Profilierung elastischer Fasern im Lungengewebe mittels quantitativer bildgebender Analysen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Gewebevorbereitung für die Visualisierung elastischer Fasern und quantitative Profilierung im Mauslungengewebe. Diese Methode ermöglicht eine robuste Bewertung der Gewebearchitektur, der räumlichen Faserorganisation und der Remodellierung der extrazellulären Matrix unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Zusammenfassung

Die Remodellierung der pulmonalen extrazellulären Matrix (ECM) ist ein zentrales Merkmal von Lungenverletzungen und -erkrankungen. Elastische Fasern sind ein zentraler Bestandteil der Lungen-ECM, bieten die für die normale Atemfunktion notwendige Widerstandskraft und Rückstoß, und ihre Störung trägt zu einer beeinträchtigten Gewebemechanik bei. Dieses Protokoll beschreibt einen robusten, reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Vorbereitung und Analyse von Mauslungengewebe mit Schwerpunkt auf der Visualisierung und quantitativen Profilierung elastischer Fasern. Es beschreibt optimierte Gewebeverarbeitungs- und histologische Färbungsmethoden zur Erhaltung und Erkennung von Elastinstrukturen. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll eine Bildanalyse-Pipeline, die eine quantitative Bewertung der elastischen Faserhäufigkeit, Organisation und räumlicher Verteilung innerhalb der Lunge ermöglicht. Der Workflow integriert zudem die Schätzung von Fleckvektoren in QuPath, Farbdekonvolution in Fiji/ImageJ und TWOMBLI-basierte Bildanalyse, um eine quantitative Bewertung der elastischen Faseranzahl, Verzweigung und Netzwerkkomplexität zu ermöglichen. Strategien für Bildaufnahme, Auswahl von Interessensregionen, Parameteroptimierung und Qualitätskontrolle sind enthalten, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen und nutzerabhängige Verzerrungen zu minimieren. Mit diesem Workflow konnten wir erfolgreich Veränderungen in der Organisation elastischer Fasern und der Netzwerkarchitektur in den Lungen fettleibiger Mäuse identifizieren und ihre Anwendbarkeit zur Erkennung krankheitsassoziierter ECM-Umstrukturierung demonstrieren. Zusammen bieten diese Ansätze einen umfassenden Rahmen zur Untersuchung elastischer Faserremodellierung und deren Beitrag zur Gewebearchitektur unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Diese Methode erleichtert die Untersuchung fibroblastengetriebener struktureller Veränderungen und unterstützt mechanistische Einblicke in ECM-Veränderungen, die der Lungenerkrankung zugrunde liegen.

Einleitung

Elastische Fasern sind wesentliche Bestandteile der pulmonalen extrazellulären Matrix (ECM), die hauptsächlich aus Elastin und zugehörigen mikrofibrillaren Proteinen besteht, die sich zu hochorganisierten, widerstandsfähigen Netzwerken zusammensetzen¹. In der Lunge sind elastische Fasern entlang der Alveolarsepten und peribronchialen Strukturen angeordnet, wo sie die Elastizität und den Rückstoß bieten, die für die normale Atemmechanik^{erforderlich sind.} Als eine der häufigsten strukturellen ECM-Komponenten in Geweben wie Lunge, Aorta und Gebärmutter ist ihre Integrität entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gewebecompliance ^1,2. Eine Störung der Organisation elastischer Fasern wurde bei einer Reihe von Lungenerkrankungen beobachtet, darunter Fibrose, Emphysem und chronisch entzündliche Erkrankungen, bei denen eine veränderte Faserarchitektur zu einer beeinträchtigten Lungenfunktion und mechanischen Eigenschaften beiträgt ^2,3.

Das Lungenmatrisom wurde kürzlich charakterisiert und zeigt Kern-ECM-Proteine wie Kollagene und Laminine sowie matrisomassoziierte Komponenten wie Zytokine, ECM-Regulatoren und ECM-assoziierte Proteine (z. B. Integrin-Liganden, Galektine)^4,5. Über die strukturelle Unterstützung hinaus regulieren diese Komponenten die Gewebefunktion aktiv und bilden spezialisierte Nischen, die ansässige und wandernde Zellen ^6,7 unterstützen. Bemerkenswert ist, dass neuere Studien gezeigt haben, dass Stoffwechselerkrankungen wie Fettleibigkeit mit signifikanten Veränderungen der Organisation elastischer Fasern verbunden sind, was systemische metabolische Dysregulation mit Veränderungen der Lungen-ECM-Architektur und der Funktion von Fibroblasten in Verbindung bringt³. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung, elastische Faserumgestaltung als dynamischen und krankheitsrelevanten Prozess zu verstehen.

