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Methodenartikel

Neonatale intrazerebrale Transplantation zur Mikroglia-Substitution und Linienanalyse in vivo

132 Ansichten

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DOI:

10.3791/72119

⸱

28. Juli 2026

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente neonatale intrazerebrale Transplantation definierter Mikrogliapopulationen, unterstützt eine robuste Langzeittransplantation und Analyse der Mikroglialinie sowie die Integration in vivo über mehrere Spenderquellen und Empfängermodelle.

Zusammenfassung

Der Mikroglia-Ersatz durch Myeloidzelltransplantation hat sich als vielversprechender experimenteller Ansatz zur Untersuchung neurologischer Prozesse und Krankheiten erwiesen. Bestehende Transplantationsstrategien sind jedoch oft durch ineffiziente Engraftments, die Abhängigkeit von strahlenbasierter Konditionierung oder eingeschränkte Flexibilität zwischen Spender- und Empfängersystemen eingeschränkt. Hier beschreiben wir ein neonatales intrazerebrales Transplantationsprotokoll zur Einführung gereinigter Mikrogliapopulationen (Hoxb8 - und Nicht-Hoxb8-Mikroglia ) in das sich entwickelnde Maushirn. Diese Methode ermöglicht eine effiziente Transplantation und Integration von Spenderzellen im Hirn-Parenchym unter physiologisch permissiven Bedingungen. Wichtig ist, dass das Protokoll mit mehreren Spenderquellen kompatibel ist, darunter embryonale hämatopoetische Vorläufer und postnatale Gehirn-abgeleitete Mikroglia, und auf verschiedene Empfängermodelle mit reduzierter oder fehlender endogener Mikroglia angewendet werden kann, einschließlich konditionaler Csf1r-Defiziente Mäuse und Csf1rΔFIRE-Mäuse . Spenderzellen werden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung gereinigt und beidseitig mit Glas-Mikropipetten in neonatale Mausgehirne abgegeben, um eine effiziente und minimal invasive Abgabe zu gewährleisten. Empfängermäuse werden so gealtert, dass Spenderzellen sich ausdehnen und die Mikroglia-Nische bevölkern können, und die Ergebnisse werden durch histologische Analyse der Verteilung und Markerexpression der Spenderzellen bewertet. Dieser Ansatz bietet eine robuste und skalierbare Plattform zur Untersuchung der Mikroglia-Ontogenese und der In-vivo-Integration in unterschiedlichen experimentellen Kontexten.

Einleitung

Der Mikroglia-Ersatz durch Transplantation myeloischer Zellen hat sich als wirkungsvolle Strategie zur Erforschung der Mikrogliabiologie und als potenzielles therapeutisches Paradigma für neurologische Erkrankungen etabliert. In den letzten Jahren hat sich das Fachgebiet zu Strategien entwickelt, die eine umfassende Ersetzung der Mikroglia im zentralen Nervensystemermöglichen. Neuere Studien haben gezeigt, dass von Spendern abgeleitete Makrophagen und Vorläufer das Gehirn einpflanzen, mikrogliaähnliche transkriptionelle Programme übernehmen und in einigen Fällen krankheitsassoziierte Phänotypen 2,3,4,5,6,7,8 verbessern können. Diese Erkenntnisse stützen das Konzept, dass der Ersatz von Gehirnmakrophagen genutzt werden kann, um neurologische Krankheitsprozesse zu untersuchen und potenziell zu verändern.

Eine zentrale Herausforderung bei der Mikroglia-Transplantation ist die Erreichung robuster Engraftments bei gleichzeitiger Minimierung experimenteller Störungen. Viele etablierte Ersatzstrategien basieren auf Bestrahlung, Chemotherapie oder Mikroglia-Depletionsparadigmen, um eine engraftable Nischezu erzeugen 6,9,10,11,12,13. Trotz ihrer Wirksamkeit können diese Ansätze die Alterung der Mikroglia auslösen, die Blut-Hirn-Schranke stören und die Entzündungssignale verändern, was die Interpretationdes Verhaltens von Spenderzellen erschweren kann. Neuere Arbeiten haben begonnen, konditionierungsunabhängige oder reduzierte Toxizitätsansätze für Mikroglia-Ersatz 5,8,15 zu erforschen.

Der Entwicklungszeitpunkt ist ein wichtiger Faktor für den Erfolg einer Transplantation. Das neonatale Gehirn bietet eine permissive Umgebung, die die Expansion und langfristige Integration der Spenderzellen unterstützt, wahrscheinlich aufgrund reduzierter struktureller Barrieren und der fortlaufenden Etablierung der endogenen Mikroglia-Nische. Jüngste Transplantationsstudien mit früher postnataler Entbindung (P0–P5) zeigen eine robuste parenchymale Engraftment und den Erwerb einer mikrogliaähnlichen Identität, was die Bedeutung des Entwicklungskontexts für eine effiziente Ersetzungunterstreicht 7,8,16,17.

