Diese Studie untersucht Schäden an der Magenschleimhaut im Zusammenhang mit der Behandlung mit Clopidogrel bei Ratten und Magenepithelzellen und betont deren Verbindung mit molekularen Veränderungen, die auf Stress im endoplasmatischen Retikulum zurückzuführen sind, sowie mit Apoptose und systemischer Entzündung.
Forschungsartikel
Clopidogrel-induzierte Schädigung der Magenschleimhaut im Zusammenhang mit Stress des endoplasmatischen Retikulums bei Ratten
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Clopidogrel wird häufig als Thrombozytenaggregationshemmer zur Prävention und Behandlung arterieller thrombotischer Erkrankungen eingesetzt, jedoch können gastrointestinale Nebenwirkungen wie Schädigungen der Magenschleimhaut die klinische Anwendung einschränken. Da das Überleben epithelialer Zellen für die Aufrechterhaltung der Integrität der Magenschleimhaut entscheidend ist, vermuteten wir, dass eine durch Clopidogrel verursachte Schädigung des Magenepithels mit Veränderungen bei Markern des endoplasmatischen Retikulums (ER)-Stresses und der Apoptose einhergeht. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden humane Magenepithelzellen des Typs GES-1 mit verschiedenen Konzentrationen von Clopidogrel behandelt, und die Zellviabilität, Apoptose, Zellzyklusverteilung sowie molekulare Veränderungen wurden mittels des Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assays, der Durchflusszytometrie, der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und der Western-Blot-Analyse evaluiert. Parallel dazu erhielten Sprague-Dawley-Ratten Clopidogrel per Magensonde, um ein in vivo-Modell einer Magenschädigung zu etablieren. Pathologische Veränderungen der Magenschleimhaut wurden mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung beurteilt, und die Konzentrationen entzündungsfördernder Zytokine im Serum wurden mit einem enzymgekoppelten Immunosorbens-Assay (ELISA) gemessen. Clopidogrel verringerte die Viabilität der GES-1-Zellen, förderte die Apoptose und veränderte den Zellzyklusverlauf. Bei den Ratten induzierte Clopidogrel Erosionen, Ödeme und eine Infiltration entzündlicher Zellen in der Magenschleimhaut, begleitet von erhöhten Serumspiegeln von Interleukin (IL)-1β, IL-6 und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α). Clopidogrel erhöhte außerdem die Expression der ER-Stress-Marker C/EBP-homologes Protein (CHOP) und aktivierenden Transkriptionsfaktor 5 (ATF5), steigerte die Expression des Bcl-2-assoziierten X-Proteins (Bax), verringerte die Expression von B-Zell-Lymphom-2 (Bcl-2) und erhöhte das Bax/Bcl-2-Verhältnis sowohl in Magengewebe als auch in GES-1-Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch Clopidogrel verursachte Schädigung der Magenschleimhaut mit einer erhöhten Expression ER-Stress-bezogener Marker und einer Störung des Bax/Bcl-2-Gleichgewichts assoziiert ist, obwohl in dieser Studie kein direkter kausaler ER-Stress–mitochondrialer Apoptoseweg nachgewiesen wurde.
Einleitung
Die angeborenen und adaptiven Immunsysteme der Magenschleimhaut, bestehend aus Epithelzellen, Immunzellen und Signalmolekülen, arbeiten zusammen, um die Schleimhautintegrität aufrechtzuerhalten und fungieren als eine entscheidende physiologische Barriere gegen schädliche Faktoren1,2. Diese Schutzfunktion ist essentiell für die gastrointestinale Homöostase, und ihre Störung kann zur Entstehung von Magenerkrankungen, einschließlich Gastritis, beitragen3. Klinisch ist eine arzneimittelinduzierte Schädigung der Magenschleimhaut eine häufige Komplikation, wobei nichtsteroidale Antirheumatika und Thrombozytenaggregationshemmer zu den häufigsten Ursachen zählen4. Die Integrität der Magenschleimhaut hängt von einem dynamischen Gleichgewicht zwischen Zellproliferation und Apoptose ab5. Eine chronische Exposition gegenüber Umweltfaktoren, einschließlich Medikamente, kann dieses Gleichgewicht stören, die Apoptose fördern und zu einer Schädigung der Schleimhaut führen6,7. Das endoplasmatische Retikulum spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der intrazellulären Homöostase. Unter Bedingungen zellulären Stresses führt die Anhäufung fehlgefalteter oder ungefalteter Proteine zur Aktivierung der Unfolded-Protein-Response, einschließlich der PERK/eIF2α/ATF4/CHOP-Signalübertragung, die die Apoptose fördern und die Expression von B-Zell-Lymphom-2-(Bcl-2)-Familienproteinen verändern kann8. ATF5 ist ebenfalls an mitochondrialen Stressreaktionen und dem Wechselspiel zwischen mitochondrialer Dysfunktion und endoplasmatischem Retikulumstress beteiligt9. Neuere klinische Befunde zeigen, dass eine fortgesetzte Thrombozytenaggregationshemmung, einschließlich Clopidogrel, mit einer progredienten Schädigung der Magen- und Dünndarmschleimhaut assoziiert ist10.
Clopidogrel ist ein weit verbreitetes Antiplättchenmittel, das einer metabolischen Aktivierung bedarf, bevor es irreversibel an die P2Y12-Rezeptoren der Thrombozyten bindet, wodurch die adenosindiphosphatvermittelte Thrombozytenaggregation gehemmt und antithrombotische Wirkungen erzielt werden11. Diese Bioaktivierung erfolgt hauptsächlich über hepatische Cytochrom-P450-Enzyme. Daher bildet die direkte Exposition kultivierter Magenepithelzellen gegenüber dem ursprünglichen Clopidogrel-Molekül den vollständigen metabolischen und pharmakokinetischen Kontext der Clopidogrel-Behandlung in vivo nicht ab. Allerdings deuten zunehmende Hinweise darauf hin, dass die Clopidogrel-Behandlung mit rezidivierenden Magengeschwüren und gastrointestinalen Blutungen assoziiert sein könnte, was die Bedeutung einer ausgewogenen Abwägung zwischen antithrombotischer Wirksamkeit und gastrointestineller Sicherheit unterstreicht12,13,14. Obwohl diese unerwünschten Wirkungen beschrieben wurden, sind die Mechanismen, die der clopidogrelbedingten Schädigung der Magenschleimhaut zugrunde liegen, noch nicht vollständig verstanden, was die Entwicklung gezielter präventiver und therapeutischer Strategien einschränkt. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirkungen von Clopidogrel auf die Magenschleimhaut unter Verwendung von Sprague–Dawley-Ratten und GES-1-Zellen. Die Ratten erhielten Clopidogrel mittels Magensonde, und ergänzende in vitro-Experimente wurden mit GES-1-Zellen durchgeführt. Histopathologische, molekulare und zelluläre Analysen wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob die clopidogrelinduzierte Schädigung der Magenschleimhaut mit endoplasmatischem Stress und Apoptose assoziiert ist. Entsprechend konzentrierte sich die vorliegende Studie darauf, die mit der clopidogrelinduzierten Magenschädigung verbundenen molekularen Veränderungen zu charakterisieren, anstatt einen kausalen Signalweg zu etablieren. Unsere Ergebnisse liefern zusätzliche Einblicke in die molekularen Veränderungen, die mit der clopidogrelinduzierten Schädigung der Magenschleimhaut einhergehen, und könnten zukünftigen Studien zur Prävention und Behandlung dieser unerwünschten Wirkungen dienen.