Die konventionelle Bewertung elastischer Fasern basiert oft auf qualitativer histologischer Bewertung, semi-quantitativen Bewertungssystemen oder Messungen der Elastinhäufigkeit, die nur begrenzte Informationen zur Faserorganisation, Konnektivität und Netzwerkkomplexität^{liefern 8,9}. Obwohl diese Ansätze nützlich sind, um grobe Veränderungen des Elastingehalts zu erkennen, erfassen sie möglicherweise nicht subtile architektonische Veränderungen im Zusammenhang mit der Geweberemodellierung. Quantitative bildbasierte Analysen haben das Potenzial, diese Einschränkungen zu überwinden, indem sie eine objektive und reproduzierbare Charakterisierung elastischer Glasfasernetze ermöglichen und Vergleiche zwischen experimentellen Bedingungen und Studien erleichtern. Um dies zu beheben, ermöglicht das hier beschriebene Protokoll eine integrierte Analyse der pulmonalen ECM-Organisation mit besonderem Fokus auf die elastische Faserarchitektur. Neben etablierten Ansätzen zur ECM-Charakterisierung ^4,5 integriert dieser Workflow Elastica-Färbung und eine auf TWOMBLI basierende^{10-Bildanalyse-Pipeline}, die für die Lungengewebearchitektur optimiert ist. Durch die Kombination von Elastica-Färbung mit quantitativer Netzwerkanalyse geht dieser Workflow über die konventionelle histologische Bewertung hinaus und ermöglicht eine detaillierte Charakterisierung von Faserhäufigkeit, Fragmentierung, räumlicher Organisation und struktureller Komplexität. Das Protokoll eignet sich besonders gut für Studien zur Untersuchung von Fibrose, Emphysem, fettleibigkeitsassoziierter Lungenremodellierung, entzündlichen Lungenerkrankungen, Alterung und anderen Erkrankungen, die durch extrazelluläre Matrix-Remodellierung in der Lunge gekennzeichnet sind.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Mausexperimente wurden gemäß der Genehmigung des Tierethikausschusses des Bundeslandes Nordrhein-Westfalen, Deutschland, durchgeführt (AZ: 81-02.04.2021.A221).

HINWEIS: Tragen Sie während des gesamten Eingriffs geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe, Augenschutz).

1. Probenahme und Vorbereitung von Mauslungengewebe

HINWEIS: Mäuse wurden gemäß institutionellen und behördlichen Richtlinien vor der Gewebeentnahme durch eine Isofluran-Überdosis eingeschläfert.

1. Öffnen Sie vorsichtig die Brusthöhle mit einem Mittellinienschnitt, schneiden Sie dann das Zwerchfell entlang des Ansatzes ab und legen Sie vorsichtig die Lunge frei.
2. Entfernen Sie die gesamte Lunge, indem Sie den rechten und linken Lappen gemeinsam entfernen und darauf achten, dass alle Lappen intakt bleiben.
3. Setzen Sie die Lungenlappen einzeln in ein 5-ml-Rohr mit 2 ml 10 % neutralem gepuffertem Formalin und inkubieren Sie 15–20 Stunden bei 4 °C.
   HINWEIS: Die Fixierung bewahrt die Gewebearchitektur für nachfolgende histologische und elastische Faseranalysen. Da das Hauptziel dieses Workflows die Visualisierung und quantitative Bewertung elastischer Faserorganisation und nicht alveoläre morphometrische Analysen war, wurden die Lungen vor der Gewebeverarbeitung nicht inflationsfixiert.
   VORSICHT: Neutral gepuffertes Formalin enthält Formaldehyd, das giftig, krebserregend ist und Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen verursachen kann. Handhabt Formalin in einer zertifizierten chemischen Abzughaube, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen, darunter Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille.
4. Das fixierte Lungengewebe in Paraffin einbetten mit einem standardisierten histologischen Einbettungsprotokoll¹¹.
   HINWEIS: Gewährleisten Sie vollständige Dehydrierung und Paraffininfiltration, um die Gewebemorphologie für die anschließende Färbung zu erhalten. Um die Variabilität zwischen den Proben zu minimieren und die Kompatibilität zwischen experimentellen Bedingungen zu gewährleisten, verwenden Sie für jede Analyse immer dieselben Lungenlappen. Für die Histologie wird empfohlen, den linken Lappen zu verwenden.
5. Schneiden Sie das FFPE-Lungengewebe mit einem Mikrotom in 5–7 μm dicke Abschnitte und montieren Sie diese auf Standard-Glasobjektträgern. Backen Sie die Objektträger bei 60 °C für 1 Stunde, bevor Sie mit den nachgelagerten Anwendungen fortfahren. Objektträger können mehrere Wochen in einer staubfreien Umgebung bei RT oder bei 4 °C zur Langzeitlagerung gelagert werden.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Feuchtigkeitsexposition während der Lagerung, da Feuchtigkeit zu einer Paraffinoxidation führen und die Verfärbungsqualität beeinträchtigen kann. Lagern Sie die Objektträger in einer versiegelten Kunststoffschachtel mit Trockenmittel, falls eine Langzeitlagerung erforderlich ist.
   Pausepunkt: Lagern Sie die Objektträger bei RT oder 4 °C bis zur Färbung.