Hoxb8-Mikroglia bieten ein besonders informatives System zur Untersuchung linienspezifischer Beiträge zur Mikrogliabiologie. Diese Zellen stammen aus embryonalen hämatopoietischen Vorläufern und stellen eine definierte Teilmenge der parenchymalen Mikroglia dar, mit Verhaltensfolgen bei Dysfunktion 17,18,19,20,21. Jüngste Arbeiten mit primären Hoxb8-Vorläufern sowie Mikroglia- und Östrogenrezeptoren (ER)-Hoxb8-Vorläufersystemen zeigen, dass diese Zellen erweitert, genetisch manipuliert und erfolgreich ins Gehirn eingepflanzt werden können, wo sie mikrogliaähnliche Transkriptionsprofile und funktionelle Eigenschaften übernehmen 7,8,17. Diese Fortschritte unterstreichen zudem den Nutzen von Transplantationsansätzen zur Analyse der Mikroglia-Linie und -Heterogenität.

Hier beschreiben wir eine neonatale intracerebrale Transplantationsplattform, die für Vielseitigkeit zwischen Spender- und Empfängersystemen optimiert ist. Im Gegensatz zu Ansätzen, die auf Bestrahlung oder systemischer Konditionierung beruhen, verwendet diese Methode eine direkte bilaterale intrazerebrale Verabreichung in neonatale Mäuse, was die Platzierung von Spenderzellen in einer entwicklungsbedingt permissiven Gehirnumgebung ermöglicht und gleichzeitig systemische Störungen minimiert. Die Technik ist mit mehreren Spenderquellen kompatibel, darunter embryonale hämatopoietische Vorläufer und postnatale Gehirn-abgeleitete Mikroglia, und kann auf verschiedene Empfängermodelle mit reduzierter oder fehlender endogener Mikroglia angewendet werden. Ein wesentlicher praktischer Vorteil besteht darin, dass der dünne neonatale Schädel eine schnelle manuelle Injektion mit Glas-Mikropipetten ermöglicht, wodurch Bohren oder stereotaktische Fixierung überflüssig bleiben und dennoch eine breite Parenchymtransplantation erreicht wird.

Zusammen bietet dieser Ansatz ein robustes, flexibles und skalierbares System zur Untersuchung der Mikroglia-Ontogenie, Heterogenität und in-vivo-Integration über verschiedene experimentelle Kontexte hinweg. Dies positioniert die neonatale intrazerebrale Transplantation als komplementäre und experimentell kontrollierte Alternative zu systemischen Mikroglia-Ersatzstrategien.

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Protokoll

Alle Methoden und Experimente in dieser Studie wurden an Mäusen durchgeführt. Experimentelle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Utah, Public Health Service Assurance #D16-00018 (A3031-01), genehmigt.

1. Vorbereitung von Zuchtpaaren für Spender- und Empfängerwürfe

  1. Stelle abends Züchterpaare in denselben Käfig, um zeitlich begrenzte Paarungen einzuleiten.
  2. Untersuchen Sie die Weibchen jeden Morgen auf das Vorhandensein eines vaginalen Plugs, um eine erfolgreiche Paarung zu bestätigen.
  3. Entfernen Sie verstopfte Weibchen von den Männchen und halten Sie sie einzeln unter, bis die Geburt etwa 18–20 Tage dauert.
  4. Pflegen Sie schwangere Mütter sanft für 5 Minuten täglich für 7–10 Tage vor der Geburt, um den Stress im Zusammenhang mit der Behandlung von Neugeborenen zu reduzieren.
  5. Setzen Sie die Mütter während der täglichen Handhabungssitzungen einem Wattestäbchen mit Betadin-Geruch aus, um den mütterlichen Stress bei der Rückkehr der Welpen nach der Operation zu verringern.
  6. Bereiten Sie saubere Käfige mit Nistmaterial für trächtige Weibchen vor der erwarteten Geburt vor.

2. Entnahme und Verarbeitung neonataler Gehirne

  1. Euthanasieren Sie neonatale Spendermäuse (P0–P4) durch eine Isofluran-Überdosis in einem Glockenglas oder einer ähnlichen geschlossenen Kammer mit einem falschen Boden, um direkten Kontakt mit dem Anästhetikum zu verhindern.
  2. Sobald die Atmung aufhört und das Fehlen von Reflexen bestätigt ist, wird sofort enthauptet.
  3. Entnehmen Sie das gesamte Gehirn, einschließlich des Kleinhirns und der Riechzwiebeln. Geben Sie das Gehirn in 3 ml kaltes 1× Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) in eine Plastik-Petrischale auf Eis.
  4. Mit sterilen Skalpellen und Pinzetten wird das Gehirn in etwa 1–2 mm großeTeile zerkleinert.
  5. Übertragen Sie das gehackte Hirngewebe (1 Gehirn pro Gewebedissoziationsröhre) in Gewebedissoziationsröhren, die enzymatische Verdauungsreagenzien enthalten, die gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll vom Neuralgewebe-Dissoziationssystem versorgt werden.
  6. Setzen Sie die Schläuche in ein mechanisches Dissoziationsgerät mit Heizfähigkeit und inkubieren Sie bei 37 °C 30 Minuten lang mit dem vom Hersteller empfohlenen Neurongewebe-Dissoziationsprogramm.
  7. Vorabweichen 70 μm Zellsiebe mit 400 μL 1× HBSS.
  8. Führen Sie das dissoziierte Gewebe durch die voreingeweichten Siebe, die über einem 50-ml-konischen Rohr auf Eis gelegt werden.
  9. Waschen Sie die Röhren mit 10 ml 1× HBSS und lassen Sie sie durch Filter führen, um maximale Zellrückgewinnung sicherzustellen.
  10. Entsorge Filter und schleudere die Zellen bei 300 × g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Aspiriere das Supernatant.
  11. Zellen pro Probe in 1 ml roten Blutkörperchen-Lysepuffer in sterilem ultrareinem Wasser resuspendieren und 10 Minuten bei 4 °C inkubieren.
  12. Löschen Sie die Lysereaktion mit 10 ml 1× HBSS/1 % BSA/5 % FBS.
  13. Entsorge Filter und spinne die Zellen bei 300 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Aspiriere das Supernatant.
  14. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Der typische Bereich der Zellausbeute liegt vor der Sortierung bei 3,2–4,0 × 106 .
  15. Zellen in 5 % FBS in 1× HBSS in der gewünschten Konzentration für die nachgeschaltete Antikörperfärbung neu suspendieren.