Protokoll
Alle tierexperimentellen Verfahren wurden von der Versuchstierethik-Kommission von Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. geprüft und genehmigt. Die Studie wurde gemäß den institutionellen Richtlinien für die Haltung und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die Genehmigungsnummer des Tierethikgutachtens lautete DRK-20251015210.
Tiere und Zelllinien
Die ethische Genehmigung umfasste die Verwendung von 20 SPF-Ratten der Zuchtlinie Sprague–Dawley. In die vorliegende Studie wurden insgesamt 12 männliche SPF-Ratten der Zuchtlinie Sprague–Dawley eingeschlossen, die zu Versuchsbeginn 6–8 Wochen alt waren und ein Gewicht von 280–300 g aufwiesen. Die Tiere stammten von der Firma Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Hangzhou, China; Produktionslizenznummer SCXK [Zhejiang] 2024-0004) und wurden zufällig auf die Kontroll- und die mit Clopidogrel behandelte Gruppe verteilt, wobei jeweils sechs Tiere pro Gruppe zugewiesen wurden. Die Ratten wurden in einer kontrollierten Umgebung bei etwa 22 °C und einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Wechsel gehalten und hatten freien Zugang zu Standardfutter und sterilisiertem Trinkwasser. Vor Beginn des Experiments durften alle Tiere sich eine Woche lang akklimatisieren. Clopidogrelhydrogensulfat wurde in 0,5 %iger Natriumcarboxymethylcellulose (CMC-Na) suspendiert, mit einer Konzentration von 0,781 mg/mL. Die Ratten der mit Clopidogrel behandelten Gruppe erhielten Clopidogrelhydrogensulfat einmal täglich über einen Zeitraum von drei aufeinanderfolgenden Tagen mittels Magensonde in einer Dosis von 10 mL/kg Körpergewicht (entspricht 1 mL/100 g Körpergewicht und einer Dosis von 7,81 mg/kg). Die Kontrollgruppe erhielt ein äquivalentes Volumen von 0,5 %iger CMC-Na. Die gewählte Dosis und die dreitägige Behandlungsdauer basierten auf einem zuvor beschriebenen Kurzzeitmodell zur oralen Verabreichung von Clopidogrel bei Ratten. Nach der letzten Gabe am Tag 3 wurde den Tieren über einen Zeitraum von 12 h Futter entzogen, während Wasser weiterhin ad libitum zur Verfügung stand. Die Ratten wurden in einer Narkosekammer mit 3 % Isofluran in Sauerstoff anästhesiert; die Aufrechterhaltung der Narkose erfolgte mittels 1,5–2,0 % Isofluran über eine Nasenmaske. Eine ausreichende Narkosetiefe wurde durch das Fehlen des Hornhautreflexes und des Zehe-Reflexes bestätigt. Unter tiefer Narkose wurde Blut durch terminale Herzpunktion entnommen. Während die Tiere weiterhin tief anästhesiert blieben, erfolgte die Tötung durch Aushöhlen (Exsanguination) gefolgt von einer bilateralen Thorakotomie. Der Tod wurde durch das Fehlen von Spontanatmung und Herzaktivität über mindestens 5 min sowie durch das Fehlen des Hornhautreflexes und des Zehe-Reflexes bestätigt. Anschließend wurde der Magen rasch entfernt, entlang der großen Kurvatur eröffnet und vorsichtig mit eiskalter Kochsalzlösung gespült.
Die humane Magenschleimhautepithelzelllinie GES-1 wurde von iCell Bioscience Inc. (Shanghai, China; Kat.-Nr. iCell-h062) bezogen und durch kurze tandemartige Wiederholungsprofilerstellung (short tandem repeat profiling) durch den Lieferanten authentifiziert. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin, in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ kultiviert. Für die Experimente wurden Zellen mit niedriger Passagezahl zwischen der 3. und 10. Passage verwendet. Wenn die Zellkonfluenz etwa 80–90 % erreichte, wurden die Zellen im Spaltverhältnis 1:3 weitergeimpft. Für nachfolgende Experimente wurden Zellen in der logischen Wachstumsphase verwendet. Für den CCK-8-Assay wurden die Zellen in 96-Well-Platten mit 6 × 103 Zellen/Well ausgesät. Für die Apoptose- und Zellzyklusanalysen wurden die Zellen in 6-Well-Platten mit etwa 5 × 105 Zellen/Well ausgesät und vor der Behandlung mit Clopidogrel zur Anheftung zugelassen.
Chemikalien und Lösungen
Clopidogrelhydrogensulfat (Bestellnr. C874834; Reinheit ≥ 99 %) wurde für die Tier- und Zellversuche verwendet. Eine Stammlösung von Clopidogrel wurde hergestellt, indem 100 mg Clopidogrel-Pulver in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst wurden, um eine 1-M-Stammlösung zu erhalten. Vor der Anwendung wurde die Stammlösung auf die erforderlichen Arbeitskonzentrationen verdünnt. Die 1-M-Stammlösung wurde nacheinander mit DMSO verdünnt, um 1000× Dosierungslösungen in Konzentrationen von 10, 100, 200, 400, 600, 800 und 1000 mM. Unmittelbar vor der Behandlung jeweils 1000× Die Dosierungslösung wurde im Verhältnis 1:1000 (V/V) dem vollständigen Kulturmedium zugesetzt, um endgültige Clopidogrel-Konzentrationen von 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 mM zu erreichen. Die Kontrollgruppe erhielt ein gleiches Volumen an DMSO ohne Clopidogrel. Somit betrug die endgültige DMSO-Konzentration in allen Gruppen 0,1 % (V/V). Kultivierte GES-1-Zellen zeigen keine hepatische, cytochrom-P450-vermittelte Bioaktivierung von Clopidogrel. Daher wurde eine direkte Clopidogrel-Behandlung als exploratives Expositionsmodell für die Ausgangssubstanz verwendet. Der Konzentrationsbereich wurde gewählt, um konzentrationsabhängige zelluläre Reaktionen unter den experimentellen Bedingungen zu charakterisieren, und sollte nicht als äquivalent zu klinisch erreichbaren Plasma- oder Magengewebe-Konzentrationen interpretiert werden.
