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Forschungsartikel

Effekte von Qi-fu-yin auf die Verbesserung kognitiver Beeinträchtigungen und die Reduktion der zellulären Seneszenz in den Gehirnen von 5xFAD-Mäusen

111 Aufrufe

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DOI:

10.3791/72118

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8. September 2026

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1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie evaluiert die Behandlung mit Qi-fu-yin (QFY) bei 5xFAD-Mäusen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Gabe von QFY mit einer verbesserten Lern- und Gedächtnisleistung, einer verminderten zerebralen Aβ-Ablagerung und zellulären Seneszenz sowie einer abgeschwächten synaptischen Strukturschädigung im zerebralen Kortex assoziiert ist.

Zusammenfassung

Obwohl der Wirkmechanismus von Qi-fu-yin (QFY), einer Rezeptur der traditionellen chinesischen Medizin, noch nicht vollständig verstanden ist, hat es therapeutisches Potenzial bei Alzheimer-Krankheit (AD) gezeigt. Diese Studie hatte das Ziel, den Zusammenhang zwischen der QFY-Behandlung und kognitiven Beeinträchtigungen bei 5xFAD-Mäusen zu untersuchen. Wir verwendeten die Griffkraft, Gangbild, Kolonienesterung, Shuttle-Box, Morris-Wasser-Maze-Test und ELISA zur Bestimmung der Amyloidspiegelβ Protein 1-42 (Aβ1-42), Aβ1-40, Wachstumsassoziiertes Protein 43 (GAP-43), Synaptophysin (SYN) und postsynaptisches Dichteprotein 95 (PSD-95) in den Gehirnen von 5xFAD-Mäusen. Die Luminex-Zytokinanalyse wurde verwendet, um die Spiegel des seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP) im Kortex zu quantifizieren. Die Menge des seneszenzassoziierten β-Galactosidase (SA-β-Gal), Aβ Ablagerung und dendritische Dornen in den Gehirnen der Tiere wurden mittels SA-β-Gal-Färbung, Immunhistochemie bzw. Golgi-Cox-Färbung. Die QFY-Behandlung reduzierte kortikales A dramatischβ Plaque-Belastung und verminderte p21-Expression in 5xFAD-Mäusen, gemäß Immunfluoreszenztests. Bei 5xFAD-Mäusen verbesserte die QFY-Therapie signifikant die Lern- und Gedächtnisleistung, linderte Alterung und erhöhte die Mengen der Proteine GAP-43, PSD-95 und SYN in der Großhirnrinde der Mäuse. Nach der Behandlung mit QFY zeigte sich eine signifikante Abnahme von Aβ Plaque und SA-β-Gal-Aktivität im Gehirn sowie Aβ1-42 und Aβ1-42/Aβ1-40 Spiegel im Hippocampus. Die Spiegel von IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A und IFN-γ waren im Kortex der 5xFAD-Mäuse deutlich vermindert. PCA- und Pearson-Korrelationsanalysen zeigten eine starke negative Assoziation zwischen SASP-Zytokinen und den Spiegel der synaptischen Proteine. Diese Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen der QFY-Behandlung und einer Verbesserung altersbedingter kognitiver Beeinträchtigungen sowie zellulärer Seneszenzphänotypen bei 5xFAD-Mäusen hin, begleitet von einer verminderten strukturellen Schädigung der Synapsen. Diese Befunde stützen die weitergehende Untersuchung von QFY als potenziellen therapeutischen Kandidaten für die Alzheimer-Krankheit.

Einleitung

Alzheimer's disease (AD)1 is the most prevalent form of dementia, characterized by amyloid-β protein (Aβ), hyperphosphorylated tau proteins (P-Tau), synaptic loss, and chronic inflammation. Currently available medications for AD have a number of side effects and are unable to stop the disease's progression2,3,4,5.

Senescence, which manifests as organism-wide disruptions across cellular and interstitial microenvironments rather than localized organ-specific alterations, is a key risk factor in AD pathogenesis. This systemic dysregulation distinguishes AD progression from single tissue-pathology models by fundamentally changing homeostatic mechanisms across biological systems6,7. Although cellular senescence initially serves as a homeostatic regulatory mechanism, the accumulation of senescent cells eventually causes progressive tissue degradation and persistent inflammatory cascades, fundamentally disrupting physiological homeostasis8. The ensuing inflammation may harm synapses and impair cognitive function9,10.