3. Zellantikörperfärbung zur FACS-Sortierung von Mikrogliapopulationen

  1. Cellen in 1 ml Färbungspuffer (5 % FBS in 1× HBSS) mit Fc-Rezeptor-Blockierungsantikörpern (gereinigtes CD16/32, 1:2000) resuspendieren und Zellen 10 Minuten bei 4 °C inkubieren.
  2. Zelle bei 240 × g für 3 Minuten bei 4 °C abdrehen. Aspiriere das Supernatant.
  3. Inkubierte Zellen mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern (CD45 APC, 1:160; CD11b Alex Fluor 700, 1:160) in 1 ml Färbepuffer für 30 Minuten auf Eis im Dunkeln.
  4. Spinde die Zellen bei 240 × g für 3 Minuten bei 4 °C. Aspiriere das Supernatant.
  5. Fügen Sie einen Lebensfähigkeitsfarbstoff hinzu (z. B. 3 μM DAPI in 1× HBSS), um abgestorbene Zellen auszuschließen.
  6. Durchführung der FACS-Sortierung mit einem Hochgeschwindigkeitszellsortierer, der mit geeigneten Lasern für DAPI, GFP, tdTomato, CD45-APC und CD11b-Alexa Fluor 700-Detektion ausgestattet ist.
  7. Verwenden Sie möglichst eine 100-μm-Düse mit niedrigem Manteldruck, um die Zellviabilität zu maximieren. Bewahren Sie die Probenentnahmeröhrchen und sortierten Zellen während des gesamten Eingriffs auf Eis auf.
  8. Verwenden Sie ungefärbte Zellen, Einfarbkompensationsregelungen und Fluoreszenz-minus-eins-Regler, um Spannungen, Kompensation und Gates einzustellen.
  9. Zuerst wird die Zellen nach vorwärts streuen versus seitlichen Streuflächen gegatet, um Trümmer auszuschließen.
  10. Gate-Singlets mit Seitenstreuhöhe versus Seitenstreuweite.
  11. Schließen Sie abgestorbene Zellen durch Gating auf DAPI⁻-Zellen aus.
  12. Von Live-Singlets, Gate auf CD45niedrig CD11b⁺ Mikroglia.
  13. Innerhalb des CD45niedrigen CD11b⁺-Mikroglia-Gates verwenden Sie GFP und tdTomato-Fluoreszenz, um Spender-Mikrogliapopulationen zu trennen (Hoxb8-Mikroglia : DAPI⁻ CD45niedrige CD11b⁺ tdTomato⁺ GFP⁺, nicht-Hoxb8-Mikroglia : DAPI⁻ CD45niedrige CD11b⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. Sortiere jede Population in sterile Sammelröhren mit kaltem 1x HBSS.
  15. Nach der Sortierung wird ein kleiner Aliquot der sortierten Zellen erneut analysiert, um Reinheit und Lebensfähigkeit vor der Transplantation zu bestätigen.
  16. Sammeln Sie sortierte Zellen in steriler 1× HBSS und halten Sie sie im Dunkeln auf Eis, bis zur Transplantation.
    HINWEIS: Die typischen Erträge für Hoxb8-Mikroglia liegen zwischen 3,70–4,60 x 104 Zellen und nicht-Hoxb8-Mikroglia 1,10–1,14 x 105 Zellen pro neonatalem Gehirn (P0–P4), wobei die Erträge je nach Alter, Genotyp und Gewebeverarbeitungseffizienz variieren können. Transplantieren Sie gereinigte lebende Zellen so schnell wie möglich, idealerweise innerhalb von 60 Minuten nach der Zellsortierung.

