Demonstration der Targeting des fluoreszierenden Peptidylinhibitors auf mitochondriale ClpXP mittels Fluoreszenzmikroskopie in Säugetierzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll etabliert einen quantitativen Bildablauf, der die Anwendung einer konfokalen Mikroskopie zur Überwachung der selektiven Lokalisierung des fluoreszierenden Peptidyl-ClpP-Inhibitors FAM-FAPAL-CMK (Carboxyfluorescein-FAPAL-Chlormethylketon) in die Mitochondrien zur Zielsetzung von ClpP sowie die anschließenden morphologischen Veränderungen der Mitochondrien intakter Zellen durch ClpP-Hemmung umfasst.

Zusammenfassung

Mitochondriale ATP-abhängige Proteasen sind essenziell für die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase durch den Abbau beschädigter oder fehlgefalteter Proteine. Unter diesen befindet sich der ClpXP-Proteasekomplex in der mitochondrialen Matrix und trägt zur Qualitätskontrolle der mitochondrialen Substanz unter physiologischen und Stressbedingungen bei. Diese Arbeit demonstriert einen quantitativen Fluoreszenzmikroskopie-Workflow, um die mitochondriale Zielsetzung des fluoreszierenden Peptidylinhibitors FAM-FAPAL-CMK zu bewerten und mitochondriale morphologische Veränderungen im Zusammenhang mit ClpXP-Hemmung in Säugetierzellen zu bewerten. HeLa-Zellen wurden mit FAM-FAPAL-CMK behandelt und mittels konfokaler Mikroskopie in Kombination mit Immunfluoreszenzfärbung mitochondrialer Marker und quantitativer Bildanalyse analysiert. Kolokalisationsanalysen mit Costes-Schwellenwert und Manders-Überlappungskoeffizienten zeigten mitochondriale Anreicherungen des Inhibitorsignals. Infolgedessen veränderte die Hemmung von ClpP die mitochondriale Morphologie. Die Immunoblot-Analyse zeigte keine signifikante Veränderung der ClpP-Proteinhäufigkeit bei der Inhibitorbehandlung. Zusammengenommen beschreibt diese Arbeit einen reproduzierbaren, bildgebenden Workflow, der die Abfrage der mitochondrialen ClpXP-Funktionen in intakten Zellen als Reaktion auf Störungen der Homöostase, wie zum Beispiel oxidativen Stress, ermöglicht.

Einleitung

Mitochondriale ATP-abhängige Proteasen sind zentral für die Proteinhomöostase und bauen fehlgefaltete oder beschädigte Proteine^ab 1,2,3,4,5,6. Dazu gehört ClpXP ein hetero-oligomer AAA+-Proteasekomplex, der sich in der mitochondrialen Matrix befindet. Die ClpX-ATPase erkennt und entfaltet Proteine und translokiert sie dann in die ClpP-proteolytische Kammer ^7,8,9. Zusammen mit anderen mitochondrialen Proteasen sorgt ClpXP für die Proteinqualitätskontrolle sowohl unter normalen als auch unter Stressbedingungen, einschließlich oxidativem Stress und metabolischen Störungen ^1,2,4. Die Störung der mitochondrialen Proteinhomöostase wurde mit Krankheiten wie Neurodegeneration und Krebs in Verbindung gebracht, was die Bedeutung des Verständnisses dieser Proteaseaktivitäten in intakten zellulären Systemen unterstreicht ^3,6,10.

Eine große Herausforderung auf diesem Gebiet ist das Fehlen von Methoden, um die Aktivität mitochondrialer Protease direkt mit räumlicher Auflösung in intakten Zellen zu überwachen. Bestehende Ansätze basieren hauptsächlich auf biochemischen Tests mit gereinigten Proteinen oder Zelllysaten, die detaillierte kinetische Informationen liefern, aber den subzellulären^{Kontext nicht erhalten.} Chemische biologische Strategien haben diese Einschränkung teilweise durch die Entwicklung fluorogener Peptidsubstrate und aktiv-ortsgerichtete Inhibitoren behoben. Fluoreszierende Peptidylsubstrate ermöglichen die quantitative Messung der ATP-abhängigen Peptidase-Aktivität, während Peptidylinhibitoren reversible kovalente Wechselwirkungen mit der proteolytischen Stelle bilden, um eine selektive Hemmung^{zu erreichen.} Zuvor wurde gezeigt, dass der laborsynthetisierte ClpXP-Inhibitor FAPAL-CMK eine kovalente Bindung mit ClpP²⁰ eingeht. In dieser Studie wurde FAM-FAPAL-CMK, ein fluorescein-markiertes Derivat von FAPAL-CMK, als mechanismusbasierter Inhibitor von ClpP entwickelt, der die Visualisierung seiner intrazellulären Lokalisation ermöglicht.