Cellular senescence is a complex cellular stress response characterized by telomere shortening, permanent cell-cycle arrest, and altered secretory activity11. Additional hallmarks include enlarged, flattened cell morphology, positive senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining, lipofuscin accumulation, and secretion of SASP factors12. Memory formation is affected by the notable decline in the levels of proteins associated with synaptic plasticity of axons and dendrites, which occurs with cellular senescence13,14. Because synaptic plasticity is essential for learning and memory, disruptions in synaptic proteins contribute to cognitive impairment. These proteins include GAP-43, SYN, and PSD-95. Undoubtedly, synaptic function is affected by reductions in dendritic numbers and functional abnormalities in the brains of the elderly15.

QFY is a traditional Chinese medicine formula derived from Jing Yue Quan Shu. It is composed of Panax ginseng C.A.Mey (Araliaceae), Polygala tenuifolia Willd (Polygalaceae), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex Fisch. & C. A. Mey (Orobanchaceae), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Apiaceae), Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. (Fabaceae), Atractylodes macrocephala Koidz (Asteraceae), Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F. Chou (Rhamnaceae). Research has demonstrated that QFY significantly ameliorates cognitive dysfunction in rats with diabetes-induced brain injury16. Our previous study found that QFY could improve cognitive learning and memory functions impairment in 5xFAD and APP/PS1 mice. In addition, QFY demonstrated high safety in non-clinical studies, and no obvious acute, subacute, or long-term toxic reactions were observed17,18,19. Analysis of the clinical therapeutic effect of QFY showed that AD patients experienced a significant increase in their capacity for activities of daily living and MMSE scores after QFY treatment20. Following three consecutive days of QFY administration in male Sprague-Dawley rats, ten prototype QFY-derived components, including butylidenephthalide, butylphthalide, 20(S)-ginsenoside Rh1, 20(R)-ginsenoside Rh1, and zingibroside R1, were detected in cerebrospinal fluid21,22. However, the therapeutic mechanism of QFY in AD is still unclear. In this study, we investigated the association between QFY treatment, cellular senescence, and AD-related pathological changes in 5xFAD mice.

Although previous studies have demonstrated the neuroprotective effects of QFY in AD models, the specific involvement of cellular senescence in mediating these effects remains unexplored. Moreover, whether QFY confers cognitive benefits through senescence‑associated synaptic preservation, rather than solely through amyloid‑β reduction, has not been addressed. The present study was therefore designed to investigate whether QFY treatment attenuates cellular senescence and whether this attenuation is associated with improved synaptic plasticity in 5xFAD mice.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von dem Ethikkomitee für Tierversuche der Shandong-Universität für Traditionelle Chinesische Medizin (SDUTCM20221101001) genehmigt.

Arzneimittel

Das QFY-Granulat-Trockencremepulver wurde vom Lunan Pharmaceutical Houpu-Forschungs- und Entwicklungszentrum hergestellt und getestet. Donepezil und Memantin wurden von Shanghai Yuanye Technology bezogen. Männliche 5xFAD-Mäuse mit einem Anfangskörpergewicht von 19–27 g wurden in dieser Studie verwendet. Die QFY-Dosis wurde aus der klinischen Human-Dosis von 43 g/Tag abgeleitet, was nach Anpassung an das QFY-Granulat-Trockencremepulver 16,297 g/Tag entspricht. Die mittlere Dosis für das vorliegende Experiment wurde basierend auf der klinischen Human-Dosis berechnet (16,297 g/70 kg × 9,1 = 2,11861 g/kg/Tag). Die hohe Dosis wurde auf das Doppelte der mittleren Dosis festgelegt (4,24 g/kg/Tag), und die niedrige Dosis auf die Hälfte der mittleren Dosis (1,06 g/kg/Tag). Alle Arzneimittellösungen wurden in einem Volumen von 0,1 mL pro 10 g Körpergewicht verabreicht.

