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Forschungsartikel

Clopidogrel-induzierte Schädigung der Magenschleimhaut im Zusammenhang mit Stress des endoplasmatischen Retikulums bei Ratten

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DOI:

10.3791/72097

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28. August 2026

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1Gastroenterology Department, Dagang Hospital of Binhai New Area, 2Clinical Laboratory, Tianjin Adicon Clinical Laboratories Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht Schäden an der Magenschleimhaut im Zusammenhang mit der Behandlung mit Clopidogrel bei Ratten und Magenepithelzellen und betont deren Verbindung mit molekularen Veränderungen, die auf Stress im endoplasmatischen Retikulum zurückzuführen sind, sowie mit Apoptose und systemischer Entzündung.

Zusammenfassung

Clopidogrel wird häufig als Thrombozytenaggregationshemmer zur Prävention und Behandlung arterieller thrombotischer Erkrankungen eingesetzt, jedoch können gastrointestinale Nebenwirkungen wie Schädigungen der Magenschleimhaut die klinische Anwendung einschränken. Da das Überleben epithelialer Zellen für die Aufrechterhaltung der Integrität der Magenschleimhaut entscheidend ist, vermuteten wir, dass eine durch Clopidogrel verursachte Schädigung des Magenepithels mit Veränderungen bei Markern des endoplasmatischen Retikulums (ER)-Stresses und der Apoptose einhergeht. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden humane Magenepithelzellen des Typs GES-1 mit verschiedenen Konzentrationen von Clopidogrel behandelt, und die Zellviabilität, Apoptose, Zellzyklusverteilung sowie molekulare Veränderungen wurden mittels des Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assays, der Durchflusszytometrie, der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und der Western-Blot-Analyse evaluiert. Parallel dazu erhielten Sprague-Dawley-Ratten Clopidogrel per Magensonde, um ein in vivo-Modell einer Magenschädigung zu etablieren. Pathologische Veränderungen der Magenschleimhaut wurden mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung beurteilt, und die Konzentrationen entzündungsfördernder Zytokine im Serum wurden mit einem enzymgekoppelten Immunosorbens-Assay (ELISA) gemessen. Clopidogrel verringerte die Viabilität der GES-1-Zellen, förderte die Apoptose und veränderte den Zellzyklusverlauf. Bei den Ratten induzierte Clopidogrel Erosionen, Ödeme und eine Infiltration entzündlicher Zellen in der Magenschleimhaut, begleitet von erhöhten Serumspiegeln von Interleukin (IL)-1β, IL-6 und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α). Clopidogrel erhöhte außerdem die Expression der ER-Stress-Marker C/EBP-homologes Protein (CHOP) und aktivierenden Transkriptionsfaktor 5 (ATF5), steigerte die Expression des Bcl-2-assoziierten X-Proteins (Bax), verringerte die Expression von B-Zell-Lymphom-2 (Bcl-2) und erhöhte das Bax/Bcl-2-Verhältnis sowohl in Magengewebe als auch in GES-1-Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch Clopidogrel verursachte Schädigung der Magenschleimhaut mit einer erhöhten Expression ER-Stress-bezogener Marker und einer Störung des Bax/Bcl-2-Gleichgewichts assoziiert ist, obwohl in dieser Studie kein direkter kausaler ER-Stress–mitochondrialer Apoptoseweg nachgewiesen wurde.