Im Vergleich zu biochemischen Tests ermöglicht die konfokale Fluoreszenzmikroskopie räumlich aufgelöste Beurteilung der Sondenverteilung und mitochondrialen Morphologie in intakten Zellen, wodurch Informationen geliefert werden, die nicht allein aus Lysaten gewonnen werden können. Im Gegensatz zu enzymatischen Tests misst die Fluoreszenzlokalisierung jedoch nicht direkt die katalytische Aktivität oder molekulare Bindungsereignisse und kann durch die Effizienz der Sondenaufnahme, mitochondriale Dynamik und bildgebende Bedingungen beeinflusst werden. Darüber hinaus hängt eine erfolgreiche Umsetzung von einer ausreichenden Probeakkumulation und ausreichend aufgelösten mitochondrialen Netzwerken ab, was diesen Arbeitsablauf am besten für adhärente kultivierte Zellen mit klar unterscheidbarer mitochondrialer Morphologie macht.

Ziel dieser Studie ist es, einen quantitativen Arbeitsablauf zu etablieren, der mechanismenbasierte fluoreszierende Sonden mit der Konfokalmikroskopie integriert, um die Lokalisierung und Funktion der mitochondrialen Protease in intakten Zellen zu überwachen. Durch die Kombination selektiver chemischer Sonden mit hochauflösender konfokaler Bildgebung ermöglicht dieser Arbeitsablauf die Bewertung der mitochondrialen Lokalisation, der Sondenverteilung und morphologischer Reaktionen auf Störungen der mitochondrialen Homöostase in intakten Zellen. Es kann die bestehenden biochemischen Assays ergänzen, die die Proteaseaktivität direkt messen, aber keine räumliche Auflösung haben.

Protokoll

Die Experimente wurden mit kommerziell erhältlichen HeLa-Zellen durchgeführt. Es wurden weder menschliche Teilnehmer, Wirbeltiere noch primäre biologische Materialien aus Menschen oder Wirbeltieren verwendet. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellkultur und Behandlung

1. Kultur der HeLa-Zellen im Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2.
2. Plattenzellen auf sterile Glasabdeckfolien und 24 Stunden inkubieren, um eine Zellanheftung zu ermöglichen.
3. Lösen Sie den Inhibitor FAM-FAPAL-CMK in DMSO auf, um einen 50 μM Vorrat vorzubereiten, und frieren Sie bei -20 °C zur Lagerung ein.
4. Fügen Sie dem Zellwachstumsmedium in den behandelten Zellproben 50 nM FAM-FAPAL-CMK hinzu.
5. Fügen Sie ein gleiches Volumen DMSO hinzu, um die Kontrollproben zu kontrollieren, damit die endgültige Lösungsmittelkonzentration der inhibitorbehandelten Proben entspricht, um sicherzustellen, dass keine Effekte durch DMSO verursacht werden.
6. Inkubieren Sie die Zellen weitere 18 Stunden unter denselben Kulturbedingungen vor der nachgelagerten Verarbeitung.
   Hinweis: Der FAM-FAPAL-CMK-Inhibitor ist im Labor entworfen und synthetisiert, und die Synthesemethode wurde bereits^{zuvor berichtet 20}.