Als positiven Kontrollansatz wurde eine kombinierte Verabreichung von Donepezil und Memantinhydrochlorid verwendet. Die Dosierungen wurden unter Bezugnahme auf die derzeitigen klinischen Applikationsdosen (10 mg/d bzw. 20 mg/d) sowie auf frühere Daten unserer Forschungsgruppe festgelegt, was zu einem Regime von 1,0 mg/kg/d Donepezil in Kombination mit 2,8 mg/kg/d Memantin führte und eine Gesamtdosis von 3,8 mg/kg/d ergab. Die endgültige Konzentration des Donepezil-Memantin-Gemischs wurde auf 0,38 mg/mL eingestellt, berechnet aus 3,8 mg/kg dividiert durch das Applikationsvolumen von 0,1 mL pro 10 g Körpergewicht.

QFY-Lösungen in niedriger, mittlerer und hoher Dosis wurden wie folgt hergestellt: 5,3 g, 10,6 g und 21,2 g QFY-Trockenpulver wurden jeweils in separate 100-mL-Bechergläser gegeben, mit 30 mL gereinigtem Wasser unter gründlichem Rühren vermischt, in Messzylinder überführt und mit gereinigtem Wasser auf ein Endvolumen von 50 mL aufgefüllt, wodurch endgültige Massenkonzentrationen von 0,106 g/mL, 0,212 g/mL bzw. 0,424 g/mL entstanden. Als positiver Kontrolle wurden 5 mg Donepezil und 14 mg Memantin in gereinigtem Wasser gelöst und auf ein Endvolumen von 50 mL eingestellt. Die Tiere jeder Gruppe erhielten einmal täglich über orale Gavage die entsprechende Arzneimittellösung verabreicht.

Tiere

5xFAD-transgene Mäuse [B6. Cg-Tg (APPSwFlLon, PSEN1* M146L* L286V)6799Vas/Mmjax] wurden im Labor gezüchtet. Alle Tiere wurden in einer SPF-Umgebung an der Shandong-Universität für Traditionelle Chinesische Medizin bei einer Temperatur von 22–24 oC, einer Luftfeuchtigkeit von 50–60 % und einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechsel gehalten. Den Tieren stand jederzeit Futter und Wasser zur Verfügung.

Männliche 5xFAD-Mäuse im Alter von 2,5 Monaten wurden zufällig fünf Gruppen zugewiesen: unbehandelte 5xFAD-Mäuse, Donepezil in Kombination mit Memantin, niedrig dosiertes QFY, mittel dosiertes QFY und hoch dosiertes QFY. Alterstypische männliche Wildtyp-(WT)-Wurfgenossen dienten als WT-Kontrollgruppe. Die Behandlungen wurden einmal täglich über einen Zeitraum von 220 Tagen verabreicht. (Abbildung 1).

Verhaltensuntersuchungen

Griffkrafttest

Die Kraft der Skelettmuskulatur der Vordergliedmaßen der Mäuse wurde mit einem Griffkraftmessgerät gemessen23. Während des Experiments wurde das Testgerät horizontal positioniert, sodass die Maus parallel zur Tischoberfläche blieb. Nachdem das Gerät eingeschaltet worden war, wurde die Maus vorsichtig auf die Grifffläche gesetzt. Sobald die Maus die Platte sicher ergriffen hatte, wurde ihr Schwanz mit gleichmäßiger Kraft nach hinten gezogen, bis die Maus losließ. Die maximale Griffkraft wurde aufgezeichnet. Diese Messung wurde dreimal wiederholt, und der Mittelwert dieser Werte wurde zur Bestimmung der Griffkraft der Maus verwendet.

Gangtest

Die Gangregelmäßigkeit von Mäusen wurde mit CatWalk XT gemessen. Das Experiment wurde in eine Trainingsphase und eine Testphase unterteilt24. Einen Tag zuvor wurden die Versuchsmäuse in den Versuchsraum verbracht, um ihnen die Anpassung an die neue Umgebung zu ermöglichen. Während der Trainingsphase wurden die Mäuse am Startpunkt platziert und liefen entlang des Kanals zum Endpunkt. Jede Maus wurde dreimal täglich trainiert. Nach drei Tagen Training (bis jede Maus den Kanal schnell durchlaufen konnte), wurden die Mäuse in den Käfig zurückgebracht. Die Testphase war identisch mit der Trainingsphase, und die Computersoftware analysierte automatisch jede Bewegungsbahn. Grüne Punkte wurden angezeigt, wenn die Bahn qualifiziert war, orange Punkte bei nicht qualifizierten Bahnen; mindestens drei grüne Punkte pro Maus mussten vorliegen, die dann mit der CatWalkXT 10.0-Software analysiert wurden.

