleichem Volumen destilliertes Wasser für die Zentrifugation vor.
  3. Zentrifugiere beide Röhren bei 12.074 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Bestätigen Sie, dass sich nach der Zentrifugation am Boden des Rohrs eine sichtbare Kugel gebildet hat.
  4. Waschen Sie das Pellet mit 10 ml 95 % Ethanol durch Zentrifugation bei 12.074 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Wiederholen Sie diesen Wash dreimal und suspendieren Sie das Pellet durch Sonikation etwa 3–5 Minuten zwischen den Waschphasen oder bis zur vollständigen Verteilung.
  5. Waschen Sie das Pellet mit 5 ml destilliertem Wasser und zentrifugieren Sie bei 12.074 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Wiederholen Sie diesen Wash zweimal, wobei das Pellet durch Sonikation etwa 3–5 Minuten zwischen den Waschen oder bis vollständig verteilt ist, wieder aufhängen.
  6. Die Kugel wird durch Sonikation in 5 ml destilliertem Wasser wieder suspendiert, bis sie vollständig dispergiert ist (es wurden keine festen Fragmente beobachtet, die die Dispersion bestätigen). Bestätigen Sie, dass die Teilchensuspension nach vollständiger Dispersion sichtbar blau erscheint.
  7. Überfülle die Suspension in ein Glasfläschchen, wickle es mit Alufolie um, um es vor Licht zu schützen, und lagere es bei Zimmertemperatur.
  8. Bewerten Sie die Partikeldispersion und Fluoreszenz mit einem in vivo Bildgebungssystem (IVIS). Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 680 nm und eine Emissionswellenlänge von 710 nm für Cy5.5.

4. Endometriose-Induktion mit ex vivo Markierung mit Cy5.5-farbstoffdotierten Siliziumnanopartikeln

  1. Injizieren Sie eine 8 Wochen alte weibliche Spendermaus (Stamm: C57Bl6J X129Sv) subkutan mit E2 (100 μL von 1 μg/mL Sesamöl) einmal täglich morgens für drei aufeinanderfolgende Tage zur hormonellen Synchronisation.
  2. Die Spendermaus wird 6 Stunden nach der letzten E2-Injektion durch eine zervikale Dislokation eingeschläfert und die Gebärmutter entfernt.
  3. Zerkleinern Sie das Gebärmuttergewebe in etwa 1 mm3 Fragmente in einer Petrischale mit einemSkalpell 30,36.
  4. Inkubieren Sie die Gebärmuttergewebefragmente (45 mg) mit 20 % (v/v) Cy5,5-farbstoffdotierten Silizium-Nanopartikeln in einer 24-Well-Platte mit vollständigem RPMI-1640-Medium (10 % FBS) für 3 Stunden bei 37 °C in 5 %CO2.
  5. Betäuben Sie die Empfängermaus (Stamm: C57Bl6J X129Sv) mit 3 % Isofluran in Sauerstoff und bilden Sie einen 0,5 cm großen Bauchschnitt in der Mittellinie.
    HINWEIS: Setzen Sie die Maus in eine Induktionskammer mit 3 % Isofluran, bis die Anästhesie erreicht ist. Rasieren Sie den Bauch und bringen Sie die Maus auf die chirurgische Plattform. Positionieren Sie den Anäsenkegel vor Beginn der Operation.
  6. Waschen Sie die ex vivo markierten Gebärmuttergewebefragmente mit einem Raumtemperaturkulturmedium durch Zentrifugation bei 380 × g für 2 Minuten. Wiederhole den Wasch dreimal.
  7. Unter Narkose wird bei den Empfängermäusen ein 1 cm großer Bauchschnitt in der Mitte gemacht. Suspendieren Sie 45 mg Cy5.5-markierte Gewebefragmente in 500 μL PBS und injizieren Sie die Suspension mit einer 20-Gauge-Nadel in die Peritonealhöhle.
  8. Schließen Sie das Peritoneum mit resorbierbaren Nähten und schließen Sie die Haut mit Wundklammern. Stellen Sie die Maus in eine warme Umgebung und überwachen Sie sie, bis sie sich von der Narkose erholt.
  9. Die Maus wird durch zervikale Dislokation am ausgewählten experimentellen Endpunkt eingeschläfert und die endometriotischen Läsionen gesammelt.