2. Fixierung und Permeabilisierung

1. Wasche die Zellen 5 Minuten lang mit vorgewärmtem D-PBS und wiederhole das einmal.
2. Fixieren Sie die Zellen für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit einem PHEM-Puffer (68 mM ROHRE, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mM MgCl₂, pH 6,9), der 2,4 % (v/v) Formaldehyd, 0,05 % (v/v) Glutaraldehyd und 0,5 % (w/v) Saponin enthält.
3. Bereiten Sie frische Natriumborhydridlösung (5 mg/mL in D-PBS) vor.
4. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang in der Natriumborhydridlösung bei Raumtemperatur, um das Restglutaraldehyd zu neutralisieren.
5. Spülen Sie die Zellen dreimal mit D-PBS jeweils 5 Minuten aus, bevor Sie die Färbung beginnen.
   HINWEIS: Formaldehyd und Glutaraldehyd sind toxische Fixieren. Führen Sie Fixierungsschritte in der Kapuze durch und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Laborkittel und Augenschutz). Natriumborhydrid ist ein reaktives Reduktionsmittel und sollte vorsichtig behandelt werden. Der PHEM-basierte Fixationspuffer mit Formaldehyd, Glutaraldehyd und Saponin wurde ausgewählt, um die mitochondriale Morphologie zu erhalten und gleichzeitig die Antigenzugänglichkeit während der Immunfärbung zu erhalten. Formaldehyd und Glutaraldehyd sorgen für Proteinvernetzung zur strukturellen Erhaltung, während die Pufferzusammensetzung und der pH-Wert von PHEM helfen, die mitochondriale Ultrastruktur²¹ zu stabilisieren. Saponin erleichtert die Membranpermeabilisierung, um die Geschwindigkeit der fixativen Penetration zu verbessern. Diese Fixierungsstrategie minimiert Verzerrungen der mitochondrialen Netzwerke und eignet sich besonders gut für die quantitative Analyse der mitochondrialen Morphologie.

3. Immunfluoreszenzfärbung

1. Blockzellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur in einem Blockpuffer, der 3 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) mit 0,1 % (v/v) Triton X-100 enthält.
2. Inkubieren Sie Zellen mit primären Antikörpern, die im Blockpuffer verdünnt sind, für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Verwenden Sie Maus-Anti-TOMM20 (1:500) und Kaninchen-Anti-ClpP (1:500).
3. Waschen Sie die Zellen jeweils 5 Minuten lang mit PBS, um ungebundene primäre Antikörper zu entfernen.
4. Inkubieren Sie Zellen mit sekundären Antikörpern, die im Blockpuffer verdünnt werden, für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Verwenden Sie CF405S-konjugierte Maus-Sekundärantikörper (1:500) und Alexa Fluor 647-konjugierte Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500).
5. Schützen Sie Proben vor Licht während und nach der sekundären Antikörperinkubation.
6. Wiederholen Sie Schritt 3.3.
7. Montiere Deckfolien mit Montagemedium auf Glasrutschen.
   HINWEIS: ClpP und TOMM20 wurden unter 405 nm und 647 nm visualisiert, um spektrale Überschneidungen mit FAM-Signalen zu vermeiden.

4. Bildaufnahme

1. Aufnahme von Bildern mit einem konfokalen Laser-Rastermikroskop, das mit einem Ölimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur ausgestattet ist.
2. Zünden Sie Fluorophore mit 405 nm und 633 nm Laserleitungen. Verwenden Sie geeignete dichroische Strahlteiler, um Anregungslicht zu reflektieren und die emittierte Fluoreszenz an die Detektoren zu übertragen.
3. Stellen Sie die Pixelgröße auf 35,3 nm (X, Y) und den Z-Schritt auf 0,1 μm ein, um eine ausreichende axiale Abtastung mitochondrialer Strukturen sicherzustellen.
4. Nehmen Sie Bilder mit einer Bildgröße von 1900 x 1900 Pixeln (X, Y) auf und sammeln Sie 5 optische Abschnitte pro Z-Stack, beginnend am oberen mitochondrialen Signal und endend unterhalb des mitochondrialen Signals, um sicherzustellen, dass das vorherrschende mitochondriale Signal erfasst wird.
   HINWEIS: Repräsentative Mikroskopaufnahme-Einstellungen sind in ergänzender Abbildung 1 aufgeführt. Für HeLa-Zellen sind Mitochondrien typischerweise dünne, röhrenförmige Strukturen mit etwa 0,5–1 μm Durchmesser²². Ein 0,5 μm Z-Volumen reicht also aus, um einen erheblichen Anteil der einzelnen mitochondrialen Matrix abzufangen, aber nicht unbedingt die gesamte Zelle. Ein 5-Sektion-Z-Stack wurde ausgewählt, um ausreichende Probenahme mitochondrialer Strukturen mit schneller Bildaufnahme auszubalancieren und bewegungsbedingte Artefakte während der Zellbildgebung zu minimieren.