Shuttle-Box-Test

Der Shuttle-Box-Test wurde verwendet, um die konditionierte aktive Vermeidungsfähigkeit bei Mäusen zu bewerten25. Die Versuchsanordnung bestand aus einer Shuttle-Box (18 cm x 18 cm), die in einer schallgedämpften Kammer untergebracht war.  Der Versuch umfasste eine vier Tage dauernde Lernphase, gefolgt von einer eintägigen Testphase.  An jedem Lerntag erhielten die Mäuse zunächst eine 120-s-Adaptationsphase in der Shuttle-Box, bevor das Training begann. Jeder Versuchsdurchlauf begann mit einem 6-s-Dauernden konditionierten Reiz (70-dB, 1000-Hz-Ton in Kombination mit einem 500-lux-hellen Licht), gefolgt von einem 3-s-Dauernden, 0,3-mA-Stromschlag, der über den Gitterboden appliziert wurde, und endete mit einer 12-s-Dauernden inter-trial-Pause. Wenn die Maus während des konditionierten Reizes in das gegenüberliegende Fach wechselte, blieb der Stromschlag aus, und die Reaktion wurde als aktive Vermeidung aufgezeichnet. Wenn die Maus während des konditionierten Reizes nicht wechselte, dies aber während des Stromschlags tat, wurde dies als passive Vermeidungsreaktion gewertet. Falls die Maus während des gesamten Durchlaufs nicht wechselte, wurde dies als Fluchtversagen registriert. Das Training wurde vier aufeinanderfolgende Tage lang durchgeführt, mit jeweils 30 Durchläufen pro Tag. Während der Testphase (Tag 5) wurde der Stromschlag weggelassen, während alle übrigen Parameter unverändert blieben. Die Anzahl der aktiven Vermeidungsreaktionen wurde als primäres Maß für Lernen und Gedächtnis erfasst.

Morris-Wasserlabyrinth

Der Morris-Wassernebel-Test wurde verwendet, um die räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeiten der Versuchstiere zu bewerten26. Das Experiment wurde in einem Becken mit einem Durchmesser von 120 cm und einer Tiefe von 50 cm durchgeführt. Das Becken wurde mit trübem, weißem Wasser gefüllt, und die Temperatur wurde bei 21 °C gehalten. In einem der vier Quadranten wurde ein Plattform mit einem Durchmesser von 10 cm 1 cm unterhalb der Wasseroberfläche angebracht. Um das Becken herum wurden visuelle Hinweise als räumliche Orientierungspunkte für die Mäuse platziert. Der Lernprozess erstreckte sich über vier aufeinanderfolgende Tage, wobei jede tägliche Sitzung in einem von drei Quadranten begann. Die Startpositionen variierten pseudorandomisiert zwischen den vier Himmelsrichtungen. Jeder Versuch endete, sobald das Tier die Plattform erfolgreich erreichte. Eine maximale Versuchsdauer von 60 s wurde festgelegt; falls das Tier innerhalb dieses Zeitraums die Plattform nicht fand, wurde es vorsichtig dorthin geleitet. Nachdem das Tier die Plattform erreicht hatte, erhielt es eine kurze Pause von 10 s, bevor es in seinen Heimkäfig zurückgebracht wurde. Nach Abschluss der Lernphase beginnt die Testphase 24 h später. Am fünften Tag werden die Mäuse aus dem dem Plattformquadranten gegenüberliegenden Quadranten ins Wasser gesetzt. Die Fluchtlatenz während der Testphase, die Verweildauer im Zielquadranten sowie die Anzahl der Querungen des ursprünglichen, unter Wasser liegenden Plattformbereichs wurden aufgezeichnet.