Ergebnisse

Farbstoffdotierte Siliziumnanopartikel können als Bildgebungssonden für Zellmarkierungsanwendungen verwendet werden. Cy5.5-farbstoffdotierte Siliziumnanopartikel (Cy5.5-SiNPs) wurden in zwei Schritten mittels eines Silizium-Sol-Gel-Verfahrens synthetisiert und mit dem fluoreszierenden Cyanin-Farbstoff Cy5.5 mittels Silanchemie funktionalisiert (Abbildung 1). Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigte einheitliche kugelförmige Nanopartikel mit Durchmessern von 156,67 ± 15,23 nm (Abbildung 1A). Die dynamische Lichtstreuung (DLS) zeigte, dass die synthetisierten Nanopartikel (SiNPs und Cy5,5-SiNPs) kolloidal stabil waren, mit hydrodynamischen Durchmessern (Hd) von 130,67 ± 3,20 nm (PDI = 0,152 ± 0,009) bzw. 185,9 ± 5,44 nm (PDI = 0,14 ± 0,009) (Abbildung 1B). Die Zeta-Potenziale nackter SiNPs und Cy5,5-SiNPs betrugen −32,39 ± 3,55 mV bzw. −50,53 ± 2,47 mV (Abbildung 1C). Die Photolumineszenzspektroskopie (Anregungswellenlänge = 680 nm; Emissionswellenlänge = 710 nm) bestätigte die erfolgreiche Einbindung von Cy5.5 in die Silizium-Nanopartikel, und die Cy5.5-SiNPs zeigten charakteristische Fluoreszenz (Abbildung 1D). Die erfolgreiche Farbkonjugation wurde durch das Photolumineszenzspektrum weiter bestätigt. Außerdem war die Quantenausbeute (QY) der Cy5,5-SiNPs (φ = 0,31) vergleichbar mit der des freien Cy5,5-Farbstoffs (φ = 0,23)36.

Zur Bewertung der Biokompatibilität von Nanopartikeln wurden 12Z-endometriale Epithelzellen über Nacht mit Cy5,5-SiNPs in DMEM bei 37 °C bei 5 % CO₂ inkubiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde mit einem MTT-Test nach Behandlung mit Nanopartikelkonzentrationen von 0, 0,5, 1, 2,5, 5 und 10 μg/mL bewertet (Abbildung 1E). Bei Konzentrationen bis zu 10 μg/mL wurde keine Zytotoxizität beobachtet. Zellen, die mit 5 μg/mL Cy5.5-SiNPs inkubiert wurden, zeigten eine effiziente Nanopartikelaufnahme, wobei die Fluoreszenzmikroskopie die Partikellokalisierung im perinuklearen Bereich zeigte (Abbildung 1F). Im Gegensatz dazu wurde in unbehandelten Kontrollzellen keine Cy5.5-Fluoreszenz nachgewiesen. Die vorbereiteten Cy5.5-SiNPs zeigten ebenfalls wässrige Stabilität mit hydrodynamischen Durchmessern von 170–190 nm in deionisiertem Wasser und einer stabilen Fluoreszenzintensität für sieben Tage, wie durch DLS bzw. Fluoreszenzbildgebung bestimmt (Abbildung 1G, H).

Um die Eignung von Cy5.5-farbstoffdotierten Silizium-Nanopartikeln für die ex vivo Gewebekennzeichnung festzustellen, wurden ihre Fluoreszenzeigenschaften vor der Endometriose-Einleitung validiert. Die IVIS-Bildgebung zeigte eine robuste Fluoreszenzemission der Nanopartikelsuspensionen, während in der negativen Kontrolle kein nachweisbares Fluoreszenzsignal nur mit Wasser beobachtet wurde, was die Spezifität und Empfindlichkeit der Cy5.5-Fluoreszenzdetektion bestätigt (Abbildung 2).

Die Konzentration und Inkubationszeit für die ex-vivo-Markierung von Gebärmuttergewebefragmenten wurden anschließend optimiert. Fluoreszenz wurde in Gebärmuttergewebefragmenten nachgewiesen, die mit 20 % (v/v) Cy5,5-farbstoffdotierten Siliziumnanopartikeln für 3 Stunden bei 37 °C bei 5 %CO235 inkubiert wurden. Die IVIS-Bildgebung bestätigte starke und konsistente Fluoreszenzsignale von den markierten Gewebefragmenten. Diese Ergebnisse zeigen, dass mit Cy5.5-Farbstoff dotierte Silizium-Nanopartikel Gebärmuttergewebefragmente effizient ohne genetische Modifikation markieren (Abbildung 3).