5. Lebendzellbehandlung und Bildgebung

1. Kultivieren Sie HeLa-Zellen auf 35-mm-Glasbodenschalen in DMEM mit 10 % FBS bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2.
2. Fügen Sie Zellen 24 Stunden nach der Aussäung einen Inhibitor (Endkonzentration: 50 nM) oder ein gleichwertiges Volumen DMSO hinzu. Zellen werden weitere 18 Stunden unter Standardkulturbedingungen inkubiert.
3. Entferne das Kulturmedium, das den Inhibitor oder DMSO enthält, und spüle die Zellen einmal mit vorgewärmtem D-PBS für 5 Minuten aus.
4. Fügen Sie eine Live-Cell-Bildgebungslösung mit 20 nM MitoTracker DeepRed hinzu.
5. Führen Sie Live-Cell-Bildgebung bei Raumtemperatur mit denselben oben beschriebenen Mikroskopeinstellungen durch. Aufnahme von Bildern im Pro-Frame-Scan-Modus mit etwa 4,72 s pro optischer Schnitt (insgesamt etwa 24 s pro 5-Abschnitts Z-Stack).
   HINWEIS: Fünf optische Abschnitte pro Z-Stack sind so eingestellt, dass sie eine ausreichende Probenahme mitochondrialer Strukturen mit handhabbaren Aufnahmezeiten ausbalancieren. Zusätzlich wird eine Raumtemperatur-Living-Cell-Bildgebungslösung verwendet, um die mitochondriale Beweglichkeit im Vergleich zur Bildgebung bei 37 °C zu reduzieren. Obwohl mitochondriale Bewegungen während der Lebendzellbildgebung weiterhin zur Variabilität der Kolokalisationsmessungen beitragen können, helfen konsistente Aufnahmebedingungen über alle Proben hinweg zur Verringerung systematischer Verzerrung. Repräsentative Softwareeinstellungen sind in ergänzender Abbildung 2 dargestellt.

6. Analyse der mitochondrialen Morphologie

1. Öffnen Sie Bilddateien in Fiji²³ und erzeugen Sie Projektionen mit maximaler Intensität aus Z-Stacks, indem Sie Image → Stacks → Z-Projekt auswählen und Max Intensity auswählen.
2. Wenden Sie die Otsu-Schwellenwertmethode an, indem Sie zu Bild → → Schwellenwert anpassen navigieren und Otsu aus den Schwellenwertoptionen auswählen. Wenden Sie die Schwelle auf Mitochondrien an.
3. Führe das Mitochondria Analyzer-Plugin²⁴ aus und wähle den 2D-Analysemodus pro mito aus.
4. Messe die Größe (Fläche) und den Umfang der Mitochondrien mit dem Mitochondrien-Analysator-Output.
5. Erhalten Sie die mitochondrialen Formfaktorwerte direkt aus dem Mitochondria-Analyzer-Output, wobei der Formfaktor als P²/(4πA) berechnet wird, wobei P den Umfang und A die Fläche darstellt.
6. Missen Sie die gesamte Zweiglänge pro Mitochondrien mithilfe der Netzwerkanalysefunktion innerhalb des Plugins, um die mitochondriale Konnektivität zu bewerten.
7. Präsentieren Sie die Daten als Verteilungen einzelner mitochondrialer Messungen zusammen mit Mittelwerten, die aus 30 Zellen pro Bedingung über drei unabhängige biologische Replikate abgeleitet werden.
8. Bewerten Sie die statistische Signifikanz mit Welchs t-Test in einer Statistikanalyse-Software.

7. Kolokalisationsanalyse

1. Öffnen Sie Bilddateien in Fidschi und erzeugen Sie maximalintensive 2D-Projektionen aus 3D-Bildstapeln. Zur Konsistenz analysieren Sie alle Proben mit derselben Prognose- und Erfassungsstrategie.
2. Spalte Fluoreszenzkanäle, indem du Bild → Farbe → Split-Kanäle auswählst.
3. Starten Sie das Coloc 2 Plugin, indem Sie Plugins → Colocalization → Coloc 2 auswählen.
4. Weisen Sie die entsprechenden Kanäle für die Analyse zu und aktivieren Sie die Costes-Schwellenwertregression in den Plugin-Einstellungen. Führe die Analyse pro Zelle durch.
5. Zeichnen Sie die Überlappungskoeffizienten von Manders (M1 und M2) auf, um den Anteil des Signals in jedem Kanal zu bestimmen, der räumlich mit dem anderen zusammenfällt.
6. Aktivieren Sie die Costes-Randomisierung in den Coloc-2-Einstellungen und setzen Sie die Anzahl der Randomisierungen auf 50, um die statistische Signifikansbestimmung zu bewerten.