2. Elastische Faserverfärbung

1. Führen Sie eine Elastica-Färbung (Resorcin-Fuchsin) auf 5–7 μm großen paraffinhaltigen Lungengewebeschnitten durch, um elastische Fasern in den alveolaren und gefäßen Strukturen sichtbar zu machen.
   HINWEIS: Färben Sie nur so viele Objektträger gleichzeitig, wie möglich sind, um eine gleichmäßige Färbungsintensität und Reproduzierbarkeit über die Proben hinweg zu gewährleisten.
   1. Deparaffinierte Objektträger, indem die Objektträger jeweils zweimal für 5 Minuten in Xylol (gemischte Isomere) eingetaucht werden.
      VORSICHT: Xylol ist giftig und entflammbar. Führen Sie es mit einer chemischen Abzugshaube und tragen Sie geeignete Schutzausrüstung.
   2. Rehydrieren Sie die Slides in absteigender Ethanolserie bis zu 80 % Ethanol.
      1. Inkubiere den Objektträger 3 Minuten bei RT in einer Färbekammer, die mit 100 % Ethanol gefüllt ist.
      2. Transferiere den Folie auf frisches, 100% Ethanol und inkubiere 3 Minuten bei RT.
      3. Transferiere den Slide auf 95 % Ethanol und inkubiere 3 Minuten bei RT.
      4. Transferiere den Schlitten auf 80 % Ethanol und inkubiere 3 Minuten bei RT.
   3. Bringen Sie den Objektträger in eine neue Färbekammer mit Resorcin-Fuchsin-Lösung und inkubieren Sie 20–30 Minuten bei RT.
      HINWEIS: Resorcin-Fuchsin-Färbungslösung kann mehrfach verwendet werden und ist bei RT stabil.
      VORSICHT: Die Resorcin-Fuchsin-Färbungslösung enthält potenziell gefährliche Chemikalien, darunter konzentrierte Säuren und Farbstoffe, die Haut- und Augenreizungen verursachen können. Behandeln Sie die Lösung in einem gut belüfteten Bereich oder in einer Abzugshaube und tragen Sie entsprechende persönliche Schutzausrüstung gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien.
   4. Stelle den Folie in eine Färbekammer unter fließendes destilliertes Wasser und wasche sie 1 Minute lang.
   5. Unterscheide bei 95–96 % Ethanol: 15–60 S, unter dem Mikroskop überwacht.
      HINWEIS: Hören Sie auf, wenn elastische Fasern noch tief violett und der Hintergrund ausreichend entfernt ist. Gefärbte elastische Fasern erscheinen dunkelviolett. Kollagenfasern bleiben unverfärbt und wirken typischerweise blass. Überfärbung kann den Hintergrund verstärken; Passen Sie die Inkubationszeit je nach Gewebedicke und Fixation an.
   6. Stoppen Sie die Differenzierung, indem Sie den Objektträger sofort in bidistilliertes Wasser überführen und 30 Sekunden lang abspülen. Optional: Gegenfärbung kann bei Bedarf für eine zusätzliche Lungenuntersuchung durchgeführt werden, kann jedoch die Effizienz der Fasersegmentierung verringern. Wir empfehlen eine H&E-Färbung, um die Lunge an benachbarten Schnitten zu untersuchen.
   7. Dehydrieren Sie die Objektträger nacheinander in 95 % Ethanol für 1–2 Minuten, gefolgt von 100 % Ethanol zweimal für jeweils 1–2 Minuten, um Restwasser zu entfernen.
   8. Reinigen Sie die Schnitte zweimal mit Xylol für 3 Minuten, bis das Gewebe optisch transparent erscheint.
   9. Deckfolien mit einem xylenkompatiblen permanenten synthetischen Harz montieren und die Verschlüsse flach bei RT trocknen.
      HINWEIS: Vollständige Dehydrierung und Reinigung sind unerlässlich, um Trübungen zu vermeiden und die verfärbte Bereiche langfristig zu erhalten.
      Pausenpunkt: Lagern befleckte montierte Objektträger bei RT bis zur Bildaufnahme.