Test zum Koloniebau

Die täglichen Aktivitäten von Versuchstieren wurden mithilfe des Kolonienestungstests27 bewertet. Das Experiment dauerte 24 h und umfasste jeweils drei Tiere pro Gruppe. Nach der Verabreichung des Wirkstoffs am selben Tag wurden neue Käfige eingerichtet, die mit 6 g weichem Papier für die Nestung ausgelegt waren. Fotografien wurden nach 6 h, 12 h und 24 h angefertigt. Am Ende des Experiments war das Papier im gesamten Käfig verstreut, ohne dass Bissspuren erkennbar waren: 1 Punkt. Die Papierstücke waren locker an einer Seite des Käfigs zusammengelegt, ohne geformte Nester, ohne offensichtliches Zerreißen oder Falten: 2 Punkte; Die Papierstücke waren gesammelt und zu einem geformten, aber relativ flachen Nest gefaltet, ohne offensichtliches Zerreißen: 3 Punkte; Ein tiefes Nest aus stark zerkleinertem Papier erhielt die Wertung 4 Punkte.  Am Ende des Experiments wurde das verbliebene unzerkaute Gewebe (definiert als Papierfragmente mit einem Gewicht von >0,1 g, die nicht zerkleinert oder in das Nest eingearbeitet wurden) sorgfältig gesammelt, luftgetrocknet und mit einer elektronischen Waage (Genauigkeit: 0,01 g) gewogen. 

Probenahme und Probensammlung

Wir sammelten Proben nur aus den WT-, 5xFAD- und QFY-Gruppen (2,12 g/kg/Tag). Nach der CO2-Asphyxiation wurden die Köpfe abgetrennt, die rechte Hemisphäre schnell geöffnet, um Hippocampus und Kortex zu isolieren, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und in 1,5-mL-Gefriertuben in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Proben wurden bei -80 oC für biochemische Untersuchungen gelagert. Die linke Hemisphäre wurde durch Einbetten in 4 % Paraformaldehyd für 24 Stunden fixiert, durch Einlegen in absoluten Ethanol dehydriert, in Paraffinwachs eingebettet, in 5-µm-Schnitte aufgeteilt und für die immunhistochemische Detektion entparaffiniert.

Enzymgebundener Immunosorbens-Assay (ELISA)

ELISA-Analysen wurden durchgeführt, um die Konzentrationen der Zielproteine in Gehirngeweben zu quantifizieren. Die Gehalte an Aβ1–40 und Aβ1–42 in homogenisierten Hippocampi wurden mithilfe kommerzieller Kits gemessen, während die kortikalen Konzentrationen von GAP-43, PSD-95 und SYN mit Kits des Unternehmens Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry bestimmt wurden. Alle Schritte wurden streng gemäß den Herstellervorschriften durchgeführt. Die Standardreihen wurden durch serielle Verdünnung gemäß den Kit-Anleitungen hergestellt. Das Mikroplatten-Layout umfasste Leerwells, Standardwells, 5xFAD-Probenwells, mit QFY behandelte Probenwells (2,12 g/kg/Tag) und Wildtyp-Wells. Vor dem Beladen wurden alle Proben mit dem bereitgestellten Verdünnungspuffer im Verhältnis 1:1 verdünnt. Die Reagenzien wurden hinzugegeben, wobei die Pipettenspitze senkrecht zum Boden des Wells gehalten wurde, und anschließend vorsichtig geschüttelt, um eine vollständige Durchmischung sicherzustellen.

Nach dem Versiegeln der Platte wurde die erste Inkubation bei 37 °C für 30 min durchgeführt. Während dieses Zeitraums wurde das Waschpuffer durch Verdünnen des konzentrierten Stamms mit ultrareinem Wasser im Verhältnis 1:29 (1 mL Konzentrat zu 29 mL Wasser) hergestellt. Nach der Inkubation wurde der Siegelfilm entfernt, die Flüssigkeit verworfen und die Platte trocken getupft. Jedes Loch wurde anschließend mit 200 µL Waschpuffer gefüllt, 30 s stehengelassen und dann entleert; der Zyklus wurde fünfmal wiederholt. Danach wurde in alle Löcher bis auf die Blindproben jeweils 50 µL enzymmarkiertes Reagenz gegeben, die Platte erneut versiegelt und erneut 30 min bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einem identischen Waschschritt mit fünf Zyklen.