8. Zelllysatgenerierung

1. Säen Sie HeLa-Zellen in DMEM mit 10 % FBS und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2.
2. Fügen Sie den Zellen 24 Stunden nach der Aussaat 50 nM-Inhibitoren oder ein gleichwertiges Volumen DMSO hinzu und inkubieren Sie weitere 18 Stunden unter Standardkulturbedingungen.
3. Entferne das Kulturmedium und spüle die Zellen 5 Minuten lang mit vorgewärmtem D-PBS ab und trypsinisiere sie, um dich zu lösen.
4. Erschrecken Sie die Trypsinisierung mit frischem Zellwachstumsmedium und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorge das Supernatant.
5. Die Zellkugel in D-PBS neu suspendieren und 3 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren, um die Zellen zu waschen. Entsorge das Supernatant.
6. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem vorgekühlten Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 % SDS, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 2 % CHAPS, 10 mM TCEP, 1 mM PMSF, 1x Proteaseinhibitor-Cocktail).
7. Lysate 20 Minuten auf Eis inkubieren und 2 Minuten in einem Eiswasserbad sonizieren, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten.
8. Zentrifuge Lysate bei 13.000 x g, 4 °C für 20 Minuten.
9. Übertragen Sie das freigegebene Supernatant in ein frisches, vorgekühltes Rohr zur nachgeschalteten Analyse.
   HINWEIS: PMSF ist giftig und sollte in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung behandelt werden. SDS ist ein Reizstoff, und die Sonikation erzeugt Wärme und Aerosole. Führen Sie Lyse- und Sonikationsschritte auf Eis durch und befolgen Sie institutionelle Sicherheitsrichtlinien.

9. Bradford-Assay

1. Bereiten Sie eine Reihe von Standardlösungen mit BSA in 0,15 M Natriumchlorid vor. Die Konzentrationen sind: 0, 0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,10 mg/mL.
2. Verdünnen Sie das unbekannte Zelllysat 50- und 100-fach in 0,15 M Natriumchlorid.
3. Die Pipette repliziert jede Standardkurvenlösung und unbekannte Proben zu einer 96-Well-Platte.
4. Fügen Sie jedem Brunnen Bradford-Reagenz hinzu. Für jedes Bohrloch verwenden Sie eine 160 μL Proteinlösung mit 40 μL 5x Bradford-Reagenz (kommerziell erhältlich). Rühren Sie vorsichtig durch Pipetten.
5. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten und messen Sie die Absorption bei 595 nm mit einem Plattenleser.
6. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie BSA-Konzentrationen auf der x-Achse und die gemittelte Absorption bei 595 nm aus Replikationsmessungen auf der y-Achse darstellen.
7. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen der Proben mit der Standardkurve. Multipliziere berechnete Werte mit dem Verdünnungsfaktor, um die ursprüngliche Konzentration zu erhalten.

10. Immunblotting

1. Fülle gleiche Mengen Zelllysat auf ein 12%iges Polyacrylamid-Gel und trenne die Proteine mit SDS-PAGE.
2. Aktivieren Sie die PVDF-Membran, indem Sie sie kurzzeitig in Ethanol eintauchen. Gleiche sowohl die Membran als auch die Blutpapiere im Transferpuffer aus.
3. Proteine werden vom Gel auf eine PVDF-Membran mit einem halbtrockenen Transfersystem übertragen.
4. Blockieren Sie die Membran mit 5 % (w/v) fettfreier Trockenmilch in TBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) bei Zimmertemperatur für 1 Stunde mit sanftem Rühren.
5. Inkubieren Sie die Membran mit dem primären Antikörper, der im Blockpuffer verdünnt wird, bei Raumtemperatur 1 Stunde lang mit sanfter Bewegung. Verwenden Sie Kaninchen-Anti-ClpP (1:2000) und Maus-Anti-Beta-Aktin (ACTB, 1:10.000).
6. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Tween 20, pH 7,6) für 5 Minuten pro Wasch, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
7. Inkubieren Sie die Membran mit HRP-konjugiertem sekundären Antikörper, der im Blockpuffer (1:3000) bei Raumtemperatur verdünnt wird, für 1 Stunde mit sanfter Bewegung.
8. Wiederhole den Waschschritt.
9. Proteinbänder mit chemilumineszenten Detektionsreagenzien nachweisen.