Zellunterkultur
Das komplette Medium wurde hergestellt, indem dem basalen Kulturmedium FBS und Penicillin-Streptomycin zugesetzt wurden. Wenn die Zellkonfluenz etwa 80 % erreichte, wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen dreimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen etwa 1–2 Minuten lang mit einer Trypsin-Ethylenendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung angesäuert. Nach teilweiser Zellablösung wurde das komplette Medium zugegeben, um die Verdauung zu beenden. Die Zellsuspension wurde bei 1.200 × g für 3 Minuten zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes wurde der Zellpellet in 1–2 mL komplettem Medium resuspendiert und gemäß den experimentellen Anforderungen in neue Kulturschalen ausgesät.
CCK-8-Zellviabilitäts-Assay
GES-1-Zellen in der logischen Wachstumsphase wurden mit 6 × 103 Zellen/Vertiefung in 96-Well-Platten ausgesät und über Nacht kultiviert, um die Zelladhärenz zu ermöglichen. Nach der Anheftung wurden die Zellen 24 Stunden lang mit verschiedenen Konzentrationen von Clopidogrel (0, 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 mM) behandelt. Die Kontrollgruppe erhielt die gleiche Endkonzentration des Lösungsmittels. Nach der Behandlung wurde CCK-8-Lösung in jedes Well gegeben und gemäß den Anweisungen des Kits bei 37 °C inkubiert. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Die Zellviabilität wurde als Prozentsatz der Kontrollgruppe berechnet. Basierend auf den Ergebnissen der Konzentrations-Wirkungs-Kurve wurde eine Behandlung mit 0,1 mM Clopidogrel über 24 Stunden für die anschließenden Analysen zur Apoptose, Zellzyklus, qPCR und Western Blot ausgewählt.
Durchflusszytometrie-Analyse
GES-1-Zellen wurden in 6-Loch-Platten ausgesät und nach Zellanheftung 24 h mit 0,1 mM Clopidogrel behandelt. Nach der Behandlung wurden sowohl schwebende als auch adhärente Zellen gesammelt. Die adhärenten Zellen wurden mit Trypsin ohne EDTA aufgelöst, zweimal mit kalter PBS gewaschen und in Bindungspuffer resuspendiert. Die Zellen wurden mit einem Annexin V-FITC/PI-Apoptosekit gemäß den Herstelleranweisungen gefärbt. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln wurden apoptotische Zellen mittels eines RaiseCyte 2L6C-Durchflusszytometers detektiert. Die Daten wurden mit der RaiseFlower-Aufnahmesoftware erfasst und mit der FlowJo-Software (Version 10.8.1) analysiert. Frühapoptotische, spätapoptotische und gesamtapoptotische Zellpopulationen wurden mit der FlowJo-Software quantifiziert.
Durchflusszytometrische Analyse der Zellzyklusverteilung
GES-1-Zellen wurden in 6-Loch-Platten ausgesät und 24 h lang mit 0,1 mM Clopidogrel behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen geerntet, mit PBS gewaschen und in vorgekühltem 70%igem Ethanol bei 4 °C fixiert. Die fixierten Zellen wurden anschließend gewaschen, um restliches Ethanol zu entfernen, und gemäß den Herstelleranweisungen mit RNase A und Propidiumiodid-Färbelösung im Dunkeln inkubiert. Die Verteilung im Zellzyklus wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten wurden mit der Erfassungssoftware erfasst und mit der FlowJo-Software ausgewertet. Die Zellzyklusverteilungen wurden nach dem Watson-Modell angepasst, und die Anteile der Zellen in den Phasen G0/G1, S und G2/M wurden berechnet.
Quantitative Echtzeit-PCR (qPCR)
Die Gesamt-RNA wurde aus GES-1-Zellen und Ratten-Magen-Gewebeproben mithilfe eines RNA-Extraktionskits gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Bei Gewebeproben wurden Magenschleimhautgewebe rasch entnommen, bei tiefen Temperaturen homogenisiert und anschließend der RNA-Extraktion unterzogen. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurden durch Messung der Absorption bei 260 und 280 nm bestimmt. Gleiche Mengen an RNA wurden mit einem Reverse-Transkriptionskit unter Verwendung einer genomischen DNA-Entfernungseinheit in komplementäre DNA (cDNA) zurücktranskribiert. Die quantitative Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung einer auf SYBR Green basierenden PCR-Master-Mix-Lösung durchgeführt. Jede Reaktion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 20 µL, das 10 µL 2× Master-Mix, 1 µL cDNA, 0,4 µL Vorwärtsprimer, 0,4 µL Rückwärtsprimer und 8,2 µL RNase-freies ddH₂O enthielt. Die thermischen Zyklenbedingungen waren wie folgt: eine initiale Denaturierung bei 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 10 s, Annealing bei 60 °C für 30 s und Extension bei 72 °C für 30 s. Die Expressionsmengen von CHOP, ATF5, Bcl-2 und Bax wurden bestimmt. GAPDH diente als interner Referenzgen. Die relative Genexpression wurde nach der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Die Primersequenzen sind in Zusätzliche Tabelle 1 aufgeführt.
Western Blot
Gesamtprotein wurde aus GES-1-Zellen und Ratten-Magen-Gewebeproben extrahiert. Für Zellproben wurden behandelte GES-1-Zellen mit kaltem PBS gewaschen und mit einem Lysepuffer für den Radioimmunpräzipitationstest (RIPA) unter Zusatz eines Proteaseinhibitors lysiert. Für Gewebeproben wurden Magenschleimhautgewebe bei niedriger Temperatur in RIPA-Puffer homogenisiert und anschließend zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. Die Protein-Konzentrationen wurden mithilfe eines BCA-Protein-Assays bestimmt. Pro Bande wurden jeweils 20 µg Protein mittels Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Nach einer Blockierung mit Rinderserumalbumin (BSA) wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000) und β-Aktin (1:5000) inkubiert. Nach dem Waschen erfolgte die Inkubation mit den entsprechenden mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern (1:10000). Die Proteinbanden wurden mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Reagenz sichtbar gemacht und mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem aufgezeichnet. Die Bandenintensitäten wurden mittels Bildanalyse-Software quantifiziert und auf β-Aktin normalisiert.
Histopathologische Bewertung
Magengewebeproben wurden nach der Behandlung mit Clopidogrel von Sprague–Dawley-Ratten gewonnen und in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert. Die Proben wurden dehydriert, gereinigt, in Paraffin eingebettet und in einer Dicke von 4 µm geschnitten. Paraffinschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Histopathologische Veränderungen wurden qualitativ am Lichtmikroskop anhand der Schleimhautmorphologie, epithelialen Integrität, Ödembildung und Entzündungszellinfiltration beurteilt. Repräsentative Bilder wurden aufgenommen. Es wurde kein histologisches Bewertungssystem angewandt.