Einleitung

Die angeborenen und adaptiven Immunsysteme der Magenschleimhaut, bestehend aus Epithelzellen, Immunzellen und Signalmolekülen, arbeiten zusammen, um die Schleimhautintegrität aufrechtzuerhalten und fungieren als eine entscheidende physiologische Barriere gegen schädliche Faktoren1,2. Diese Schutzfunktion ist essentiell für die gastrointestinale Homöostase, und ihre Störung kann zur Entstehung von Magenerkrankungen, einschließlich Gastritis, beitragen3. Klinisch ist eine arzneimittelinduzierte Schädigung der Magenschleimhaut eine häufige Komplikation, wobei nichtsteroidale Antirheumatika und Thrombozytenaggregationshemmer zu den häufigsten Ursachen zählen4. Die Integrität der Magenschleimhaut hängt von einem dynamischen Gleichgewicht zwischen Zellproliferation und Apoptose ab5. Eine chronische Exposition gegenüber Umweltfaktoren, einschließlich Medikamente, kann dieses Gleichgewicht stören, die Apoptose fördern und zu einer Schädigung der Schleimhaut führen6,7. Das endoplasmatische Retikulum spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der intrazellulären Homöostase. Unter Bedingungen zellulären Stresses führt die Anhäufung fehlgefalteter oder ungefalteter Proteine zur Aktivierung der Unfolded-Protein-Response, einschließlich der PERK/eIF2α/ATF4/CHOP-Signalübertragung, die die Apoptose fördern und die Expression von B-Zell-Lymphom-2-(Bcl-2)-Familienproteinen verändern kann8. ATF5 ist ebenfalls an mitochondrialen Stressreaktionen und dem Wechselspiel zwischen mitochondrialer Dysfunktion und endoplasmatischem Retikulumstress beteiligt9. Neuere klinische Befunde zeigen, dass eine fortgesetzte Thrombozytenaggregationshemmung, einschließlich Clopidogrel, mit einer progredienten Schädigung der Magen- und Dünndarmschleimhaut assoziiert ist10.

Clopidogrel ist ein weit verbreitetes Antiplättchenmittel, das einer metabolischen Aktivierung bedarf, bevor es irreversibel an die P2Y12-Rezeptoren der Thrombozyten bindet, wodurch die adenosindiphosphatvermittelte Thrombozytenaggregation gehemmt und antithrombotische Wirkungen erzielt werden11. Diese Bioaktivierung erfolgt hauptsächlich über hepatische Cytochrom-P450-Enzyme. Daher bildet die direkte Exposition kultivierter Magenepithelzellen gegenüber dem ursprünglichen Clopidogrel-Molekül den vollständigen metabolischen und pharmakokinetischen Kontext der Clopidogrel-Behandlung in vivo nicht ab. Allerdings deuten zunehmende Hinweise darauf hin, dass die Clopidogrel-Behandlung mit rezidivierenden Magengeschwüren und gastrointestinalen Blutungen assoziiert sein könnte, was die Bedeutung einer ausgewogenen Abwägung zwischen antithrombotischer Wirksamkeit und gastrointestineller Sicherheit unterstreicht12,13,14. Obwohl diese unerwünschten Wirkungen beschrieben wurden, sind die Mechanismen, die der clopidogrelbedingten Schädigung der Magenschleimhaut zugrunde liegen, noch nicht vollständig verstanden, was die Entwicklung gezielter präventiver und therapeutischer Strategien einschränkt. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirkungen von Clopidogrel auf die Magenschleimhaut unter Verwendung von Sprague–Dawley-Ratten und GES-1-Zellen. Die Ratten erhielten Clopidogrel mittels Magensonde, und ergänzende in vitro-Experimente wurden mit GES-1-Zellen durchgeführt. Histopathologische, molekulare und zelluläre Analysen wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob die clopidogrelinduzierte Schädigung der Magenschleimhaut mit endoplasmatischem Stress und Apoptose assoziiert ist. Entsprechend konzentrierte sich die vorliegende Studie darauf, die mit der clopidogrelinduzierten Magenschädigung verbundenen molekularen Veränderungen zu charakterisieren, anstatt einen kausalen Signalweg zu etablieren. Unsere Ergebnisse liefern zusätzliche Einblicke in die molekularen Veränderungen, die mit der clopidogrelinduzierten Schädigung der Magenschleimhaut einhergehen, und könnten zukünftigen Studien zur Prävention und Behandlung dieser unerwünschten Wirkungen dienen.

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Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden von der Versuchstierethik-Kommission von Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. geprüft und genehmigt. Die Studie wurde gemäß den institutionellen Richtlinien für die Haltung und Verwendung von Labor­tieren durchgeführt. Die Genehmigungsnummer des Tierethikgutachtens lautete DRK-20251015210.