4. Entnahme und Verarbeitung hämatopoietischer Vorläufer der fetalen Leber

  1. Lassen Sie schwangere Mutter mit 5 % Isofluran, das in Sauerstoff über einen Präzisionsverdampfer abgegeben wird, eingeschläfern, bis die Atmung aufhört und das Fehlen von Reflexen bestätigt ist.
  2. Nach einer Isofluran-Überdosis führen Sie eine sekundäre physikalische Methode durch eine zervikale Verrenkung durch, um den Tod zu gewährleisten, gemäß den institutionellen Tierpflege- und Anwendungsrichtlinien.
  3. Entfernen Sie die Gebärmutterhörner von den trächtigen Mäusen und legen Sie sie in eine kalte 3 ml 1× HBSS in Plastik-Petrischalen (60 mm × 15 mm).
  4. Sezieren Sie E12.5-Embryonen aus der Gebärmutter und legen Sie sie in frisch kaltes 3 ml 1× HBSS in Plastik-Petrischalen.
  5. Seziere fetale Leber mit feinen Pinzetten und lege sie in frische 3 ml kaltes 1× HBSS mit 5 % FBS in Petrischalen.
  6. Mechanisch dissoziiert man das gesammelte fetale Lebergewebe mit einer 26-G-Nadel und einer 3-mL-Spritze.
  7. Spinne die Zellen bei 240 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Aspiriere das Supernatant.
  8. Wasche Zellen mit 1× HBSS.
  9. Führen Sie die Zellsuspension durch ein 80-μm-Sieb.
  10. Zellen in 20 μL roten Blutkörperchen-Lysepuffer (0,15 M Ammoniumchlorid, 1 mM KHCO3) für 5 Minuten inkubieren, gefolgt von 13 ml 1× HBSS zum Abschrecken.
  11. Inkubation für 5 Minuten fortsetzen, um rote Blutkörperchen zu lysieren.
  12. Spinne die Zellen bei 200 × g für 5 Minuten bei 4 °C.

5. Zellantikörperfärbung zur FACS-Sortierung hämatopoietischer Vorläuferzellen

  1. Inkubieren fetaler Leberzellen mit fluoreszierend konjugierten Antikörpern (Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50; Kit PE-Cy7, 1:100) in 5 % FBS/1 % BSA in 1× HBSS für 30 Minuten auf Eis im Dunkeln.
  2. Wasche die Zellen mit 1× HBSS und spinne sie bei 240 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
  3. Fügen Sie einen Lebensfähigkeitsfarbstoff hinzu (z. B. 3 μM DAPI in 1× HBSS), um abgestorbene Zellen auszuschließen.
  4. Durchführung der FACS-Sortierung mit einem Hochgeschwindigkeitszellsortierer, der mit geeigneten Lasern und Filtern für DAPI, Ter119 PerCP-Cy5.5, Kit PE-Cy7, tdTomato und GFP-Erkennung ausgestattet ist.
  5. Verwenden Sie möglichst eine 100-μm-Düse mit niedrigem Manteldruck, um die Zellviabilität zu maximieren. Bewahren Sie die Probenentnahmeröhrchen und sortierten Zellen während des gesamten Eingriffs auf Eis auf.
  6. Verwenden Sie ungefärbte Zellen, Einfarbkompensationsregelungen und Fluoreszenz-minus-eins-Regler, um Spannungen, Kompensation und Gates einzustellen.
  7. Zuerst werden Gate-Zellen verwendet, die den vorderen Streubereich versus den seitlichen Streubereich verwenden, um Trümmer auszuschließen.
  8. Gate-Singlets mit Vorwärtsstreuhöhe versus Vorwärtsstreubreite, gefolgt von Seitenstreuhöhe versus Seitenstreubreite.
  9. Schließen Sie abgestorbene Zellen durch Gating auf DAPI⁻-Zellen aus.
  10. Von lebenden Singlets werden erythroide Linienzellen durch Gating auf Ter119⁻-Zellen ausgeschlossen.
  11. Innerhalb der Ter119⁻-Population werdenKit-Zellen mit hohem hämatopoietischen Vorläuferzustand gefestigt.
  12. Innerhalb derDAPI ⁻ Ter119⁻ Kit hohen Population isolieren Sie Hoxb8-Linien-positive Vorläufer durch Gating auf tdTomato⁺-Zellen.
  13. Wenn die Spenderlinie auch den Cx3cr1-GFP-Reporter trägt, wird GFP-Fluoreszenz verwendet, um zu bestätigen, dass die sortierte fetale Leber-Vorläuferpopulation zu diesem Zeitpunkt GFP⁻ oder GFP-niedrig ist, wodurch Vorläuferzellen von differenzierten Cx3cr1-exprimierenden myeloischen Zellen unterschieden werden.
  14. Sortiere die endgültige DAPI⁻ Ter119⁻ KitHigh tdTomato⁺ GFP-Population in sterile Sammelröhren mit kaltem 1× HBSS.
  15. Nach der Sortierung wird ein kleiner Aliquot der sortierten Zellen erneut analysiert, um Reinheit und Lebensfähigkeit vor der Transplantation zu bestätigen.
  16. Sammeln Sie sortierte Zellen in steriler 1× HBSS und halten Sie sie im Dunkeln auf Eis, bis zur Transplantation.
    HINWEIS: Die typischen Erträge liegen zwischen etwa 5,0–7,0 × 104 Hoxb8 hämatopoetischen Vorläufern pro E12,5-Leber Präparation, abhängig von Embryogröße und Sortiereffizienz. Transplantierte gereinigte lebende Zellen so schnell wie möglich, idealerweise innerhalb von 60 Minuten nach der Sortierung.