Die Fähigkeit von Cy5.5-Stoffstoff-dotierten Silika-Nanopartikel-Gewebefragmenten, Uterusgewebefragmente zu induzieren und die Läsionenidentifikation zu erleichtern, wurde anschließendgetestet 35. Markierte Gewebefragmente wurden in die Peritonealhöhle der Empfängermäuse injiziert, und der Krankheitsverlauf wurde einen Monat lang überwacht. Am experimentellen Endpunkt wurden endometriotische Läsionen innerhalb der Peritonealhöhle leicht erkannt. Cy5.5-positive Läsionen wurden durch IVIS-Bildaufnahme und Fluoreszenzmikroskopie klar von den umgebenden Wirtsgeweben unterschieden, was eine schnelle und eindeutige Läsionsidentifikation ermöglichte. Die Cy5.5-Fluoreszenz innerhalb der Läsionen wurde durch eine Fluoreszenzmikroskopie weiter bestätigt.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die ex vivo Markierung mit Cy5.5-farbstoffdotierten Silizium-Nanopartikeln die erfolgreiche Induktion der Endometriose unterstützt und eine zuverlässige Sichtbarkeit endometriotischer Läsionen in vivo ermöglicht (Abbildung 4).

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Abbildung 1: Physikalische Charakterisierung von Cy5.5-farbstoffdotierten Siliziumnanopartikeln (Cy5.5-SiNPs). (A) Repräsentatives Transmissionselektronenmikroskopiebild (TEM) von Cy5.5-SiNPs. Teilchendurchmesser = 156,67 ± 15,23 nm. Skala = 100 nm. (B) Dynamische Lichtstreuungsmessungen (DLS) der hydrodynamischen Durchmesser von SiNPs (130,67 ± 3,20 nm, PDI = 0,152 ± 0,009) und Cy5,5-SiNPs (185,9 ± 5,44 nm, PDI = 0,14 ± 0,009). (C) Zeta-Potentialmessungen von SiNPs (−32,39 ± 3,55 mV) und Cy5,5-SiNPs (−50,53 ± 2,47 mV), was den Rückgang des Zeta-Potentials nach der Cy5.5-Konjugation zeigt. (D) Fluoreszenzprofil von Cy5,5-SiNPs (Anregungswellenlänge = 680 nm; Emissionswellenlänge = 710 nm). Eingelegt: Hellfeld- und Fluoreszenzbilder von Cy5.5-SiNPs, die im Wasser verteilt sind. (E) MTT-Zellviabilitätstest von 12Z-Zellen, behandelt mit Cy5,5-SiNPs bei Konzentrationen von 0, 0,5, 1, 2,5, 5 und 10 μg/mL. (F) Zelluläre Aufnahme von Cy5.5-SiNPs durch 12Z-Zellen. Die Zellen wurden mit PBS (Kontroll) oder Cy5.5-SiNPs behandelt. Blau = DAPI; red = Cy5.5-SiNPs. Scale Bar = 200 μm. (G) Größenstabilität von Cy5,5-SiNPs, die 7 Tage lang im Wasser gelagert wurden, wobei keine signifikante Veränderung des hydrodynamischen Durchmessers gezeigt wurde. (H) Fluoreszenzstabilität von Cy5.5-SiNPs, die 7 Tage lang in Wasser gelagert werden, wobei keine signifikante Änderung der Fluoreszenzintensität gezeigt wird. Einlage: Repräsentative Fluoreszenzbilder, aufgenommen an den Tagen 1, 3 und 6. NS = nicht signifikant. Die Werte werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Bestätigung von Cy5.5-farbstoffdotierten Siliziumnanopartikeln. (A) Repräsentatives Bild von Cy5.5-farbstoffdotierten Siliziumnanopartikeln. (B) Nachweis von Cy5.5-Fluoreszenz aus Cy5.5-farbstoffdotierten Siliziumnanopartikeln mittels IVIS-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Ex-vivo-Kennzeichnung von Gebärmuttergewebefragmenten mit Cy5.5-Farbstoff-dotierten Siliziumnanopartikeln. Das linke Panel zeigt unbehandelte kontrollierte Gebärmuttergewebefragmente, das rechte Panel zeigt Gebärmuttergewebefragmente, die mit Cy5.5-Farbstoff-dotierten Siliziumnanopartikeln gekennzeichnet sind. Die Fluoreszenz von Cy5.5 wurde mittels IVIS-Bildgebung nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Nachweis endometriotischer Läsionen, markiert mit Cy5.5-Farbstoff-dotierten Siliziumnanopartikeln. (A) IVIS-Bild der Peritonealhöhle. (B) Die Fluoreszenzmikroskopie von Cy5.5-markierten endometriotischen Läsionen ermöglicht eine klare Bestimmung innerhalb der Peritonealhöhle. (C) Repräsentative Fluoreszenzmikroskopiebilder von endometriotischen Läsionen. Gelbe Fluoreszenz zeigt das Cy5.5-Signal an, und die Kerne wurden mit DAPI gegenfärbt. (D) Repräsentatives Bild einer endometriotischen Läsion. Der Pfeil zeigt Cy5,5-farbstoffdotierte Siliziumnanopartikel an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Die vorliegende Studie stellt einen Cy5.5-Farbstoff-dotierten, silizium-Nanopartikel-basierten Ansatz als praktische und effiziente Methode zur Visualisierung endometriotischer Läsionen in Mausmodellen35 vor. Diese Strategie bietet mehrere Vorteile, darunter ihre Einfachheit, Flexibilität und nicht-genetische Natur, sodass transgene Reporter-Tiere nicht mehr erzeugt werden müssen. Im Vergleich zu herkömmlichen Visualisierungsansätzen, wie fluoreszierenden Reporter-Mausmodellen, reduziert diese Methode die technische Komplexität bei einer robusten Kennzeichnungseffizienz und erweitert so ihre Zugänglichkeit für die Endometrioseforschung. Darüber hinaus bieten Silizium-Nanopartikel eine stabile Plattform zur Einbindung fluoreszierender Farbstoffe und deren effiziente Bindung im Gewebe, wodurch die Identifikation einer reproduzierbaren Läsion unterstützt wird.