Tiere und Zelllinien

Die ethische Genehmigung umfasste die Verwendung von 20 SPF-Ratten der Zuchtlinie Sprague–Dawley. In die vorliegende Studie wurden insgesamt 12 männliche SPF-Ratten der Zuchtlinie Sprague–Dawley eingeschlossen, die zu Versuchsbeginn 6–8 Wochen alt waren und ein Gewicht von 280–300 g aufwiesen. Die Tiere stammten von der Firma Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Hangzhou, China; Produktionslizenznummer SCXK [Zhejiang] 2024-0004) und wurden zufällig auf die Kontroll- und die mit Clopidogrel behandelte Gruppe verteilt, wobei jeweils sechs Tiere pro Gruppe zugewiesen wurden. Die Ratten wurden in einer kontrollierten Umgebung bei etwa 22 °C und einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Wechsel gehalten und hatten freien Zugang zu Standardfutter und sterilisiertem Trinkwasser. Vor Beginn des Experiments durften alle Tiere sich eine Woche lang akklimatisieren. Clopidogrelhydrogensulfat wurde in 0,5 %iger Natriumcarboxymethylcellulose (CMC-Na) suspendiert, mit einer Konzentration von 0,781 mg/mL. Die Ratten der mit Clopidogrel behandelten Gruppe erhielten Clopidogrelhydrogensulfat einmal täglich über einen Zeitraum von drei aufeinanderfolgenden Tagen mittels Magensonde in einer Dosis von 10 mL/kg Körpergewicht (entspricht 1 mL/100 g Körpergewicht und einer Dosis von 7,81 mg/kg). Die Kontrollgruppe erhielt ein äquivalentes Volumen von 0,5 %iger CMC-Na. Die gewählte Dosis und die dreitägige Behandlungsdauer basierten auf einem zuvor beschriebenen Kurzzeitmodell zur oralen Verabreichung von Clopidogrel bei Ratten. Nach der letzten Gabe am Tag 3 wurde den Tieren über einen Zeitraum von 12 h Futter entzogen, während Wasser weiterhin ad libitum zur Verfügung stand. Die Ratten wurden in einer Narkosekammer mit 3 % Isofluran in Sauerstoff anästhesiert; die Aufrechterhaltung der Narkose erfolgte mittels 1,5–2,0 % Isofluran über eine Nasenmaske. Eine ausreichende Narkosetiefe wurde durch das Fehlen des Hornhautreflexes und des Zehe-Reflexes bestätigt. Unter tiefer Narkose wurde Blut durch terminale Herzpunktion entnommen. Während die Tiere weiterhin tief anästhesiert blieben, erfolgte die Tötung durch Aushöhlen (Exsanguination) gefolgt von einer bilateralen Thorakotomie. Der Tod wurde durch das Fehlen von Spontanatmung und Herzaktivität über mindestens 5 min sowie durch das Fehlen des Hornhautreflexes und des Zehe-Reflexes bestätigt. Anschließend wurde der Magen rasch entfernt, entlang der großen Kurvatur eröffnet und vorsichtig mit eiskalter Kochsalzlösung gespült.

Die humane Magenschleimhautepithelzelllinie GES-1 wurde von iCell Bioscience Inc. (Shanghai, China; Kat.-Nr. iCell-h062) bezogen und durch kurze tandemartige Wiederholungsprofilerstellung (short tandem repeat profiling) durch den Lieferanten authentifiziert. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin, in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ kultiviert. Für die Experimente wurden Zellen mit niedriger Passagezahl zwischen der 3. und 10. Passage verwendet. Wenn die Zellkonfluenz etwa 80–90 % erreichte, wurden die Zellen im Spaltverhältnis 1:3 weitergeimpft. Für nachfolgende Experimente wurden Zellen in der logischen Wachstumsphase verwendet. Für den CCK-8-Assay wurden die Zellen in 96-Well-Platten mit 6 × 103 Zellen/Well ausgesät. Für die Apoptose- und Zellzyklusanalysen wurden die Zellen in 6-Well-Platten mit etwa 5 × 105 Zellen/Well ausgesät und vor der Behandlung mit Clopidogrel zur Anheftung zugelassen.