6. Vorbereitung von Injektionsnadeln

  1. Laden Sie Borosilikatglaskapillaren (1,0 mm Außendurchmesser, 0,58 mm Innendurchmesser, mit Filament) in einen Mikropipettenzieher.
  2. Ziehen Sie Kapillaren mit einem zweizeiligen Zugprogramm, das optimiert ist, um lange, spitz zulaufende Nadeln zu erzeugen, die für neonatale intrazerebrale Transplantationen geeignet sind.
    1. Typische Einstellungen sind: Hitze = 645, Zug = 30, Geschwindigkeit = 120, Verzögerung = AUS und Druck = 200. Optimieren Sie die Endeinstellungen für den jeweiligen Glastyp, die Umweltbedingungen und die Kalibrierung des Ziehers. Anschließend werden die resultierenden Nadeln zugeschnitten und abgeschrägt, um einen endgültigen äußeren Spitzendurchmesser von etwa 30 μm zu erhalten.
  3. Legen Sie die gezogenen Nadeln auf zwei Spachtelstreifen in einer großen Plastik-Petrischale, um die Spitzen vor Beschädigungen zu schützen, bevor Sie schneiden und abschrägen.
  4. Legen Sie die gezogene Nadel unter ein sezierendes Stereomikroskop mit einer Vergrößerung von etwa 10×–20 × und stützen Sie sie mit einer weichen Schiene.
    HINWEIS: Bei der Spitzeninspektion kann eine höhere Vergrößerung (20×–40×) verwendet werden, um die korrekte Verjüngungsbildung zu überprüfen und eventuelle Mängel vor dem Trimmen und Abschrägen zu erkennen.
  5. Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um die Nadelspitze abzuschneiden, um einen Außendurchmesser von etwa 30 μm zu erhalten.
  6. Sichern Sie die getrimmte Nadel in einem Mikrogrinderhalter.
  7. Stellen Sie den Nebenwinkel auf 30°–35° ein.
  8. Schalte die Mühle und die Beleuchtung ein.
  9. Lassen Sie destilliertes Wasser mit einer gleichmäßigen Geschwindigkeit von etwa einem Tropfen alle 4–5 Sekunden auf den Schleifstein tropfen.
  10. Bringen Sie die Nadelspitze vorsichtig in Kontakt mit dem rotierenden Schleifstein, bis eine abgeschrägte Kante entsteht.
  11. Missen Sie den Außendurchmesser der abgeschrägten Spitze mit einem Messgerät, wenn verfügbar.
  12. Wählen Sie Nadeln mit einem Außendurchmesser von etwa 30 μm für die Transplantation aus.
  13. Füllen Sie die Nadel mit sterilem Puffer und geben Sie vorsichtig die Flüssigkeit aus, um sicherzustellen, dass die Spitze offen und unverstopft ist.

7. Vorbereitung des Injektionsapparats

  1. Stellen Sie eine manuelle, mundgesteuerte Pipette zusammen, die aus flexiblem Schlauch, einem Mundstück, einem Inline-Filter und einem Kapillarhalter besteht.
    HINWEIS: Ein Inline-Filter ist in das mundgesteuerte Pipettergerät integriert, um Kontaminationen zu verhindern.
  2. Markiere die Nadel alle 2 mm (bis zu 2 Markierungen pro Nadel). Alle 2 mm entsprechen ~2 μL.
  3. Führen Sie die vorbereitete Glasinjektionsnadel ~1,5 cm in den Kapillarhalter ein und prüfen Sie, dass die Baugruppe sicher und luftdicht ist.
  4. Wenden Sie sanfte Saugkraft durch das Mundstück an, um einen ungehinderten Luftstrom und den richtigen Widerstand zu überprüfen.
  5. Bestätigen Sie, dass das System eine reibungslose Steuerung der Aspiration und Injektion vor dem Laden der Spenderzellen ermöglicht.
  6. Füllen Sie die Glasinjektionsnadel mit der vorbereiteten Spenderzellsuspension (insgesamt 4,5 μL) mit einer feinen Pipettenspitze nach.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass vor Beginn der Transplantation keine Luftblasen in der Nadel verbleiben. Benutze eine Nadel pro Maus.