Die Unterscheidung endometriotischer Läsionen vom umgebenden Wirtsgewebe ist für die Untersuchung des Krankheitsinitiators und -verlaufs in Mausmodellen unerlässlich. Rosa26mTmG-Reportermäuse exprimieren allgegenwärtig ein membranzielgerichtetes Tandem-Dimer Tomaten-fluoreszierendes Protein (mT), das nach Cre-vermittelter Exzision in spezifischen Zielgewebenin membranzielorientiertes grünes fluoreszierendes Protein (mG) umgewandelt wird. Obwohl zahlreiche transgene Mausmodelle zur Untersuchung der Genfunktion bei Endometriose verfügbar sind, ist die Erzeugung fluoreszierender Reportertiere arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Im Gegensatz dazu bietet die ex-vivo-Markierung mit Cy5.5-farbstoffdotierten Siliziumnanopartikeln eine schnelle, flexible und nicht-genetische Alternative zur Läsionsvisualisierung, während sie mit einer Vielzahl bestehender Mausmodelle kompatibel bleibt.

Eine erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls hängt von einer sorgfältigen Kontrolle mehrerer kritischer experimenteller Parameter ab. Während der Nanopartikelsynthese beeinflussen Katalysatorkonzentration, Lösungsmittelzusammensetzung, TEOS-Additionsrate, Mischbedingungen und Wascheffizienz direkt die Partikelgröße, die Fluoreszenzintensität und die Reproduzierbarkeit der Markierung. Die Stöber-Methode bietet einen einfachen, skalierbaren und reproduzierbaren Ansatz zur Synthese von fluoreszierenden Silizium-Nanopartikeln mit präziser Kontrolle über die Partikelgröße und stabile Farbstoffinkorporation 38,39,40,41. Im Vergleich zu Reverse-Mikroemulsionsmethoden minimiert der Stöber-Ansatz die mit dem Tensid verbundenen Reinigungsherausforderungen, während die Cy5.5-Fluoreszenz unter milden Reaktionsbedingungenerhalten bleibt 39,40,41,42. Eine Erhöhung der Katalysatorkonzentration erhöht in der Regel die Partikelgröße40, während eine schnellere TEOS-Additionsrate die Nukleation fördert, was zu kleineren Partikeln41 führt. Eine gründliche Wäsche ist unerlässlich, um nicht reagierte Reagenzien zu entfernen und die Stabilität der Nanopartikel während der Lagerung zu verbessern.

Mehrere weitere Faktoren sind wichtig, um eine reproduzierbare ex vivo Gewebemarkierung und Läsionenbildung zu erreichen. Gleichmäßige Gebärmuttergewebefragmentgröße, homogene Nanopartikelverteilung und konstante Inkubationsbedingungen verbessern die Markierungseffizienz und verringern die experimentelle Variabilität. Die parallele Verarbeitung unmarkierter Kontrollgewebe ist ebenfalls unerlässlich, um echte Cy5.5-Fluoreszenz von Gewebeautofluoreszenz und unspezifischen Hintergrundsignalen zu unterscheiden. Während der Läsionseinleitung minimieren konsequente hormonelle Priming von Spendermäusen, sanfte Einnistung markierter Gewebefragmente und angemessene postoperative Pflege Gewebetraumata und unspezifische Entzündungen und verbessern so die Reproduzierbarkeit der Läsionenbildung.