3. Elastische Faserbildgebung und Netzwerkanalyse

1. Bildaufnahme
   1. Erfassen Sie hochauflösende Hellfeldbilder von Lungengewebeschnitten mit einem Objektträger mit einem 40×-Objektiv. Achten Sie auf gleichmäßige Belichtungs- und Weißabgleichseinstellungen in allen Proben.
      HINWEIS: Die Bilder wurden während der gesamten Studie mit identischen Scannereinstellungen aufgenommen, einschließlich Vergrößerung, räumlicher Auflösung (0,25 μm/Pixel), Beleuchtung und Belichtung.
   2. Zeichnen Sie ein Interessengebiet (ROI), das den gesamten Lungengewebeschnitt umfasst, um eine vollständige Abdeckung während des Scans sicherzustellen.
   3. Definieren Sie einen Hintergrundreferenzbereich ohne Gewebe zur Messung und subtrahieren Sie die Hintergrundintensität während der Bildanalyse.
   4. Nutzen Sie die automatische Fokussierungserkennung des Scanners, um eine optimale Anzahl von Brennpunkten im Gewebe zuzuweisen und so einheitliche Schärfe und Bildqualität zu gewährleisten.
   5. Nehmen Sie das Bild mit gleichmäßigen Beleuchtungs- und Belichtungseinstellungen auf.
      HINWEIS: Wenn die automatische Fokussierung in dichten oder ungleichmäßigen Bereichen fehlschlägt, verwenden Sie manuelle Feinfokussierung, um sicherzustellen, dass alle Gewebestrukturen, einschließlich alveolaren und gefäßreichen Bereichen, scharf erfasst werden.
2. Bilddekonvolution: Fleckvektor-Schätzung in QuPath¹². Färbevektoren stellen die spezifischen RGB-Absorptionswerte jedes histologischen Farbstoffs dar und ermöglichen so die Trennung überlappender Färbungen während der Farbdekonvolution.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurden Fleckvektoren in QuPath definiert, da vordefinierte Färbevektoren für Resorcin-Fuchsin in Fiji nicht verfügbar sind.
   1. Öffnen Sie das Bild in QuPath und wählen Sie den Brightfield-Bildtyp aus.
      HINWEIS: Um Verzerrung zu minimieren, berechnen Sie Fleckenvektoren mit repräsentativen Bildern aus dem Datensatz und wenden Sie auf alle Bilder dieselben Werte an.
   2. Zeichnen Sie ein Interessengebiet (ROI), das überwiegend elastische Fasern enthält, um die erste Fleckenkomponente zu definieren.
   3. Im Reiter Bild navigiere zu den Fleckenvektor-Abschnitten.
   4. Klicke auf Fleck 1 und setze dann den Fleckenvektor aus ROI, um den Farbvektor für elastische Fasern (typischerweise lila-violett) zu definieren.
   5. Wählen Sie einen ROI aus, der nicht-elastisches Gewebe (z. B. Hintergrund oder Kollagen) enthält, klicken Sie auf Fleck 2, dann setzen Sie den Farbvektor aus dem ROI ein, um die sekundäre Farbkomponente zu definieren.
   6. QuPath berechnet automatisch Fleck 3, entsprechend dem Hintergrund.
   7. Ein Beispiel für in Fidschi berechnete und angewandte Vektoren: Resorcin-Fuchsin R:0,6201225, G:0,6541292, B:0,43308553; Unspezifisches Signal R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295; Hintergrund R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665.
      HINWEIS: Diese Werte wurden für Bilder gefärbt, die nur mit Resorcin-Fuchsin gefärbt wurden. Wenn eine Gegenfärbung vorhanden ist, müssen neue Färbungsvektoren berechnet werden.
   8. Speichere diese als benutzerdefinierte Färbungsvektoren und wende sie für eine konsistente Farbdekonvolution über alle Proben hinweg an.
      HINWEIS: Die Definition benutzerdefinierter Färbungsvektoren aus repräsentativen Regionen verbessert die Genauigkeit der Farbdekonvolution, insbesondere bei Resorcin-Fuchsin-Färbung, wo Elastin- und Hintergrundtöne je nach Charge variieren können.
3. Bildfarb-Dekonfaltion in Fidschi^13,14.
   1. Öffne Fiji (ImageJ) und lade das Brightfield-Bild des gefärbten Gewebeschnitts.
   2. Optional: Transformieren Sie das Bild nur dann in RGB-Format (Bild → Typ → RGB Color), wenn das Bild nicht bereits in RGB ist (z. B. 8-Bit-Bilder). Dieser Schritt öffnet ein neues Bildfenster; Speichere es, um die ursprünglichen Rohdaten zu erhalten.
   3. Führen Sie Farbdekonvalution durch, indem Sie Bild > Farbe > Farbdekonvolution > Benutzerwerte auswählen.
   4. Hier kommt der zuvor von QuPath erhaltene benutzerdefinierte Fleckvektor ins Spiel.
   5. Führe das Plugin aus, um drei separate Graustufenbilder zu erzeugen, die elastischen Fasern, Gewebe ohne elastische Fasern und Hintergrund entsprechen.
   6. Verwenden Sie Bilder direkt für TWOMBLI ohne zusätzliche Vorverarbeitung. TWOMBLI benötigt scharfe Bilder mit ausreichender Auflösung; Glättung (z. B. Gaußsche Unschärfe) sollte vermieden werden, um strukturelle Details zu erhalten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die in QuPath für die Vektorschätzung ausgewählten Regionen repräsentativ für die typische Färbung sind, da diese benutzerdefinierten Vektoren für einen konsistenten Vergleich auf alle Bilder einheitlich angewendet werden.
   7. Speichere den elastischen Faserkanal als TIFF-Datei für die nachgeschaltete Quantifizierung und Analyse.
4. ROI-Auswahl für die Faseranalyse
   1. Für jeden Lungenabschnitt wählen Sie fünf unvoreingenommene quadratische ROIs im Alveolarbereich und fünf ROIs im peribronchiolaren Bereich (jeweils 100 μm x 100 μm).
   2. Duplizieren Sie jeden ROI auf dem RAW-Bild (Bild > Duplikat), um die Originaldaten zu erhalten.
   3. Duplizieren Sie dieselben ROIs in der Analyse der dekonvolutierten elastischen Fasern.
   4. Speichere alle duplizierten ROIs als einzelne TIFF-Dateien für die nachgelagerte Analyse.
      HINWEIS: Bereiche mit Gewebefalten, Schnittartefakten, Rissen, großen Blutgefäßen oder schlecht erhaltener alveolarer Architektur wurden von der Analyse ausgeschlossen. Nur die dekonvolvierten elastischen Faser-ROIs wurden als Eingabe für die TWOMBLI-Analyse verwendet, während entsprechende Rohbildduplikate als Referenzdateien für Qualitätskontrolle und visuelle Inspektion erhalten blieben. Interessensgebiete (ROIs) sollten systematisch zufällig ausgewählt werden, um eine unvoreingenommene Darstellung des Gewebes sicherzustellen. Um Operator-Bias weiter zu minimieren, wird in Supplementary File 1 und Supplementary File 2 ein automatisiertes ROI-Auswahlskript bereitgestellt, das mit QuPath kompatibel ist, und dessen Implementierung wird in Abschnitt 3.5 beschrieben.
5. Anwendung der automatisierten ROI-Auswahl in QuPath mit einem automatisierten ROI-Auswahlskript.