Zur Farbentwicklung wurden 50 µL Chromogenlösung A in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von 50 µL Chromogenlösung B, wobei nach jeder Zugabe vorsichtig gemischt wurde. Die Platte wurde 10 min bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von jeweils 50 µL Stopplösung pro Vertiefung beendet, wodurch sich die blaue Farbe prompt in gelb umwandelte. Die Extinktion (optische Dichte) wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, wobei leere Vertiefungen als Referenz dienten; alle Messwerte wurden innerhalb von 15 min nach Beendigung der Reaktion erfasst.

Luminex

Die kortikalen Konzentrationen von SASP-Faktoren wurden mit dem Bio‑Plex Pro Mouse Cytokine 23‑plex Assay-Kit gemessen, wobei alle Schritte gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt wurden. Die Reagenzien wurden aus der Lagerung bei 4 °C entnommen und vor der Verwendung 30 Minuten lang zur Raumtemperatur akklimatisiert. Die Standardstammlösungen wurden seriell verdünnt, um eine Sieben-Punkt-Standardkurve sowie ein Leerwert-Loch gemäß Kit-Protokoll zu erzeugen. Die magnetischen Beads wurden vorgemischt und auf die empfohlene Arbeitskonzentration verdünnt; die Detektionsantikörper wurden als Arbeitslösungen hergestellt; und der Waschpufferkonzentrat wurde mit entionisiertem Wasser auf 1x verdünnt. Das PE‑Streptavidin-Konjugat wurde ebenfalls mit dem beigefügten Verdünnungspuffer auf 1x verdünnt.

Für den Assay wurden 50 µL der Beadsuspension, der Standards, der Qualitätskontrollen und der verdünnten Gewebeproben (5,6 µg/µL) entsprechend dem Plattenlayout nacheinander in die dafür vorgesehenen Vertiefungen gegeben. Die Platte wurde anschließend verschlossen und über Nacht bei 4 °C bei orbitaler Schüttelung mit 800 U/min inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Beads dreimal mit jeweils 200 µL Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen. Danach wurden 50 µL des vorbereiteten Detektionsantikörpers in jede Vertiefung gegeben, und die Platte wurde 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln mit 800 U/min inkubiert. Nach weiteren drei Waschzyklen wurden 50 µL der PE‑Streptavidin-Arbeitslösung zugegeben, und die Platte wurde weitere 30 min bei Raumtemperatur unter denselben Schüttelbedingungen inkubiert. Ein abschließender Waschschritt (dreimal mit 200 µL Waschpuffer) wurde durchgeführt, woraufhin 150 µL Waschpuffer zu jeder Vertiefung hinzugefügt wurden. Die Platte wurde dann 2 min bei Raumtemperatur mit 800 U/min geschüttelt, bevor sie auf dem Bio‑Plex-Gerät ausgelesen wurde.

SA-β-Gal-Färbung und Immunhistochemie

Die SA-β-Gal-Färbung wurde gemäß der Anleitung des Senescence-β-Galactosidase-Färbekits durchgeführt. Nach der SA-β-Gal-Färbung wurden die Schnitte einer Antigen-Retrieval-Behandlung durch Erhitzen in Citratpuffer (pH 6,0) unterzogen. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde blockiert, indem die Schnitte 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer Peroxidase-Blockierungslösung inkubiert wurden. Anschließend wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit einem monoklonalen Kaninchen-Antikörper gegen Aβ₁-₄₂ (1:400) inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Schnitte 20 Minuten bei Raumtemperatur mit einem sekundären Antikörper gegen Kaninchen/Maus-IgG inkubiert. Nach weiterem Waschen wurde die Immunreaktivität mittels DAB für 2 Minuten sichtbar gemacht. Schließlich wurden die Schnitte dehydriert, geklärt und mit neutralem Harz eingedeckt, um sie mikroskopisch zu untersuchen.