Trotz dieser Vorteile sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. Die Persistenz und Stabilität des Fluoreszenzsignals in vivo können nach der Einnistung aufgrund von Geweberemodellierung, zellulärer Proliferation und immunvermittelter Clearance variieren. Als exogenes fluoreszierendes Label wird erwartet, dass das Cy5.5-Signal mit der Teilung der markierten Zellen allmählich abnimmt, was die Machbarkeit langfristiger Längsschnittstudien einschränken könnte. Darüber hinaus kann die Variabilität in der Gewebevorbereitung und der Aufnahme von Nanopartikeln die Markierungseffizienz zwischen den Experimenten beeinflussen, was die Bedeutung standardisierter experimenteller Verfahren unterstreicht.

Obwohl sich die vorliegende Studie auf die ex vivo Läsionenerkennung konzentriert, ist Cy5.5 ein weit-rot/naheinfraroter (NIR) fluoreszierender Farbstoff, der die Autofluoreszenz des Gewebes minimiert und eine tiefere Penetration von Photonen ermöglicht. Diese optischen Eigenschaften machen Cy5.5 gut geeignet für In-vivo-Bildgebungsanwendungen. Dementsprechend bietet die hochquantenreiche Cy5.5-Farbstoff-dotierte Silizium-Nanopartikel-Labeling-Strategie eine robuste Grundlage für nicht-invasive longitudinale Läsionen mittels NIR-Fluoreszenz und photoakustischer Bildgebung43,44.

Künftige Studien sollten sich darauf konzentrieren, die Fluoreszenzbeständigkeit zu verbessern und die Konsistenz der Markierung unter experimentellen Bedingungen weiter zu optimieren. Eine systematische Evaluation der Signalretention wird helfen, das optimale Bildgebungsfenster für Längsstudien zu definieren, während die fortgesetzte Verfeinerung von Nanopartikel-Design- und Markierungsbedingungen die Sensitivität erhöhen und die Anwendbarkeit dieses Ansatzes auf andere Krankheitsmodelle erweitern kann. Insgesamt bietet diese nanopartikelbasierte Strategie eine schnelle, reproduzierbare und vielseitige Alternative zu genetischen Markierungsmethoden zur Visualisierung endometriotischer Läsionen und sollte mechanistische Studien sowie die präklinische Bewertung diagnostischer und therapeutischer Strategien erleichtern.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) unterstützt (R01HD108895 an T.K. und J.W.J.).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES)Sigma-Aldrich440140Reinheit ≥99%
17β-EstradiolMilliporeSigmaE8875Reinheit ≥98%
AmmoniumhydroxidFisher ScientificA669S-50028%ige Ammoniumhydroxidlösung
BD Autoclip WundverschlusssystemBD427631Chirurgische Wundclips
Klare GlasgewindevialFisherbrandFS60910A-311,1 ml klare Glasvial
Cy5,5 NHS-EsterSigma-AldrichGEPA15502Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff
Ethanol, absolutFisher ScientificBP2818Molekularbiologie-Qualität
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco16000044Zellkultur-Ergänzung
HochgeschwindigkeitszentrifugeBeckman Coulter Life SciencesAvanti J-EHochgeschwindigkeitszentrifuge
In-vivo-BildgebungssystemPerkinElmerIVIS SpectrumFluoreszenz-Bildgebungssystem
IsofluranBaxterNDC1001-9-360-60Inhalationsanästhetikum
MagnetrührerFisherbrand14-513-648 mm
MagnetrührplatteChelmsfordSP88854200Variable Geschwindigkeit Magnetrührer
KühlzentrifugeEppendorf5427 RAusgestattet mit FA-45-48-11 Rotor
RPMI-1640-MediumGibco11835-030Zellkulturmedium
SesamölMilliporeSigmaS3547Vehikel für Estradiol-Zubereitung
Tetraethylorthosilikat (TEOS)Sigma-Aldrich86578Reinheit ≥99%
Triethylamin (TEA)Sigma-AldrichT0886Reinheit ≥99%
UltraschallbadFisherbrandCPX1800HFür Nanopartikel-Dispergierung durch Ultraschall

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