Immunhistochemie
Paraffin-eingebettete Magengewebsschnitte wurden in Xylol deparaffinisiert und über eine abgestufte Ethanolreihe rehydriert. Die hitzeinduzierte Antigenfreisetzung erfolgte in Zitratpuffer. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde mit 3 % Wasserstoffperoxid für 10 min blockiert, und unspezifische Bindungen wurden mit normalem Ziegenserum für 30 min bei Raumtemperatur blockiert. Die Schnitte wurden anschließend über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen CHOP, ATF5, Bcl-2 und Bax inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit den entsprechenden mit Rettichperoxidase konjugierten sekundären Antikörpern inkubiert. Die immunreaktiven Signale wurden mithilfe einer DAB-Färbung sichtbar gemacht, gefolgt von einer Gegenfärbung mit Hämatoxylin. Die Schnitte wurden dehydriert, geklärt, eingedeckt und unter dem Lichtmikroskop untersucht. Repräsentative Bilder wurden aufgenommen, und der Bereich der positiven Färbung wurde mittels Bildanalyse-Software quantifiziert.
Immunfluoreszenzfärbung
Paraffin-eingebettete Magengewebsschnitte wurden entparaffiniert, rehydriert und einer hitzeinduzierten Antigen-Retrieval-Behandlung in Zitratpuffer unterzogen. Nach der Blockierung mit normalem Ziegenserum für 30 min wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) und Bax (1:200) inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS erfolgte die Inkubation mit den entsprechenden fluoreszierenden sekundären Antikörpern (1:500) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln, gefolgt von einer Gegenfärbung mit DAPI. Die Aufnahmen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer Vergrößerung von ×200 angefertigt. Pro Tier wurden drei zufällig ausgewählte, nicht überlappende Felder mithilfe von Image-Pro Plus 6.0 analysiert, wobei die Fluoreszenzintensität als IOD/Fläche angegeben wurde. Pro Gruppe wurden drei Tiere in die Analyse eingeschlossen.
Enzymgebundener Immunosorbens-Assay (ELISA)
Blutproben wurden nach der Behandlung von Sprague-Dawley-Ratten entnommen und bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Das Serum wurde durch Zentrifugation abgetrennt und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert. Die Konzentrationen von IL-1β, IL-6 und TNF-α im Serum wurden mithilfe von ELISA-Tests gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Absorption wurde mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, und die Zytokinkonzentrationen wurden anhand der Standardkurven berechnet.
Statistische Analyse
Die statistischen Analysen wurden mit statistischer Analyse-Software durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± SD. Die Normalverteilung und die Varianzhomogenität wurden mit dem Shapiro-Wilk-Test bzw. dem Levene-Test überprüft. Der Vergleich zwischen zwei Gruppen erfolgte mit dem t-Test nach Student t-Test. Der Vergleich zwischen mehreren Gruppen erfolgte mittels einfaktorieller Varianzanalyse, gefolgt von Dunnetts post-hoc-Test. Ein Wert von P < Ein p-Wert von 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Zellexperimente wurden mit mindestens drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt.
Ergebnisse
Clopidogrel verringert die Zellviabilität von GES-1-Zellen und erhöht die Apoptose In Vitro
Zunächst untersuchten wir, ob Clopidogrel die Lebensfähigkeit und Apoptose von GES-1-Zellen beeinflusst. CCK-8-Assays zeigten, dass die Behandlung mit Clopidogrel die Lebensfähigkeit der GES-1-Zellen signifikant verringerte (Abbildung 1A,B), was auf eine reduzierte Zellviabilität hindeutet. Basierend auf der Gesamtreduktion der Zellviabilität über den getesteten Konzentrationsbereich hinweg wurde eine Behandlung mit 0,1 mM Clopidogrel für 24 h für alle nachfolgenden Zellversuche ausgewählt. Anschließend wurde die Apoptose und die Verteilung im Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie analysiert (Abbildung 1C–F). Die zytometrische Analyse zeigte einen erhöhten Anteil an Zellen in der S-Phase, begleitet von einer verminderten Population in der G0/G1-Phase und keiner deutlichen Zunahme der G2/M-Population, was auf eine Anreicherung in der S-Phase statt eines Arrests in der G2/M-Phase hindeutet. Die Ergebnisse zeigten, dass Clopidogrel im Vergleich zur Kontrollgruppe die Apoptose signifikant erhöhte und die Verteilung im Zellzyklus in GES-1-Zellen veränderte. Insgesamt deuten diese Befunde darauf hin, dass Clopidogrel die Lebensfähigkeit von GES-1-Zellen verringert und mit einer erhöhten Apoptose sowie Veränderungen im Zellzyklusverlauf assoziiert ist. Diese Ergebnisse belegen zytotoxische Reaktionen nach direkter Exposition gegenüber der Clopidogrel-Ausgangsverbindung unter den gewählten experimentellen Bedingungen. Sie belegen jedoch nicht, dass vergleichbare Effekte bei klinisch relevanten Expositionskonzentrationen auftreten oder dass die beobachteten Reaktionen durch das aktive Metabolit von Clopidogrel vermittelt werden.
Abbildung 1. Clopidogrel verringert die Zellviabilität von GES-1-Zellen und erhöht die Apoptose. (A) Die Zellviabilität der humanen gastrischen Epithelzelllinie GES-1 wurde mittels CCK-8-Assay nach Behandlung mit steigenden Konzentrationen von Clopidogrel (0–1,0 mM) über 24 h bestimmt. (B) Quantitativer Vergleich der Zellviabilität zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe, die 24 h lang mit 0,1 mM Clopidogrel behandelt wurde. (C) Repräsentative zellzyklusbezogene Durchflusszytometrieprofile, analysiert mit dem Watson-Modell. (D) Quantifizierung der Anteile von Zellen in den Phasen G0/G1, S und G2/M. Die Behandlung mit Clopidogrel erhöhte die Population in der S-Phase, ohne einen offensichtlichen Anstieg der G2/M-Population zu verursachen. (E) Repräsentative Durchflusszytometrie-Dotblots der Apoptose nach Färbung mit Annexin V-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Propidiumiodid (PI). (F) Quantifizierung der gesamten apoptotischen Zellpopulation. Alle Zellversuche wurden mit drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt (n = 3). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe ermittelt. ***P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Die durch Clopidogrel verursachte Magenverletzung ist mit systemischer Entzündung assoziiert
Sprague-Dawley-Ratten wurden zufällig in zwei Gruppen eingeteilt (n = 6 pro Gruppe): eine Kontrollgruppe und eine mit Clopidogrel behandelte Gruppe, die täglich eine Gavage erhielt. Die Dosis von Clopidogrel und das dreitägige Behandlungsregime wurden basierend auf einem zuvor beschriebenen Rattenmodell einer clopidogrelinduzierten Magenverletzung16 ausgewählt. Nach 3 Tagen wurden Magengewebe zur Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung entnommen. Die histopathologische Untersuchung zeigte im Vergleich zur Kontrollgruppe Magenschleimhauterosionen, Ödeme und eine Infiltration entzündlicher Zellen in der mit Clopidogrel behandelten Gruppe (Abbildung 2A). Die Spiegel entzündlicher Serumzytokine wurden mittels ELISA gemessen. Die mit Clopidogrel behandelte Gruppe wies signifikant höhere Serumspiegel von Interleukin (IL)-1β, IL-6 und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) auf als die Kontrollgruppe (Abbildung 2B–D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Behandlung mit Clopidogrel mit einer Verletzung der Magenschleimhaut und erhöhten systemischen Entzündungsreaktionen assoziiert ist15,16.