Chemikalien und Lösungen

Clopidogrelhydrogensulfat (Bestellnr. C874834; Reinheit ≥ 99 %) wurde für die Tier- und Zellversuche verwendet. Eine Stammlösung von Clopidogrel wurde hergestellt, indem 100 mg Clopidogrel-Pulver in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst wurden, um eine 1-M-Stammlösung zu erhalten. Vor der Anwendung wurde die Stammlösung auf die erforderlichen Arbeitskonzentrationen verdünnt. Die 1-M-Stammlösung wurde nacheinander mit DMSO verdünnt, um 1000× Dosierungslösungen in Konzentrationen von 10, 100, 200, 400, 600, 800 und 1000 mM. Unmittelbar vor der Behandlung jeweils 1000× Die Dosierungslösung wurde im Verhältnis 1:1000 (V/V) dem vollständigen Kulturmedium zugesetzt, um endgültige Clopidogrel-Konzentrationen von 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 mM zu erreichen. Die Kontrollgruppe erhielt ein gleiches Volumen an DMSO ohne Clopidogrel. Somit betrug die endgültige DMSO-Konzentration in allen Gruppen 0,1 % (V/V). Kultivierte GES-1-Zellen zeigen keine hepatische, cytochrom-P450-vermittelte Bioaktivierung von Clopidogrel. Daher wurde eine direkte Clopidogrel-Behandlung als exploratives Expositionsmodell für die Ausgangssubstanz verwendet. Der Konzentrationsbereich wurde gewählt, um konzentrationsabhängige zelluläre Reaktionen unter den experimentellen Bedingungen zu charakterisieren, und sollte nicht als äquivalent zu klinisch erreichbaren Plasma- oder Magengewebe-Konzentrationen interpretiert werden.

Zellunterkultur

Das komplette Medium wurde hergestellt, indem dem basalen Kulturmedium FBS und Penicillin-Streptomycin zugesetzt wurden. Wenn die Zellkonfluenz etwa 80 % erreichte, wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen dreimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen etwa 1–2 Minuten lang mit einer Trypsin-Ethylenendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung angesäuert. Nach teilweiser Zellablösung wurde das komplette Medium zugegeben, um die Verdauung zu beenden. Die Zellsuspension wurde bei 1.200 × g für 3 Minuten zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes wurde der Zellpellet in 1–2 mL komplettem Medium resuspendiert und gemäß den experimentellen Anforderungen in neue Kulturschalen ausgesät.

CCK-8-Zellviabilitäts-Assay

GES-1-Zellen in der logischen Wachstumsphase wurden mit 6 × 103 Zellen/Vertiefung in 96-Well-Platten ausgesät und über Nacht kultiviert, um die Zelladhärenz zu ermöglichen. Nach der Anheftung wurden die Zellen 24 Stunden lang mit verschiedenen Konzentrationen von Clopidogrel (0, 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 mM) behandelt. Die Kontrollgruppe erhielt die gleiche Endkonzentration des Lösungsmittels. Nach der Behandlung wurde CCK-8-Lösung in jedes Well gegeben und gemäß den Anweisungen des Kits bei 37 °C inkubiert. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Die Zellviabilität wurde als Prozentsatz der Kontrollgruppe berechnet. Basierend auf den Ergebnissen der Konzentrations-Wirkungs-Kurve wurde eine Behandlung mit 0,1 mM Clopidogrel über 24 Stunden für die anschließenden Analysen zur Apoptose, Zellzyklus, qPCR und Western Blot ausgewählt.

Durchflusszytometrie-Analyse

GES-1-Zellen wurden in 6-Loch-Platten ausgesät und nach Zellanheftung 24 h mit 0,1 mM Clopidogrel behandelt. Nach der Behandlung wurden sowohl schwebende als auch adhärente Zellen gesammelt. Die adhärenten Zellen wurden mit Trypsin ohne EDTA aufgelöst, zweimal mit kalter PBS gewaschen und in Bindungspuffer resuspendiert. Die Zellen wurden mit einem Annexin V-FITC/PI-Apoptosekit gemäß den Herstelleranweisungen gefärbt. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln wurden apoptotische Zellen mittels eines RaiseCyte 2L6C-Durchflusszytometers detektiert. Die Daten wurden mit der RaiseFlower-Aufnahmesoftware erfasst und mit der FlowJo-Software (Version 10.8.1) analysiert. Frühapoptotische, spätapoptotische und gesamtapoptotische Zellpopulationen wurden mit der FlowJo-Software quantifiziert.