   1. Öffne das Bild in QuPath und setze den Bildtyp auf Brightfield.
   2. Im Menü Tools wählen Sie das gewünschte Annotationswerkzeug aus, um die Anfangsanmerkungen zu erstellen. Quadratische Anmerkungen werden empfohlen.
   3. Zeichne quadratische Anmerkungen im Lungengewebe. Jede Annotation sollte nur einen Bereich von Interesse (ROI) für die Analyse umfassen, entweder einen alveolaren Bereich oder einen peribronchialen Bereich.
   4. Sobald die Annotationen erstellt wurden, navigieren Sie zu Annotations und wählen Sie Annotations Lock, um versehentliche Bewegungen oder Änderungen zu verhindern.
   5. Füge die Klassen "Alveolen" und "peribronchialer Bereich" zur Klassenliste hinzu, indem du auf die Schaltfläche "+" neben der Klassenliste im Annotationsfeld klickst.
   6. Weise jede Annotation der entsprechenden Klasse zu. Wähle eine Anmerkung, wähle die entsprechende Klasse und klicke auf Set selected. Die Annotationsfarbe ändert sich, und die zugewiesene Klasse ("Alveolen" oder "peribronchiales Areal") wird im Annotationseigenschaften-Panel angezeigt.
   7. Öffne das entsprechende Skript und führe es aus. Nach Abschluss wird eine Nachricht anzeigen, dass die ROIs erfolgreich generiert wurden. Die neu erstellten ROIs erscheinen in der Annotationshierarchie als Kindannotationen der ursprünglichen klassendefinierenden Annotation.
   8. Um die ROIs zu exportieren, wählen Sie sie aus und navigieren Sie zu File → Export Images → Original Pixels. Speichere die exportierten ROIs als TIFF-Dateien.
      HINWEIS: Die Skripte sind so konzipiert, dass sie nur die Klassennamen "Alveoli" und "peribronchialer Bereich" erkennen. Diese Namen müssen genau wie angegeben eingegeben werden. Standardmäßig erzeugen die Skripte zufällig fünf nicht überlappende quadratische ROIs mit 100 μm × 100 μm innerhalb jeder Annotation. Kandidaten-ROIs werden nur akzeptiert, wenn ihre Ecken und ihr Zentrum vollständig innerhalb der Annotationsgrenzen liegen, was eine vollständige Aufnahme in den ausgewählten Bereich sicherstellt. Sowohl die Anzahl als auch die Maße der ROIs können innerhalb des Skripts angepasst werden, um spezifische experimentelle Anforderungen zu erfüllen. Für Analysen werden mindestens drei biologische Replikate und mindestens fünf ROIs pro Probe empfohlen.
6. TWOMBLI-Analyse
   1. Speichern Sie alle ROI-Bilder elastischer Fasern in einem speziellen Ordner zur Analyse.
   2. Erstelle zwei Unterordner innerhalb des Arbeitsverzeichnisses: a. Maskenordner – für binäre Masken, die von TWOMBLI generiert wurden. b. HDM-Ordner – für High-Density Matrix (HDM)-Bilder, die von TWOMBLI generiert wurden.
   3. Starte das TWOMBLI-Plugin: Öffne Fiji und starte TWOMBLI (Plugins -> Macros -> Run).
   4. Wählen Sie die entsprechende Analyseparameterdatei aus. Die folgenden TWOMBLI-Parameter wurden für die Analyse elastischer Fasern verwendet, aufgeführt in Tabelle 1.
      HINWEIS: Diese Parameter können je nach Färbungsintensität variieren. Die Parameter wurden empirisch optimiert anhand mehrerer repräsentativer Bilder von Lungengewebeschnitten, die unter standardisierten Bedingungen gefärbt wurden. Die Optimierung erfolgte, indem die erzeugten Masken mit dem ursprünglichen Färbungsmuster verglichen und die Einstellungen ausgewählt wurden, die die beste Überlappung zwischen der segmentierten Maske und dem zugrunde liegenden elastischen Glasfasernetz boten. Nach der Etablierung wurden dieselben Parameter auf alle Bilder im Datensatz angewendet.
   5. Wähle die Option "dunkle Fasern über hellen Hintergrund".
   6. Generiere und speichere binäre Masken im Mask-Ordner.
   7. Generiere und speichere Binärbilder im HDM-Ordner.
   8. Quantitative Netzwerkparameter wie Faserlänge, Verzweigungspunkte, Krümmung, Dichte und Ausrichtung extrahieren.
      HINWEIS: Die TWOMBLI-Analyse erfordert scharfe, hochauflösende Bilder (>1 Pixel/μm). Schlechte Farbdekonvolution, unscharfe Bereiche oder Bildkompression können die Genauigkeit der Glasfasernetzquantifizierung beeinträchtigen.
7. Quantifizierung und statistische Analyse
   1. Exportiere TWOMBLI-Netzwerkparameter als CSV-Datei.
   2. Importiere die Roh-CSV-Daten in GraphPad Prism zur statistischen Analyse und Visualisierung.
      HINWEIS: Folgender Parameter wird empfohlen: Masken-Gesamtlänge, die die Gesamtmenge elastischer Fasern innerhalb der ROI widerspiegelt und so die Quantifizierung von Faserhäufigkeit und -verlust ermöglicht. Faserendpunkte geben den Grad der Glasfaserfragmentierung an; Eine erhöhte Anzahl von Endpunkten deutet auf gestörte oder gebrochene Fasern hin. Faserverzweigungen messen, wie miteinander verbundene Fasern sind, was die strukturelle Komplexität und Integrität des ECM-Netzwerks widerspiegelt. Eine höhere Anzahl von Verzweigungspunkten weist auf ein komplexeres und verflochteres Netzwerk hin. Lacunarität quantifiziert die Homogenität der Faserverteilung über die ROI. Niedrige Lacunarität weist auf ein einheitliches Netzwerk mit ähnlich großen Lücken hin, während hohe Lacunarität ein heterogenes Netzwerk mit variablen Lückengrößen widerspiegelt, was eine komplexere Struktur beschreibt. Box Counting-Fractal Dimension erfasst die Komplexität der Glasfaserarchitektur. Höhere fraktale Dimensionswerte deuten auf komplexere und detailliertere Netzwerke hin, während niedrigere Werte auf einfachere oder gestörte Strukturen hinweisen.
   3. Erzeugen Sie Spaltendiagramme, die den Mittelwert ± SEM für jeden quantifizierten Netzwerkparameter (z. B. Faserlänge, Verzweigung, Krümmung und Dichte) anzeigen.
   4. Testdatennormalität mit dem Shapiro-Wilk-Test. Für parametrische Daten wenden Sie einen zweiseitigen, ungepaarten Studenten-t-Test an. Für nichtparametrische Daten wenden Sie einen Mann-Whitney-U-Test an. Für Vergleiche mit mehr als zwei experimentellen Gruppen sollte eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von einem geeigneten Post-hoc-Mehrfachvergleichstest oder einem Kruskal–Wallis-Test für nichtparametrische Daten angewendet werden.
      HINWEIS: Bewahren Sie alle rohen CSV-Dateien unverändert, um Reproduzierbarkeit und Rückverfolgbarkeit der Daten sicherzustellen. Geben Sie in den Abbildungslegenden die Anzahl der analysierten ROIs und biologischen Replikaten für jede Erkrankung an.