Abbildung 2. Clopidogrel verursacht eine Schädigung der Magenschleimhaut und erhöht die Konzentrationen zirkulierender entzündlicher Zytokine bei Ratten. (A) Repräsentative mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbte Schnitte der Magenschleimhaut von Kontroll- und Clopidogrel-behandelten Sprague–Dawley-Ratten. Die histologische Untersuchung zeigt eine erhaltene Architektur der Magenschleimhaut in der Kontrollgruppe und morphologische Veränderungen in der Clopidogrel-behandelten Gruppe. Gelbe Pfeile zeigen Magenschleimhaut-Epithelzellen, rote Pfeile weisen auf fokale Kongestion innerhalb der Schleimhautschicht hin und schwarze Pfeile zeigen eine leichte Infiltration durch entzündliche Zellen. Originale Vergrößerung, ×200; Maßstabsbalken = 100 µm. n = 6 Tiere pro Gruppe. (B–D) Die Serumkonzentrationen von Interleukin (IL)-1β, IL-6 und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) wurden mittels enzymgekoppelter Immunosorbent-Assay (ELISA) gemessen. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt; n = 6 Tiere pro Gruppe. ***P < 0,001 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Clopidogrel verändert die Marker für ER-Stress und Apoptose im Magenepithel von Ratten
Um molekulare Veränderungen im Zusammenhang mit clopidogrelinduzierter Magenschädigung zu untersuchen, wurde eine immunhistochemische Färbung an Magengewebeschnitten durchgeführt. Repräsentative Bilder zeigten eine stärkere Färbung für CHOP, ATF5 und Bax in der mit Clopidogrel behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe, während die Bcl-2-Färbung schwächer erschien (Abbildung 3A). Die quantitative Analyse des IOD/Fläche zeigte, dass die Färbungen für CHOP, ATF5 und Bax nach Clopidogrel-Behandlung signifikant erhöht waren (Abbildung 3B,C,E). Die Bcl-2-Färbung wies einen abnehmenden Trend auf, obwohl der Unterschied keine statistische Signifikanz erreichte (Abbildung 3D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Behandlung mit Clopidogrel mit veränderter Expression von Stress- und Apoptose-assoziierten Proteinen in der Magenschleimhaut von Ratten verbunden ist. Eine Immunfluoreszenzanalyse zeigte stärkere CHOP- und ATF5-Signale im Magenschleimhautgewebe der mit Clopidogrel behandelten Gruppe. Die quantitative Analyse bestätigte signifikante Zunahmen bei CHOP (Abbildungen 4A und 5A) und ATF5 (Abbildungen 4B und 5B), während Bcl-2 (Abbildungen 4C und 5C) und Bax (Abbildungen 4D und 5D) abnehmende bzw. zunehmende Tendenzen zeigten, ohne statistische Signifikanz zu erreichen. Insgesamt weisen diese Befunde darauf hin, dass die Clopidogrel-Behandlung mit einer veränderten Expression von Markern für endoplasmatischen Retikulum-Stress und Apoptose in der Magenschleimhaut von Ratten assoziiert ist.
Abbildung 3. Immunhistochemischer Nachweis von Proteinen, die mit endoplasmatischem Stress und Apoptose assoziiert sind, im Magengewebe. (A) Repräsentative immunhistochemische Färbungsbilder des C/EBP-homologen Proteins (CHOP), des aktivierenden Transkriptionsfaktors 5 (ATF5), des B-Zell-Lymphoms 2 (Bcl-2) und des Bcl-2-assoziierten X-Proteins (Bax) im Magenschleimhautgewebe von Kontroll- und mit Clopidogrel behandelten Sprague–Dawley-Ratten. Braunfärbungen weisen auf positive Immunreaktivität hin; die Kerne wurden mit Hämatoxylin kontragefärbt. Die gezeigten Bilder sind repräsentativ für alle analysierten Proben, wobei jeweils drei Tiere pro Gruppe eingeschlossen wurden. Ursprüngliche Vergrößerung, ×200; Maßstabsbalken = 100 µm. (B–E) Quantitative Analyse der integrierten optischen Dichte pro Flächeneinheit (IOD/Area) für CHOP, ATF5, Bcl-2 bzw. Bax. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. *P < 0,05 und **P < 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4. Immunfluoreszenznachweis von Proteinen, die mit endoplasmatischem Retikulum-Stress und Apoptose assoziiert sind, im Magengewebe. Repräsentative Immunfluoreszenzbilder zeigen die Lokalisation des C/EBP-homologen Proteins (CHOP), des aktivierenden Transkriptionsfaktors 5 (ATF5), des B-Zell-Lymphoms 2 (Bcl-2) und des Bcl-2-assoziierten X-Proteins (Bax) im Magenschleimhautgewebe von Kontroll- und mit Clopidogrel behandelten Sprague–Dawley-Ratten. Die Kerne wurden mit 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) (blau) kontragefärbt, und die positiven Immunfluoreszenzsignale sind rot dargestellt. Die überlagerten Bilder sind in der rechten Spalte zu sehen. (A) CHOP. (B) ATF5. (C) Bcl-2. (D) Bax. Ursprüngliche Vergrößerung, ×200; Maßstabsbalken = 100 µm. Die gezeigten Bilder sind repräsentativ für alle analysierten Proben, mit jeweils n = 3 Tieren pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 5. Quantitative Analyse der Immunfluoreszenz für Proteine, die mit endoplasmatischem Stress und Apoptose in Magengewebe assoziiert sind. (A–D) Quantifizierung der integrierten optischen Dichte pro Flächeneinheit (IOD/Fläche) für das C/EBP-homologe Protein (CHOP), den aktivierenden Transkriptionsfaktor 5 (ATF5), das B-Zell-Lymphom-2 (Bcl-2) und das Bcl-2-assoziierte X-Protein (Bax) in Magenschleimhautgewebe von Kontroll- und Clopidogrel-behandelten Sprague–Dawley-Ratten. Für jedes Tier wurden drei zufällig ausgewählte, sich nicht überlappende mikroskopische Felder pro Gewebeschnitt mit einer Bildanalyse-Software ausgewertet, und der Mittelwert wurde für die statistische Analyse verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angegeben; n = 3 Tiere pro Gruppe. *P < 0,05 und **P < 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Clopidogrel verändert die Gen- und Proteinausprägung von ER-Stress- und Apoptose-assoziierten Genen in GES-1-Zellen und im Rattenmagengewebe
Frühere Studien haben gezeigt, dass der ER-Stress eine Schlüsselrolle bei zellulären Stressantworten und der Apoptose spielt17,18. Um Veränderungen von ER-Stress-assoziierten Markern nach Behandlung mit Clopidogrel zu bewerten, wurde die Expression von CHOP und ATF5 in GES-1-Zellen untersucht. Die qRT-PCR zeigte eine erhöhte mRNA-Expression von CHOP und ATF5 nach der Behandlung mit Clopidogrel. Die Western-Blot-Analyse bestätigte zudem eine erhöhte Proteinausprägung von CHOP und ATF5 (Abbildung 6A–E). Anschließend wurde die Expression von Apoptose-assoziierten Proteinen in GES-1-Zellen und im Magengewebe von Ratten analysiert. Im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte die Behandlung mit Clopidogrel die Expression von Bax und verringerte die Expression von Bcl-2, was zu einem erhöhten Bax/Bcl-2-Verhältnis führte (Abbildung 6A–J). Diese Expressionsmuster zeigten sich konsistent sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene in GES-1-Zellen und im Magengewebe von Ratten. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Behandlung mit Clopidogrel mit veränderten Expressionsmustern von ER-Stress- und Apoptose-assoziierten Markern in beiden experimentellen Modellen verbunden ist.