Immunfluoreszenz

Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden Paraffinschnitte in Xylol (3 × 15 min) deparaffinisiert und durch eine abgestufte Ethanolreihe (100 %, 95 % und 75 %; jeweils 2 × 5 min) rehydriert. Die Antigenrückgewinnung erfolgte durch Einlegen der Schnitte in 1× Zitratpuffer bei 95 °C für 30 min, gefolgt von einer allmählichen Abkühlung auf Raumtemperatur. Nach dreimaligem Spülen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung mit Tween 20 (PBST) (jeweils 5 min) wurden die Schnitte mit 10 % normalem Zieusersum, das 0,3 % Triton X‑100 enthielt, für 90 min bei Raumtemperatur permeabilisiert und blockiert. Anschließend wurden die Schnitte mit primären Antikörpern gegen p21/CIP1/CDKN1A (1:200) und Aβ₁‑₄₂ (1:400) bei 37 °C für 2 h inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit PBST (jeweils 5 min) erfolgte die Inkubation mit artübereinstimmenden, mit Alexa Fluor markierten sekundären Antikörpern (1:500) bei 37 °C für 2 h im Dunkeln. Nach weiterem Waschen (4 × 5 min in PBST) wurden die Schnitte mit einem Antifade-Montagemedium, das DAPI enthält, auf Objektträger aufgebracht und mit einem Fluoreszenzmikroskop bildlich erfasst.

Färbung nach Golgi-Cox

Die Golgi-Cox-Färbung wurde mithilfe eines kommerziellen Kits gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Lösung A und Lösung B wurden 24 Stunden vor dem Experiment gemischt. Nachdem die Mäuse getötet worden waren, wurden die Gehirngewebe rasch entnommen, mit PBS gespült und in die Mischung aus Lösung A und Lösung B eingetaucht. Die Gewebe wurden 6 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert, danach wurde die Imprägnierlösung durch frische Lösung ersetzt und die Inkubation weitere zwei Wochen bei Raumtemperatur im Dunkeln fortgesetzt (mindestens 2 mL Imprägnierlösung pro Gehirngewebe). Anschließend wurden die Gewebe in Lösung C überführt und 24 Stunden lang inkubiert, danach wurde die Lösung durch frische Lösung C ersetzt und die Inkubation weitere 7 Tage bei Raumtemperatur im Dunkeln fortgesetzt. Die Gehirngewebe wurden mit einem Vibratom in Schnitte von 100 µm Dicke zerteilt. Die Schnitte wurden auf mit Gelatine beschichtete Objektträger aufgebracht und drei Tage bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die Objektträger wurden zweimal mit destilliertem Wasser gespült (jeweils 5 Minuten), dann 15 Minuten lang in einer Mischung aus Lösung D, Lösung E und destilliertem Wasser (im Verhältnis 1:1:2) inkubiert. Nach zwei weiteren Spülgängen mit destilliertem Wasser (jeweils 5 Minuten) wurden die Schnitte nacheinander durch abgestufte Ethanol-Lösungen (50 %, 75 % und 95 %; jeweils 5 Minuten) dehydriert, gefolgt von vier Spülgängen in absolutem Ethanol (jeweils 4 Minuten) und drei Spülgängen in Xylol (jeweils 5 Minuten). Abschließend wurden die Schnitte mit Eindeckmedium überdeckt. Die Aufnahmen wurden mit einem Mikroskop angefertigt, und die Dichte der dendritischen Dornen wurde mittels ImageJ quantifiziert.

Statistische Analyse

Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Daten wurden mit GraphPad Prism 8.1.0 analysiert und grafisch dargestellt. Zum Vergleich von zwei Gruppen wurde der Student’s t-Test verwendet. Bei Vergleichen mit mehreren Gruppen kam eine einfaktorielle ANOVA zum Einsatz, wobei paarweise Vergleiche mit dem Dunnett-Test durchgeführt wurden. Die statistische Signifikanz wurde bei p < 0,05 festgelegt.

Multivariate und Korrelationsanalysen

Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde mit GraphPad Prism 8.0.1 durchgeführt, um die gruppenweise Clusterung von SASP-Faktoren (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A, IFN-γ, CCL3, CCL4 und CCL5) zwischen den WT-, 5xFAD- und QFY-Gruppen (2,12 g/kg/Tag) zu visualisieren (n = 8 pro Gruppe). Das Score-Plot wurde basierend auf den ersten beiden Hauptkomponenten erstellt. Vor der PCA wurde keine Datentransformation angewendet. Eine Pearson-Korrelationsanalyse wurde durchgeführt, um lineare Zusammenhänge zwischen SASP-Faktoren und synaptischen Proteinen (PSD-95, GAP-43 und SYN) sowie Aβ₁₋₄₀, Aβ₁₋₄₂ und dem Aβ₁₋₄₂/Aβ₁₋₄₀-Verhältnis zu bewerten. Die Analyse erfolgte mit GraphPad Prism bei einer zweiseitigen Signifikanzschwelle von p < 0,05. Korrelationsmatrizen und eine Heatmap wurden erstellt, um Stärke und Richtung der Assoziationen zu visualisieren.