Ergebnisse

Dieses Protokoll stellt quantitative Parameter des elastischen Fasernetzwerks über verschiedene Lungenregionen und experimentelle Bedingungen hinweg. Die zuvor beschriebene TWOMBLI-Analyse liefert Parameter wie Faserlänge, Verzweigungsdichte, Lacunität und fraktale Dimension für die Bewertung der extrazellulären Matrix¹⁰. Aufbauend auf diesem Rahmen ermöglicht unser Ansatz eine umfassende Charakterisierung der elastischen Faserorganisation, die die Bewertung von Veränderungen in Faserhäufigkeit, Konnektivität, Gleichmäßigkeit und struktureller Komplexität sowohl in physiologischen als auch pathologischen Lungengeweben ermöglicht.

In gesundem Lungengewebe bilden elastische Fasern lange, kontinuierliche und gut ausgerichtete Netzwerke entlang der Alveolarsepta und der peribronchialen Strukturen. Im Gegensatz dazu zeigen pathologische oder metabolisch veränderte Lungen, wie die von fettleibigen Mäusen, oft eine erhöhte Verzweigung und eine größere Netzwerkkomplexität, was Veränderungen in der elastischen Faserorganisation³ widerspiegelt. Repräsentative Ausgaben, einschließlich binärer Masken und quantitativer Parameter, sind in Abbildung 1A, B dargestellt. Diese Ergebnisse können mit histologischen und molekularen Analysen kombiniert werden, um die ECM-Integrität und das Ausmaß der Remodellierung^zu bewerten. Lacunarität und Lückenfüllung werden im gesunden Lungengewebe demonstriert, um Unterschiede in der ECM-Organisation zu visualisieren (Abbildung 1C). In Kombination mit anderen quantitativen Kennzahlen erfassen diese Parameter die Netzwerkkomplexität und zeigen Veränderungen in der Gewebearchitektur, die durch ECM-Reorganisation angetrieben werden, wodurch Einblicke in unterschiedliche Muster struktureller Umstrukturierung innerhalb des elastischen Fasernetzwerks geliefert werden.