Abbildung 6. Expression von Markern für endoplasmatischen Retikulum-Stress und Apoptose in GES-1-Zellen und Ratten-Magen-Gewebe nach Behandlung mit Clopidogrel. (A–D) Relative Expression von Boten-RNA (mRNA) von C/EBP-homologem Protein (CHOP), aktivierendem Transkriptionsfaktor 5 (ATF5), B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) und Bcl-2-assoziiertem X-Protein (Bax) in der humanen Magenepithelzelllinie GES-1, bestimmt mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). (E) Repräsentative Western Blot-Bilder mit entsprechender dichtometrischer Quantifizierung der Proteinexpression von CHOP, ATF5, Bcl-2 und Bax in GES-1-Zellen. Die Proteinexpressionsniveaus wurden auf β-Aktin normalisiert. Die Zellversuche wurden mit drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt (n = 3). (F–I) Relative mRNA-Expression von CHOP, ATF5, Bcl-2 und Bax in Ratten-Magen-Gewebe, bestimmt mittels qRT-PCR. (J) Repräsentative Western Blot-Bilder mit entsprechender dichtometrischer Quantifizierung der Proteinexpression von CHOP, ATF5, Bcl-2 und Bax in Ratten-Magen-Gewebe. Die Proteinexpressionsniveaus wurden auf β-Aktin normalisiert. Pro Gruppe wurden n = 3 Tiere in die Gewebeversuche eingeschlossen. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe ermittelt. *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die Behandlung mit Clopidogrel die Lebensfähigkeit von GES-1-Zellen verringerte, die Apoptose erhöhte, die Expression von Markern für ER-Stress und Apoptose veränderte und mit einer Schädigung der Magenschleimhaut einherging, die bei Ratten mit erhöhten zirkulierenden Spiegeln entzündungsfördernder Zytokine verbunden war. Diese Befunde stützen die Studienhypothese, dass die Behandlung mit Clopidogrel mit einer Schädigung der Magenschleimhaut sowie gleichzeitigen Veränderungen in den Markern für ER-Stress und Apoptose assoziiert ist.
Datenverfügbarkeit:
Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem publizierten Artikel und den ergänzenden Materialien enthalten. Die Primersequenzen, die für die RT-PCR verwendet wurden, sind in Ergänzungstabelle 1 angegeben. Die Rohdaten, die alle Abbildungen und einzelnen Abbildungspanels unterstützen, einschließlich der ursprünglichen experimentellen Datensätze und Quelldateien, sind im beigefügten ergänzenden Rohdaten-Archiv (gezippte Datei) enthalten.
Ergänzungstabelle 1. Primersequenzen, die für die RT-PCR-Analyse verwendet wurden. Vorwärts (F) und rückwärts (R) gerichtete Primersequenzen, die in dieser Studie für die RT-PCR-Analyse von GAPDH, CHOP, ATF5, Bcl-2 und Bax verwendet wurden, sind in 5′–3′-Orientierung aufgelistet.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Clopidogrel wird häufig zur Prävention und Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen eingesetzt; jedoch ist seine klinische Anwendung mit Blutungsrisiken und gastrointestinellen Komplikationen verbunden, einschließlich peptischer Ulzerationen, Blutungen und Perforationen19. Daher ist das Verständnis der molekularen Veränderungen, die mit einer clopidogrelinduzierten Magenschädigung einhergehen, wichtig, um die Prävention und das Management dieser unerwünschten Wirkungen zu verbessern. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirkungen von Clopidogrel auf Magenepithelzellen und Magengewebe von Ratten und beobachteten Veränderungen in der Zellviabilität, Apoptose, entzündlichen Reaktionen sowie der Expression von Markern, die mit ER-Stress und Apoptose assoziiert sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch Clopidogrel verursachte Schädigung der Magenschleimhaut mit Veränderungen in der Expression von Markern im Zusammenhang mit ER-Stress und Apoptose einhergeht. Da jedoch keine pharmakologischen Wiederherstellungsversuche oder genetischen Funktionsverlustexperimente durchgeführt wurden, belegen diese Ergebnisse keinen kausalen Zusammenhang zwischen ER-Stress und Apoptose.
Frühere Studien haben darauf hingewiesen, dass Clopidogrel die Reparatur der Magenschleimhaut beeinträchtigen und die Heilung von Magengeschwüren verzögern kann20. In der vorliegenden Studie zeigten CCK-8-Assays, dass Clopidogrel die Vitalität von GES-1-Zellen verringerte, und die Durchflusszytometrie zeigte eine erhöhte Apoptose sowie veränderte Zellzyklusprogression (Abbildung 1). Diese Befunde stimmen mit früheren Berichten über Clopidogrel-induzierte Apoptose in Magenepithelzellen überein21. Diese Beobachtungen legen nahe, dass eine Behandlung mit Clopidogrel mit einer beeinträchtigten Vitalität der Magenepithelzellen und einer erhöhten Apoptose assoziiert ist, was zu einer Schädigung der Magenschleimhaut beitragen könnte11. Im Rattenmodell zeigte die H&E-Färbung eine Schädigung der Magenschleimhaut nach Gabe von Clopidogrel (Abbildung 2A). Die Serumspiegel von IL-1β, IL-6 und TNF-α waren ebenfalls signifikant erhöht (Abbildung 2B–D), was auf eine entzündliche Reaktion im Zusammenhang mit einer Schädigung der Magenschleimhaut hinweist22. Darüber hinaus zeigten immunhistochemische und immunfluoreszenzbasierende Analysen eine veränderte Expression von mit endoplasmatischem Retikulum (ER)-Stress und Apoptose assoziierten Markern im Magengewebe von Ratten, die mit Clopidogrel behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5).