Durchflusszytometrische Analyse der Zellzyklusverteilung

GES-1-Zellen wurden in 6-Loch-Platten ausgesät und 24 h lang mit 0,1 mM Clopidogrel behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen geerntet, mit PBS gewaschen und in vorgekühltem 70%igem Ethanol bei 4 °C fixiert. Die fixierten Zellen wurden anschließend gewaschen, um restliches Ethanol zu entfernen, und gemäß den Herstelleranweisungen mit RNase A und Propidiumiodid-Färbelösung im Dunkeln inkubiert. Die Verteilung im Zellzyklus wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten wurden mit der Erfassungssoftware erfasst und mit der FlowJo-Software ausgewertet. Die Zellzyklusverteilungen wurden nach dem Watson-Modell angepasst, und die Anteile der Zellen in den Phasen G0/G1, S und G2/M wurden berechnet.

Quantitative Echtzeit-PCR (qPCR)

Die Gesamt-RNA wurde aus GES-1-Zellen und Ratten-Magen-Gewebeproben mithilfe eines RNA-Extraktionskits gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Bei Gewebeproben wurden Magenschleimhautgewebe rasch entnommen, bei tiefen Temperaturen homogenisiert und anschließend der RNA-Extraktion unterzogen. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurden durch Messung der Absorption bei 260 und 280 nm bestimmt. Gleiche Mengen an RNA wurden mit einem Reverse-Transkriptionskit unter Verwendung einer genomischen DNA-Entfernungseinheit in komplementäre DNA (cDNA) zurücktranskribiert. Die quantitative Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung einer auf SYBR Green basierenden PCR-Master-Mix-Lösung durchgeführt. Jede Reaktion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 20 µL, das 10 µL 2× Master-Mix, 1 µL cDNA, 0,4 µL Vorwärtsprimer, 0,4 µL Rückwärtsprimer und 8,2 µL RNase-freies ddH₂O enthielt. Die thermischen Zyklenbedingungen waren wie folgt: eine initiale Denaturierung bei 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 10 s, Annealing bei 60 °C für 30 s und Extension bei 72 °C für 30 s. Die Expressionsmengen von CHOP, ATF5, Bcl-2 und Bax wurden bestimmt. GAPDH diente als interner Referenzgen. Die relative Genexpression wurde nach der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Die Primersequenzen sind in Zusätzliche Tabelle 1 aufgeführt.

Western Blot

Gesamtprotein wurde aus GES-1-Zellen und Ratten-Magen-Gewebeproben extrahiert. Für Zellproben wurden behandelte GES-1-Zellen mit kaltem PBS gewaschen und mit einem Lysepuffer für den Radioimmunpräzipitationstest (RIPA) unter Zusatz eines Proteaseinhibitors lysiert. Für Gewebeproben wurden Magenschleimhautgewebe bei niedriger Temperatur in RIPA-Puffer homogenisiert und anschließend zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. Die Protein-Konzentrationen wurden mithilfe eines BCA-Protein-Assays bestimmt. Pro Bande wurden jeweils 20 µg Protein mittels Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Nach einer Blockierung mit Rinderserumalbumin (BSA) wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000) und β-Aktin (1:5000) inkubiert. Nach dem Waschen erfolgte die Inkubation mit den entsprechenden mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern (1:10000). Die Proteinbanden wurden mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Reagenz sichtbar gemacht und mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem aufgezeichnet. Die Bandenintensitäten wurden mittels Bildanalyse-Software quantifiziert und auf β-Aktin normalisiert.

Histopathologische Bewertung

Magengewebeproben wurden nach der Behandlung mit Clopidogrel von Sprague–Dawley-Ratten gewonnen und in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert. Die Proben wurden dehydriert, gereinigt, in Paraffin eingebettet und in einer Dicke von 4 µm geschnitten. Paraffinschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Histopathologische Veränderungen wurden qualitativ am Lichtmikroskop anhand der Schleimhautmorphologie, epithelialen Integrität, Ödembildung und Entzündungszellinfiltration beurteilt. Repräsentative Bilder wurden aufgenommen. Es wurde kein histologisches Bewertungssystem angewandt.