Eine genaue Interpretation dieser quantitativen Ergebnisse hängt entscheidend von hochwertiger Bildaufnahme und -verarbeitung ab. Suboptimale Bildgebungs- oder Verarbeitungsbedingungen, darunter schlechte Schärfe, inkonsistente Beleuchtung oder ungenaue Schätzung von Fleckvektoren, können zu fragmentierten oder verrauschten Masken und folglich zu unzuverlässigen quantitativen Ergebnissen führen (Abbildung 1D). Daher ist eine sorgfältige visuelle Inspektion von Rohbildern und Segmentierungsergebnissen unerlässlich, um die Datenqualität vor der Interpretation sicherzustellen. Suboptimale Masken können typischerweise an übermäßiger Fragmentierung kontinuierlicher Fasern, diskontinuierlicher oder unvollständiger Segmentierung, Einbindung von Hintergrundrauschen als Faserstrukturen oder einer schlechten Überlappung zwischen dem ursprünglichen Färbungsmuster und der erzeugten Maske erkannt werden, was darauf hindeutet, dass Bildaufnahme, Fleckvektorschätzung oder Segmentierungsparameter neu bewertet werden sollten. Um diese Merkmale zu veranschaulichen, wurden Schnitte mit Gegenfärbung gezielt analysiert, was die Identifikation elastischer Fasern stört und zu suboptimaler Segmentierung führt. Ein Beispiel für eine solche minderwertige Maske ist in Abbildung 1E dargestellt. Um die Robustheit und Reproduzierbarkeit des Workflows weiter zu bewerten, wurden Bilddatensätze unabhängig voneinander von zwei Forschern mit denselben optimierten Analyseparametern analysiert (Abbildung 2A). Zusätzlich wurden Proben unabhängiger Tiere einbezogen, um die biologische Variabilität zu bewerten (Abbildung 2B). Vergleichbare quantitative Ergebnisse wurden über Operatoren und biologische Replikate hinweg erzielt, was die Reproduzierbarkeit und Benutzerunabhängigkeit der vorgeschlagenen Bildanalyse-Pipeline unterstützt. Zusammen zeigen diese Analysen, dass der Arbeitsablauf eine robuste Bewertung der Organisation elastischer Fasern ermöglicht und Vergleiche zwischen physiologischen und pathologischen Bedingungen erleichtert.

Abbildung 1. Workflow zur Analyse der Elastica-Färbung. (A) Repräsentatives Rohbild, isoliertes elastisches Fasersignal erhalten durch Bilddekonvolution, binäre Maske erzeugt mit TWOMBLI und Überlagerung der ursprünglichen elastischen Fasern mit der entsprechenden Maske, was eine genaue Segmentierung zeigt. (B) Repräsentative quantitative Parameter, die durch TWOMBLI-Analyse generiert werden. (C) Beispiele für Lacunitäts- und Lückenfüllungsanalysen im gesunden Mauslungengewebe zur Veranschaulichung von Unterschieden in der Organisation der extrazellulären Matrix. (D) Darstellung fragmentierter und verrauschter Masken, die durch suboptimale Bildaufnahme oder Bildverarbeitung entstehen. (E) Gewebeschnitt mit Hämatoxylin und Eosin gegenfärbt, was eine beeinträchtigte elastische Fasererkennung und suboptimale Maskenbildung zeigt. Bereiche mit schlechter Übereinstimmung zwischen dem ursprünglichen Färbungsmuster und der erzeugten Maske sind angezeigt. Maßstab A, D = 100 μm, E = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2. Reproduzierbarkeit und Robustheit des Workflows zur Analyse elastischer Fasern. (A) Bilddatensätze wurden unabhängig von zwei Forschern unter Verwendung von TWOMBLI-Analyseparametern analysiert, um die Interoperator-Reproduzierbarkeit zu bewerten. Quantitative von TWOMBLI abgeleitete Kennzahlen werden dargestellt. A und B geben die beiden unabhängigen Operatoren an. (B) Proben unabhängiger Tiere wurden analysiert, um die biologische Variabilität zu bewerten. Quantitative von TWOMBLI abgeleitete Metriken werden dargestellt, die vergleichbare Ergebnisse über biologische Replikate hinweg zeigen und die Robustheit der Analysepipeline unterstützen. M1, M2 und M3 deuten auf einzelne gesunde Tiere hin. n = 3, Die statistische Analyse wurde mit Einweg-ANOVA durchgeführt, gefolgt vom Dunnett-Mehrfachvergleichstest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Parameter	Werte
Kontrastsättigung	0.75
Minimale Leitungsbreite	5
Maximale Leitungsbreite	10
Minimun-Krümmungsfenster	20
Maximun-Krümmungsfenster	80
Minimun-Zweiglänge	10
Maximun HDM-Display	175
Minimun-Spaltdurchmesser	0

Tabelle 1: Zusammenfassung der von TWOMBLI abgeleiteten quantitativen Parameter. Überblick über die von TWOMBLI generierten Parameter und deren Interpretation zur Bewertung der elastischen Faserarchitektur im Lungengewebe. Kennzahlen umfassen Maße wie Glasfaserhäufigkeit, Verzweigungen, Ausrichtung, Konnektivität und Netzwerkorganisation.