CHOP, ATF5, Bcl-2 und Bax sind wichtige Regulatoren zellulärer Stressantworten und der Apoptose23,24,25,26. In dieser Studie war die Behandlung mit Clopidogrel mit einer erhöhten Expression von CHOP und ATF5 sowie veränderten Expressionsniveaus von Bax und Bcl-2 sowohl in GES-1-Zellen als auch im Magengewebe von Ratten verbunden (Abbildung 6). Diese Ergebnisse deuten auf gleichzeitige Veränderungen bei Markern für Stress und Apoptose hin. Allerdings bewertete die vorliegende Studie lediglich Expressionsänderungen und untersuchte nicht, ob diese Moleküle die durch Clopidogrel induzierte Magenschleimhautverletzung direkt vermitteln. Ebenso wurde zwar ein erhöhtes Bax/Bcl-2-Verhältnis beobachtet, die Studie konnte jedoch keine direkte Aktivierung des mitochondrialen Apoptosewegs nachweisen. Daher sollten diese Befunde als Assoziationen und nicht als Beleg für einen kausalen Signalmechanismus interpretiert werden.
Die vorliegende Studie kombiniert ein in vivo-Rattenmodell mit explorativen Direktexpositionsversuchen in GES-1-Zellen, um die mit der Clopidogrel-Behandlung assoziierten morphologischen und molekularen Veränderungen zu bewerten. Das in vivo-Modell liefert den primären Nachweis einer Magenschleimhautschädigung, während die GES-1-Experimente unterstützende Hinweise auf zelluläre Reaktionen nach direkter Exposition gegenüber der Ausgangssubstanz liefern. Die Kombination aus histopathologischer Analyse, Messung entzündlicher Zytokine, Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, qRT-PCR und Western Blotting ermöglicht eine umfassende Beurteilung der mit Magenverletzungen assoziierten morphologischen und molekularen Veränderungen. Dieser experimentelle Ansatz könnte nützlich sein, um die gastrointestinellen Wirkungen von Thrombozytenaggregationshemmern zu untersuchen und potenzielle Schutzmaßnahmen in zukünftigen Studien zu evaluieren.
Mehrere Einschränkungen sollten berücksichtigt werden. Clopidogrel ist ein Prodrug, das eine hepatische metabolische Aktivierung erfordert, wohingegen die direkte Exposition von GES-1-Zellen gegenüber der Ausgangsverbindung diesen Prozess nicht reproduziert oder die klinische Pharmakokinetik vollständig widerspiegelt. Zudem könnten die relativ hohen Konzentrationen, die in vitro verwendet wurden, zu unspezifischer Zytotoxizität geführt haben. Daher sollten die GES-1-Experimente als exploratorische Hinweise auf zelluläre Reaktionen unter direkter Expositionsbedingungen betrachtet werden. Der CCK-8-Assay enthielt keine positive Kontrolle für verminderte Zellviabilität, was eine unabhängige Überprüfung der Assay-Leistung einschränkt. Die upstream liegenden Mechanismen, die für die beobachteten ER-Stress-bedingten Veränderungen verantwortlich sind, wurden nicht untersucht, und pharmakologische Hemmung, Gen-Knockdown- oder Gen-Knockout-Experimente wurden nicht durchgeführt, um zu klären, ob der ER-Stress direkt die Bax/Bcl-2-Balance und die Apoptose reguliert. Künftige Studien sollten die Ausgangsverbindung mit ihrem aktiven Metaboliten vergleichen, ein geeignetes System zur metabolischen Aktivierung einbeziehen und funktionelle Interventionsexperimente durchführen, um diese Zusammenhänge aufzuklären. Außerdem wurde im Annexin V-FITC/PI-Assay keine gut etablierte positive Kontrolle für Apoptoseinduktion verwendet. Daher wurde die technische Leistung des Apoptose-Assays, obwohl die Behandlung mit Clopidogrel im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle mit einer erhöhten Population Annexin-V-positiver Zellen assoziiert war, nicht unabhängig mittels einer positiven Kontrollbedingung verifiziert. Künftige Studien sollten einen Apoptoseinduktor wie Staurosporin in derselben experimentellen Ansammlung einbeziehen.
Zusammenfassend verursachte eine orale Clopidogrel-Behandlung bei Ratten eine Schädigung der Magenschleimhaut, die mit Veränderungen von Markern für den ER-Stress und die Apoptose einherging. Die direkte Exposition von GES-1-Zellen mit der Clopidogrel-Ausgangssubstanz verringerte ebenfalls die Zellviabilität und veränderte verwandte molekulare Marker unter den experimentellen Bedingungen. Da das Zellmodell jedoch die hepatische Bioaktivierung nicht widerspiegelt und vergleichsweise hohe Konzentrationen verwendet wurden, können die in-vitro-Ergebnisse nicht direkt auf die klinische Exposition übertragen werden, und eine unspezifische Zytotoxizität kann nicht ausgeschlossen werden. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die durch Clopidogrel verursachte Schädigung der Magenschleimhaut mit Veränderungen in der Expression von Markern für ER-Stress und Apoptose assoziiert ist, obwohl weitere mechanistische Studien erforderlich sind, um kausale Zusammenhänge zu belegen.
Offenlegungen
Interessenkonflikt:
Die Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die den in dieser Studie beschriebenen Arbeiten Einfluss hätten verleihen können.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Projekt „Grundlagenforschung zum CHOP/ATF5/Bcl-2-Signalweg in der durch Clopidogrel induzierten Apoptose der Magenschleimhaut-Epithelzellen“ (Projekt-Nr. 2023BWKY009).