Immunhistochemie

Paraffin-eingebettete Magengewebsschnitte wurden in Xylol deparaffinisiert und über eine abgestufte Ethanolreihe rehydriert. Die hitzeinduzierte Antigenfreisetzung erfolgte in Zitratpuffer. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde mit 3 % Wasserstoffperoxid für 10 min blockiert, und unspezifische Bindungen wurden mit normalem Ziegenserum für 30 min bei Raumtemperatur blockiert. Die Schnitte wurden anschließend über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen CHOP, ATF5, Bcl-2 und Bax inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit den entsprechenden mit Rettichperoxidase konjugierten sekundären Antikörpern inkubiert. Die immunreaktiven Signale wurden mithilfe einer DAB-Färbung sichtbar gemacht, gefolgt von einer Gegenfärbung mit Hämatoxylin. Die Schnitte wurden dehydriert, geklärt, eingedeckt und unter dem Lichtmikroskop untersucht. Repräsentative Bilder wurden aufgenommen, und der Bereich der positiven Färbung wurde mittels Bildanalyse-Software quantifiziert.

Immunfluoreszenzfärbung

Paraffin-eingebettete Magengewebsschnitte wurden entparaffiniert, rehydriert und einer hitzeinduzierten Antigen-Retrieval-Behandlung in Zitratpuffer unterzogen. Nach der Blockierung mit normalem Ziegenserum für 30 min wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) und Bax (1:200) inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS erfolgte die Inkubation mit den entsprechenden fluoreszierenden sekundären Antikörpern (1:500) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln, gefolgt von einer Gegenfärbung mit DAPI. Die Aufnahmen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer Vergrößerung von ×200 angefertigt. Pro Tier wurden drei zufällig ausgewählte, nicht überlappende Felder mithilfe von Image-Pro Plus 6.0 analysiert, wobei die Fluoreszenzintensität als IOD/Fläche angegeben wurde. Pro Gruppe wurden drei Tiere in die Analyse eingeschlossen.

Enzymgebundener Immunosorbens-Assay (ELISA)

Blutproben wurden nach der Behandlung von Sprague-Dawley-Ratten entnommen und bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Das Serum wurde durch Zentrifugation abgetrennt und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert. Die Konzentrationen von IL-1β, IL-6 und TNF-α im Serum wurden mithilfe von ELISA-Tests gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Absorption wurde mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, und die Zytokinkonzentrationen wurden anhand der Standardkurven berechnet.

Statistische Analyse

Die statistischen Analysen wurden mit statistischer Analyse-Software durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± SD. Die Normalverteilung und die Varianzhomogenität wurden mit dem Shapiro-Wilk-Test bzw. dem Levene-Test überprüft. Der Vergleich zwischen zwei Gruppen erfolgte mit dem t-Test nach Student t-Test. Der Vergleich zwischen mehreren Gruppen erfolgte mittels einfaktorieller Varianzanalyse, gefolgt von Dunnetts post-hoc-Test. Ein Wert von P < Ein p-Wert von 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Zellexperimente wurden mit mindestens drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt.

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Ergebnisse

Clopidogrel verringert die Zellviabilität von GES-1-Zellen und erhöht die Apoptose In Vitro

Zunächst untersuchten wir, ob Clopidogrel die Lebensfähigkeit und Apoptose von GES-1-Zellen beeinflusst. CCK-8-Assays zeigten, dass die Behandlung mit Clopidogrel die Lebensfähigkeit der GES-1-Zellen signifikant verringerte (Abbildung 1A,B), was auf eine reduzierte Zellviabilität hindeutet. Basierend auf der Gesamtreduktion der Zel...

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Diskussion

Clopidogrel wird häufig zur Prävention und Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen eingesetzt; jedoch ist seine klinische Anwendung mit Blutungsrisiken und gastrointestinellen Komplikationen verbunden, einschließlich peptischer Ulzerationen, Blutungen und Perforationen19. Daher ist das Verständnis der molekularen Veränderungen, die mit einer clopidogrelinduzierten Magenschädigung einhergehen, wichtig, um die Prävention und das Management dieser unerwünschten Wirkungen zu verbessern. In der vo...