Ergänzende Datei 1: Unparteiische ROI-Alveolen Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 2: Unvoreingenommener ROI peribronchialer Bereich Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen robusten, reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Untersuchung der Architektur der musinen pulmonalen extrazellulären Matrix (ECM), mit besonderem Fokus auf fibroblastgetriebene elastische Faserremodellierung. Elastische Fasern sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Lungencompliance und des Rückstoßs, und ihre Störung ist ein Kennzeichen mehrerer Lungenerkrankungen, darunter Fibrose, Lungenverletzungen, Alterung und Stoffwechselerkrankungen². Trotz ihrer zentralen funktionalen Rolle blieb die quantitative Bewertung der Organisation und Montage elastischer Fasern begrenzt. Der Workflow schließt diese Lücke, indem er eine systematische und quantitative Charakterisierung der elastischen Glasfasernetzwerkarchitektur ermöglicht.

Eine große Stärke dieser Methode liegt in der Integration eines quantitativen Bildverarbeitungs-Workflows mit der strukturellen Histologieanalyse. Während herkömmliche Ansätze oft die ECM-Zusammensetzung oder histologische Merkmale separat bewerten, ermöglicht dieses Protokoll eine objektive Quantifizierung der elastischen Faserorganisation, einschließlich Faserlänge, Verzweigung und Netzwerkkomplexität. Dies ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen physiologischen und pathologischen Bedingungen und liefert Einblicke in die fibroblastvermittelte ECM-Remodellierung³.

Allerdings sind mehrere technische Aspekte entscheidend, um experimentelle Konsistenz und Datenqualität sicherzustellen. Die Resorcin-Fuchsin-Färbung ist empfindlich gegenüber Variablen wie Fixierungszeit, Schnittdicke und Konsistenz des Reagens, was Standardisierung für die Reproduzierbarkeit unerlässlich macht. Die quantitativen Ergebnisse von TWOMBLI hängen von Bildqualität, Auflösung und konsistenter Auswahl des Interessensbereichs ab und müssen daher parallel zur histologischen Bewertung interpretiert und über mehrere Proben hinweg validiert werden. Darüber hinaus unterscheiden sich Faserdichte und -morphologie zwischen alveolaren und peribronchialen Regionen, was eine regionsspezifische Optimierung erfordert. Dieser Ansatz erfasst die globale Organisation des elastischen Glasfasernetzes in zwei Dimensionen und löst keine ultrastrukturellen Merkmale auf, die höherauflösende Techniken wie die Elektronenmikroskopie erfordern. Dreidimensionale Bildgebungsverfahren, einschließlich Konfokal- oder Multiphotonenmikroskopie, können die Analyse der Fasergeometrie und -konnektivität weiter verbessern.

Mehrere Schritte im Workflow sind besonders entscheidend, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen. Gewebefixierung, Schnittqualität und konsistente Resorcin-Fuchsin-Färbung beeinflussen die Sichtbarkeit elastischer Fasern erheblich und sollten daher sorgfältig standardisiert werden.  Schlechte Färbintensität, ungleichmäßige Färbungen oder hoher Hintergrund können durch variable Reagenzienqualität, inkonsistente Färbungsbedingungen oder unzureichende Gewebekonservierung verursacht werden. Zusätzlich wird empfohlen, gesundes und krank Lungengewebe, technische Färbungskontrollen und Referenzproben aus experimentellen Chargen einzubeziehen, um die Konsistenz der Färbung und die analytische Robustheit zu überwachen. Gewebe, die reich an elastischen Fasern sind, können zudem als positive Kontrollmechanismen dienen, um Bildaufnahme- und Segmentierungsverfahren zu validieren. Eine genaue Schätzung des Fleckvektors während der Bilddekonvolution ist ein weiterer wesentlicher Schritt, da eine ungeeignete Vektorauswahl zu unvollständiger Faserextraktion und fragmentierten Masken führen kann. Je nach experimenteller Frage kann der Workflow durch Anpassung der ROI-Größe und -Zahl, Anpassung von Bildverarbeitungsparametern oder Integration dreidimensionaler Bildansätze zur weiteren Untersuchung elastischer Faserorganisation angepasst werden.

Insgesamt stellt diese Methode eine vielseitige Plattform dar, um ECM-Remodellierung sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Kontexten zu untersuchen. Da die elastische Faserintegrität direkt mit der Lungenkomplibilität und mechanischer Funktion verknüpft ist, ist dieser Ansatz besonders wichtig, um zu verstehen, wie strukturelle Veränderungen im ECM sich in Veränderungen der Lungenfunktion übersetzen. Sie eignet sich hervorragend zur Untersuchung fibroblastgetriebener struktureller Veränderungen und bietet neue Möglichkeiten, ECM-Remodellierung und ihren Beitrag zum Krankheitsverlauf und zur Gewebefunktion besser zu verstehen. Der Ansatz kann auch auf andere Gewebe ausgeweitet werden, darunter Herz-Kreislauf-Gewebe, Haut, Gebärmutter, Bindegewebserkrankungen, fibrotische Organe und menschliche Proben, oder mit fortschrittlichen räumlichen und hochauflösenden Bildgebungstechniken kombiniert werden, um seine Anwendbarkeit weiter zu erweitern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	version 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	version 11
Qupath		https://qupath.github.io	version 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172