8. Betäubung von Neugeborenen und Vorbereitung auf das chirurgische Feld

  1. Positionieren Sie die neonatale Maus in der Rückenposition auf dem Operationstisch und leiten Sie eine Anästhesie mit 2,0–5,0 % Isofluran, das über einen Präzisionsverdampfer in Sauerstoff abgegeben wird.
  2. Setzen Sie die Mausnase in einen Nasenkegel, um während des gesamten Eingriffs eine kontinuierliche Zufuhr von Isofluran und Sauerstoff aufrechtzuerhalten.
  3. Planen Sie etwa 1 Minute für die Einleitung der Anästhesie ein, während Sie die Atmung überwachen.
  4. Berühren Sie vorsichtig die Gliedmaßen und überprüfen Sie das Fehlen eines Entzugsreflexes, um eine ausreichende Anästhesie zu überprüfen.
  5. Sobald eine angemessene anästhetische Ebene erreicht ist, wird die Isoflurankonzentration zur Erhaltung auf 0,5–2,0 % reduziert und die Anästhesie bis zu 10 Minuten während des Transplantationsverfahrens fortgesetzt.
  6. Halten Sie die Neugeborenenmaus bei etwa 38 °C mit einem Wärmepad, das unter dem Operationstisch platziert ist.
  7. Reinigen Sie die Injektionsstelle am Kopf mit abwechselnden Anwendungen von Betadin und 70 % Ethanol sowie sterilen Wattestäbchen.
  8. Tragen Sie eine letzte Schicht Betadin auf und lassen Sie die Haut vor der Injektion trocknen.
    VORSICHT: Isofluran ist ein gefährliches Anästhetikum. Verwenden Sie geeignete Anästhetikum-Säuberungssysteme und sorgen Sie für eine ausreichende Belüftung des Raumes gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien.

9. Durchführung einer neonatalen intrazerebralen Transplantation

  1. Stabilisieren Sie den Kopf sanft mit behandschuhten Fingern oder einer weichen Stütze, um die Bewegung während der Injektion zu minimieren.
    HINWEIS: Die Empfängermäuse werden zwischen P1 und P4 verpflanzt.
  2. Identifikation beidseitiger Injektionsstellen im vorderen dorsalen Telenzephalon (Bereich des zukünftigen Frontalkortex), etwa 1–2 mm lateral zur sagittalen Mittellinie und unmittelbar kaudal zu den Riechzübeln. Positionieren Sie die Injektionsstellen symmetrisch in jeder Hemisphäre und vermeiden Sie sichtbare Oberflächenblutgefäße.
    HINWEIS: Aufgrund des dünnen Schädels und der geringen Größe der Neugeborenenmäuse werden Injektionen anhand visueller anatomischer Orientierungspunkte statt stereotaxischer Koordinaten durchgeführt.
  3. Untersuchen Sie den Schädel visuell und vermeiden Sie es, die Nadel in der Nähe sichtbarer Blutgefäße einzuführen.
  4. Führen Sie die abgeschrägte Glas-Mikropipette vorsichtig durch die Haut und den sich entwickelnden Schädel.
  5. Führen Sie die Nadel etwa 1–2 mm unterhalb der Schädeloberfläche in die Frontalhälfte.
  6. Spenderzellen werden unter kontrolliertem manuellem Druck über das mundgesteuerte Pipettenapparat abgegeben.
    HINWEIS: Bei der Transplantation gereinigter hämatopoietischer Vorläufer oder neonataler Mikroglia wird pro Hemisphäre 2–3 μL injiziert, was etwa 2,5 × 104 Zellen pro Injektion entspricht. Dies liefert etwa 5 × 104 Zellen pro Mausgehirn.
  7. Ziehen Sie die Mikropipette langsam aus dem Gehirn heraus, um den Rückfluss der injizierten Zellen zu minimieren und Gewebeschäden zu verringern.
  8. Führe eine kontralaterale Injektion durch.
    HINWEIS: Verwenden Sie pro Maus eine Nadel, um Kreuzkontaminationen zwischen Mäusen zu vermeiden.

10. Genesende transplantierte Neugeborene

  1. Leg jeden Welpen direkt nach dem Eingriff auf eine Wärmematte.
  2. Beobachten Sie die Welpen, bis die normale Körperfarbe, spontane Bewegung und allgemeine Aktivität zurückkehren.
    HINWEIS: Die Erholungszeit liegt zwischen 5 und 10 Minuten.
  3. Die Welpen zur Mutter zurückbringen.
  4. Reiben Sie jeden Welpen gründlich mit Einstreu und Nistmaterial für den Käfig.
  5. Setze die Welpen zurück in den Käfig mit der Mutter.
  6. Bestätigen Sie, dass die Mutter die zurückgebrachten Jungtiere holt und aufnimmt.