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Offenlegungen

Interessenkonflikt:

Die Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die den in dieser Studie beschriebenen Arbeiten Einfluss hätten verleihen können.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Projekt „Grundlagenforschung zum CHOP/ATF5/Bcl-2-Signalweg in der durch Clopidogrel induzierten Apoptose der Magenschleimhaut-Epithelzellen“ (Projekt-Nr. 2023BWKY009).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Erkennungs-KitElabscienceE-CK-A211Apoptose-Erkennungs-Kit
ATF5-AntikörperProteintech67066-1-APPrimärantikörper
BCA-Proteinbestimmungs-KitSolarbioPC0020Protein-Konzentrationsbestimmung
Bax-AntikörperProteintech50599-1-APPrimärantikörper
Bcl-2-AntikörperProteintech26593-1-APPrimärantikörper
β-Actin-AntikörperProteintech66009-1-IgPrimärantikörper
BlockierpufferBeyotimeP0252Blockierungslösung für Western Blot
CCK-8-Zellzähl-KitKeyGen BiotechKGA317Zellviabilitätsbestimmung
cDNA-Synthese-KitTransGen BiotechAU341Kit zur Synthese der ersten cDNA-Stränge mit Entfernung genomischer DNA
Zellzykluserkennungs-KitLianke BiotechnologieCCS012Zellzyklusanalyse-Kit
CHOP-AntikörperProteintech15204-1-APPrimärantikörper
Clopidogrel-Hydrogensulfat (Reinheit ≥99 %)MacklinC874834Experimenteller Wirkstoff
DAB-Chromogen-KitBeyotimeP0201MSubstrat für Immunhistochemie
Dimethylsulfoxid (DMSO)MedChemExpressHY-Y0320CLösungsmittel
Verstärktes Chemilumineszenz-(ECL-)ReagenzMeilunbioMA0186Chemilumineszenz-Substrat
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco10099-141Zellkulturzusatz
GES-1 humane gastrale epitheliale ZelllinieiCell BioscienceiCell-h062Menschliche gastrale epitheliale Zelllinie
Hämatoxylin- und Eosin-(H&E-)FärbekitBeyotimeC0105SHistorische Färbung
Sekundärantikörper, konjugiert mit Peroxidase aus Rettichwurzel (HRP)ProteintechRGAM001/RGAR001Sekundärantikörper
Wasserstoffperoxid-LösungAbsinABS9333-100mLReagenz zur Blockierung endogener Peroxidasen
IL-1β-ELISA-KitMEIMIANMM-0047R2Serum-Zytokinbestimmung
IL-6-ELISA-KitMEIMIANMM-0190R2Serum-Zytokinbestimmung
Mikroplatten-ReaderBeijing Liuyi BiotechnologieWD-2102BBestimmung der Absorption
Penicillin-Streptomycin-LösungSolarbioP1400Antibiotikum-Lösung
Pufferlösung mit Phosphat und Kochsalz (PBS)ServicebioG4202-500ML1× PBS
Polyvinylidenfluorid-(PVDF-)MembranMilliporeIPVH00010Membran für Western Blot
Verdünnungspuffer für PrimärantikörperBeyotimeP0023AAntikörperverdünnungspuffer
Protein-Molekulargewichts-MarkerYeasenWJ103Prägefärbter Proteinmarker
Master-Mix für quantitative Echtzeit-PCR (SYBR Green)CWBioCW3008qPCR-Reagenz
Lysispuffer nach Radioimmunpräzipitation (RIPA)SolarbioR0010Proteinextraktionspuffer
RNAse ALianke BiotechnologieCCS012Reagenz für Zellzyklusanalyse
RPMI-1640-MediumServicebioG4535-500MLGrundmedium für Zellkultur
Sprague-Dawley-RattenHangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd.N/ASPF-Grad
TNF-α-ELISA-KitMEIMIANMM-0180R2Serum-Zytokinbestimmung
Gesamt-RNA-Extraktions-KitTransGen BiotechER501-01RNA-Extraktions-Kit
Trypsin-EDTA-LösungSolarbioT1300Zell-Dissociationsreagenz

Referenzen

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