11. Densitometrische Analyse

1. Öffnen Sie das Western-Blot-Bild in Fidschi.
2. Ändern Sie den Bildtyp auf 8-Bit durch Image → Typ → 8-Bit.
3. Subtrahiere den Bildhintergrund durch Prozess → Hintergrund subtrahieren. Überprüfe den Lichthintergrund und stelle den Rolling-Ball-Radius auf 50,0 Pixel ein.
4. Umrunden Sie das Band an der ersten Spur mit dem Rechteck-Werkzeug, wählen Sie →dann Gel analysieren → auswählen erste Spur auswählen.
5. Verschieben Sie das Rechteck-Werkzeug auf die zweite Bahn und wählen Sie → Gel analysieren → die nächste Spur auswählen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Spuren ausgewählt sind.
6. Plotten Sie die Banddichte , indem Sie → Gel → Spuren analysieren.
7. Verwenden Sie das Geradelinien-Werkzeug, um eine Linie am unteren Rand des Banddichte-Peaks zu zeichnen, und verwenden Sie das Wandwerkzeug, um die Banddichte abzulesen.
8. Wiederholen Sie dasselbe Verfahren aus den Schritten 11.1–11.8 auf dem Bild des Ladekontroll-Blots.
9. Berichte die relative Banddichte durch Division der Dichte (ClpP) durch die Dichte (ACTB).

Ergebnisse

ClpP-Hemmung verändert die mitochondriale Morphologie und Netzwerkorganisation
Die mitochondriale Morphologie wurde untersucht, um festzustellen, ob die ClpP-Hemmung die mitochondriale Organisation in HeLa-Zellen verändert. Repräsentative Fluoreszenzbilder zeigten deutliche Unterschiede in der mitochondrialen Organisation zwischen Kontroll- und FAM-FAPAL-CMK-behandelten Zellen (Abbildung 1A). Quantitative Analysen zeigten, dass die mitoch...

Diskussion

Das Peptidylchlormethylketon FAPAL-CMK¹⁵ wurde zuvor als potenzieller irreversibler Inhibitor der Protease-Untereinheit (ClpP) der mitochondrialen ATP-abhängigen Protease ClpXP gezeigt. Während die kinetischen Experimente die Potenz des Inhibitors und den Wirkmechanismus zeigten, konnte der in-vitro-Ansatz die Wirksamkeit von FAPAL-CMK als selektiver mitochondrieller ClpP-Inhibitor in intakten Zellen nicht bewerten. Die fluoreszenzkonfokale Mikroskopie be...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Fluor 647-konjugiertes Kaninchensekundärantikörper	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin Mausantikörper	Proteintech	66009
bovines Serumalbumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP Kaninchen PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete Proteasehemmer-Cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modifiziertes Eagle-Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-konjugiertes Maussekundärantikörper	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Nachweisreagenz	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fötales bovines Serum	R&D Systems	S11550
Glutaraldehyd, 70% Lösung	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-konjugiertes Mausantikörper	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-konjugiertes Kaninchenantikörper	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Lebendzell-Imaging-Lösung	Gibco	A59688DJ
Magnesiumchlorid Hexahydrat	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer-Plugin für Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
Maus-Anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
Paraformaldehyd, 16% Lösung	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Kaliumchlorid	Alfa Aesar	11595
Kaliumphosphat monobasisch	VWR	BDH9268
ProLong Montagemedium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
Saponin	Thermo Scientific	A18820.14
Natriumborhydrid	Thermo Scientific	200050250
Natriumchlorid	VWR	BDH9286
Natriumdeoxycholat	Sigma	D6750
Natriumdodecylsulfat	VWR	0227
Natriumphosphat dibasisch	AMERSCO	0348
Softwarename	Versionsinformationen
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3