11. Überwachung der postoperativen Gesundheit

  1. Beobachten Sie die Welpen täglich 10 Minuten in den ersten 3 Tagen nach der Transplantation.
  2. Bewerten Sie die Welpen auf normale Aktivitäten, Säuglingsverhalten und Interaktion mit der Mutter.
    HINWEIS: Mäusekäfige sollten während dieser Zeit nicht gestört werden. Dies kann den Stress für den Damm erhöhen.
  3. Überwachen Sie die Welpen weiterhin alle zwei Tage bis zum Abstillen nach der ersten 3-Tage-Phase.
  4. Bewerten Sie die Welpen hinsichtlich normaler Entwicklung, Fütterungsverhalten, Aktivitätsniveau und mütterlicher Fürsorge.
  5. Messen und zeichnen Sie das Körpergewicht täglich während der frühen postoperativen Phase.
  6. Untersuchen Sie die Welpen auf Anzeichen von Stress, abnormaler Haltung, Lethargie oder eingeschränkter Fütterung.
  7. Führen Sie bei Bedarf humane Euthanasie gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege durch.
    1. Bei Neugeborenenmäusen wird durch eine Isofluran-Überdosis mit einem Glockenglas oder einer ähnlichen geschlossenen Kammer mit einem falschen Boden eingeschläfert, um direkten Kontakt mit dem Anästhetikum zu verhindern. Sobald die Atmung aufhört und das Fehlen von Reflexen bestätigt ist, wird sofort enthauptet.
    2. Bei erwachsenen Mäusen wird mit 5 % Isofluran, das in Sauerstoff durch einen Präzisionsverdampfer abgegeben wird, eingeschläfert, bis die Atmung aufhört und das Fehlen von Reflexen bestätigt ist, gefolgt von einer zervikalen Verrenkung als sekundäre physische Methode zur Sicherung des Todes.
      HINWEIS: Tiere mit postoperativer Sterblichkeit oder Ausbleiben nachweisbarer Spenderzellen-Engraftments am experimentellen Endpunkt wurden von der Analyse ausgeschlossen. Postoperative Analgesie wurde nicht verabreicht, da eine neonatale intrazerebrale Transplantation als minimalinvasiv galt.

12. Sammeln von Hirngeweben für Kryosektion und Immunfluoreszenzfärbung

  1. Entfernen Sie das Gehirn vorsichtig und bereiten Sie es auf die Frorenschnittsanalyse vor.
  2. Verarbeiten Sie postnatales Hirngewebe zur Kryosektion und schneiden Sie koronale Schnitte mit einem Kryostat gemäß den zuvor beschriebenen Verfahren.
    HINWEIS: Für jede Maus werden 9–12 koronale Schnitte analysiert, die sich über den somatosensorischen Kortex erstrecken.
  3. Teile auf Objektträger montieren und bei -20 °C lagern, bis zum Färben.
  4. Inkubieren Sie Abschnitte kurz in einem Permeabilisierungspuffer mit 0,2 % Triton X-100 und 1 % Natriumdeoxycholat.
  5. Vorbereitung von primären Antikörpern (Hühner-Anti-GFP, 1:500; Meerschweinchen-Anti-Tomaten-Antikörper, 1:250; Kaninchen anti-Iba1; 1:500) verdünnt in einem geeigneten Antikörper-Verdünnungspuffer.
  6. Inkubieren Sie Gewebeschnitte mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C.
  7. Waschen Sie Schnitte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um ungebundene primäre Antikörper zu entfernen.
  8. Inkubieren Sie Schnitte mit fluorophorkonjugierten sekundären Antikörpern (Ziegen-Antikaninchen Alexa Fluor 647, 1:500; Ziegen-Anti-Meerschweinchen Alexa Fluor 555, 1:500; Ziegen-Anti-Huhn Alexa Fluor 488, 1:500) für 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  9. Gegenfärbung mit DAPI zur Visualisierung von Zellkernen.
  10. Teile mit einem Antifade-Montagemedium montieren und einen Glasdeckmantel anbringen.

13. Erfassung von konfokalen mikroskopischen Bildern

  1. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen Mikroskop auf, das mit 10×- oder 20×-Objekten ausgestattet ist.
  2. Bilder mit 512 × 512 oder 1024 × 1024 Pixel Auflösung mit Scangeschwindigkeiten von 200–400 Hz aufnehmen.
  3. Optische Schnitte mit Z-Schritt-Intervallen von 2–5 μm durch das Gewebe zu sammeln.

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Ergebnisse

Die neonatale intrazerebrale Transplantation gereinigter Mikrogliapopulationen führt zu einem langfristigen Überleben und einer weit verbreiteten Einpflanzung von Spenderzellen im empfangenden Gehirnparenchym. Gereinigte Donor-Mikrogliapopulationen wurden vor der Transplantation durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit fluoreszierenden Linienreportern (Hoxb8 microglia: tdTomato⁺ GFP⁺; nicht-Hoxb8 Mikroglia: tdTomato⁻ GFP⁺) isoliert (Abbildung ...

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Diskussion

Die neonatale intrazerebrale Transplantation gereinigter mikroglialer Vorläufer oder definierter mikroglialer Subpopulationen bietet einen robusten Ansatz zur Rekonstruktion des mikroglialen Kompartments in vivo und zur Untersuchung linienspezifischer Eigenschaften von Gehirnmakrophagen. Diese Methode ermöglicht eine selektive Rekonstitution mit genetisch definierten Spenderzellen und ermöglicht eine direkte Beurteilung der Zelltransplantation und Reifung im Gehirn.

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01 MH093595) (M.R.C.), der Dauten Family Foundation und der Flow Cytometry Facility der University of Utah unterstützt. Csf1rΔFIRE-Mäuse wurden von Dr. Ben Xu an der University of Utah erzeugt.