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Erkennungs-Kit | Elabscience | E-CK-A211 | Apoptose-Erkennungs-Kit |
| ATF5-Antikörper | Proteintech | 67066-1-AP | Primärantikörper |
| BCA-Proteinbestimmungs-Kit | Solarbio | PC0020 | Protein-Konzentrationsbestimmung |
| Bax-Antikörper | Proteintech | 50599-1-AP | Primärantikörper |
| Bcl-2-Antikörper | Proteintech | 26593-1-AP | Primärantikörper |
| β-Actin-Antikörper | Proteintech | 66009-1-Ig | Primärantikörper |
| Blockierpuffer | Beyotime | P0252 | Blockierungslösung für Western Blot |
| CCK-8-Zellzähl-Kit | KeyGen Biotech | KGA317 | Zellviabilitätsbestimmung |
| cDNA-Synthese-Kit | TransGen Biotech | AU341 | Kit zur Synthese der ersten cDNA-Stränge mit Entfernung genomischer DNA |
| Zellzykluserkennungs-Kit | Lianke Biotechnologie | CCS012 | Zellzyklusanalyse-Kit |
| CHOP-Antikörper | Proteintech | 15204-1-AP | Primärantikörper |
| Clopidogrel-Hydrogensulfat (Reinheit ≥99 %) | Macklin | C874834 | Experimenteller Wirkstoff |
| DAB-Chromogen-Kit | Beyotime | P0201M | Substrat für Immunhistochemie |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | MedChemExpress | HY-Y0320C | Lösungsmittel |
| Verstärktes Chemilumineszenz-(ECL-)Reagenz | Meilunbio | MA0186 | Chemilumineszenz-Substrat |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Zellkulturzusatz |
| GES-1 humane gastrale epitheliale Zelllinie | iCell Bioscience | iCell-h062 | Menschliche gastrale epitheliale Zelllinie |
| Hämatoxylin- und Eosin-(H&E-)Färbekit | Beyotime | C0105S | Historische Färbung |
| Sekundärantikörper, konjugiert mit Peroxidase aus Rettichwurzel (HRP) | Proteintech | RGAM001/RGAR001 | Sekundärantikörper |
| Wasserstoffperoxid-Lösung | Absin | ABS9333-100mL | Reagenz zur Blockierung endogener Peroxidasen |
| IL-1β-ELISA-Kit | MEIMIAN | MM-0047R2 | Serum-Zytokinbestimmung |
| IL-6-ELISA-Kit | MEIMIAN | MM-0190R2 | Serum-Zytokinbestimmung |
| Mikroplatten-Reader | Beijing Liuyi Biotechnologie | WD-2102B | Bestimmung der Absorption |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | Solarbio | P1400 | Antibiotikum-Lösung |
| Pufferlösung mit Phosphat und Kochsalz (PBS) | Servicebio | G4202-500ML | 1× PBS |
| Polyvinylidenfluorid-(PVDF-)Membran | Millipore | IPVH00010 | Membran für Western Blot |
| Verdünnungspuffer für Primärantikörper | Beyotime | P0023A | Antikörperverdünnungspuffer |
| Protein-Molekulargewichts-Marker | Yeasen | WJ103 | Prägefärbter Proteinmarker |
| Master-Mix für quantitative Echtzeit-PCR (SYBR Green) | CWBio | CW3008 | qPCR-Reagenz |
| Lysispuffer nach Radioimmunpräzipitation (RIPA) | Solarbio | R0010 | Proteinextraktionspuffer |
| RNAse A | Lianke Biotechnologie | CCS012 | Reagenz für Zellzyklusanalyse |
| RPMI-1640-Medium | Servicebio | G4535-500ML | Grundmedium für Zellkultur |
| Sprague-Dawley-Ratten | Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | N/A | SPF-Grad |
| TNF-α-ELISA-Kit | MEIMIAN | MM-0180R2 | Serum-Zytokinbestimmung |
| Gesamt-RNA-Extraktions-Kit | TransGen Biotech | ER501-01 | RNA-Extraktions-Kit |
| Trypsin-EDTA-Lösung | Solarbio | T1300 | Zell-Dissociationsreagenz |
Referenzen
- Mills JC, Shivdasani RA. Gastric epithelial stem cells. Gastroenterology. 2011;140(2):412-424.
- Zhou CB, et al. The role of pyroptosis in gastrointestinal cancer and immune responses to intestinal microbial infection. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019;1872(1):1-10.
- Boltin D, Niv Y. Pharmacological and alimentary alteration of the gastric barrier. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2014;28(6):981-994.
- Kwon DA, et al. Protective effects of a standardized extract (HemoHIM) using indomethacin- and ethanol/HCl-induced gastric mucosal injury models. Pharm Biol. 2019;57(1):543-549.
- Guo XZ, et al. Effect of Bax, Bcl-2 and Bcl-xL on regulating apoptosis in tissues of normal liver and hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2002;8(6):1059-1062.
- Gomi A, et al. Effect of Bifidobacterium bifidum BF-1 on gastric protection and mucin production in an acute gastric injury rat model. J Dairy Sci. 2013;96(2):832-837.
- Chiou SK, et al. Suppression of growth arrest and DNA damage-inducible 45alpha expression confers resistance to sulindac- and indomethacin-induced gastric mucosal injury. J Pharmacol Exp Ther. 2010;334(3):693-702.
- Chen X, et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):352.
- Lian X, et al. ATF5-regulated mitochondrial unfolded protein response attenuates neuronal damage in epileptic rats by reducing endoplasmic reticulum stress through mitochondrial ROS. Neurochem Res. 2024;49(2):388-401.
- He C, et al. Progression of gastrointestinal injury during antiplatelet therapy after percutaneous coronary intervention: a secondary analysis of the OPT-PEACE randomized clinical trial. JAMA Netw Open. 2023;6(11):e2343219.
- Zongdan J, et al. The mechanism of miR-363-3p/DUSP10 signaling pathway involved in the gastric mucosal injury induced by clopidogrel. Toxicol Mech Methods. 2021;31(2):150-158.
- Chan FK, et al. Clopidogrel versus aspirin and esomeprazole to prevent recurrent ulcer bleeding. N Engl J Med. 2005;352(3):238-244.
- Taha AS, et al. Upper gastrointestinal mucosal abnormalities and blood loss complicating low-dose aspirin and antithrombotic therapy. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23(4):489-495.
- Wu HL, et al. Increased endoplasmic reticulum stress response is involved in clopidogrel-induced apoptosis of gastric epithelial cells. PLoS One. 2013;8(9):e74381.
- Forsgard RA, et al. Intestinal permeability to iohexol as an in vivo marker of chemotherapy-induced gastrointestinal toxicity in Sprague-Dawley rats. Cancer Chemother Pharmacol. 2016;78(4):863-874.
- Wu H, et al. Clopidogrel-induced gastric injury in rats is attenuated by stable gastric pentadecapeptide BPC 157. Drug Des Devel Ther. 2020;14:5599-5610.
- Zhu XM, et al. The involvement of endoplasmic reticulum stress response in immune dysfunction of dendritic cells after severe thermal injury in mice. Oncotarget. 2017;8(6):9035-9052.
- Oakes SA, Papa FR. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 2015;10:173-194.
- Abrignani MG, et al. Gastroprotection in patients on antiplatelet and/or anticoagulant therapy: a position paper of the National Association of Hospital Cardiologists (ANMCO) and the Italian Association of Hospital Gastroenterologists and Endoscopists (AIGO). Eur J Intern Med. 2021;85:1-13.
- Takahashi K, et al. Influence of antiplatelet drugs on gastric ulcer healing after endoscopic submucosal dissection in patients with early gastric cancer. DEN Open. 2025;5(1).
- Wu H, et al. Role of MKP-5-p38/MAPK pathway in clopidogrel-induced gastric mucosal epithelial cells apoptosis and tight junction dysfunction. Am J Transl Res. 2020;12(5):1741-1753.
- Fu X, et al. Protective effect of teprenone on gastric mucosal injury induced by dual antiplatelet therapy in rats. Am J Transl Res. 2021;13(4):2702-2709.
- Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 2004;11(4):381-389.
- Sears TK, Angelastro JM. The transcription factor ATF5: role in cellular differentiation, stress responses, and cancer. Oncotarget. 2017;8(48):84595-84609.
- Zhang Y, et al. Puerarin attenuates neurological deficits via Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3 and Sirt3/SOD2 apoptotic pathways in subarachnoid hemorrhage mice. Biomed Pharmacother. 2019;109:726-733.
- Manas A, et al. Immunohistochemical detection of the pro-apoptotic BaxΔ2 protein in human tissues. Histochem Cell Biol. 2020;154(1):41-53.
Nachdrucke und Genehmigungen
Dieser Artikel wurde veröffentlicht
Video demnächst verfügbar