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Ergebnisse

Administration of QFY enhances learning and memory in 5xFAD mice

After QFY administration, a shuttle box test was conducted to assess the conditional active avoidance response of mice (Figure 2A–C). The results showed the number of active avoidances on days 1-4 (Figure 2A, p < 0.05) and the area under the curve (AUC) of active avoidance (Figure 2B, p ...

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Diskussion

Die neuronale synaptische Plastizität spielt eine Schlüsselrolle bei der kognitiven Funktion. Im Gehirn von AD-Patienten breiten sich Aβ-Ablagerungen über verschiedene Regionen aus und verursachen direkt strukturelle Schäden an Synapsen, Verlust erregender Synapsen und kognitiven Abbau28. GAP-43 (ein präsynaptisches Membranprotein)29, PSD-95 (ein Gerüstprotein in der postsynaptischen Membran)30 und SYN (ein Phosphoprotein, das mit synaptischen Vesike...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (82205078, 82374062), der Natürlichen Wissenschaftlichen Stiftung der Provinz Shandong (ZR2026MS1293, ZR2021QH157), des Projekts für Wissenschaft und Technologie der Traditionellen Chinesischen Medizin der Provinz Shandong (M20251730), der Wissenschafts- und Technologieprojekte der Autonomen Region Xizang, China (XZ202601ZY0167), sowie des Programms zur Technologieinnovationsförderung der Provinz Shandong (Fonds für die von der Zentralregierung geleitete wissenschaftliche und technologische Entwicklung auf lokaler Ebene) (YDZX2023137) unterstützt, mit dem Projekt mit dem Titel „Entwicklung und Industrialisierungsforschung von Tongli-Enterikumhüllten Kapseln als neuartige traditionelle chinesische Arzneimittel der Klasse 1“.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Arzneimittel
DonepezilShanghai Yuanye Technologylot.J15HB188725
MemantinShanghai Yuanye Technologylot. J21HB189391
Qi-fu-yinForschungs- und Entwicklungscenter Houpu, Lunan Pharmaceuticallot. 2209001
Verhaltensuntersuchungen
CatWalk XTNoldusCatWalkXT 10.0-Software
Kraftmessgerät für den GriffBileadbiosciBLD-ZL-20
Morris-WasserlabyrinthShanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd120 cm
Shuttle-BoxShanghai Xinruan Information Technology Co., LtdXR-XC404
Antikörper
Anti-Aβ1-42-AntikörperAbcamCat# ab201061
Anti-p21/CIP1/CDKN1A-AntikörperNovus BiologicalsCat# NBP3-15661
Test-Kits
Aβ1-40-ELISA-KitThermo Fisher ScientificCat# KHB3482
Aβ1-42-ELISA-KitThermo Fisher ScientificCat# KHB3442
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay-KitR&D SystemsCat# LXLBM23-1
GAP-43-ELISA-KitJiangsu Enzyme Immunoassay IndustryCat# MM-47506M1
Golgi-Cox-FärbekitBeiJing Biolead Biology Sci & Tech CoCat# PK401
PSD-95-ELISA-KitJiangsu Enzyme Immunoassay IndustryCat# MM-45953M1
Seneszenz-β-Galactosidase-FärbekitBeyotimeCat# C0602
Synaptophysin (SYN)-ELISA-KitJiangsu Enzyme Immunoassay IndustryCat# MM-46504M1
Chemikalien & Reagenzien
Anti-Kaninchen- und Maus-IgG (sekundärer Antikörper)StarterCat# S0C1001
DAB-ChromogenStarterCat# S0C1001
Software
CatWalk XTNoldus Information TechnologyVersion 10.0
ImageJNational Institutes of Health (NIH)Version 1.53

Referenzen

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  3. Muralidar S, et al. Role of tau protein in Alzheimer's disease: the prime pathological player. Int J Biol Macromol. 2020;163:1599-617.
  4. Hardy JA, Higgins GA. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 1992;256(5054):184-5.
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