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Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bell jarVariousN/AVerwendet für Euthanasie
Borosilikatglaskapillaren mit
Filament		Sutter InstrumentBF100-78-15Verwendet für Injektionsnadeln
Bovines Serumalbumin (BSA)Sigma AldrichA8806Verwendet zur Herstellung von PB-Puffer. Verschiedene Marken sind verfügbar. Die hier aufgeführte ist nur ein Beispiel.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222Myeloide Zellen
CD45 APCBioLegend103112Hämatopoetische Zellen
Zellsiebe (70 µm)Falcon352350Verwendet zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen. Verschiedene Marken sind verfügbar. Die hier aufgeführte ist nur ein Beispiel.
Huhn Anti-GFP AntikörperAves LabsGFP-1020Immunfluoreszenz
Färbung
c-Kit PE-Cy7 AntikörperBioLegend105814Hämatopoetische Vorläufer
KonfokalmikroskopLeicaTCS SP5Verwendet für Fluoreszenz
Bildgebung
Konische Röhrchen (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301Gewebe/Zellverarbeitung. Verschiedene Marken sind verfügbar. Die hier aufgeführte ist nur ein Beispiel.
KryostatmaschineLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/Herstellung von gefrorenen Gewebe
Abschnitten. Verschiedene Marken sind verfügbar. Die hier aufgeführte ist nur ein Beispiel.
DAPI KernfärbungThermo Fisher ScientificD1306Verwendet für Lebensfähigkeit und
Kernfärbung
DissektionsmikroskopLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/Verwendet für das Trimmen und die Herstellung von Injektionsnadeln. Verschiedene Marken sind verfügbar. Die hier aufgeführte ist nur ein Beispiel.
FACSAria Durchflusszytometer SorterBD BioscienceFACSAria Zellreinigung
Fc block (gereinigtes CD16/32)Biolegend101302Blockiert unerwünschte Antikörperbindung an Mauszellen, die Fc-Rezeptoren exprimieren
Fötales Rinderserum (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlVerwendet in Zellpräparations
Puffern. Verschiedene Marken sind verfügbar. Die hier aufgeführte ist nur ein Beispiel.
Flexibles Schlauchmaterial für MundpipetteVariousN/AKomponente des manuellen
Injektionsapparats
Flow Cytometrie AnalysesoftwareFlowJov10.8.1Verwendet für FACS Daten
Analyse
Flow Cytometrie ZellsortiererBD BiosciencesFACSAriaVerwendet für Zellreinigung
gentleMACS Octo Dissociator mit
Heizung		Miltenyi Biotec130-096-427Verwendet für Gehirngewebe
Dissoziation
Ziegen Anti-Huhn Alexa Fluor 488
Sekundärantikörper		Thermo Fisher ScientificA-11039Sekundärantikörper
Ziegen Anti-Meerschweinchen Alexa Fluor
555 Sekundärantikörper		Thermo Fisher ScientificA-21428Sekundärantikörper
Ziegen Anti-Kanin Alexa Fluor 647
Sekundärantikörper		Thermo Fisher ScientificA-21245Sekundärantikörper
Ziegen Anti-Ratte Alexa Fluor 647
Sekundärantikörper		Thermo Fisher ScientificA-48265Sekundärantikörper
Meerschweinchen Anti-tdTomato AntikörperFrontier InstituteAB_2631185Immunfluoreszenz
Färbung
Hanks' ausgewogene Salzlösung
(HBSS)		Gibco14175-079Verwendet während der Zell
Vorbereitung
HämazytometerVariousN/AZellzählung
Inline-Filter für MundpipetteVariousN/AVerhindert Kontamination
MikroschleiferNarishigeEG-400Verwendet zum Schrägen von Glas
Injektionsnadeln
MikropipettenzieherSutter InstrumentP-1000Verwendet zur Herstellung von feinen
Injektionsnadeln
MundpipettenmundstückVariousN/AVerwendet für manuelle Steuerung der
Injektion
Neural Tissue Dissociation Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628Verwendet für enzymatische Dissoziation von Hirngewebe
PetrischalenThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022Verwendet zur Aufbewahrung von gezogenen Nadeln oder Gewebeernte. Verschiedene Marken sind verfügbar. Die hier aufgeführte ist nur ein Beispiel.
Kaninchen Anti-Iba1 AntikörperWako019-19741Mikroglia Marker
Kaninchen Anti-TMEM119 AntikörperAbcam209064Mikroglia-spezifischer Marker
Ratten Anti-CD206 AntikörperBioLegend141712Verwendet zur Identifizierung von Makrophagenpopulationen
Ratten Anti-P2RY12 AntikörperBioLegend848002Mikroglia Marker
Rasierklingen/SkalpelleVariousN/AVerwendet zum Trimmen von Nadelspitzen oder
Gewebeernte
RBC LysepufferChemCruzsc-296258Verwendet zur Entfernung von roten
Blutkörperchen
Stereotaktisches GerätKopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com/Verwendet für chirurgische
Implantation. Verschiedene Marken sind verfügbar. Die hier aufgeführte ist nur ein Beispiel.
Ter119 PerCP-Cy5.5 AntikörperBioLegend116228Erythroide Abstammungszellen
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Referenzen

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  26. Lund H, et al. Competitive repopulation of an empty microglial niche yields functionally distinct subsets of microglia-like cells. Nat Commun. 2018;9(1):4845.

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